DIAGNÓSTICO LABORATORIAL

HIV

Dra. Gabriela CantilloPATÓLOGA CLÍNICA

INTRODUCCIÓN

Síndrome Inmunodeficiencia Adquirida causado virus transmiten:

a) Contacto sexual

b) Exposición a sangre contaminada

c) Hemoderivados

d) Transmitido de madre infectada al feto, durante embarazo o parto. ORIGEN DEL HIV

Virus se transmitió al humano por zoonosis, especies de monos africanos.

Existen dos virus bien diferenciados: VIH-1 VIH-2

ESTRUCTURA DEL VIRUS

CÓMO ACTÚA EL VIRUS

1. Enlace y Fusión

2. Transcriptasa Inversa

3. Integración

4. Transcripción

5. Ensamblaje

6. Gemación

DIAGNÓSTICO

MÉTODOS INDIRECTOS

a. Pruebas de Screening Serológicas:

Técnicas Inmunoenzimáticas Inmunocromatográficas Aglutinación

b. Pruebas Confirmatorias:

  Western Blot Inmunofluorescencia Indirecta (IFI) Radioinmunoprecipitación (RIPA) Inmunoensayo Lineal (LIA)

MÉTODOS DIRECTOS

Cultivo Vírico

Detección de Antigenemia (antígeno p24)

Detección molecular de Ácidos Nucleicos

MÉTODOS INDIRECTOS DE SCREENING:

ENZIMOINUNOENSAYO (EIA – ELISA)

EIA 1ª generación: Lisado viral VIH-1 (+falsos positivos)

EIA 2ª generación: Péptidos recombinantes/sintéticos de

VIH-1 y VIH-2 (poca sensibilidad, detectan seroconversión en 6 a 12 semanas después de producirse la infección).

EIA/ELFA 3ª generación:

- Péptidos recombinantes/sintéticos VIH-1 y VIH-2 y Ag.VIH 1 “O”- Detectan anticuerpos (IgG, IgM e IgA)- Reducen el período de ventana a 3 semanas.

EIA/ELFA 4ª generación:

- Péptidos recombinantes/sintéticos VIH-1 y VIH-2 y Ag.VIH-1 “O”- Detectan anticuerpos (IgG, IgM e IgA)- Anticuerpos para detectar Antígeno p24- Reduciendo el período de ventana a 2 semanas- Sensibilidad del 100% y especificidad del 99,7%.

PROCEDIMIENTO

INMUNOCROMATOGRAFÍA

Método indirecto cualitativo

Detección de todos los anticuerpos de tipo (IgG, IgM, IgA) específicos para HIV-1 incluyendo subtipo O y HIV-2 (tercera Generación)

Antígeno p24 (cuarta Generación)

Suero, plasma o sangre total

Tercera Generación: S: 100% y E: 99,3%

Cuarta Generación: S: 100% y E: 99,88%

MÉTODOS INDIRECTOS CONFIRMATORIOS

WESTERN BLOT

La metodología: electroforesis en gel en función al peso molecular de las proteínas víricas

Si el suero del paciente posee anticuerpos frente a una proteína se produce una banda coloreada

Detecta anticuerpos frente a:

a) glicoproteínas de envoltura gp160, gp120 y gp41,

b) glicoproteínas las codificadas por el gen gag p55, p24 y p17

c) las proteínas enzimáticas p66, p51 y p31

INTERPRETACIÓN

- Positivo- Negativo- Indeterminado

Causas resultados Indeterminados:

- Seroconversión reciente- RN de madres seropositivas- Enfermedad avanzada o deterioro inmunológico- Enfermedades autoinmunes- Embarazadas

En estos casos se recomienda control en 30 días.

 

INTERPRETACIÓN

CAUSAS DE FALSOS POSITIVOS EN LAS PRUEBAS SÉRICAS DE DETECCIÓN DE ANTICUERPOS ANTI VIH

RELATIVAS AL SUERO:

Congelaciones y descongelaciones repetidas

Almacenamiento a temperatura subóptima

Aspecto lipídico o turbio del suero

Contaminación microbiana

Sueros tratados con calor (mayores o iguales a 60ºC)

Errores de extracción o identificación

RELATIVAS A LA PRESENCIA DE ANTICUERPOS

Personas con anticuerpos anti-HLA – DR4,

DQw3

Enfermedades reumatoideas

Lupus eritematoso

Multitrasfundidos

Transplantados renales

Multíparas

RELATIVAS A OTRAS CONDICIONES:

Hemodializados, fracaso renal crónico

Síndrome de Stevens – Johnson

Administración previa de inmunoglobulinas

Sueros postvacunales (gripe, Hepatitis B)

Infecciones agudas por virus DNA

Enfermedad hepática alcohólica grave

CAUSAS DE FALSOS NEGATIVOS EN LAS PRUEBAS SÉRICAS DE DETECCIÓN DE ANTICUERPOS ANTI VIH

Periodo Ventana que precede a la aparición de anticuerpos Tratamiento inmunosupresor prolongado Transplante de médula ósea Disfunciones de los linfocitos B Plasmaféresis Exanguíneotransfusión Neoplasias Errores de extracción o identificación Fallos en el principio técnico o en el proceso de fabricación del

equipo diagnóstico Respuestas anómalas ante la infección de VIH

MÉTODOS DIRECTOS

CULTIVO VIRAL:

Indicaciones

Infección pediátrica. Infección silente (“período ventana”). Estudios de epidemiología molecular. Estudios de sensibilidad a los antirretrovirales (fenotipo) Caracterización biológica de las cepas (tropismo, sincitiales, etc.)

Desventajas

Sensibilidad variable (generalmente baja). Técnica laboriosa

DETECCIÓN DE ANTIGENEMIA (ANTÍGENO p24):

El antígeno p24 de la cápside del VIH (core) Detectado en suero o plasma mediante una reacción de EIA Es un marcador precoz de infección aguda por VIH.

DETECCIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS:

Técnicas de diagnóstico genético.

Hibridación simple (dot-blot, hibridación in situ). Amplificación por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y variantes: RT-PCR, nested PCR, in situ-PCR, competitive PCR, etc. Amplificación isotérmica con RNasa H (NASBA).

Indicaciones.

Diagnóstico perinatal Individuos con patrón serológico indeterminado. Infecciones silentes (“periodo ventana”).

Algoritmo para el diagnóstico serológico de la infección por VIH

Técnicas de TamizajeNo Reactivoinformar

Reactivo

Laboratorio Periférico

Banco de Sangre

Laboratorio de Referencia2 Técnicas de Tamizaje

Distinta Configuración antigénica

No Reactivo(-/ -)informar

Reactivo(+/ +)

Discordante(+/ -)

WESTERN BLOT

Positivo Indeterminado NegativoINFORMAR

Repetir serología en 30 días

SEGUIMIENTO DE PACIENTES VIVIENDO CON HIV/SIDA

RECUENTO DE CÉLULAS CD4

-Una vez diagnosticado el paciente: exámenes complementarios- Recuento de Células T CD4 (glóbulos blancos)-Consiste en medición del # de células CD4 en un milímetro cúbico de sangre (mm3).-El recuento de células CD4 de una persona no infectada por VIH: 450 a 1.600. -El recuento de CD4 también varía: estrés, el fumar, ciclo

menstrual, actividad física reciente, la hora del día y otras enfermedades.-También permite conocer el # de linfocitos T CD8 y lintocitos T

CD3. - La relación de CD4/CD8 es de 2:1.- Se emplea la técnica de citometría de flujo.

Su recuento es importante para:

Evaluar el estado inmunológico Indicación de inicio de TARV

Evaluar eficacia TARV

Indicación de profilaxis

Suspensión de profilaxis

Monitoreo de evolución sin TARV

PARAMETROS DEL RECUENTO DE CELULAS CD4/CD8

Superiores a 500 células CD4+: (Buen estado de salud) Entre 200 y 500 células CD4+: Incrementa riesgo de Herpes, Infecciones en piel, Infecciones pulmonares, TB, Enfermedades Oportunistas, Neumonía por Pneumocistis carini, Citomegalovirus Entre 50 y 200 células CD4+: Se incrementa el riesgo por otras enfermedades oportunistas. Se recomienda ya el tratamiento preventivo

Inferiores a 100: Considerar el tratamiento preventivo para enfermedades oportunistas e infecciones masivas por hongos. Inferiores a 50 células CD4+: Se incrementa riesgo de enfermedades oportunistas. Continuar con terapias preventivas.

CARGA VIRAL

-Las pruebas de carga viral miden la cantidad de material genético del VIH en sangre mediante técnicas moleculares.

-Los resultados de una prueba de carga viral se expresan como el número de copias de ARN del VIH en un mililitro de sangre

-Es importante su determinación para:

1.iniciar el tratamiento

2.evaluar el tratamiento

3.efectuar cambios en el mismo, conjuntamente con los valores

del recuento de los linfocitos T CD4.

CARGA VIRAL (COPIAS/ML) MENOR 500

501 - 3000 3.001 – 10.000 10.001 – 30.000 MAYOR 30.000

PROBABILIDAD DESARROLLAR SIDA (%)

5,4 16,6 31,7 55,2 80,0

PROBABILIDAD DE MORIR (%) 0,9 6,3 18,1 34,9 69,5

UTILIZACIÓN DE LA CARGA VIRAL PARA PREDECIR EL CURSO DE LA ENFERMEDAD

DIAGNÓSTICO DE LA INFECCIÓN PERINATAL

-Transferencia pasiva de anticuerpos de la madre al recién nacido (IgG) y permanece en sangre del niño hasta 18 meses de edad.

- Niños < 18 meses: necesidad de métodos directos.

a)PCR detectar ADN genoma vírico (sensibilidad 100%) mes edad.

b)Cultivo viral (complicado)

c) Antigenemia (baja sensibilidad)

d)Carga viral (puede dar falsos positivos)

-Métodos Indirectos:

a) Determinar mediante EIA, IgM e IgA para el virus.

GRACIAS