Determinaciones en Leche

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Determinaciones en leche por potenciometría, espectrofotometría y cromatografía.

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  • MTODOS

    ANALTICOS EN LECHE

    Final Qumica Analtica

    Julio de 2014

    Giusiano, Marcela - Rodrguez, Marcela

    UTN frvm

  • POTENCIOMETRA

    Los mtodos potenciomtricos de anlisis se basan en la medida del potencial de celdas electroqumicas sin paso de corriente apreciable. En base a ello, se puede utilizar la potenciometra para determinar puntos finales de valoraciones. Ms recientemente, las concentraciones inicas selectivas se miden a travs del uso de electrodos de membrana diseados especficamente. La potenciometra es una tcnica electroanaltica con la que se puede determinar la concentracin de una especie electroactiva en una disolucin empleando un electrodo de referencia (un electrodo con un potencial constante con el tiempo y conocido) y un electrodo de trabajo (un electrodo sensible a la especie electroactiva). Mediante el siguiente diagrama que describe una celda tpica para estudios potenciomtricos, se detallarn cada una de las partes en un equipo de potenciometra y sus funciones. Todas las pilas tienen lugar a una transferencia de energa. Este movimiento conduce a la produccin de una corriente elctrica a travs del circuito conectado a la batera.

    Los dos vasos y sus contenidos son semipilas. El circuito que conecta los 2 electrodos est formado por un cable, un interruptor (para cerrar y abrir el circuito) y un aparato de medida (que seala el paso de la corriente elctrica a travs del circuito). Las dos disoluciones se conectan mediante un puente salino. Este puente est formado por un tubo de vidrio cerrado parcialmente en sus dos extremos con un material poroso, tal como lana de vidrio, rellena de una disolucin salina.

    Cuando se abre el interruptor no se producen reacciones en ninguna de las semipilas. Cuando se cierra, se producen reacciones en las superficies de ambos electrodos, los

  • electrones fluyen a travs del cable y el aparato de medida registra un voltaje. Las reacciones que tienen lugar en los electrodos son:

    Oxidacin: Zn Zn2+ + 2e- Reduccin: Ag+ + e- Ag El puente salino mantiene la electroneutralidad de las dos disoluciones. Para equilibrar la acumulacin de cargas en los vasos, los iones del puente salino se

    desplazan de un vaso al otro, movindose los iones positivos de izquierda a derecha y los negativos de derecha a izquierda. La reaccin total de la pila se describe:

    Zn + 2 Ag+ Zn2+ + 2Ag

    El diagrama de funcionamiento de la celda sera el siguiente:

    Una celda para la medida de pH consiste en un par de electrodos, la pila es una continuacin de dos semipilas:

    Electrodo de referencia Da origen a un potencial constante en el tiempo con independencia de la concentracin

    de iones H y retorna a su potencial original despus de haber estado sometido a corrientes pequeas.

  • Electrodo de Hidrgeno

    Pt|H2(g)(1atm)|H+ (1M)

    E= 0.00 Electrodos de calomelanos

    Hg|Hg2Cl2(s)|KCl (concentrac. Conocida) Hg2Cl2(s) + 2e

    - 2Hg(l) + 2Cl

    Electrodo de calomelanos saturado (ECS) Tiene coeficiente de temperatura mayor. El potencial del electrodo de calomelanos saturado a 25 C es 0,2413 V.

    Electrodos de plata/cloruro de plata

    AgCl(s) + e Ag(s) + Cl

    - Es el electrodo de referencia ms ampliamente comercializado.

  • Est formado por un electrodo de saturado con ClAg y sumergido en KCl. Alambre de plata recubierto parcialmente por una pelcula de cloruro de plata. La concentracin de cloruros est fijada por la solubilidad del cloruro de plata Pueden utilizarse a temperaturas superiores a 60 C.

    Electrodo de medida o indicador Responde de forma rpida y reproducible a los cambios de concentracin del in

    analito.

    Los tipos son: Metlicos

    Pueden clasificarse en: Electrodos de primera clase.

    Electrodos de segunda clase.

    Electrodos de tercera clase.

    Electrodos redox.

    De Membrana

    Se denominan electrodos selectivos de iones. Tienen mnima solubilidad, onductividad elctrica, reactividad selectiva con el analito Fuerza electromotriz, FEM

    La fem es una medida e la carga sobre la superficie del electrodo o consecuencia de la presencia de un exceso o una diferencia de e-. se mide en volteos (volt) o milivolteos.

    - 2

    -

    -

    0.059 [Ag][Cl ]E =E- log( )

    2 [AgCl]

    E =E - 0.059 log([Cl ])

    E = 0.222 - 0.059 log([Cl ])

  • La fem de cualquier semireaccion puede expresarse como tal cuando tiene lugar como semiraccin de la reduccin o bien como la fem de la semireaccin considerada como una oxidacin. La ecuacin de Nernts

    La ecuacin de Nernst se utiliza para calcular el potencial de reduccin de un electrodo fuera de las condiciones estndar (concentracin 1 M, presin de 1 atm, temperatura de 298 K 25 C).

    La siguiente reaccin es una ecuacin general para una reaccin de oxido-reduccin.

    aA + bB cC + dD

    El efecto de las concentraciones de los productos y de los reactivos viene dado por la ecuacin de Nernst:

    E=E0 0,059 * log [C]c * [D]d n [A]a * [B]b

    0,059: valor numrico de una combinacin de factores, uno de los cuales es la temperatura. n: numero de electrones tranferidos en la reaccin general de redox. E0: reaccin o semireaccin en sentido en que aparezca escrita.

    pH-metro Es un aparato de medida formado por una pila voltaica y un dispositivo para medir la

    fem producida por la pila. Nos permite medir la concentracin de iones H midiendo la fem producida por la pila.

    Para medidas de pH se usa el electrodo de vidrio en conjunto con un electrodo de referencia, generalmente calomelanos o cloruro de plata, sumergidos en la disolucin de la que queremos medir el pH. El bulbo sensible, que es el extremo sensible del electrodo, est formado por un vidrio polarizable (vidrio sensible de pH). Este electrodo desarrolla un potencial en caso que la concentracin protones de H sea diferente de las disoluciones que estn en contacto con las paredes del vidrio.

    El contacto elctrico entre dos pilas se consigue mediante un tapn poroso situado en el electrodo de referencia.

    Se llena el bulbo con la solucin de cido clorhdrico 0.1M saturado con cloruro de plata. El voltaje en el interior del bulbo es constante, porque se mantiene su pH constante (pH 7) de manera que la diferencia de potencial solo depende del pH del medio externo.

    El alambre que se sumerge al interior (normalmente Ag/AgCl) permite conducir este potencial hasta un amplificador.

  • Errores que afectan a las mediciones de pH con electrodo de vidrio Error Alcalino: Los electrodos de vidrio ordinarios se vuelven sensibles a los materiales

    alcalinos con valor de pH mayores a 9. Error cido: El electrodo de vidrio tpico exhibe un error, de signo opuesto al error

    alcalino, en soluciones de pH menor de aproximadamente 0,5. Como consecuencia, las lecturas del pH tienden a ser demasiado elevadas en esta regin. La magnitud del error depende de una variedad de factores y generalmente no es muy reproducible. Las causas del error cido no se comprenden bien.

    Temperatura: La medicin de pH varia con la temperatura, esta variacin puede compensarse.

    Deshidratacin. Errores en las disoluciones con fuerzas inicas bajas. Variacin en el potencial de unin.

    DETERMINACIN DEL pH La determinacin de pH consiste en medir el potencial que se desarrolla a travs de una

    fina membrana de vidrio que separa dos soluciones con diferente concentracin de protones. Mtodo

    1. Objeto. Esta tcnica describe la medida potenciomtrica del pH (acidez inica). Determina concentracin de protones en el medio. pH=-log [H]

    2. Material y aparatos pH-metro con electrodo de vidrio. Sensibilidad 0,05 unidades de pH.

    3. Reactivos.

    Solucin tampn de referencia a pH=7. Solucin tampn de referencia a pH=4. Solucin de limpieza: agua destilada

    4. Procedimiento.

    PREPARACIN DE SOLUCIONES BUFFER.

    Buffer pH 4 (Solucin buffer de CH3COOH/CH3COONa) Se coloca en vaso de precipitado acetato de sodio (2,05gr) y cido actico, adicionar

    el 80% de agua destilada del volumen de solucin a preparar. Llevar al agitador

    magntico para agitar la solucin hasta que se vea homognea. Esperar unos

    minutos. Medir el pH con pH-metro. Si no corresponde exactamente al

    requerido, sin dejar de agitar y medir el pH, agregue el acido o base de ajuste

    de pH, para obtener lo ptimo.

  • Buffer pH 7 (Solucin buffer de fosfato de potasio) Se coloca en vaso de precipitado KH2PO4 (1,3239 gr) y K2HPO2 (1,6425 gr),

    adicionar el 80% de agua destilada del volumen de solucin a preparar. Llevar al

    agitador magntico para agitar la solucin hasta que se vea homognea. Esperar

    unos minutos. Medir el pH con pH-metro. Si no corresponde exactamente al

    requerido, sin dejar de agitar y medir el pH, agregue el acido o base de ajuste de pH,

    para obtener lo ptimo.

    PREPARACIN DE LA MUESTRA. Antes del anlisis poner la muestra a 202 C y mezclarla cuidadosamente. Si no se obtiene una dispersin homognea de la materia grasa, calentar nuevamente la muestra a 40C mezclar nuevamente y enfriarla de nuevo a 202C. DETERMINACIN.

    Calibrar el pH-metro con la ayuda de las dos soluciones tampn de referencia. o Colocar en el buffer 7 y calibrar display 7. o Lavar con agua destilada. o Colocar en el buffer 4 y calibrar display 4.

    Medir el pH.

    5. Expresin de los resultados. Leer directamente el valor del pH sobre la escala graduada del potencimetro. Los resultados se expresan en unidades de pH, a 20C, segn la forma: pH a 20C=x,xx (la segunda cifra decimal es 0 5).

    6. Precisin. La diferencia mxima entre dos determinaciones sucesivas debe ser de 0,1 unidades de pH.

    7. Parmetros 6,6 6,8

    Aplicacin. Se determina por medida directa con pH-metro el valor de pH de la muestra de leche. Resultados: pH = 6,71

  • ACIDEZ La leche fresca contiene muy poco cido lctico. Bajo la influencia de algunos

    microorganismos, la lactosa presente en la leche se convierte en cido lctico, y por lo tanto se acidifica. (La leche, adems del cido lctico contiene cantidades pequeas de otros cidos, stos tambin quedan neutralizados en el proceso del mtodo, pero calcularemos los resultados como si nicamente estuviera presente el cido lctico).

    El grado de acidez de la leche determina su comportamiento y las propiedades de sus derivados.

    DETERMINACIN DE ACIDEZ

    Para esta determinacin podemos aplicar dos mtodos:

    Titulacin cido-Base. Mtodo

    1. Principio Se entiende por acidez en las leches natural, certificada, higienizada y esterilizada,

    el contenido aparente de cido, determinado por el procedimiento expuesto a continuacin. Un determinado volumen de leche se valora con solucin de sosa, empleando

    solucin de fenolftalena y luego se expresa el resultado en grados Dornic (D)

    2. Material y aparatos Bureta graduada cada 0,05 mililitros o cada 0,1 mililitros que permita apreciar la

    semidivisin. Portabureta. Vaso de precipitado o erlenmeyer.

    3. Reactivos

    Solucin 0,11M de hidrxido sdico (NaOH). Indicador: 0,5 mililitros de una solucin de fenolftalena al 1 %.

    4. Procedimiento

    PREPARACIN DE LA MUESTRA. Antes del anlisis poner la muestra a 202 C y mezclarla cuidadosamente. Si no se obtiene una dispersin homognea de la materia grasa, calentar nuevamente la muestra a 40C mezclar nuevamente y enfriarla de nuevo a 202C. DETERMINACIN.

    Se determina volumtricamente operando sobre 10 mililitros de leche con solucin 0,11M de NaOH. Como indicador se emplean 0,5 mililitros de solucin alcohlica de fenolftalena al 1 por 100. Dar por terminada la valoracin cuando aparece una coloracin rosa fcilmente perceptible por comparacin con un testigo tomado de la misma leche. Dicha coloracin desaparece progresivamente, pero se considera obtenido el viraje cuando el tinte rosa persiste durante unos 10 segundos.

  • 5. Expresin de los resultados. Los resultados se expresan en D, cada 0,1 ml de NaOH gastado equivale a 1D.

    6. Parmetros. 14D 18D

    Aplicacin. Valoracin de cido dbil (cido lctico) con base fuerte (hidrxido de sodio)

    Valoramos una muestra de 10 ml de leche que contiene cido lctico con NaOH 0,11M. Para alcanzar el punto final determinado por indicador se gastaron 1,6 ml de titulante, con este valor calculamos la concentracin de cido lctico.

    mmoles de base = mmoles de cido 1,6ml*0,11M = 10ml*Ccido Ccido = 0,0176M La reaccin de valoracin es NaOH + C3H6O3(ac) C3H5O3Na + H2O Equilibrios involucrados

    H2O --------> H+ + OH-

    HL H+ + L-

    NaOH -----> OH- + Na+

    Clculos

    Los clculos de valoracin para este ejemplo se hacen de cuatro formas distintas segn la regin de la curva de valoracin:

    1. Antes de que se aada base, la disolucin contiene nicamente HL en leche. ste es un cido dbil, cuyo pH queda determinado por el equilibrio

    Ka

    HL H+ + L-

    2. A partir de la primera adicin de NaOH hasta inmediatamente antes del punto de equivalencia, hay una mezcla de HL sin reaccionar y L- producido por la reaccin de valoracin.

    3. En el punto de equivalencia, todo el HL se ha convertido en L-. 4. Despus del punto de equivalencia, se aade un exceso de NaOH a una disolucin

    de A-. como buena aproximacin, el pH est determinado por la base fuerte.

  • Resultados 1,6 ml NaOH = 16D

  • Valoracin Potenciomtrica.

    Mtodo 1. Principio

    Este mtodo sigue el transcurso de una valoracin cido-base con un pH-metro. El aparato elimina la necesidad de un indicador visual, puesto que el punto de equivalencia de la reaccin se determina construyendo una grfica del pH (medido con el pH-metro) en funcin de los ml de disolucin valorada aadidos (medidos con la bureta). Cuando la curva alcanza el punto de mxima pendiente, se ha alcanzado el punto

    final de la valoracin. Se realiza la titulacin potenciometrica para encontrar el valor exacto en el cual se

    produce el punto de equivalencia de la titulacin y por ende la acidez verdadera.

    2. Material y aparatos Bureta graduada cada 0,05 mililitros o cada 0,1 mililitros que permita apreciar la

    semidivisin. Portabureta. Vaso de precipitado o erlenmeyer. pH-metro

    3. Reactivos

    Solucin 0,11M de hidrxido sdico (NaOH).

    4. Procedimiento PREPARACIN DE LA MUESTRA.

    Antes del anlisis poner la muestra a 202 C y mezclarla cuidadosamente. Si no se obtiene una dispersin homognea de la materia grasa, calentar nuevamente la muestra a 40C mezclar nuevamente y enfriarla de nuevo a 202C.

    DETERMINACIN.

    Calibrar el pH-metro con la ayuda de las dos soluciones tampn de referencia. o Colocar en el buffer 7 y calibrar display 7. o Lavar con agua destilada. o Colocar en el buffer 4 y calibrar display 4.

    Colocar 5 ml de una alcuota de la muestra en un vaso de precipitado. Aadir 100 ml de agua.

    Introducir un par de electrodos vidrio-calomenanos (o combinado) en la disolucin.

    Introducir un agitador magntico en el vaso y ajustar la altura de los electrodos de modo que la barra del agitador no pueda tocar a los electrodos.

    Poner en marcha el agitador y el pH-metro.

    Valorar la disolucin con la solucin de NaOH. Tomar una lectura por cada ml o cada vez que el aparato seale una variacin de 0,2 unidades, segn lo que suceda antes.

  • Construir una grfica del pH (eje vertical) frente a ml de base aadida (eje horizontal).

    Determinar los ml de NaOH necesarios para alcanzar el punto final.

    5. Expresin de los resultados. Los resultados se expresan en D, cada 0,1 ml de NaOH gastado equivale a 1D. Pueden utilizarse varios procedimientos para determinar el punto final de una valoracin potenciomtrica.

    El ms directo consiste en una grfica directa del potencial en funcin del volumen del reactivo. Se estima visualmente el punto de inflexin en la parte casi vertical de la curva y se lo escoge como punto final.

    El segundo enfoque para detectar el punto final es calcular el cambio de pH por volumen unitario de valorante (es decir, pH/V), lo cual equivale a estimar la primera derivada numrica de la curva de valoracin. Una grafica de los datos de la primera derivada en funcin del volumen medio produce una curva con un mximo que corresponde al punto de inflexin, el punto final.

    El tercer procedimiento utiliza la segunda derivada. El punto en el que la segunda derivada cruza el cero es el punto de inflexin, que se toma como punto final de la valoracin y se puede localizar de manera muy precisa.

    6. Parmetros. 14D 18D

    Aplicacin. Valoracin Potenciomtrica

    1 derivada 2 derivada

    V (ml NaOH) pH pH/ (pH/)/

    0 2,81

    0,2 3,1 0,1 2,9

    0,4 3,39 0,3 1,45 -7,25

    0,6 3,63 0,5 1,2 -1,25

    0,8 3,86 0,7 1,15 -0,25

    1 4,03 0,9 0,85 -1,5

    1,2 4,33 1,1 1,5 3,25

    1,3 4,45 1,25 1,2 -2

    1,4 4,67 1,35 2,2 10

    1,5 5,01 1,45 3,4 12

    1,6 7,98 1,55 29,7 263

    1,7 10,95 1,65 29,7 4,61853E-13

    1,8 11,24 1,75 2,9 -268

    1,9 11,41 1,85 1,7 -12

    2 11,55 1,95 1,4 -3

    2,2 11,73 2,1 0,9 -3,333333333

    2,4 11,84 2,3 0,55 -1,75

    2,6 11,92 2,5 0,4 -0,75

    2,8 12,1 2,7 0,9 2,5

    3 12,05 2,9 -0,25 -5,75

  • Grfica directa del potencial en funcin del volumen del reactivo

    Grfica primer derivada

    Grfica segunda derivada

    0

    2

    4

    6

    8

    10

    12

    14

    0 0,4 0,8 1,2 1,4 1,6 1,8 2 2,4 2,8

    pH

    V (ml NaOH)

    pH

    -5

    0

    5

    10

    15

    20

    25

    30

    35

    0,1

    0,3

    0,5

    0,7

    0,9

    1,1

    1,2

    5

    1,3

    5

    1,4

    5

    1,5

    5

    1,6

    5

    1,7

    5

    1,8

    5

    1,9

    5

    2,1

    2,3

    2,5

    2,7

    2,9

    pH/

    V (ml NaOH)

    1 Derivada

    -300

    -200

    -100

    0

    100

    200

    300

    0,3 0,7 1,1 1,35 1,55 1,75 1,95 2,3 2,7

    (pH/

    )/

    V (ml NaOH)

    2 Derivada

  • Resultados 1,6 ml NaOH = 16D

    Conclusin

    El mtodo ms exacto para la determinacin del punto final de una valoracin cido-base es el poteciomtrico. El uso de indicadores visuales trae aparejado un pequeo error.

    Un indicador cido-base, es un cido orgnico o una base orgnica dbil, cuya forma disociada tiene un color distinto que su base o cido conjugado. Estas molculas se pueden utilizar para determinar cundo se ha adicionado la cantidad suficiente de titulante y se les denomina indicadores visuales.

    Como regla general, se debe seleccionar el indicador que cambia de color en un pH aproximado al punto de equivalencia de la titulacin.

    El punto final es el punto en el que finaliza la valoracin, y se determina mediante el uso

    de un indicador. Idealmente es el mismo volumen que en el punto de equivalencia (el nmero de moles de valorante aadido es igual al nmero de moles de analito).

    Debido a la naturaleza logartmica de la curva de pH, las transiciones en el punto final son muy rpidas; y entonces, una simple gota puede cambiar el pH de modo muy significativo y provocar un cambio de color en el indicador. Hay una ligera diferencia entre el cambio de color del indicador y el punto de equivalencia de la titulacin o valoracin. Este error se denomina error del indicador.

    Errores debido al indicador Existen por lo menos dos fuente de error al determinar el punto final de una titulacin

    utilizando indicadores visuales. Uno de ellos ocurre cuando el indicador que se utiliza no cambia de color en el pH adecuado. Este es un error determinado que se puede corregir por medio de la determinacin del indicador en blanco.

    El segundo tipo es un error indeterminado que se origina por la limitada capacidad del ojo humano para distinguir de manera reproducible el color intermedio de indicador. La incertidumbre visual del observador medio con un indicador acido-base se sita en el intrvalo de +- 0.5 a 1+- unidades de pH.

  • ESPECTROFOTOMETRA

    MTODOS ESPECTROSCPICOS DE ANLISIS

    Los mtodos espectroscpicos de anlisis se basan en la medicin de la radiacin electromagntica emitida o absorbida por los analitos.

    Los mtodos de emisin utilizan radiacin emitida cuando un analito es excitado por

    energa trmica, elctrica o radiante. A diferencia de los anteriores, los mtodos de absorcin se basan en la disminucin de

    la potencia de un haz de radiacin electromagntica como consecuencia de su interaccin con el analito.

    Los mtodos espectroscpicos se clasifican segn la regin del espectro

    electromagntico que se utiliza. stas regiones incluyen rayos X, ultravioleta, visible, infrarrojo, microondas y radiofrecuencias.

    La radiacin electromagntica es una forma de energa que se transmite por el espacio a

    velocidades muy altas. Se debe considerar como un flujo de partculas discretas o paquetes ondulatorios de energa (fotones o cuantos). Espectro Electromagntico

    Se denomina espectro electromagntico o espectro a la radiacin electromagntica que emite o absorbe una sustancia.

    El espectro electromagntico se extiende desde la radiacin de menor longitud de onda, como los rayos gamma y los rayos X, pasando por la luz ultravioleta, la luz visible y los rayos infrarrojos, hasta las ondas electromagnticas de mayor longitud de onda, como son las ondas de radio. Abarca un intervalo muy amplio de longitudes de onda.

  • Componentes de instrumentos que se emplean en la espectroscopa ptica La mayora de los instrumentos espectroscpicos incluyen cinco componentes:

    1. Fuente estable de energa radiante. 2. Selector de longitud de onda que asla una regin limitada del espectro para la

    medicin. 3. Uno o ms recipientes para la muestra. 4. Detector de radiacin, que convierte la energa radiante en una seal medible. 5. Un sistema que procesa y lee la seal, y la visualiza en una escala de medida, en la

    pantalla de un osciloscopio, en un medidor digital o en un registrador grfico.

    Espectro de absorcin El espectro de absorcin de un material muestra la fraccin de la radiacin electromagntica incidente que un material absorbe dentro de un rango de frecuencias. Cada elemento qumico posee lneas de absorcin en algunas longitudes de onda; hecho que est asociado a las diferencias de energa de sus distintos orbitales atmicos. Se emplea el espectro de absorcin para identificar los elementos componentes de algunas muestras. Fuentes de radiacin Existen fuentes de radiacin continuas y de lnea. Las primeras emiten una radiacin cuya intensidad vara slo de manera gradual con la longitud de onda. Las fuentes de lnea emiten un nmero restringido de bandas de radiacin, cada una de las cuales abarca un margen muy reducido de longitud de onda. Espectroscopa infrarroja (IR) Es la rama de la espectroscopa que trata con la parte infrarroja del espectro electromagntico. sta cubre un conjunto de tcnicas, siendo la ms comn una forma de especttroscopa de absorcin.

  • Puede usarse para identificar un compuesto e investigar la composicin de una muestra. ste mtodo se basa en el hecho de que las molculas tienen frecuencias a las cuales rotan y vibran, es decir, los movimientos de rotacin y vibracin moleculares tienen niveles de energa discretos (modos normales vibracionales). Fuentes continas de radiacin infrarroja La radiacin infrarroja continua produce calentando slidos inertes. El emisor de Nernst es un cilindro de 2 por 20 mm formado de xido de circonio y de itrio, emite radiacin infrarroja cuando se calienta a una temperatura elevada por el paso de corriente elctrica.

    DETERMINACIN SIMULTNEA DE MATERIA GRASA, PROTENAS Y

    LACTOSA POR ESPECTROSCOPA INFRARROJA.

    Mtodo

    1. Principio El principio del mtodo de anlisis por espectroscopa infrarroja radica en que casi todas las sustancias orgnicas se comportan absorbiendo selectivamente ciertas longitudes de onda de la regin infrarroja del espectro, y adems, los grupos funcionales en una molcula son susceptibles de absorber dicha radiacin a una longitud de onda caracterstica que, por lo general, est poco afectada por el resto de la molcula. Luego de la homogeneizacin de la muestra, se mide la cantidad de radiacin infrarroja de diferentes longitudes de onda absorbida por grupos CH en las cadenas de cidos grasos de las molculas de grasa, grupos carbonilos en las uniones steres de las molculas de grasa, por los grupos NH de las uniones peptdicas de las protenas y por los grupos OH en las molculas de lactosa. Un estimado del contenido de cada componente se hace en referencia a la cantidad de luz infrarroja absorbida.

    Los grupos carbonilo de los enlaces ster de los glicridos a, aproximadamente, 5,73 m, o por los grupos CH2, a aproximadamente, 3,48 m en la determinacin del contenido en grasa.

    Los grupos amida secundaria de los enlaces peptdicos a, aproximadamente, 6,46 m para la determinacin del contenido en protenas.

    Los grupos hidroxilo de la lactosa a, aproximadamente, 9,61 m, en la determinacin del contenido de lactosa.

    La medida de la concentracin de cada componente se hace refirindola a la cantidad de luz absorbida. En la prctica, las medidas se hacen usando instrumentos automticos o semiautomticos definidos aparatos de infrarrojo.

  • 2. Campo de aplicacin El mtodo descripto se aplica a la determinacin de grasa, protenas y, como apropiado, lactosa en leche entera.

    3. Definicin Aparatos de infrarrojos: instrumentos de fbrica utilizados bajo condiciones definidas los cuales dan sucesivamente la concentracin de grasa, protenas y lactosa en leche, expresada en gramos del componente por cada 100 gramos de leche.

    4. Caractersticas principales de los aparatos IR Los instrumentos comerciales disponibles pueden tener una o dos celdas; con dos o una banda de ondas por canal (componente). Pueden utilizar un sistema ptico de haz de luz simple o doble, usar un sistema electrnico o un servo sistema para estimar la transmisin de luz. La longitud de onda seleccionada puede ser producida por red de difraccin o por un filtro ptico de referencia. Los instrumentos pueden diferir entre s con respecto al nmero especfico de longitudes de onda disponibles.

    5. Calibracin del aparato

    Ajuste a cada longitud de onda de la seal del aparato, de forma que, a cada nivel de concentracin del componente que se est midiendo la lectura del aparato se acerque lo ms posible al valor dado por el mtodo de referencia. Puesto que los aparatos de anlisis por IR tienen diferentes sistemas de calibracin, no se puede dar un procedimiento especfico. El fabricante debe suministrar al laboratorio los medios para ajustar el instrumento con el fin de cumplir con los requisitos.

    6. Procedimiento ALMACENAMIENTO DE LAS MUESTRAS A ANALIZAR:

    Las muestras se almacenan en recipientes de forma y capacidad adecuada y de un material que las proteja adecuadamente. Los materiales convenientes incluyen al vidrio, el acero inoxidable y algunos plsticos (como el polipropileno). Los recipientes y sus cierres estn secos y limpios en el momento de la toma de muestra, el cierre es seguro, no absorbente, resistente a la grasa, previene la entrada de olores, no influye en las propiedades, la composicin, el olor o el sabor de la muestra. Las muestras sin conservantes debern almacenarse en heladera a temperatura entre 0 y 7C durante 2 das como mximo.

  • MTODO DE ENSAYO Este Plan de la Calidad rene la informacin necesaria para realizar el anlisis de determinacin materia grasa, protenas y slidos totales basado en la Norma FIL 141C: vigente. LECHE DE VACA (NORMA FIL 141C: vigente) Esta tcnica describe un mtodo para la determinacin de materia grasa, protenas y slidos totales en leche cruda de vaca y leche cruda de vaca preservada qumicamente.

    DETERMINACIN MATERIA GRASA, PROTENAS Y SLIDOS TOTALES Gua para la operacin de equipos infrarrojos

    EQUIPOS Y MATERIAL DE LABORATORIO:

    Equipo infrarrojo.

    Bao con agua de circulacin capaz de mantener 40C +/- 1C. REACTIVOS:

    Se utilizan concentrados y polvos provistos por el fabricante o representante del equipo, y se preparan siguiendo sus instructivos.

    S-6060 concentrado de cero: 5ml en 5 litros de agua destilada.

    S-470 Cleaning reagent. Reactivo de limpieza: 25 g de polvo en 5 litros de agua destilada.

    Foss clean buffer.

    Foss clean: sn de limpieza enzimtica.

    Foss clean solution: Disolver 0.5 g del foss clean buffer en 500 ml de agua destilada.

    Adicionar 10 ml de Foss clean. CALIBRACIN DEL EQUIPO:

    Se toman un mnimo de 5 muestras de leche cruda de vaca con una concentracin de materia grasa de aproximadamente 2,3% y 5%, y de protenas de 2,5% y 4%. Estas pueden estar constituidas por un set de calibracin. Se analizan las muestras utilizando la metodologa de referencia y por triplicado usando el mtodo instrumental. Las muestras se pasan por el equipo como slope/intercept. Los resultados de referencia se ingresan al equipo manualmente. Comparar los datos de referencia con los medidos por el equipo para proceder a la validacin de la recta de calibracin existente.

  • El resultado obtenido por el pasaje de una muestra por el milkoscan se establece a travs de una combinacin entre una calibracin bsica provista de fbrica y de un ajuste de slope/intercept. El ajuste slope / intercept se aplica a cada uno de los componentes y se describe por medio de la siguiente ecuacin: Resultado final de la medicin = S*(resultado de la calibracin bsica)+Y Donde: S: es el slope Y: es el intercept. La calibracin est validada si se verifica que el valor absoluto de las diferencias algebraicas entre los resultados instrumentales y los resultados de referencia obtenidas del anlisis de n nmero de muestras es menor o igual a 0.14 /n y el desvo estndar de las diferencias numricas es menor o igual a 0.07% para muestras de leche de pool.

    Ajuste de calibracin: Se procede a un ajuste de calibracin si la calibracin existente no cumple con los requerimientos de la validacin. Se toman un mnimo de 5 muestras de leche cruda con una concentracin de materia grasa de aproximadamente 2,3% a 5%, y de protenas de 2,5% a 4%. Estas pueden estar constituidas por un set de calibracin. Se analizan utilizando la metodologa de referencia para dar los resultados Y y por triplicado usando el instrumento para dar los resultados X. Las muestras se pasan por el equipo como slope/intercept. Ingresar los resultados de referencia manualmente. Comparar los datos de referencia con los medidos en modo slope/intercept y se le pide al equipo el clculo de la recta propuesta de ajuste de calibracin. En el caso que se modifique el ajuste de la calibracin, se deber redefinir el valor del material de referencia interno para cada parmetro. El nuevo valor medio se obtendr del promedio de 10 muestras medidas en el tiempo. Luego de un ajuste de calibracin, para validar la primera sesin de trabajo del equipo en la que se realizar la redefinicin o definicin del material de referencia interno, utilizar un material de referencia interno de UAT o muestras de leche cruda utilizadas en la verificacin del ajuste de calibracin. PREPARACIN DE LA MUESTRA:

    La muestra se calienta a 40C +/- 1C por inmersin y mezclar suavemente. PROCEDIMIENTO

    a) Encender el equipo.

    b) Ejecutar ajuste de cero.

  • El equipo ejecuta cinco mediciones con el lquido de cero y toma el promedio. Si est dentro de las especificaciones del cero de fbrica (
  • TIPO DE EQUIPO: MILKOSCAN MINOR FOSS El equipo ayudar a:

    Hacer comprobaciones rpidas y optimizar el tratamiento de la leche.

    Asegurar la calidad mediante la realizacin de comprobaciones en el producto acabado que sale de fbrica.

    QU PUEDE DETERMINARSE?

    PARMETRO LECHE NATA

    Grasa SI SI

    Protena SI SI

    Lactosa SI SI

    Slidos totales SI SI

    Slidos no grasos SI SI

    Descenso crioscpico SI -

    PASOS PARA LA DETERMINACIN EN MILKOSCAN Se debe seleccionar el tipo de producto a analizar y darle comienzo con el botn INICIO. Fcil ajuste de calibracin, presentacin grfica y la posibilidad de archivo de datos mediante PC externo. Opcionalmente se puede conectar directamente al Milkoscan Minor una impresora.

  • 1) Carga de la muestra:

    2) Dar el botn de INICIO:

    3) Esperar el resultado:

  • CROMATOGRAFA

    Es un mtodo analtico empleado ampliamente en la separacin, identificacin y determinacin de los componentes qumicos en mezclas complejas.

    Es un mtodo fsico de separacin basado en la distribucin de los componentes de una mezcla entre dos fases inmiscibles, una fija o estacionaria y otra mvil.

    La muestra se disuelve en una fase mvil, que puede ser un gas, un lquido o un fluido supercrtico. sta fase mvil se hace pasar a travs de una fase estacionaria inmiscible, la cual se mantienen fija en una columna o sobre una superficie slida. Las fases se eligen de tal forma que los componentes de la muestra se distribuyen de modo distinto entre la fase mvil y la fase estacionaria. Aquellos componentes que son retenidos con ms fuerza por la fase estacionaria se mueven lentamente con el flujo; por el contrario los componentes que unen dbilmente a la fase estacionaria, se mueven con rapidez. Como consecuencia de la distinta movilidad, los componentes de la muestra se separan en bandas discriminadas que pueden analizarse cualitativa y/o cuantitativamente.

    Los mtodos cromatogrficos son de dos tipos:

    Cromatografa de columna; donde la fase estacionaria se mantiene dentro de un tubo angosto y la fase mvil es forzada a pasar a travs del tubo bajo presin por gravedad.

    Cromatografa planar; en donde la fase estacionaria est sostenida por una placa plana o en los poros de un papel. En ste caso, la fase mvil se mueve a travs de la fase estacionaria por accin capilar o bajo la influencia de la gravedad.

    Dichos mtodos cromatogrficos tambin pueden clasificarse en tres categoras basadas

    en la naturaleza de la fase mvil. Los tres tipos de fases incluyen lquidos, gases y fluidos superficiales. Existen cinco tipos de cromatografa lquida y tres tipos de cromatografa gaseosa que

    difieren en la naturaleza de la fase estacionaria y los tipos de equilibrio dentro de las fases.

    CLASIFICACIN DE MTODOS CROMATOGRFICOS EN COLUMNA

    Clasificacin general Mtodo especfico Fase estacionaria Tipo de equilibrio

    Cromatografa lquida (CL)

    (fase mvil:lquida)

    Lquido-Lquido o particin

    Lquido adsorbido sobre un slido

    Particin entre lquidos inmiscibles

    Cromatografa lquida (CL)

    (fase mvil:lquida)

    Lquido-Fase unida Especies orgnicas unidas a una sup.

    Slida

    Particin entre lquidos y sup.

    Unida.

    Cromatografa lquida (CL)

    (fase mvil:lquida)

    Lquido-Slido o adsorcin

    Slido Adsorcin

    Cromatografa lquida (CL)

    (fase mvil:lquida)

    Intercambio de iones

    Resina de intercambio inico

    Intercambio inico

  • Cromatografa lquida (CL)

    (fase mvil:lquida)

    Exclusin por tamao

    Lquido en intersticios de un slido polimrico

    Particin/tamizado

    Cromatografa gaseosa (CG) (fase

    mvil:gas)

    Gas-Lquido Lquido adsorbido sobre un slido

    Particin entre gas y lquido

    Cromatografa gaseosa (CG) (fase mvil:gas)

    Gas-Fase unida Especies orgnicas unidas a una sup.

    Slida

    Particin entre lquido y sup. Unida

    Cromatografa gaseosa (CG) (fase mvil:gas)

    Gas-Slido Slido Adsorcin

    Cromatografa fluida (CFS)

    (fase mvil:fluido supercrtico)

    Gas-Slido Especies orgnicas unidas a una sup.

    slida

    Particin entre fluido supercrtico y

    superficie unida

    CROMATOGRAFA LQUIDA ALTA RESOLUCIN La cromatografa lquida de alta resolucin se ubica dentro de la cromatografa de elucin. En sta, un lquido (fase mvil) circula en ntimo contacto con un slido u otro lquido inmiscible (fase estacionaria). Al introducir una mezcla de sustancias (analitos) en la corriente de fase mvil, cada analito avanzar a lo largo del sistema con una velocidad diferente que depender de su afinidad por cada una de las fases. Esto supone que despus de determinado recorrido de la muestra por la columna, cada una de las sustancias introducidas en el sistema eluir con un tiempo diferente, es decir, estarn separadas. INSTRUMENTACIN Si bien es cierto que para realizar una cromatografa lquida tan solo es necesario disponer de las dos fases implicadas en el proceso y de la columna, la moderna cromatografa de lquidos de alta eficacia, debido al pequeo dimetro de las partculas de fase estacionaria que se utilizan, requiere de la utilizacin de unos dispositivos que constituyen el cromatgrafo. Los componentes bsicos de un cromatgrafo lquido son:

    Dispositivo de suministro de eluyentes (bomba y dispositivo de mezclado de eluyentes).

    Dispositivo de inyeccin.

    Conducciones y conexiones.

    Detector y registrador.

    Columna.

  • La muestra en solucin es inyectada en la fase mvil. Los componentes de la solucin emigran de acuerdo a las interacciones no-covalentes de los compuestos con la columna. Estas interacciones qumicas, determinan la separacin de los contenidos en la muestra. La utilizacin de los diferentes detectores depender de la naturaleza de los compuestos a determinar. Esta tcnica est indicada para la separacin de compuestos orgnicos semivlatiles como hidrocarburos poliaromticos, aminocidos, cido flico, vitaminas, etc. Sistema de suministro de fase mvil

    LA BOMBA:

    La misin de la bomba es la de suministrar un caudal constante y libre de pulsos de la fase mvil a travs de la columna sin que el flujo sea influido por la presin en cabeza de la columna, ya que sta puede variar por obstruccin de las lneas de conduccin o del filtro de la cabeza de la columna. El sistema de bombeo debe cumplir con:

    Estar construido con materiales qumicamente inertes frente a la fase mvil.

    Ser capaz de trabajar a presiones elevadas.

    Suministrar flujos adecuados para cada tipo de columna. El rango de caudales para las columnas que se utilizan habitualmente varan desde los 10 l/min hasta los 10 ml/min.

    Sistemas de inyeccin Un inyector ideal debe cumplir con los siguientes requisitos:

    Introducir la muestra a la columna como una banda los ms estrecha posible.

    Ser de fcil manejo.

    Ser capaz de trabajar a presiones elevadas.

  • Existen dos tipos de inyectores: Inyectores de jeringa:

    En ellos, la introduccin de la muestra en la columna se realiza por medio de una jeringa cuya aguja entra en el sistema cromatogrfico a travs de una membrana, lo que permite depositar la muestra en la cabeza de la columna. Las ventajas de ste tipo de inyector radican en su fcil construccin y que permiten sacar partido de la eficacia de la columna. Por el contrario, son inyectores que tienen una presin de trabajo limitada y gran dificultad de manejo. Inyectores de vlvula:

    stos consisten en una vlvula de seis vas, dos de las cuales estn conectadas entre s por medio de una espira. sta espira, es un tubo de volumen conocido, cuya misin es la de contener la muestra antes de efectuarse la inyeccin. Son muchos ms utilizados stos tipos de inyectores ya que todas las caractersticas que exige un inyector eficaz. Detectores: Un detector para cromatografa es un dispositivo que permite medir, a la salida de la columna, una propiedad fsica del eluyente, que deber depender de la composicin de ste. La deteccin se realiza en continuo. Las caractersticas principales de un detector son las siguientes:

    A. Caractersticas que no afectan la eficacia de la separacin:

    Respuesta: es la seal ofrecida por el detector ante una determinada variacin de la propiedad fsica del eluyente que es medida. La respuesta del detector suele ser lineal, lo que implica que la seal generada por el detector vara linealmente con la concentracin o la masa de soluto que sale de la columna por unidad de tiempo.

    Ruido: cualquier perturbacin de la seal generada por el detector y que no es originada por la salida de un soluto de la columna.

    Deriva: es la variacin de la seal de base a lo largo del tiempo, que origina una variacin lenta y progresiva de la lnea de base.

    Sensibilidad: es la mnima concentracin o cantidad de soluto que debe pasar por el detector para que la seal a que ste da lugar sea dos veces mayor que la del ruido de fondo. ste parmetro indica la cantidad mnima de soluto que es posible detectar, y es dependiente del ruido del detector.

    B. Caractersticas que afectan a la eficacia de la separacin:

    Volumen de la cubeta: puede provocar una prdida considerable de la eficacia del sistema, ya que volmenes grandes de clula originan un efecto de dilucin

  • exponencial del soluto que sale de la columna, deformndose el pico y pudindose mezclar dos solutos que salen separados de la columna.

    Constante de tiempo: indica el tiempo que necesita la electrnica del detector para asumir la seal instantnea originada por el soluto.

    Se utilizan comnmente tipos de detectores como: Detector ndice de refraccin. Detector de ultravioleta y/o visible. Detector de fluorescencia. Detector de conductividad elctrica. Detector electroqumico.

    LA COLUMNA: La columna es el elemento fundamental de un cromatgrafo de lquidos, puesto que es en ella donde tiene lugar a separacin. As, resulta fundamental una correcta eleccin de la columna adecuada para cada separacin. Las columnas ms utilizadas en ste tipo de cromatografas son las de relleno. stas consisten en un tubo, generalmente de acero, relleno de una fase estacionaria adecuada al tipo de separacin que desee llevarse a cabo. El dimetro interno vara entre 2 y 60 mm dependiendo su utilizacin y su longitud vara entre 5 y 30 cm. Todas las separaciones cromatogrficas tienen lugar sobre la fase estacionaria. sta se encuentra constituida generalmente por partculas de materiales rgidos o semirgidos, y en la mayora de los rellenos suele utilizarse slice. La slice utilizada realiza una de las tres funciones que se indican:

    Superficie adsorbente: en este caso, los propios grupos activos de la superficie de la slice (grupos silanol) son los responsables de la separacin.

    Soporte de la fase estacionaria: sta, o bien impregna la superficie de la slice, o bien se encuentra ligada qumicamente a ella (slice modificada qumicamente).

    Actuacin como sustrato microporoso: aqu la slice permite la seleccin de molculas en funcin de su tamao.

  • DETERMINACIN DE SUERO DE QUESERA EN LA LECHE FLUIDA Y EN POLVO

    MTODO DE CROMATOGRAFA LQUIDA DE ALTA EFICACIA

    1- OBJETO Y ALCANCE: Este mtodo permite determinar la adulteracin de la leche con suero de quesera, usando el mtodo de cromatografa lquida de alta eficacia. El mtodo se aplica a las leches lquidas, y en polvo para determinar la adulteracin con suero de quesera.

    2- FUNDAMENTO DEL MTODO:

    Se pone de manifiesto la presencia de suero de quesera mediante la determinacin de glicomacropptidos por Cromatografa Lquida de Alta Eficacia (HPLC) previa la eliminacin de grasas y protenas con cido tricloroactico.

    3- MATERIALES Y EQUIPOS: Material de uso corriente de laboratorio. Equipo de cromatografa lquida de alta eficacia que comprende:

    a. Una o dos columnas en serie, de caractersticas permeables de gel TSK 2000 SW

    (30 cm de longitud, dimetro interior de 0,75 cm). Alternativamente puede utilizarse una de estas columnas con precolumna (3 cm x 0,3 cm) rellena de I125 o material de eficacia equivalente. Puede utilizarse una columna de eficiencia equivalente.

    b. Cuando se realiza el anlisis con la columna TSK 2000 SW es recomendable

    trabajar con el horno de columna con termostato regulado a 35C 1C. Se puede trabajar con columnas mantenidas a temperatura ambiente, pero su poder de resolucin es ligeramente menor. En este caso las variaciones de temperatura durante una misma serie de anlisis debern ser inferiores a 5C. Cuando se utiliza una columna diferente la temperatura depende de fase estacionaria usada.

    c. Detector ultravioleta que permita efectuar lecturas a 205 nm.

    d. Integrador que pueda integrar de valle a valle (rea bajo el pico). Puede utilizase otra opcin de integracin, por ejemplo las alturas de los picos, en este caso se aplicar el mtodo de integracin adecuado.

    4- REACTIVOS:

    Acetonitrilo PA. Acido orto fosfrico PA-ACS-ISO.

  • cido tricloroactico PA-ACS. Agua PA-ACS. Di-potasio Hidrgeno fosfato anhidro PA. Potasio di-hidrgeno fosfato PA. Potasio Hidrxido lentejas PA. Sodio Sulfato PA.

    Preparacin de soluciones:

    Solucin de cido tricloroactico: disolver 240 g de cido Tricloroactico PA-ACS en Agua PA-ACS hasta 1 000 ml.

    Solucin eluente pH 6,0: disolver 1,74 g de di-Potasio hidrgeno fosfato anhidro PA, 12,37 g de Potasio di-hidrgeno fosfato PA y 21,41 g de sodio sulfato PA en, aproximadamente, 700 ml de agua. Ajustar, si es necesario, a pH 6,0 con ayuda de una solucin de cido fosfrico o de hidrxido potsico. Completar hasta 1000 ml y homogenizar. En caso de utilizar una columna diferente a TSK 2000 SW, emplear una solucin eluente adecuada. Filtrar la solucin, antes de utilizar, utilizando una membrana filtrante de 0,45 m de dimetro de poro. Cuando se utiliza una columna diferente la fase mvil depender de fase estacionaria usada.

    Solucin de lavado y conservacin de columnas: mezclar un volumen de acetonitrilo en nueve volmenes de agua. Filtrar la mezcla, antes de utilizar, utilizando una membrana filtrante de 0,45 m de dimetro de poro. Puede utilizarse cualquier otra solucin de lavado que tenga efecto bactericida y que no altere la eficacia de resolucin de las columnas. Cuando se utiliza una columna diferente la solucin de lavado y conservacin de columnas depender de fase estacionaria usada.

    5- MUESTRAS PATRN

    Para leche en polvo:

    Previo al anlisis homogenizar bien la leche. Trasvasar la leche a un recipiente aproximadamente el doble del volumen de sta, provisto de un cierre hermtico. Cerrar el recipiente inmediatamente y mezclar bien. Pesar 2,000 g 0,001 g y aadir 20,0 g de agua a 50 C. Disolver agitando durante 5 minutos con la ayuda de un agitador. Llevar a 25 C. Aadir en 2 minutos 10,0 ml de la solucin de cido tricloroactico agitando constantemente con la ayuda de un agitador. Mantener a 25C durante 60 minutos. Centrifugar por 10 min a 2500 rpm o filtrar sobre papel desechando los primeros 5 ml de filtrado. Pasar filtrado por un filtro de membrana de poro 0,45 m o menor.

  • Para leche lquida: Homogeneizar la muestra a 40 C y tomar 20 ml de leche. Llevar a 25C. Aadir en 2 minutos 10,0 ml de la solucin de cido tricloroactico agitando constantemente con la ayuda de un agitador. Mantener a 25C durante 60 minutos. Centrifugar por 10 min a 2500 rpm o filtrar sobre papel desechando los primeros 5 ml de filtrado. Pasar filtrado por un filtro de membrana de poro 0,45 m o menor.

    6- PROCEDIMIENTO

    I. Inyectar en la columna un volumen de 15 a 30 l, medidos con exactitud, del filtrado del patrn exento de suero, del patrn con 5% de suero y de las muestra, en el aparato de cromatografa lquida de alta eficacia con un flujo de 1,0 ml/min de la solucin eluente o en las condiciones adecuadas de acuerdo con la columna usada.

    II. En cada interrupcin lavar las columnas con agua y en toda interrupcin superior a

    veinticuatro horas, despus del lavado con agua, se les debe pasar solucin de lavado; por lo menos tres horas a un flujo de 0,2 ml por minuto.

    7- CLCULOS:

    Con el fin de detectar cualquier anomala, ya sea debida al mal funcionamiento del cromatgrafo o de las columnas, debido a la muestra a analizar, es necesario observar el aspecto de cada cromatograma antes de efectuar cualquier interpretacin cuantitativa. Procedimiento de clculo cuando se utilizan las reas de los picos para la determinacin del porcentaje de suero de quesera aadido. Clculo del coeficiente de respuesta:

    R= P A(5) A(0)

    En donde: R = es el coeficiente de respuesta A(5) = es el rea del pico III obtenido del anlisis cromatogrfico del patrn de leche en polvo adicionada el 5% (m/m) de suero de quesera. A(0) = es el rea del pico III, obtenido en el anlisis cromatogrfico del patrn de leche en polvo exenta de suero de quesera. P = es el porcentaje de suero de quesera presente en el patrn (en este caso 5%). Clculo del rea relativa del pico III obtenido del anlisis cromatogrfico de la muestra:

    S (E) = R x A (E) En donde: S(E) = rea relativa del pico III en la muestra A(E) = rea correspondiente al pico III obtenida en el anlisis cromatogrfico de la muestra R = Coeficiente de respuesta (calculado en el paso anterior).

  • Clculo del rea relativa del pico III obtenido en el anlisis cromatogrfico del patrn de leche en polvo exento de suero de quesera:

    S (0) = R x A (0) En donde: S(0) = rea relativa del pico III en el patrn de leche en polvo exenta de suero de quesera. A(0) = rea correspondiente al pico III obtenido en el anlisis cromatogrfico del patrn de leche exenta de suero de quesera. R = coeficiente de respuesta. Clculo del tiempo de retencin relativo del pico III en la muestra:

    TRR (E) = TR (E) TR (5)

    En donde: TRR(E) = tiempo de retencin relativo del pico III de la muestra. TR(E) = tiempo de retencin del pico III obtenido en el anlisis cromatogrfico de la muestra. TR(5) = tiempo de retencin del pico III obtenido en el anlisis cromatogrfico del patrn de leche en polvo adicionada del 5 % (m/m) de suero de quesera. Por la experimentacin est demostrado que existe relacin lineal entre el tiempo relativo del pico III en la muestra y el porcentaje de suero de quesera aadido hasta el 10 %.

    Con un contenido < 5 %, el TRR(E) es > 1,000.

    Con un contenido " 5 %, el TRR(E) es = 1,000.

    Clculo del porcentaje de suero de quesera presente en la muestra:

    W = S (E) (1,3 + (S(0) 0,9))

    En donde: W = porcentaje m/m de suero de quesera presente en la muestra. S(E) = rea relativa del pico III para la muestra. 1,3 + = media experimental del rea relativa del pico III expresada en gramos de suero de quesera en 100 g de leche no adulterada. S(0) = rea relativa del pico III para el patrn de leche exenta de suero de quesera. S(0)-0,9 = correccin que hay que efectuar en el rea relativa media 1,3 cuando el valor S(0) no es igual a 0,9. Lmite de deteccin: Se considerar que una muestra contiene suero de quesera aadido cuando el porcentaje cuantificado sea superior al 5 % para las leches UHT y superior a 3% en leches pasteurizadas, esterilizadas y en polvo.