Determinación de Enzimas Oxidativas Presentes en El Tejido Muscular

7/21/2019 Determinacin de Enzimas Oxidativas Presentes en El Tejido Muscular

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Determinacin de Enzimas oxidativas presentes en el tejido muscular.

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Fernando Cristancho *1, Camilo Guerrero *2, Andrs Vsquez *3, Alba Luz Muriel *4, JuanDavid Galn *5.

Resumen

Enzimas, cualquiera de las numerosas sustancias orgnicas especializadas compuestas por

polmeros de aminocidos, son de origen natural y catalizan reacciones biolgicas con un

alto grado de especificidad. Debido a su naturaleza proteica, a las enzimas les afectan los

mismos factores que a las protenas: temperatura, disolventes, sales, pH, entre otras, quemodifican su estructura qumica con la consecuente prdida de su actividad cataltica. Las

enzimas se clasifican en varias categoras: hidrolticas, oxidantes y reductoras, dependiendo

del tipo de reaccin que controlen. Las enzimas hidrolticas aceleran las reacciones en las

que una sustancia se rompe en componentes ms simples por reaccin con molculas de

agua. Las enzimas oxidativas, conocidas como oxidasas, aceleran las reacciones de

oxidacin, y las reductoras las reacciones de reduccin en las que se libera oxgeno. Otras

enzimas catalizan otros tipos de reacciones. Las enzimas oxidativas entran dentro de la

clasificacin de oxidoreductasas de las cuales se manejarn glucosa oxidasa,

polifenoloxidasa, catalasa, peroxidasa, lipoxidasa. Las enzimas oxidoreductasas catalizan la

oxidacin o reduccin del substrato, el cual puede ocurrir de diferentes formas. Cada enzima

es especfica de forma selectiva para la sustancia sobre la que causa la reaccin, y es ms

eficaz a una temperatura determinada. Aunque un aumento de la temperatura puede acelerar

una reaccin, las enzimas son inestables cuando se calientan. La actividad cataltica de una

enzima est determinada sobre todo por su secuencia de aminocidos y por la estructura

terciaria, es decir, la estructura de plegamiento tridimensional de la macromolcula. Muchas

enzimas precisan para su funcin la presencia de un ion o una molcula que recibe el

nombre de cofactor. Dentro de las enzimas oxidativas que tiene la funcin de oxidar los

tejidos para hacerlos perder su capacidad funcional se encuentran las OXIDASAS enzimas

que catalizan la remocin de hidrogeno de un sustrato y usan solamente al oxigeno como

aceptor de hidrogeno.


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Abstract

Enzyme, any of numerous specialized organic substances composed by polymers of amino

acids, theyre from natural origin and catalyze biological reactions with a high degree of

specificity. Due to their protein nature, enzymes are affected by the same factors of proteins:

temperature, solvents, salts, pH, among others, that modify their chemical structure withconsequent loss of its catalytic activity. Enzymes are classified into several categories:

hydrolytic, oxidizing and reducing, depending on the type of reaction they control. Hydrolytic

enzymes speed up reactions where a substance is broken into simpler components by

reaction with water molecules. The oxidative enzymes, known as oxidases, accelerate

oxidation reactions, and the reducing ones in reduction reactions, in which, oxygen is

released. Other enzymes catalyze other types of reactions. The oxidative enzymes are within

the classification of oxidoreductases and specifically will be handled glucose oxidase,

polyphenol oxidase, catalase, peroxidase, lipoxidase. Oxidoreductases enzymes catalyze the

oxidation or reduction of the substrate, which can occur in different ways. Each enzyme is

selectively specific for the substance on which cause the reaction, and is more effective at a

given temperature. Although an increase in temperature can speed up a reaction, the

enzymes are unstable when get heated. The catalytic activity of an enzyme is determined

primarily by its amino acid sequence and tertiary structure, the structure of dimensional

folding of the macromolecule. Many enzymes required for its function, the presence of an ion

or molecule that receives the name of cofactor. Within the oxidative enzymes which can

oxidize the tissues to make them lose their functional capacity are the oxidases enzymes that

catalyze the removal of hydrogen from a substrate and used only to oxygen as hydrogen

acceptor.

Palabras clave

Enzimas oxidativas, sustrato, coenzimas, oxidoreductasas, catalizador .flavoproteinas, norita

(carbn activado), anaerobio. Deshidrogenasa lctica.

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Recibido: 28 de octubre del 2014

*Medicina, Facultad de Ciencias de la Salud, Universidad Cooperativa de Colombia.

Estudiantes 1 semestre.

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3 [email protected]
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Introduccin

Las enzimas son sustancias orgnicas especializadas compuestas por polmerosde aminocidos, que actan como catalizadores en el metabolismo de los seres vivos. Consu accin, regulan la velocidad de muchas reacciones qumicas implicadas en este proceso.El nombre de enzima, que fue propuesto en 1867 por el fisilogo alemn Wilhelm Khne(1837-1900), deriva de la frase griega en zyme, que significa 'en fermento'. Enzima es unaprotena dotada de propiedades catalticas que inducen principalmente a supoder deactivacin especfica, expresada por Dixon y Webb (1958). son agentes que afectan aavelocidad de una reaccinqumica,y no son alterados durante elproceso de la reaccin yaque se encuentran presentes al final de la reaccin en idntica cantidad y en las mismas

condiciones fsicas y qumicas en las que se encontraban al comienzo de la misma.Lasenzimas no son alterados por la reaccin, pero por ser protenas, resultan termolbiles ysensibles a los cambios y variaciones delmedio ambiente fsico en que se hallen, estnnvolucradas en todas las reacciones metablicas, tanto catalizndolas y acelerndolas, yvan desde la digestin de nutrientes como en la formacin de otras molculas. Ningnelemento, ni mineral, ni vitamina o hormona puede realizar ninguna funcin en el organismosin que exista la accin de las enzimas, es por ello que son tan importantes en toda la salud ybienestar general en el organismo, En la actualidad los tipos de enzimas identificados sonms de 700.Las enzimas se clasifican en varias categoras: hidrolticas, oxidantes yreductoras, dependiendo del tipo de reaccin que controlen. Las enzimas hidrolticasaceleran las reacciones en las que una sustancia se rompe en componentes ms simples por

reaccin con molculas de agua. Las enzimas oxidativas, conocidas como oxidasas,aceleran las reacciones de oxidacin, y las reductoras las reacciones de reduccin en las quese libera oxgeno. Algunas enzimas, como la pepsina y la tripsina, que intervienen en ladigestin de las protenas de la carne, controlan muchas reacciones diferentes, mientras queotras como la ureasa, son muy especficas y slo pueden acelerar una reaccin. Otrasiberan energa para la contraccin cardiaca y la expansin y contraccin de los pulmones.Muchas facilitan la conversin de azcar y alimentos en distintas sustancias que elorganismo precisa para la construccin de tejidos, la reposicin de clulas sanguneas y laiberacin de energa qumica para mover los msculos. La cintica de las reaccionesenzimticas difiere de las reacciones inorgnicas simples. Cada enzima es especfica deforma selectiva para la sustancia sobre la que causa la reaccin, y es ms eficaz a unatemperatura determinada. Aunque un aumento de la temperatura puede acelerar unareaccin, las enzimas son inestables cuando se calientan. La actividad cataltica de unaenzima est determinada sobre todo por su secuencia de aminocidos y por la estructuraterciaria, es decir, la estructura de plegamiento tridimensional de la macromolcula. Muchasenzimas precisan para su funcin la presencia de un ion o una molcula que recibe elnombre de cofactor. Dentro de las enzimas oxidativas que tiene la funcin de oxidar lostejidos para hacerlos perder su capacidad funcional se encuentran las OXIDASASenzimasque catalizan la remocin de hidrogeno de un sustrato y usan solamente al oxigeno como
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aceptor de hidrogeno. Ellas contienen invariablemente cobre y forman agua como unproducto de la reaccin (con la excepcin de la uricasa y la monoaminooxidasa que formanH2O2, ej.: citocromo oxidasa). DESHIDROGENASAS AEROBIASenzimas que catalizan laremocin de hidrogeno de un sustrato pero que, a diferencia de las oxidasas, pueden usar yasea oxigeno u otras sustancias artificiales como aceptores, ej.: el azul de metileno. Se forma

perxido de hidrogeno en lugar de agua como producto. En forma caracterstica estasdeshidrogenasas son flavoprotenas. LAS DESHIDROGENASAS ANAEROBIAS sonEnzimas que catalizan la remocin del hidrogeno de un substrato, pero que no son capacesde usar oxigeno como aceptor de hidrogeno. Hay un gran nmero de enzimas en esta clase.Ellas realizan dos funciones principales, Transferencia de hidrogeno de un sustrato a otro enuna reaccin de xido reduccin acoplada que no implica una cadena respiratoria. Estasdeshidrogenasas son especficas para sus substratos pero a menudo utilizan la mismacoenzima o transportador de hidrogeno que otras deshidrogenasas. Como las reaccionesson reversibles, estas propiedades permiten que los equivalentes reductores sean librementetransferidos dentro de la clula. Este tipo de reaccin, que permite que un sustrato seaoxidado a expensas de otro, es particularmente til para permitir que ocurran los procesos

oxidativos en ausencia del oxgeno. Ej.: deshidrogenasa lctica. Y Como enzima inicial deuna cadena respiratoria de transporte de electrones desde el substrato al oxgeno.HIDROPEROXIDASAS enzimas que utilizan el perxido de hidrogeno como sustrato. Dosenzimas pertenecen a esta categora: la peroxidasa, que se encuentra en la leche, en lasplantas, en leucocitos y eritrocitos, y la catalasa que se encuentra en los animales y en lasplantas.OXIGENASAS enzimas que catalizan la transferencia directa e incorporacin deloxgeno a una molcula de sustrato.CITOCROMO OXIDASA:La citocromo oxidasa, es unaenzima de la cadena respiratoria por lo cual se encuentra en todos los tejidos especialmentecon el miocardio. Esta enzima contiene Fe, que pasa alternativamente de una formareducida a una oxidada. La funcin biolgica de la citocromo oxidasa es la catlisis deoxidacin por O2 del citocromo C. Esta enzima es inhibida por el cianuro que se acopla a laforma oxidada del hierro, bloqueando as a la enzima. En el laboratorio, la actividad de lacitocromo oxidasa (y su inhibicin por el cianuro) puede demostrarse mediante la oxidacinsecundaria de sustancias tales como la p-fenilendiamina que se vuelve roja o prpura con laoxidacin. En este caso, el cianuro inhibe la reaccin, acoplndose con el hierro oxidado dea citocromo oxidasa, evitando de esta manera, el funcionamiento ulterior de la enzima.DESHIDROGENASA LCTICA La enzima deshidrogenasa lctica est ampliamentedistribuida en todo el organismo, pero se encuentra especialmente en el msculo, hgado,corazn y rin. Su funcin es catalizar la oxidacin reversible del lactato a piruvato,removiendo o adicionando dos H. Para efectuar tal funcin, es necesaria la presencia de unacoenzima que es el NAD (nicotinamida adenin dinucletido), tambin ampliamentedistribuido en el organismo, la cual acta en otros sistemas enzimticos de oxidacin yreduccin. En tales reacciones, pasa de una forma oxidada (NAD) a una reducida(NADH+H+), esta ltima se reoxida mediante flavoprotenas termolbiles, las cuales a suvez, pueden reducir el azul de metileno a la forma incolora (leuco) por lo cual ste puede serusado en el laboratorio como indicador de las reacciones de xido- reduccin.

Al ensayar la reaccin de la deshidrogenasa lctica, el producto de la reaccin, el piruvato,debe ser removido por la adicin de KCN (para formar la cianhidrina del cido pirvico) y aspermitir que la reaccin proceda en un solo sentido y casi hasta su integridad. En la


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preparacin enzimtica tambin est presente suficiente flavoprotenas para reducir el azulde metileno. El presente artculo tiene la finalidad de exponer en forma clara y sencilla losefectos de las enzimas oxidativas sobre los tejidos del organismo y que caractersticas setienen que presentar para poder llevarlo a cabo.

Mtodos

Este trabajo lo realizamos en el laboratorio de la universidad cooperativa de Colombia amodo de prctica donde se llev a cabo una serie de pasos que nos llevaran a ladeterminacin de las enzimas mediante reacciones qumicas utilizando tejido de origenanimal en este caso un pollo, as como por reactivos NaCl al 0,9%,norita(carbn activado)yazul de metileno 0,02% este se realiz de tres maneras diferentes una primera parte lapreparacin del tejido del animal ,luego la preparacin de la coenzima y la enzima y porltimo la preparacin en tubos de ensayo de todas las preparaciones con la cual se

obtendrn los resultados.

Preparacin del tejido animal

Se tom un trozo de musculo de la pierna de un pollo fresco previa descongelacin pasofundamental para lograr unos buenos resultados.(imagen 1)

magen 1. Preparacin del tejido muscular.

Preparacin de la coenzima

Se Tomaron aproximadamente 1 gramo de msculo de una de las piernas del conejo y secolocaron en 8 mls de agua caliente (esto para inactivar las enzimas del msculo, quepueden destruir la coenzima despues de la muerte del animal). Se Calento el bao demaria hirviendo por 4 5 minutos; luego se enfrio y se paso todo el contenido del tubo a unmortero. Se le Aadio 1 gramo de arena y se trituro hasta formar una pasta fina.paso


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siguiente se Centrifugo la mezcla y guardo el sobrenadante que contiene la coenzima enun bao de hielo hasta ser usado. (imagen 2)

Imagen 2 (preparacin de la coenzima)

1. pesaje de la muestra 2.maceracion del tejido


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3. centrifugar la mezcla 4.guardar los sobrenadantes

Preparacin de la enzima

Se Tom aproximadamente 1 gramo de msculo de la otra pierna y se coloco en unmortero. Se Aadi 20 mls de NaCl 0.9% y 1 a 2 gramos de arena. Se Trituro hastaobtener una pasta fina. Luego la mezcla se pas a la Centrifuga por 10 minutos, se tomel sobrenadante, que contena la enzima lctica.

Para remover cualquier resto de la coenzima de la preparacin enzimtica evitando asque la muestra se daara se le aadi gramo de NORITA (carbn activado). El cualse mezcl por inversin. Se Dej reposar la mezcla con agitaciones ocasionales pormedia hora. Luego se centrifugo y se guard el sobrenadante que ser la solucin deenzima pura tambin en hielo hasta ser usada.(imagen 3)

5. pesaje de la nueva muestra 6.se le adiciono NaCl al 0.9 %


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6.se trituro la mezcla hasta formar una solucin 7.se centrifugo la mezcla

8. se sacaron los tubos con el sobrenadante.

Luego de tener ya preparado tanto la enzima como la coenzima, se aplic el procedimientode la siguiente tabla (tabla 1) para determinar que tubo tiene activa la coenzima la cualdebera reaccionar cambiando de color.

Tubo # Enzima(ml)

Coenzima(ml)

KCN0,5%(ml)

Lactato 1%(ml)

Azul demetileno0,2% (ml)

H2O (ml)

1 1 0 1 1 1 1

2 1 1 1 1 1 1

3 1 1 1 0 1 1

4 0 1 1 1 1 1

Tabla 1(preparacin de los tubos de ensayo)

Como ltimo paso luego de tener 4 tubos con la anterior indicacin (tabla 1) se Cubri

cada mezcla con aproximadamente 2mls de aceite mineral para establecer condicionesrelativamente anaerbicas. Y se esper tres horas para ver cuales muestras tuvieronalguna decoloracin lo que significaba positivo para nuestro estudio.

Resultados


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Teniendo en cuenta el siguiente cuadro se elabor cada tubo de ensayo:

TUBO # EnzimamL

CoenzimamL

KCN0.5% mL

Lactato1% mL

Azul demetileno0.2% mL

H2OmL

1 1 0 1 1 1 12 1 1 1 1 1 13 1 1 1 0 1 14 0 1 1 1 1 1

Tubo de ensayo N 1

En esta preparacin se trabaj con enzima extrada de tejido animal, se le adiciono

KCN (cianuro de potasio), Lactato, azul de metileno y agua; adems se le adiciono 2

mL de aceite mineral para dar un estado anaerbico al preparado. Esta solucin tomo

un color azul que al pasar 3 horas no cambio. Por esta razn no hubo reaccin.

Tubo de ensayo N2


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Esta solucin fue preparada utilizando enzima y coenzima de tejido animal, este

preparado contiene los dems componentes del tubo de ensayo N1, igualmente se le

adiciono 2 mL de aceite mineral, se calent por 3 horas, pero no tuvo una reaccin. La

coloracin inicial y final fue azul clara.

Tubo de ensayo N3

En este tubo de ensayo se aadieron todos los componentes exceptuando el lactato,

de igual forma se le aadieron 2 mL de aceite mineral y se calent por 3 horas; la

solucin tomo el mismo color de las dems soluciones (azul claro) pero pasadas las 3

horas no cambio, por ende no hubo reaccin.

Tubo de ensayo N4


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La preparacin N4 fue la solucin que primero se realiz, esta solucin no llevaenzima de tejido animal, contiene coenzima, KCN (cianuro de potasio), lactato, azul de

metileno y agua. Adicionalmente se le adiciono igual que a los dems 2 mL de aceite

mineral y por ltimo se calent por 3 horas. La coloracin igual que las otras

soluciones fueron azul claro desde el principio y permaneci as por las 3 horas. Por

ende no tuvo ninguna reaccin.

Discusin

Las enzimas oxidativas las encontramos en el tejido animal, especialmente en el tejidomuscular ya que son importantes en procesos de respiracin e incluso de contraccin. Pormedio de la prctica tratamos de identificar y enunciar la importancia biolgica de dichasenzimas, igualmente esclarecer la funcin y distribucin de las enzimas en tejidos animales.

La prctica en laboratorio busca obtener cuatro preparados con distintos reactivos paraobtener dichas reacciones enzimticas.


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La prctica se realiz de acuerdo a la gua, pero hubo varios tipos de errores que nopermitieron el perfecto resultado de la prctica, puesto que los preparados no reaccionaronen el tiempo indicado ni despus.

Conclusiones

Se logr enunciar la importancia biolgica de las enzimas por medio de los preparados, atravs del proceso de centrifugacin se separaron enzimas y coenzimas; gracias a distintosreactivos y a otros materiales como arena y norita

Por medio del agua caliente, se aislaron las enzimas y coenzimas de los tejidos muscularesseleccionados, se logr demostrar su relacin con el tejido animal.

Tericamente se puede establecer la funcin y funcin de las enzimas y coenzimas en lostejidos animales; prcticamente en laboratorio no se pudo establecer su funcin ydistribucin, puesto que los preparados no reaccionaron de acuerdo a los distintos reactivos

utilizados.

La inhibicin enzimtica se logra gracias a sustancias como el cianuro que inhibe lacitocromo oxidasa, en estos preparados no se pudo identificar la inhibicin de estas enzimas.

En esta prctica no tuvo una reaccin como la que se esperaba por varios factores o errorescometidos durante y antes de la prctica. Dos casos que pueden explicar la no reaccin en laprctica es que el tejido animal no fue utilizado de manera adecuada puesto que el animal yavarias horas muerto y las enzimas se deterioran rpidamente. Otro factor que pudo influir fueel uso escaso de aceite mineral, como se sabe el aceite mineral permite al preparado unestado anaerbico, en caso de entrada de aire al preparado inmediatamente se deteriora.

Bibliografa

www.ehu.es/biomoleculas/enzimas/enz1.htm

Linda J. Vorvick, MD, Medical Director and Director of Didactic Curriculum, MEDEX Northwest Division ofPhysician Assistant Studies, Department of Family Medicine, UW Medicine, School of Medicine, University ofWashington. Also reviewed by A.D.A.M. Health Solutions, Ebix, Inc., Editorial Team: David Zieve, MD, MHA,David R. Eltz, Stephanie Slon, and Nissi Wang.medline plus.

bioquibi.webs.ull.es/bioquimica%20estructural/.../fosforoxidativa.pdf

http://www.botanica.cnba.uba.ar/Pakete/3er/LaEnergia/imag/LAS%20ENZIMAS.html

http://www.sociciens.org/files/biosportmed/biosportmed/biosportmed_articulo_5.pdf
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Anexos

CUESTIONARIO

1. Usando la web explique con sus propias palabras que son las enzimas oxidoreductasas.

Las enzimas oxidoreductasas hacen parte de los 6 grandes grupos de las enzimas que seclasifican segn su accin cataltica.

Estas enzimas son las encargadas de catalizar las reacciones de oxidorreduccin, es decir,transferencia de hidrgeno (H) o electrones (e-) de un sustrato a otro, segn la reaccingeneral:

AH2 + B A + BH2

Ared + Box Aox + Bred

Ejemplos son la succinato deshidrogenasa o la citocromo c oxidasa.

2. Usando las bases de datos de la universidad descargue dos artculos relacionados ycolocarlos como link en la wiki.

3. Explique qu tubo reacciona y porque otros no.

Ninguna solucin reacciono

4. Explique el xito o fracaso de su prctica, errores posibles

En esta prctica realizada ningn tubo reaccion, es posible que haya ocurrido debido aque las enzimas ya estaban deterioradas en el tejido animal, lo cual ocurre inmediatamentede su muerte.


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Otro aspecto a tener en cuenta, puedo haber sido el aceite mineral utilizado paraestablecer condiciones anaerbicas, el cual pudo no haber realizado el aislamientocompletamente de las enzimas preparadas.

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