DETERMINACION ESTEREOESPECIFICA, INVERSION QUIRAL IN VITRO Y FARMACOCINETICA EN HUMANOS DE LOS ENANTIOMEROS DE LA TALIDOMIDA

La talidomida (alfa-ftalimidoglutarimida) tiene un centro quiral y existe un racemato de los enantiomeros R Y S. El racemato fue introducido como un inductor del sueño en 1956, pero esta fue retirada en 1961 por causar malformaciones en el feto. Pocos años después se informo que la talidomida es muy activa en contra de manifestaciones inmunológicas severas en algunos tipos de lepra. La talidomida ha demostrado ser un eficaz agente antiinflamatorio en variedad de desordenes de las membranas mucosas y la piel. Estas acciones inmunomoduladoras también son utilizadas en la prevención y tratamiento de enfermedad de injerto contra huésped, después de un transplante de hueso. La dosis terapéutica de la rac-talidomida es normalmente 100-400 mg/dia, que pueden causar somnolencia severa. En la enfermedad de injerto contra huésped, la dosis que se puede utilizar es de hasta 1600 mg/dia. Un posible o conocido embarazo es, de hecho, una contraindicación absoluta para el uso de la talidomida. Sin embargo, actualmente el mal supervisado uso de la talidomida en contra de la lepra esta causando un numero desconocido y posiblemente grande de defectos congénitos en Brazil.

En el uso moderno de la talidomida, su acción sedativa/hipnotica debe ser considerada como un efecto secundario no deseado. Otros efectos adversos de la talidomida incluyen neuropatía periferica potencialmente grave durante su uso regular, también constipación xerostomía y rash cutáneo.

No esta claro si algunas de las acciones de la talidomida racemica pueden ser separadas usando un enantiomero puro. Los hallazgos en la literatura son contradictorios. Enantiomeros de talidomida sintetizados sepradamente producen efectos hipnóticos similares en ratones y efectos teratogenicos similares en conejos. En contraste, cuando los enantiomeros son separados cromatograficamente (de posiblemente alta pureza óptica) son administrados via intraperitoneal a ratones y ratas, (-) (s)- talidomida causo teratogenicidad dosis dependiente en ambas especies, mientras que la (+)(r)-talidomida carecia de efecto. Considerando el otro efecto adverso importante de la talidomida i.e., neuropatía periférica, no se sabe nada acerca de las actividades relativas de los enantiomeros. En modelos animales con enfermedad injerto contra huésped la (-)(s)- talidomida fue superior a la (+)(r)-talidomida en la prevención de splenomegalia en embriones de pollo, pero en ratas no fue vista la diferencia entre los enantiomeros.

Los intentos de separar los diversos efectos farmacológicos de fármacos como la talidomida usando enantiomeros puros llega a ser algo sin sentído si el enantiomero es rápidamente raceimzado invivo

Fig 1 Estructuras estereoquímicas de la R y S talidomida y las constantes de velocidad para la inversión y degradación de los enantiomeros en por ejemplo solución acuosa. Krs:

constante de velocidad de inversión de R talidomida a S talidomida. Kro Constante de degradación de R talidomida Ksr y Kso son definidas analogamente

La interconversion de enantiomeros bajo condiciones fisiológicas ha sido observado, con oxazepam, amfepramona y sus congéneres, y con algunos análogos de la talidomida, y, como se ha demostrado con el acido 2-arilpropionico agentes antiinflamatorios, la inversión quiral unidireccional puede ocurrir invivo. A la inversa, si la disposición del fármaco es marcadamente estéreo selectivo de modo que un enantiomero se convertira en la especie predominante in vivo después de la administración del racemato, el cuerpo puede también ser expuesto principalmente al deseado ( o el indeseado) enantiomero.

Regimenes de dosificación de la talidomida se han basado en estudios clínicos tempranos y reportes de casos más que en su comportamiento farmacocinético. Un estudio farmacocinetico ha informado en el que 8 voluntarios masculinos sanos se les dio una dosis oral de 200 mg del racemato. A partir de datos del plasma la media de Concentracion máxima se estimo en 1.15 mcg/mlk el tiempo máximo en 4.39 horas, y la vida media de eliminación (en u modelo de compartimiento) en 8.70 horas. La excreción renal fue del 0.6% de la dosis. La talidomida es excretada principalmente por hidrolisis espontanea en la sangre y tejidos, pero también se ha encontrado metabolismo por hidroxilacion aromatica.

La farmacocinética que tienen los enantiomeros de la talidomida, sin embargo, nose ha descrito. En vista de su rápida interconversion in vitro en medios biológicos, es probable que la inversión quiral podría también ser observada in vivo. La escasez de datos farmacocineticos es presumiblemente debido a la falta de un ensayo estéreo especifico rápido para la talidomida en materiales biológicos. Los métodos de cromatografía liquida adecuados para la separación preparativa de los enantiomeros de la talidomida han sido descritos, pero solo muy recientemente se tiene un ensayo de HPLC aplicable a muestras de plasma.

Los objetivos de este trabajo son, por lo tanto 1. Desarrollar un ensayo de hplc rápido y sensitivo para los enantiomeros de la talidomida en sangre, 2. Estudiar la inversión y degradación de los enantiomeros invitro (en sangre humana), y 3. Estudiar la farmacocinética de (+)(R)- y (-)(S)- talidomida después de la administracion oral de los enantiomeros separados o del racemato en voluntarios sanos.

METODOS Y MATERIALES

Ensayo estéreo especifico HPLC

El racemato y los enantiomeros de la talidomida son suministrados amablemente por Grunenthal GmbH (Stolberg/Rheinland, Germany) y la fenacetina era de calidad farmacopeica. Todas las soluciones stock fueron preparados en metanol y mantenidas a -25 ºC. Eter dietilico, diclorometano, y n-hexano fueron comprados en Merck. El Metanol y el etanol al 99.5% eran de calidad farmacopeica. El agua estaba recién destilada y recogida en un recipiente de acero inoxidable. Los sistemas de cromatocromatografía consistían d LDC/Milton Roy Constametric 3 bombas, inyectores de bucle Rheodyne 7725 con 20 microlitros , y un monitor de espectro, detectores UV longitud de onda variable.

Para el ensayo estéreoespecifico una columna de celulosa tribenzoil protegida por una columna C18 fue usada, y la fase mobil fue metanol con 10%-25% de etanol al 99.5%. La velocidad de flujo fue de 0.5 ml/min y la longitud de onda fue de 220 nm.

Inmediatamente después de la recoleccion, todas las muestras de sangre fueron estabilizadas por la adicion de un volumen igual de buffer Citrato de Sorensen, 0.025M, ph 1.5. Despues de la adicion de 50 microlitros de la solución estandar interno (fenacetica, 100mcg/ml), las muestras (1.0-4.0 ml de mezlca sangre-buffer) se extrajeron con 5.0 ml de cualquier dietileter o diclorometano:n-hexano (1:1) previamente descrita para la rac-talidomida. La capa organica se transfirió a otro tubo, el solvente se evaporo bajo una corriente de aire seco, el residuo fue tomado en 100 microlitros de metanol y 20 microlitros de esta solución fueron inyectados en el cromatografo para la determinación de la proporción del enantiomero de talidomida. El resto del extracto fue entonces usado para la determinación de la concentración total de talidomida por HPLC no estereoespecifica como previamente se describió. Debido al riesgo de interferencia en los cromatogramas, posibles contaminantes, e.g , ploimeros, detergentes, y agua común, se

evitaron. Los tubos con tapon de vidrio fueronlavados con agua destilada y etanol al 99.5%.

Los rendimientos de extracción de la talidomida y la fenacetina de la sangre-buffer con diclorometano :n-hexano (1:1) fue determinada como previamente se describió usando muestras enriquecidas con 1 microgramo/ml de rac-talidomida. Los rendimientos de extracción usando dietileter han sido presentados anteriormente. . Las curvas de calibración fueron preparadas con 1 ml de solución sangre-buffer (1:1), enriquecidas con estandar interno (5mcg) y talidomida para una cantida total de 1.0 mcg con proporciones R/S o S/R de 0, 0.063, 0.125, 0.33, 0.67, y 1. Dentro de días la exactitud y precisión en las muestras de sangre-buffer se revisaron por ensayos de series de 8 muestras enriquecidas con varias conentraciones y proporciones de enantioneros de talidomida (Tab 1).

Durante los ensayos actuales en los estudios de la cinetica, un punto de estandarización en contra de las muestras elaboradas de rac-talidomida se utilizó .El coeficiente de variación entre días se calculó de la S/R las relaciones de altura del pico de esas muestras. En adicion el coeficiente de variación entre días del ensayo no estereoespecifico fue monitoreado usando una fuente enriquecida con 0.40 mcg/ml de rac-talidomida.

La posible racemizacion de (-)(S)- talidomida en soluciones stock (100 mcg/ml) protegida de la luz y mantenidas en el congelador (-25ºC) se monitoreo a 1,2,3,6,8,12,16,27,48 y 221 dias por inyección directa en el cromatografo. La estabilidad estereoquímica de (+) (R) Y (-)(S) talidomida se investigo por adicion de sangre humana recién heparinizada para una concentración total de 1 microgramo/ml. Un volumen igual de solución de buffer de citrato se añadió, y las muestras se mantuvieron a -25ºC en la oscuridad. 4 muestras se analizaron al tiempo y otras 4 despues de 100 dias.`

TABLA 1 EXACTITUD Y PRECISION DEL ENSAYO HPLC ESTEREOESPECIFICO

Para bajas concentraciones 2.0 ml de sangre (4 ml de sangre + buffer) y para las alatas condentraciones 0,5 ml de sangre (1 ml de sangre+ buffer) fueron analizadas. N=8 en

todas las determinaciones.

INVERSION INVITRO Y DEGRADACION DE (+)(R)-Y (-)(S)- TALIDOMIDA EN SANGRE A 37ºC

(+)(R)-Y (-)(S)- Talidomida se añadió a sangre humana heparinizada recién extraida de 4 voluntarios sanos a una ocncentracion de 5 mcg/ml. Las mezclas se repartieron en tubos de vidrio llenados con CO2-O2 (95:5) (para el control de ph), selladas , e incubadas a 37 ºC en un baño de agua. Muestras duplicadas se tomaron a 0.083 0.25 0.5 1 2 3 4 5 6 7 8 10 y 12 horas. Simultaniamente, las incubaciones se realizaron con rac-talidomida y el muestreo a 1 4 7 9 y 12 horas. Un volumen igual de solucion buffer de citrato se adiciono para detener las reacciones, y las muestras se almacenaron a -25ºC hasta analizadas (dentro de 10 dias). El ph de la sangre enriquecida fue revisado a 0 1 4 7 9 y 12 horas usando un analizador de sangre automatico. ABL 3300.

FARMACOCINETICA HUMANA- PROTOCOLO DEL ESTUDIO

El estudio fue aprobado por el comité ético de la universidad de land y pir la agencia medica de productos de Suecia, 6 voluntarios masculinos sanos (25-40 años) peso (71-100 kg) quienes están libres de mediación y no tienen historia de alergia a fármacos, s eles informo de consentimiento escrito del estudio. Ellos recibieron talidomida oral como enantiomero R o S o como racemato en 3 ocasiones separados por una semana en un diseño randomizado 3x3.

La dosis fue de 1 mg/kg de alguno R o S talidomida o 1.5 mg /kg del racemato Las capsulas duras de gelatina contienen dosis individuales del medicamento y lactosa que son preparadas por el autor encargado de la randomizacion mientras sujetos e investigadores participando en las sesiones de estudio son cegados del tratamiento, los sujetos ayunan desde la noche anterior. A las 8:30 am aprox. Ellos toman la capsula con 200 ml de agua y permanecen descansando durante el resto del dia (8-10h), excepto que ellos sean autorizados a tomar un almuerzo liviano después de 4 horas. La sedación y otros posibles efectos del fármaco fueron notificados concomitantemente con el muestreo de sangre , las muestras fueron tomadas de una vena antecubito en tubos heparinizados antes y a 0.25 0.5 0.75 1 2 3 4 5 6 7 8 10 12 16 20 23 y 24 horas después de tomar el fármaco. Cada muestra de sangre se mezclo directamente con un

volumen igual de buffer de citrato y fue congelado.

FIGURA 2 Modelo usado para caracterizar la farmacocinética invivo de la r y s talidomida después de la administración oral de algún enantiomero o racemato

Abrevaiciones: Dr y Ds depósitos presistemicos de talidomida R y S Kar y Kas constantes de velocidad de absorción, Kir Kis constantes de velocidad de inversión quiral, Ker y Kes

constantes de velocidad de eliminación Vdr y Vds volúmenes de distribución compartimental de los respectivos enantiomeros

ANALISIS FARMACOCINETICOS

Las constantes de velocidad para la inversión y degradación invitro mostrados en la figura 1 son estimados por el ajuste de 2 compartimientos modelo con eliminación de ambos compartimientos.

Las ecuaciones modelo son codificadas en el software SAS y el modelo se ajusta simultáneamente a las 4 curvas de concentración obtenidas en cada experimento, con l0s reciprocos de las concentraciones predecidas como factores de ponderación.

A partir de los datos invivo aparentemente la vida media terminal de los enantiomeros fue estimada por una regresión no lineal usando el software RSTRIP. El área de la curva se calculó por el método logarítmico trapezoidal desde 0 hasta el infinito usando el software MKMODEL. Un pseudoequilibrio de la relación entre la concentración en sangre de R/S Se calculó para cada sujeto como un promedio alrededor de las 10-24 horas datos de concentración después de la administración del racemato.

El modelo farmacocinetico mostrado en la figura 2 se uso para estimar la velocidaed de las constantes de absorción inversión y eliminación de los dos enantiomeros.

Los volúmenes de los compartimientos Vdr y Vds podrían ser estimados solo como valores aparentes El volumen dividido por la biodisponibilidad efectiva desde los datos de concentración en sangre después de la admon intravenosa podrían no ser obtenidos. El modelo se codifico en el SAS y las estimaciones fueron hechas por el procedimiento NLIN

Primero, las concentraciones de R o S talidomida obtenida en las 2 sesiones donde cada enantiomero se administró separadamente fueron usados para estimar todos los parámetros del modelo ajustando las 4 curvas de concentración simultáneamente para cada sujeto iterativamente reponderadas estimaiones on minimos cuadrados usando primero los reciprocos de las concentraciones predecidas como factores ponderados.

La opción entre estos dos factores ponderados para cada sujeto se basó en el valor r2 del ajuste y sobre la inspección de los residuos.

En un segundo paso, la velocidad de absoricon de los aparentes volúmenes de distribución de los enantiomeros después de la administración de rac-talidomida fue estimada para cada sujeto usando los parámetros de disposicion encontrados anteriormente como valores arreglados. Una estimación del retraso en el tiempo de absorción se incorporo. Si no fue encontra un tiempo de retraso significante, el ajuste se repitió después de suprimir el parámetro.

Figura 3 Cromatogramas de las muestras de sangre

ESTADISTICAS

Los distribuiciones de los parámetros farmacocineticos estimados, son testeados por el shapiro wilk estadistics. Ajustando P>0.10 como el límite de rechazo de la hipótesis nula de la distribución normal.

Normalmente los parámetros distribuidos fueron comparados por un análisis de variante (ANOVA) seguido por la prueba de rango multiple de Duncan. La prueba rangos con signos de Wilcoxon fue usada para la comparacionn de parámetros distribuidos anormalmente.

El nivel de significancia fue establecido a P< 0.05 El software SAS fue usado para todos estos cálculos estadísticos.

RESULTADOS

Los cromatogramas representativos son dados en la figura 3. Los factores de capacidad (k ’) de la R y S Talidomida fueron 2.4 y 3.1 respectivamente, cuando la fase móvil consistio de 100% metanol. Ellos se elevaron a 2.6 y 3.2 con 10% de etanol y en 2.8 y 3.6 con 25% de etanol en la fase móvil. En el ultimo caso una nueva muestra podría ser inyectada cada 15 min. Las columnas demostraron ser bastante estables y el sistema cromatografico reproducible, de hecho, una simple columna analítica fue usada para el trabajo entero descrito aquí.

El rendimiento de la extracción de rac-talidomida a partir de sangre acidificada usando diclorometano:n-hexano 1:1 FUE DE 96+- 2 % (el valor correspondiente para la fenacetina fuen de 91 +/- 7%.). Este medio de extracción era normalmente usado. Las curvas de calibración preparadas a partir de los enantiomeros de talidomida en proporciones de 0.063 a1.0 fueron lienales (r=0.999). La exactitud y precisión de el ensayo es mostrada en la tabla 1.

El coeficiente de variación entre días de el ensayo estereoespecifico fue de 1.6% (n=31) y el del para la talidomida total fue de 8.2% (n=16)

La R y S talidomida suministrada, demostro que contenia menos que 0.7% de el otro enantiomero .Eso fue menos que el 1% de perdida de pureza óptica en las soluciones stock de enantiomero puro mantenidas a -25ºC después de 221 dias.

No hay racemizacion detectable de los enantiomeros en las soluciones Sangre-Buffer almacenas por 100 dias a -25ºC

Figura 4

Modeloajustado de las curvas de concentración invitro de ;la r y s talidomida durante la incubación del enantimero en sangre humana a 37 gracos C. En equilibrio la relación de

concentración R/S excede 1 ligeramente

INVERSION Y DEGRADACION INVITRO DE R Y S TALIDOMIDA EN SANGRE A 37ºC

La inversión y degradación de los enantiomeros de talidomida invitro es ilustrada en la figura 4.

Las constantes de velocidad estimadas son dadas en la tabla 2. La incubación de la rac talidomida en sangre provoco un ligero cambio en el equilibrio entre los enantiomeros. Las relaciones de concentración en estado estacionario de R/S son calculados como la media de los valores a 9 y 12 horas y son también mostrados en la tabla 2.

FARMACOCICNETICA HUMANA

Durante las primeras 8-10 horas de las sesiones de estudio los sujetos empezaron a sentirse leve a marcadamente sedados o se quedaron dormidos. Nigun otro efecto adverso al tratamiento fue observado por nostros o reportado por los sujetos.

Las curvas representativas de concentración-tiempo, después de la administración de (+)(R)-Y (-)(S)- TALIDOMIDA al mismo sujeto son presentadas en la figura 5. Las constantes de velocidad disposición de los enantiomeros de la talidomida son dadas en la tabla 3. Todos los sujetos mostraron el mismo patrón para estas constantes de velocidad con Ke.s > Ki.R > Ki.S >Ke.R, implicando un considerablemente ritmo mas rápido de eliminación de la (-)(S)- TALIDOMIDA que el (+)(R)- enantiomero . la aparente vida media de la (+)(R)-talidomida después de la administración de este enantiomero fue de 4.6 +/- 0.51 horas, y la aaparente vida media de la (-)(S)- TALIDOMIDA fue de 4.8 +/- 0.98 horas.

El ajuste por separado del modelo farmacocinética de las concentraciones de (+)(R)-Y (-)(S)- TALIDOMIDA obtenidas después de la administración de el racemato es ilustrado en la figura 6. La relación de concentración en sangre estabilizada dentro de unas pocas horas después de la administración. La proporción de pseudoequilibrio fue de 1.67 +/- 0.18 en los 6 sujetos.

Los aparentes (volúmenes de distribución )/(biodisponibilidad efectiva) (Vd/F) Y las constantes de la velocidad de absorción de los enantiomeros de la talidomida son dados en la tabla 4. Los valores Vd/F son significantemente diferentes para la R y la S talidomida, y consistentes valores fueron obtenidos independientemente de si la talidomida ha sido administrada como enantiomeros puros o como racemato. La diferencia entre la velocidad de absorción para la S talidomida después de la administración de el enantiomero puro o el racemato fue significativo mediante la prueba de rangos con signos, mientras la correspondiente comparación para la R talidomida no fue (P=0.094). sin embargo los datos apuntan a una rápida absorción de la talidomida cuando es administrada como enantiomero puro que cuando se da como racemato.

Los valores de AUC para la R y S talidomida despues de la administración de un simple enantiomero o del racemato son presentadas en la tabla 5. Tambien respecto a la R talidomida fue predominante en especies in vivo, la relacion AUCR/AUCS después de la administración de rac talidomida siendo 1.60 +/- 0.12. Con la administracion de talidomida S se incremento relación opuesta AUCS/ AUCR a 1.32 +/- 0.13 en comparación de 0.63 +/- 0.05% después del racemato.

TABLA 2 CONSTANTES DE VELOCIDAD INVITO Y CORRESOPONDIENTES VIDA MEDIA DE INVERSION Y DEGRADACION DE ENANTIOMEROS DE TALIDOMIDA EN SANGRE HUMANA ,

Y RELACION DE EQUILIBRIO R/S

DISCUSION

La exactitud y precisión del ensayo estereoscópico fue documentada para cubrir las concentraciones encontradas en el estudio farmacocinetico. A altas concentraciones, buena exactitud fue mostrada en ambos R/S y S/R.

Durante las fases posteriores de estudios, la disminución de la concentración total fue compensado por acercarse al equilibrio de los enantiomeros y solo moderadas discrepancias en la concentración entre ellos necesitan ser medidas. Se encontró que la cafeína interfiere en el ensayo. Los sujetos se les pidió que no consumieran grandes cantidades de bebidas que contuvieran este estimulante durante los días anteriores al estudio, y el consumo de cafeína fue prohibido durante el estudio. A pesar de esto algunos sujetos todavía tenían cafeína en la sangre después del ayuno nocturno. los picos de la talidomida y la cafeína podrían sin embargo ser movidos para que no interfieran uno con el otro mediante el cambio del contenido de etanol in la fase móvil.

Durante la elaboración de este reporte un método de HPLC para la determinación estereoselectiva de la talidomida en muestras biológicas fue publicado. Sin embargo los rangos dinámicos de este ensayo no fueron reportados, y esto es incierto si cubriría las concentraciones de sangre encontradas en el presente estudio, no era una aplicación farmacocinética in vivo.

Los resultados de las incubaciones invitro en sangre confirmaron anteriores búsquedas que la talidomida es rápidamente hidrolisada y que los enantiomeros son rapidaente interconvertidos en medios biológicos y ph fisiológico . Una modesta influencia estereoselectiva de los constituyentes de la sangre era evidente como una tasa ligeramente más alta de la degradación de la S que la de la R con un consecuente cambio en el pseudoequilibrio de la relación de concentracion. Tambien hubo una clara diferencia

entre las velocidades de inversión y de degradación, la inversión siendo el proceso más rápido para ambos enantiomeros.

El estudio de la farmacocinética in vivo de la talidomida fue obstaculizado por la falta de una formulación intravenosa. Intentos para mejorar la pobre solubilidad y estabilidad de la talidomida en agua han tenido un éxito limitado Nuestro principales objetivos eran describir la disposicion de los enantiomeros de la talidomida determinar sus constantes de velocidad para la inversión y eliminación y el investigar como la administración de un simplre enantiomero puede reducir la exposición real del sujeto al otro enantiomero. Estos objetvos podrían ser realizados aunque los parámetros convencionales farmacocineticos no puedan ser estimados.

Despues de la inspección y el procesamiento preliminar de las curvas de concentración en sangre era evidente que la absorción era mas rápida cuando los enantiomeros eran administrados separadamente que cuando ellos se daban como racemato, las curvas de concentración Se han utilizado desde antiguos experimentos para la estimación de las constantes de velocidad para la inversión y la eliminación, ya que las fases de absorción más cortas tendrían menos impacto en estas estimaciones.

Figura 5 Curvas de concentración en sangre de r y s talidomida des pues de la administración oral del enantiomero indicado para 2 sujetos.

La baja absorción de la R y S talidomida cuando es dada como racemato fue confirmada por el modelo ajustado.

Esto es debido probablemente a que la disolución de talidomida racémica es más lenta que la de los enantiómeros, que a su vez dependerá de que la solubilidad acuosa del racemato es considerablemente más baja, 50 mg/l, que la de los separados enantiómeros, 250 mg/l. Los valores Ka de 0.33 y 0.38 h-1 que nosotros encontramos para la absorción de (+)-(R)- y (-)-(S)-talidomida a partir de cápsulas que contienen el racemato corresponden a una absorción de la vida media de 2 horas. Una vida media similar de 1,7 horas ha sido reportada para la absorción de tabletas de talidomida. En el inicio del estudio farmacocinético de la talidomida, no se hace distinción entre los enantiómeros, eliminación aparente y volumen de distribución los cuales fueron estimados asumiendo el 100% de biodisponibilidad. En la descripción de la farmacocinética de los enantiómeros, este supuesto es insostenible. Cuando la biotransformación reversible ocurre, incluso si después de la administración intravenosa se emplean los datos, la verdadera eliminación del fármaco no puede ser calculada por la fórmula estándar de dosis/AUC. Esto es debido a que “dosis” no es simplemente la cantidad de fármaco administrada, también incorpora una cantidad formada in vivo, en el presente caso por inversión del enantiómero opuesto. Consecuentemente, con la administración oral la biodisponibilidad también se convierte en un parámetro complejo. Cada enantiómero está biodisponible tanto como lo está la cantidad formada por inversión del otro enantiómero. Esto se ilustra en nuestro modelo farmacocinético (Fig. 2). La entrada del fármaco, por ejemplo, en Vd,R está influenciada por Ka, R y ki,s (y directamente por ki, R) si la (+)-(R)-talidomida es administrada; por Ka, S, ki, S (y ki, R) si (-)-(S)-talidomida es dada; y por ka, R, ka, S, ki, S (y ki, R) si el racemato es administrado. En el último caso, la biodisponibilidad del enantiómero predominante en estado estacionario podría exceder fácilmente el 100%. La interpretación de los volúmenes compartimentales estimados (Vd/F) es por lo tanto ambigua. La diferencia entre Vd, R/F y Vd, S/F puede ser debida a una diferencia actual en la distribución de los enantiómeros, pero el bajo valor de Vd, R/F puede también reflejar una alta biodisponibilidad efectiva del (+)-(R)-enantiómero cinéticamente favorecido. Un modelo farmacocinético teóricamente más atractivo incluiría constantes de velocidad para la inversión presistemática, la eliminación y, posiblemente, un compartimiento periférico (distribución) para cada enantiómero. Las constantes de velocidad para los procesos presistemáticos se incluyeron inicialmente en el modelo, pero se encontró que están altamente correlacionadas y tuvieron que ser rechazadas. Esto no es sorprendente, ya que no tenemos datos de medición para los procesos presistemáticos.

TABLA 3 DISPOSICION INVIVO(INVERSION Y ELIMINACION) constantes de velocidad de R y S talidomida con intervalos del 95% de confianza.

FIG 6 curvas de concentración en sangre de R y S talidomida después de la administración oral de talidomida racemica en 2 sujetos.

Como para los compartimientos periféricos no hubo fases de distribución discernibles en las curvas, siendo estos enmascarados por la relativamente baja absorción y la distribución en la forma de inversión reversible. También, desde el punto de vista estadístico, el número considerablemente incrementado de parámetros podría incrementar la mejora en los ajustes, especialmente desde un modelo plausible entre los compartimientos periféricos.

La inversión de los enantiomeros fue más rápido invitro que invivo (Tablas 2 y 3). En este contexto cabe señalar que los volúmenes de compartimiento estimados (Vd/F) exceden considerablemente el volumen fisiológico de sangre (0.07L/kg) y que con cualquier valor plausible para F (esto es aproximadamente por encima de 0.1) los volúmenes de distribución actuales de los enantiomeros también deben ser.

Alguna talidomida es distribuida en algunos sitios extravasculares donde la inversión parece ser menor que en la sangre. Cuando la eliminación invivo es comparada con la degradación (presumible solo por hidrolisis) in vitro, la velocidad fue menor in vivo que in vitro para el R enantiomero, mientras que la S talidomida fue elimiada rápidamente in vivo que la que fue hidrolizada in vitro. Ya que las velocidades de hidrolisis de la R y S talidomida en sangre solo eran ligeramente diferentes, es poco probable que la diferencia de tres veces en la velocidad de eliminación de los enantiomeros in vivo seria solo debido a la facilitación(o inhibición) de hidrolisis no enzimática. Los datos sugieren un mayor grado de metabolismo para el enantiomero S.

El promedio de la aparente vida media terminal de los enantiómeros de talidomida fue de 4,7 horas (cuando el equilibrio entre los enantiómeros ha sido establecido, sus vidas medias serán idénticas). La eliminación promedio de la vida media de la talidomida ha sido previamente reportada con un valor de 8,7 horas, con una considerable variabilidad interindividual: 3.0-14.6 horas. Incluso después de la administración intravenosa de algún fármaco, la estimación de la vida media terminal es marcadamente dependiente del plan de muestreo de sangre. El protocolo de estudio empleado en el reporte citado implica muestreo frecuente de sangre durante 12 horas seguido por una sola muestra a las 24 horas. Con la máxima concentración de plasma a las 2-6 horas, los estimados de la eliminación de las vidas medias se hacen más bien con escasos datos. Muestro adicional de sangre a las 16, 20, y 23 horas y el cálculo de las vidas medias con las curvas de concentración obtenidas con los enantiómeros puros absorbidos más rápidamente puede haber permitido estimaciones más precisas en nuestro estudio.

TABLA 4 VOLUMENES DE DISTRIBUCION Y CONSTANTES DE VELOCIDAD DE ABSORCION PARA R Y S TALIDOMIDA DESPUES DE LA ADMINISTRACION DE LOS ENANTIOMEROS SEPARADOS O EL RACEMATO (RAC)

Tabla 5 valores AUC calculados por el método trapezoidal para R y S talidomida después de la administración de los enantiomeros separados o talidomida racemica en 6 sujetos.

CONCLUSION

Desde un punto de vista práctico, la conclusión más importante de este estudio es que las diferencias putativas en los efectos terapéuticos o adversos entre la R y S talidomida debería ser en gran medida abolida por la rápida interconversion in vivo de los enantiomeros administrados separadamente.