DIAGNOSI NELLE MALATTIE INFETTIVE

DIAGNOSI EZIOLOGICA

• Suggerire un trattamento terapeutico appropriato

• Valutare l’efficacia di una terapia

• Valutare la presenza di portatori sani (potenziale fonte di contagio per la comunità)

Identificazione dell’agente patogeno responsabile di una malattia

Diagnosi di laboratorio

Esigenza di utilizzare metodologie scientificamente valide ed eseguibili in tempi accettabili

Necessità di acquisire in tempi rapidi informazioni utili alla diagnosi ed alla terapia

Fase pre-analitica

1. Richiesta del Clinico (scelta degli esami)

2. Informazione e Preparazione del Paziente

3. Raccolta del campione

4. Identificazione del campione

5. Trasporto del campione

FASE ANALITICA

•Fondamentale momento di interfaccia tra il

laboratorio e le altre parti coinvolte nel processo• momento cruciale nel

quale si compiono il 46% degli errori!

• L’appropriatezza di tutta la fase pre-analitica si traduce in maggiorequalità del servizio diagnostico e maggiore sicurezza dell’operatore

• Solo la stretta collaborazione tra tutte le figure coinvolte a diversotitolo nell’indagine microbiologica (che ha inizio al letto del malato conla decisione di richiedere le indagini fino al momento dell’utilizzo deireferti) ed il rispetto in tutte le fasi delle corrette procedure puòassicurare la piena valorizzazione dell’indagine microbiologica.

Fasa pre-analitica1. richiesta degli esami di laboratorio

• nella patologia infettiva ad eziologia definita, per diagnosi diforme clinicamente atipiche o iniziali, per la determinazione dellasensibilità ai farmaci.

• nelle sindromi polieziologiche, per indicazioni terapeutiche(sempre, se in assenza di specifiche informazioniepidemiologiche).

• nella patologia infettiva del paziente immunocompromesso, perindicazioni terapeutiche (quasi sempre necessarie).

• in ogni caso, per valutazioni epidemiologiche indispensabili per lostudio della circolazione dei microrganismi e la identificazione deifattori di rischio, l’adozione di idonee misure preventive, ladefinizione di un corretto approccio diagnostico e terapeutico.

La richiesta di accertamenti microbiologici è giustificata:

FASE PRE-ANALITICA2. Informazione e preparazione del Paziente

Il Paziente deve essere adeguatamente istruito sulle corrette modalità di prelievo, conservazione e trasporto del campione biologico

Esempio:

• Prelievo urine (tecnica del “mitto intermedio”)

• Prelievo dell’espettorato

FASE PRE-ANALITICA3. Raccolta del campione clinico

• Può essere prelevato da:

• siti sterili (sangue, midollo, liquido cefalo-rachidiano (liquor), liquido pleurico/pericardico/peritoneale/articolare, vie respiratorie inferiori, urine, tessuti profondi)

• ogni isolamento ha significato eziologico

• siti “contaminati” da flora autoctona (bocca, naso, vie respiratorie superiori, feci, espettorato, tratto gastro-intestinale, tratto genitale femminile, terzo distale dell’uretra, cute)

• i risultati vanno interpretati a seconda del caso

• necessaria una richiesta “mirata” del clinico, volta alla ricerca di uno o più specifici patogeni nel contesto dell’abbondante flora contaminante

• Ad ogni campione è associato un potenziale rischio biologico per la salute degli operatori sanitari

Campione clinico: materiale biologico da esaminare per verificare la

presenza o assenza di specifici microrganismi patogeni

Flora microbica “residente”

• Svantaggi

• Può contaminare i campioni

• Può causare malattia

• Vantaggi

• è in grado di proteggere dalle infezioni prevenendo la colonizzazione delle superfici epiteliali da parte dei patogeni (resistenza alla colonizzazione)

• la riduzione (o rimozione) della flora “normale” mediante impiego di antibiotici può causare superinfezioni, generalmente sostenute da microrganismi resistenti

Tutte le superfici corporee “esposte” (a contatto con l’ambiente circostante,

i.e. bocca, naso, intestino, cute, vie genitali femminili, uretra) sono

colonizzate da una flora “autoctona”

Tipologie di campioni biologici

• Campione prelevato da una zona in cui

coesistono patogeni e flora residente

(tampone)

• Campione INDIRETTO: prelevato previo

passaggio in una zona con flora residente

(lavaggio bronco-alveolare)

• Campione DIRETTO: il patogeno è localizzato in

un sito normalmente sterile ed una barriera (la

cute, generalmente) deve essere superata per

la sua raccolta (liquor, ago-aspirato)

• Campioni INUTILI ai fini diagnostici: non vanno

prelevati in quanto non forniscono alcuna

indicazione (vomito, aspirato gastrico,

contenuto intestinale, etc.)

APPROPRIATEZZA DEL CAMPIONE

Molto importante è l’adeguata raccolta (appropriatezza) del campione.

In particolare, il campione dovrebbe essere:

A. raccolto nel momento giusto;

B. prelevato da un distretto corporeo rappresentativo della patologia

infettiva;

C. prelevato in quantità sufficiente da poter effettuare i test diagnostici

necessari;

D. raccolto in maniera da evitare contaminazioni.

Appropriatezza del campione

A. QUANDO: nel momento giusto• Nella fase acuta della malattia (carica microbica maggiore)

• Prima dell’inizio di una terapia antimicrobica, quando possibile, o a distanza di almeno 48h dalla sua sospensione (se ciò non è possibile segnalarlo al laboratorio)

B. DOVE: dal distretto corporeo rappresentativo dell’area infetta

• Esempio:Il sospetto clinico di febbre tifoide, unito alla conoscenza della storia naturale di questa malattia infettiva, suggerisce la ricerca di Salmonella typhi nel sangue durante la 1°e 2°settimana e nelle feci nella 3°e 4°settimana.

Appropriatezza del campione

C. QUANTO: in quantità sufficiente• Esempio: quantità di sangue sufficiente per rilevare batteriemie

(spesso la carica batterica ematica è molto bassa)

D. COME: in maniera da evitare contaminazioni• Se il prelievo non viene eseguito con modalità rigorosamente

asettiche, altri microorganismi (flora “autoctona”), non responsabili della patologia, potrebbero contaminare i campioni e “falsare” così il risultato delle indagini microbiologiche.

• Esempio: ricerca di Streptococcus pyogenes va effettuata a mezzo di un tampone nelle fosse peritonsillari, evitando il contatto con l’orofaringe

FASE PRE-ANALITICA4. Identificazione del campione

I contenitori inviati in laboratorio debbono essere identificati con l'etichetta

riportante il relativo codice a barre ed accompagnati da un foglio di richiesta

indicante:

• Identificativo del paziente (nome, cognome, età, sesso)

• Provenienza anatomica del campione

• Nominativo del prelevatore

• Data e ora di campionamento(informazione critica!)

• Diagnosi clinica presuntiva

• (eventuale) Schema del trattamento antibiotico in corso

FASE PRE-ANALITICA5. Trasporto del campione

• Al fine di ottenere la massima recovery dei microrganismi, il campione deve essere trasportato:

• in adeguati contenitori sterili, per assicurare la corretta esecuzione delle indagini microbiologiche e consentire il corretto trasporto e manipolazione dal campione;

• rapidamente: il trasporto del campione frequentemente causa una riduzione della vitalità dei microrganismi in esso presenti;

• in adeguati terreni di trasporto, se necessario(es. tamponi), al fine di mantenere inalterata la “facies” microbica del campione, conservandone le caratteristiche possedute al momento del prelievo;

• Terreni liquidi o semisolidi (agarizzati)

• a temperatura “controllata”: generalmente a +4C, occasionalmente a temperatura ambiente

• Trasporto in sistemi “dedicati”, come nel caso della ricerca di germi anaerobi

Riflessioni … sulla fase pre-analitica

• Il contributo di chi richiede e preleva i campioni alla qualità degli esami di

laboratorio dipende sia dalla consapevolezza del fenomeno che nella capacità di

attenersi a quella serie di norme che permettono di ridurre al minimo i fattori che

possono modificare il risultato finale delle analisi.

• Un campione non idoneo può infatti causare il mancato isolamento del

microorganismo responsabile dell’infezione.

• Inoltre, si evitano in tal modo "dispersioni" di germi patogeni, specie quelli

resistenti (MRSA, Pseudomonas spp), che vanno indirettamente ad incrementare

l'incidenza delle infezioni nosocomiali.

• Il risultato dell'esame batteriologico sarà qualitativamente valido e più rapido.

In ultima analisi, gli operatori coinvolti nella fase pre-analitica sono

responsabili della qualità del percorso diagnostico del paziente…almeno

fino all’arrivo del campione in Laboratorio!

Diagnosi di laboratorio delle malattie infettive

A) DIAGNOSI DIRETTA

Ricerca dell'agente eziologico (intero o di una suacomponente) e sua identificazione:

Esame batteriologico/micologico/parassitologico/virologico

B) DIAGNOSI INDIRETTA

Ricerca di anticorpi specifici (test sierologici):sviluppo di una risposta anticorpale specifica

Diagnosi diretta

A. Esame microscopico

B. Esame colturale (isolamento)

C. Ricerca di antigeni

D. Ricerca di sequenze geniche

a. Esame microscopico

Scopo: accertare la presenza, nel materiale patologico adatto, del microrganismo patogeno sospettato e identificarlo.

Preparati fissati e colorati

Preparati “a fresco”

BatteriParassitiFunghi

BatteriParassitiFunghiVirus

a. Esame microscopico• Campioni “a fresco” oppure fissati (al calore o chimicamente)

• La scelta del tipo di microscopia dipende dal patogeno presente:

• microscopia in campo oscuro: il condensatore illumina obliquamentel’oggetto in modo che le strutture cellulari riflettano la luce verso l’occhiodell’operatore, a differenza dell’ambiente circostante. Ricerca di spirochete(T. pallidum) nelle lesioni cutanee associate alla sifilide.

• microscopia in contrasto di fase: le differenze nell’indice di rifrazione neicampioni sono convertite in differenze nella intensità della lucenell’immagine. Consente la visualizzazione di strutture in campioni noncolorati (funghi e parassiti, ma anche batteri).

• microscopia in fluorescenza: le molecole fluorescenti assorbono luce ad unae la ri-emettono ad una più lunga. Tale differenza viene rilevata dall’impiegodi filtri. Utile per l’identificazione di batteri e funghi.

• Spesso si utilizzano colorazioni “dedicate” i.e. Gram, alcool-acido resistenza(ZiehlNielsen)

Esame microscopico (“a fresco”)

Si esegue soprattutto per la ricerca di microrganismi difficilmente colorabilicon le tecniche disponibili, evidenziabili invece in campo oscuro:–ricerca di Spirochete(Treponema, Borrelia)–ricerca di Leptospire

Osservazione in campo oscuro: Treponema pallidum

Esame microscopico (previa colorazione)

• Campioni fissati (al calore o chimicamente)• Fornisce indicazioni riguardo:

•Idoneità del campione (espettorato: neutrofili / cellule squamose)•Numero e percentuale di polimorfonucleati neutrofili•Presenza/assenza di microrganismi (batteri, funghi, parassiti)

• Colorazione del campione con tecnica di Gram:• morfologia (cocchi, bastoncelli,cocco-bacilli, lanceolata)• disposizione (catenelle, clusters, diplococchi)• quantità assoluta di batteri presenti• percentuale relativa di Gram+ e Gram-• localizzazione in sede intra-od extra-cellulare

• Specifiche colorazioni:• colorazione di Ziehl Nielsen (bacilli alcool-acido resistenti)• verde malachite (endospore batteriche)• colorazione di Albert (granuli metacromatici o volutina)• colorazione di Leifson (flagelli)

Colorazioni SEMPLICI, che prevedono l’impiego di un solo

colorante:

–cristalvioletto

–fucsina basica

–blu di metilene

Colorazioni DIFFERENZIALI, che prevedono l’impiego di più di un

colorante:

–Colorazione di Gram

–Colorazione di Ziehl-Neelsen

Esame microscopico (previa colorazione)

Colorazione di gram: regressiva e differenziale

Tecnica1.Fissare gli strisci al calore2.Coprire con cristalvioletto per 1-2 min3.Lavare con acqua. Non asciugare4.Coprire con la soluzione iodio-iodurata di Lugol per 1-2 min5.Lavare con acqua. Non asciugare6.Decolorare per 10 sec con alcool-acetone7.Lavare con acqua. Non asciugare8.Coprire con safranina (2.5% in alcool 95%) per 1-2 min9.Lavare con acqua e lasciare asciugare

PrincipioNei batteri Gram+ il cristalvioletto e lo iodio sicombinano a formare un complesso (CV-I) di grossedimensioni che precipita all’interno della cellula. Ildecolorante condensa, per disidratazione, la strutturapeptidoglicanica. In questo modo, il complesso CV-Iviene “catturato” dalla parete cellulare.Nei batteri Gram- il decolorante agisce come solventelipidico, dissolvendo la membrana esterna della paretecellulare, permettendo così il rilascio del complessoCV-I e, quindi, la decolorazione della cellula batterica.

Colorazione gram: utilità clinica

• Idoneità del campione da sottoporre a coltura• Diagnosi eziologica presuntiva (suggestiva)

• meningiti e polmoniti batteriche, batteriuria, gonorrea ed infezioni piogene

• Suggerire la necessità di attuare tecniche di coltivazione “non routinarie”• anaerobi, funghi

• Ausilio nella interpretazione dell’esame colturale• angina di Vincent (spirochete, fusobatteri)• paziente antibiotizzato

• Informazioni sulla natura dell’infezione•infezioni poli/mono-microbiche

Tuttavia:• La colorazione di Gram non deve essere effettuata su campioni clinici (feci,escreato) in cui la flora patogena non può essere differenziata da quellacommensale• La colorazione di Gram non è utile per la rilevazione di:

•Legionella spp.(immunofluorescenza)•bacilli acido-resistenti (micobatteri, Nocardia spp.) (Ziehl-Neelsen)

Esame microscopico in micologia

Preparati “a fresco” o fissati e colorati

Cryptococcus: lievitiCandida: lieviti

Candida: ife in striscio vaginale

Microsporum: conidi

Aspergillus: testa conidiale

Esame microscopico in parassitologia

È di alto valore diagnostico

Preparati “a fresco” (utile per parassiti mobili) o fissati e colorati

Giardia intestinalis

Leishmania: promastigoti e amastigoti

Sarcoptes scabiei

Plasmodium: trofozoiti

Entamoeba Taenia: proglottide matura

Diagnosi diretta

A. Esame microscopico

B. Esame colturale (isolamento)

C. Ricerca di antigeni

D. Ricerca di sequenze geniche

B. Esame colturale (isolamento)

BATTERI

quasi tutti →terreni “artificiali”

M. leprae, T. pallidum→non coltivabili

chlamydie rickettsie →colture cellulari

VIRUS

Uova embrionate

colture cellulari (primarie/continue)

molti virus non coltivabili o coltivabili con difficoltà

B. Esame colturale (BATTERI)

Quasi tutti i batteri di interesse medico possono essere coltivati in sistemi artificiali (in vitro) denominati terreni di coltura.

I terreni di coltura si distinguono in base allo stato fisico:

• LIQUIDI(brodo).Composizione del brodo“normale”:

• peptone (digestione parziale di proteine animali) 0,5%

• estratto di carne 0,3%

• NaCl (per rendere isotonico il terreno)

• tampone fosfato (PBS; pH 7,0)

• H2O

• SOLIDI (brodo normale solidificato con agar). L’agar:

• Polisaccaride acido (70% agarosio,30% agaropectina) estratto da alghe rosse del genere Gelidium

• Addizionato al brodo in quantitàpari a1,5-2%

• liquido a temperature 80C, gelifica a 42-47C

• Non viene metabolizzato dalla maggior parte dei batteri

• Permettono l’isolamento di specie microbiche (colonie)

Terreni di coltura

Terreni arricchitimicrorganismi con particolari

richieste metaboliche

Terreni selettivicrescita di alcuni, inibizione della

crescita di altri

Terreni differenziali identificazione in base alle caratteristiche

differenti di crescita

Terreni minimicrescita della maggior parte dei

batteri

Agar sale-mannite Agar sangue

Streptococchi:α emoliticiβ emoliticiγ emolitici

•Carbonio•Azoto•Zolfo•Fosforo•Sotto forma di Sali inorganici, aggiunti in concentrazione nota

•sangue•siero•estratto di lievito•infusi di cuore e cervello•carboidrati•amminoacidi

ISOLAMENTO COLTURALE MEDIANTE TECNICA DELLA DISSEMINAZIONE IN SUPERFICIE

Diagnosi diretta

A. Esame microscopico

B. Esame colturale (isolamento)

C. Ricerca di antigeni

D. Ricerca di sequenze geniche

identificazione

Una volta che dal campione biologico si sia verificata, su terreni solidi opportuni, la crescita di colonie batteriche isolate si procede alla identificazione:

IDENTIFICAZIONE PRESUNTIVA caratteri microscopici (colorazioni,forma,organizzazione) caratteri macroscopici (aspetto coloniale)

IDENTIFICAZIONE FINALE (DEFINITIVA)

A. biochimicaB. immunologica (sierologica)C. molecolare

IDENTIFICAZIONE

A. IDENTIFICAZIONE BIOCHIMICA

La determinazione di “specie” si basa sulla capacità del microrganismo inesame di:

• metabolizzare zuccheri per via ossidativa (via aerobica) o per viafermentativa (via anaerobica)• produrre specifici enzimi• produrre specifici prodotti metabolici

Utilizzo di metodi “manuali” od “automatizzati”.Identificazione possibile in tempi rapidi (4-6h).

La fermentazione degli zuccheri e l’utilizzazionedi altri substrati (ureasi, indolo, gelatina, etc.)viene evidenziata da un indicatore di pHresponsabile della reazione colorimetrica

B. Identificazione sierologica

Ha come obiettivo finale quello di ricercare ANTIGENI direttamente nel

campione biologico esaminato.

Le tecniche di identificazione sierologica comprendono:

• agglutinazione: quando l’antigene è corpuscolato (globuli rossi, batteri)• precipitazione: quando l’antigene è solubile• fissazione del complemento: quando l’antigene è corpuscolato (lisi) • neutralizzazione: quando l’antigene, per azione del corrispondente anticorpo, perde la sua attività

• IF immunofluorescenza • RIA radioimmunoassy• test immunoenzimatici ELISA, immunoblot

Alla base di ogni reazione sierologica c’è la formazione dell’ immunocomplesso (antigene+anticorpo)

C. Identificazione molecolare

SONDE MOLECOLARI

• Sonde specifiche a DNA per geni che identificano uno specifico patogeno.

• Le sonde legano il DNA complementare presente nel campione(ibridazione), indicando la presenza del patogeno

• Permettono di individuare anche esigue quantità di acidi nucleici (elevatasensibilità)

• La reazione di ibridazione può essere condotta su diverse tipologie dicampioni:

• colonie batteriche

• preparazioni di DNA purificato

• campioni clinici

La digestione del DNA per mezzo dienzimi di restrizione, seguita daibridazione con differenti sonde genichegenera patterns specie-specifici (ossiacaratteristici di una specie microbica).

PRINCIPALI TECNICHE DI IBRIDAZIONE DEGLI ACIDI NUCLEICI

Il DNA target denaturato (singolo filamento) viene direttamenteimmobilizzato su un supporto solido (p. es., membrana di nitrocellulosa)ed ibridato con una specifica sonda a DNA a singolo filamento marcata,per facilitarne la successiva rivelazione (dot blot). In alternativa,differenti frammenti di DNA con diverso peso possono essere separatiattraverso elettroforesi su gel di agarosio, denaturati e poi trasferiti sumembrane per l’ibridazione con sonda e rilevazione (Southern blot). Sesi utilizzano molecole di RNA separate con elettroforesi si parla diNorthern blot.

Diagnosi diretta

A. Esame microscopico

B. Esame colturale (isolamento)

C. Ricerca di antigeni

D. Ricerca di sequenze geniche

identificazione

antibiogramma

ANTIBIOGRAMMA: TEST DI ANTIBIOTICO-SENSIBILITà

Una volta eseguita l’identificazione del microrganismo in esame, si procedealla determinazione della sensibilità/resistenza dell’isolato agli antibiotici(antibiogramma).

• Obiettivo dei test per la determinazione della antibiotico-S è di predire ilsuccesso od il fallimento in vivo della terapia antibiotica.• I test vengono effettuati in vitro, e misurano la risposta (crescita) di unmicrorganismo isolato verso un particolare antibiotico/antibiotici.• I test sono eseguiti in condizioni standardizzate per garantire lariproducibilità dei risultati.• I risultati di questi test debbono essere usati per guidare la sceltadell’antibiotico da adottare, alla quale contribuiscono anche le informazionicliniche e l’esperienza professionale.

Dopo aver seminato su terreno solido ilgerme in esame si appoggiano sullasuperficie dei dischetti imbevuti degliantibiotici-test. Incubazione; Il mancatosviluppo del germe (alone di inibizione)significa sensibilità a quell’antibiotico.

Determinazione della MIC (CONCENTRAZIONE MINIMA INIBENTE):

Misura quantitativa dell’attività di un antibiotico verso un determinato batterio. Definita come la più bassa concentrazione di antibiotico in grado di inibire la crescita batterica visibile.

Diagnosi diretta

A. Esame microscopico

B. Esame colturale (isolamento)

C. Ricerca di antigeni:

A. Test di agglutinazione

B. Test di precipitazione

C. Fissazione del complemento

D. Immunofluorescenza, ELISA, RIA, Wester blot

D. Ricerca di sequenze geniche (PCR)

Diagnosi indiretta

Volta a rilevare una RISPOSTA IMMUNE UMORALE SPECIFICA dell’ospiteall’agente infettivo

La diagnosi INDIRETTA è, ovviamente, più tardiva di quella DIRETTAin quanto si può ricorrere ad essa soltanto quando si sia sviluppata già lareattività immunitaria dell’ospite. Ciò non è sempre possibile, come nelcaso di pazienti anergici.

Le indagini sierologiche diventano di ausilio diagnostico, pertanto,soltanto quando l’isolamento del microrganismo sia difficoltoso, fallito,o non possibile.

L’accertamento indiretto non comportando l’isolamento del germe,preclude la possibilità di saggiare la sensibilità dell’agente etiologicoverso i farmaci antimicrobici.

Tecniche per la diagnosi indiretta

A. Reazione di fissazione del Complemento

B. Reazione di agglutinazione

C. Test immunoenzimatico (ELISA)

D. Saggio inimmunofluorescenza

E. Saggio radioimmunologico

Praticamente le stesse viste per la ricerca diretta dell’antigene nel campione,solo che qui cerchiamo l’anticorpo diretto contro l’antigene!

Agglutinazione diretta

antigeni corpuscolati vengono posti a contatto con siero contenente anticorpi specifici

antigeni presenti sulla superficie delle cellule batteriche

Agglutinazione indiretta

Antigeni solubili o Anticorpi vengono fatti aderire artificialmente allasuperficie di particelle corpuscolate come il lattice di polistirolo.

La reazione di agglutinazione è molto sensibile anche a piccole quantità dianticorpi ed è molto usata per esempio per la TIPIZZAZIONE SIEROLOGICA(tecnica di identificazione che fa uso di antisieri che reagiscono con i vari antigenibatterici permettendone il riconoscimento).

Ricorda!

Precipitazione

antigene solubile (macromolecole o tossine) viene messo a contatto con un siero contenente anticorpi specifici.La formazione degli immunocomplessi si può osservare con un precipitato.

Quando la concentrazione degli antigeni e degli anticorpi è ottimale si creano dei “ponti” tra un immunocomplesso e l’altro. Questa fase corrisponde al punto di equivalenza dove è massima la quantità di precipitato.

Esempi di reazione di precipitazione

Immunodiffusione

Immunoelettroforesi

Si esegue prima una elettroforesi delleproteine del siero su gel di agar stratificato sulastra di vetro. Ai lati, su dei solchi vieneintrodotto l’antisiero che contiene anticorpicontro le proteine del siero. All’unione traproteine del siero separate e i rispettivianticorpi, si formano degli archi caratteristici.

Si tratta di pozzetti scavati nell’agar.Quando si introducono antigene oanticorpo, essi diffondono e danno originead una banda di precipitazione nel puntod’incontro.

FISSAZIONE DEL COMPLEMENTOE’ una tecnica utilizzata per la diagnosi di sifilide (reazione di Wassermann)

Siero in esame con anticorpi + antigene immunocomplesso

COMPLEMENTO di cavia

SISTEMA RIVELATORE formato da: Emolisine + Emazie

Se il complemento è stato utilizzato dal 1^ immunocomplesso, non ci può essere emolisi, la reazione è positiva (presenza di anticorpi).

Se invece si verifica emolisi, significa che il complemento si è reso disponibile per il sistema rivelatore, la reazione è negativa.

+

Immunocomplesso

+

REAZIONE DI FISSAZIONE DEL COMPLEMENTO

Gli Ab sono coniugati con molecole fluorescenti (fluorescina), sono molecole in grado di assorbire la luce ultravioletta emettendo poi radiazioni nel campo del visibile.Per poter osservare la reazione si utilizza un microscopio a fluorescenza.

IMMUNOFLUORESCENZA DIRETTASi utilizza un anticorpo coniugato confluoresceina isotiocianato, che siaspecifico per l’antigene in esame.

IMMUNOFLUORESCENZA INDIRETTASi utilizza un anticorpo specifico perl’antigene in esame ma nonconiugato, che viene riconosciuto daun secondo anticorpo coniugato ediretto contro regioni costanti delleimmunoglobuline della specie in cui èstato prodotto il primo anticorpo.

immunofluorescenza

ImmunoenzimaticaE.L.I.S.A. Enzyme Linked Immunosorbent Assay

• Si ricopre la superficie plastica di un pozzetto (micropiastra) con anticorpi specifici contro l’antigene.• Si aggiunge l’antigene che viene poi evidenziato da anticorpi, anch’essi contro l’antigene ricercato, legati covalentemente ad un enzima (perossidasi, fosfatasi alcalina, β-galattosidasi) (sandwichELISA)• La quantificazione avviene con tecniche spettrofotometriche, attraverso la valutazione dell’intensità del colore prodotto in risposta alla conversione enzimatica del relativo substrato cromogeno.• La reale concentrazione dell’antigene viene determinata per confronto con diluizioni standard dell’antigene stesso.

RadioimmunologiaR.I.A. Radio Immuno Assay

Sono tecniche in cui la reazione antigene anticorpo è evidenziata da un isotoporadioattivo. La radioattività prodotta viene misurata con appositi strumenti. Questatecnica si utilizza nella determinazione della concentrazione degli ormoni.

L' isotopo è ciascuno degli atomi di unostesso elemento, con lo stesso numeroatomico ma con differente numero dimassa. Possiedono lo stesso numero diprotoni ed elettroni (quindi proprietàchimiche uguali) ma un diverso numero dineutroni (quindi proprietà fisiche diverse).

Western blot

• Separazione degli antigeni su gel dipoliacrilammide in base al pesomolecolare (elettroforesi)

• Trasferimento degli antigeni (bandeelettroforetiche) su membrana dinitrocellulosa

• Incubazione degli antigeni conl’anticorpo specifico

• Esposizione ad un anticorposecondario (anti-anticorpo primario)marcato con un enzima (perossidasi)

•La formazione di immunocomplessi (equindi la presenza dell’antigenericercato) viene evidenziatadall’aggiunta di un substrato sul qualeagisce l’enzima, che provoca laprecipitazione di colorante.

Isolamento, identificazione e tipizzazione dei

virus

Coltivazione dei virus animali

Essendo PARASSITI ENDOCELLULARI OBBLIGATI i virus devono:

• entrare in contatto (aderire)

• penetrare in una cellula ospite dentro la quale si possa svolgere il loro ciclo replicativo

Cellula sensibile e permissiva

cellule sensibili (suscettibili)possono essere infettate da undeterminato virus; sono provvistedi idonei recettori

cellule permissiveconsentono un ciclo di replicazionevirale completo (infezioneproduttiva)

Coltivazione dei virus animali

• Nell’animale (conigli, topi furetti, piccoli roditori)

• Nelle uova embrionate di pollo

• Nelle colture cellulari

coltivazione dei virus in colture cellulari

allestimento delle colture in vitro

inoculazione del campione

incubazione

Valutazione della crescita del virusnelle colture

identificazionetitolazione

Valutazione della crescita del virusnelle colture cellulari

Effetti dello sviluppo del virus• ECP (+/- specifico)

• Emoadsorbimento

• Emoagglutinazione

• ………………………………

Necessità di test di identificazione del virus:• inibizione dell’emoagglutinazione, neutralizzazione, IEA,

IF, metodi molecolari

Valutazione della moltiplicazione viralein colture in vitro

esame microscopico diretto (microscopio ottico)

effetto citopatico (CPE)

• degenerazione cellulare• formazione di cellule multinucleate o sincizi• formazione di inclusioni

• il tipo di CPE• il tempo della comparsa• la velocità di progressione

dipendono dal tipo di celluleinfettante e dal tipo di virusinfettante

Cpe (effetto citopatico)

Degenerazione cellulare (lisi delle cellule)

Cellule VERO infettate con poliovirus

Fusione delle membrane delle cellule adiacenti formazione di cellule multinucleate o sincizi

HSVLinee cellulari: HEK, HEP-2, KB, NCIH292,VeroTempo di comparsa: HSV 1: 1-2 giorniHSV 2: più lentoTipo di CPE: cellule giganti, multinucleate

Cpe (effetto citopatico)

Inclusioni cellulari

Colorazione, osservazione microscopica

• Localizzazione

• nucleo (adenovirus, herpesvirus)

• citoplasma (virus della rabbia, poxvirus, reovirus)

• entrambi (CMV, paramyxovirus)

• Tipo

• ammassi di virioni (papovavirus)

• viroplasma (poxvirus)

• materiale cellulare alterato (adenovirus)

dimostrazione della moltiplicazionevirale in colture in vitro

emoagglutinazione

Sospensione di globuli rossi

Sospensione di globuli rossi + surnatante colturale

emoadsorbimento

Cellule infettate +

sospensione di globuli rossi

Identificazione e tipizzazione dei virus

effetto citopatico (CPE) +/-

caratteristiche antigeniche

• fissazione del complemento• neutralizzazione• inibizione dell’emoagglutinazione• immunofluorescenza (IFA)• test immunoenzimatici (EIA)

sequenza genomica• ibridazione con sonde molecolari• reazioni di amplificazione