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Determinación de la actividad antibacteriana de los
extractos y hemolinfa de larvas de Lucilia eximia
(Diptera: Calliphoridae)
Paula Andrea Giraldo Hincapié
Universidad Nacional de Colombia
Facultad de Ciencias, Escuela de Biociencias
Medellín, Colombia
2014
Determinación de la actividad
antibacteriana de los extractos y
hemolinfa de larvas de Lucilia eximia
(Diptera: Calliphoridae)
Paula Andrea Giraldo Hincapié
Bióloga
Tesis presentada como requisito parcial para optar al título de:
Magister en Ciencias - Entomología
Director:
PhD., Sergio Orduz Peralta
Línea de Investigación:
Sustancias bioactivas para el control de patógenos
Grupo de Investigación: Ecología y Sistemática de Insectos
Facultad de Ciencias, Escuela de Biociencias
Medellín, Colombia
2014
Resumen
Lucilia eximia es una especie neotropical, de importancia médica y forense que ha sido
utilizada en la terapia larval como método de desinfección, desbridamiento y cicatrización
de heridas ulcerativas en pacientes en la ciudad de Medellín.
En el presente trabajo, mediante técnicas de ultrafiltración y cromatografía de alta
resolución (HPLC) se realizó una búsqueda preliminar de compuestos con actividad
antibacteriana, presentes en exosecreciones y hemolinfa de larvas de Lucilia eximia.
La evaluación de la actividad biológica de las fracciones de exosecreciones obtenidas
por HPLC indica la presencia de compuestos activos sobre bacterias gram positivas y
gram negativas, con pesos moleculares en el rango de 3-10 kDa y menores a 3 kDa. No
se encontraron diferencias significativas en cuanto a la inhibición del crecimiento de las
bacterias tratadas con excreciones y secreciones (E/S) expuestas y sin exposición a
patógenos.
Se encontraron ocho fracciones activas en un rango de peso entre 3-10 kDa y tres de
tamaño molecular menor a 3 kDa, en la hemolinfa de larvas expuestas a patógenos.
Las cepas Gram positivas, son más susceptibles a la exposición tanto de hemolinfa
como de E/S provenientes de larvas de L. eximia de tercer estadio.
Palabras clave: Lucilia eximia, respuesta inmune insectos, antimicrobianos, péptidos
antimicrobianos.
VI Determinación de la actividad antibacteriana de extractos y
hemolinfa de larvas de Lucilia eximia (Diptera: Calliphoridae)
Abstract
Lucilia eximia is a neotropical species of medical and forensic importance, which has
been used in maggot therapy as a method of disinfection, debridement and ulcerative
wound healing in diabetic patients in Medellín.
In this thesis, by ultrafiltration techniques and high performance liquid chromatography
(HPLC ) a preliminary search of compounds with antibacterial activity present in larval
hemolymph and exosecretions of L. eximia was made.
The evaluation of the biological activity of exosecretions's fractions obtained by HPLC,
indicates the presence of active compounds on Gram positive and Gram negative
bacteria, with molecular weights between 3 and 10 kDa and less than 3 kDa. No
significant difference in growth inhibition was observed between bacterial strains treated
with exosecretions previously exposed or not exposed to pathogenic bacteria.
Eight active fractions were found in a range between 3 and 10 kDa and three 3-fractions
lower than 3 kDa molecular weight, in the hemolymph of larvae exposed to pathogens.
The Gram-positive strains are more susceptible to exposure to both of hemolymph as
exosecretions from third instar larvae of L. eximia
Keywords: L. eximia, antimicrobial peptides, insect immunology.
VII
Contenido
Pág.
Resumen ....................................................................................................................... V
Lista de figuras ............................................................................................................. IX
Lista de tablas .............................................................................................................. XI
Introducción .................................................................................................................. 13
1 Objetivos ............................................................................................................... 17
1.1 Objetivo General ................................................................................................ 17
1.2 Objetivos Específicos ........................................................................................ 17
2 Estado del Arte ...................................................................................................... 18
2.1 Características generales de Lucilia eximia ..................................................... 20
2.2 Excreciones y secreciones (E/S) de larvas medicinales .................................. 21
2.3 Sistema Inmune en insectos ............................................................................. 23
2.3.1 Respuesta Celular .................................................................................. 24
2.3.2 Respuesta Humoral ................................................................................ 31
3 Metodología ........................................................................................................... 41
3.1 Colección de especímenes y mantenimiento en laboratorio ............................ 42
3.2 Aislamiento de compuestos antibacterianos .................................................... 42
3.3 Inducción de la respuesta inmune .................................................................... 43
3.3.1 Preparación de inóculo bacteriano......................................................... 43
3.3.2 Inoculación de especímenes .................................................................. 44
VIII Determinación de la actividad antibacteriana de extractos y
hemolinfa de larvas de Lucilia eximia (Diptera: Calliphoridae)
3.4 Colección de secreciones y excreciones (E/S) ................................................. 46
3.5 Colección de hemolinfa ..................................................................................... 46
3.6 Pre-purificación y fraccionamiento de exosecreciones y hemolinfa ................. 47
3.7 Fraccionamiento de exosecreciones y hemolinfa y purificación por HPLC ..... 47
3.8 Ensayos de actividad antibacteriana ................................................................ 48
3.9 Análisis de resultados........................................................................................ 49
4 Resultados y Discusión ..........................................................................................51
4.1 Actividad antibacteriana de E/S ........................................................................ 51
4.2 Actividad antibacteriana en hemolinfa .............................................................. 60
5 Conclusiones y recomendaciones ...........................................................................69
5.1 Conclusiones ..................................................................................................... 69
5.2 Recomendaciones ............................................................................................. 70
A. Anexo ....................................................................................................................71
6 Bibliografía .............................................................................................................72
Contenido IX
Lista de figuras
Figura 2-1 Caracteres morfológicos de importancia taxonómica en L. eximia ................. 21
Figura 2-2. Subtipos de hemocitos en Drosophila ............................................................ 28
Figura 2-3 Esquema de la respuesta inmune en insectos . ............................................... 32
Figura 2-4 Identificación de péptidos antimicrobianos en diferentes órdenes de insectos34
Figura 2-5 Sitios de expresión de péptidos antimicrobianos (AMP) en larvas de
Drosophila ........................................................................................................................... 35
Figura 2-6 Cecropinas en Diptera ...................................................................................... 37
Figura 2-7 Conformación estructural de las defensinas en insectos. ................................ 38
Figura 3-1. Trampa para insectos adultos, cebada con hígado fresco de cerdo. ............. 43
Figura 3-2 Grupos de tratamiento para obtención de muestras. ....................................... 45
Figura 4-1 Efecto de las E/S crudos de L. eximia sobre el crecimiento bacteriano. ......... 53
Figura 4-2 Cuartil-Cuartil (QQ-plot) .................................................................................... 55
Figura 4-3 Diagrama de cajas y bigotes del Índice de sobrevivencia de bacterias tratadas
con fracciones de exosecreciones ..................................................................................... 58
Figura 4-4 Q-Q plot para el índice de sobreviviencia de bacterias tratadas con hemolinfas
de L. eximia ......................................................................................................................... 61
Figura 4-5 Efecto de las hemolinfas sin fraccionar sobre tres cepas bacterianas. ........... 63
Figura 4-6 Diagrama de cajas y bigotes de los índices de viabilidad de bacterias tratadas
con diferentes clases de hemolinfa de L. eximia. .............................................................. 64
X Determinación de la actividad antibacteriana de extractos y
hemolinfa de larvas de Lucilia eximia (Diptera: Calliphoridae)
Figura 4-7 Diagrama de cajas y bigotes del Índice de sobrevivencia de bacterias tratadas
con hemolinfa fraccionada de L. eximia. ............................................................................ 66
Contenido XI
Lista de tablas
Tabla 2-1. Tipos de hemocitos en insectos ........................................................................ 26
Tabla 2-2: Categorización de los hemocitos en diferentes insectos. ................................ 27
Tabla 2-3 Receptores celulares homólogos en insectos y mamíferos involucrados en la
respuesta inmune (80) ........................................................................................................ 29
Tabla 2-4. Diptericinas de diversas especies de insectos dípteros ................................... 39
Tabla 4-1 Índice de sobrevivencia de cepas tratadas con ESH y ESM de L. eximia ....... 54
Tabla 4-2 Pruebas de Normalidad para la variable índice de sobrevivencia .................... 54
Tabla 4-3 Prueba de homogeneidad de varianza .............................................................. 54
4-4 Análisis de la Varianza para el Índice de sobrevivencia de cepas tratadas con E/S.. 55
4-5 Comparación de medias entre las fracciones según tipo de extracto......................... 57
Tabla 4-6 Fracciones de E/S con actividad inhibitoria, separadas por HPLC ................... 59
4-7 Test de normalidad de Shapiro-wilk ............................................................................. 61
4-8 Prueba de homogeneidad de varianza de Levene ...................................................... 62
Tabla 4-9 Comparación de Índices de sobrevivencia entre las cepas tratadas con
diferentes hemolinfas procedentes de L. eximia. ............................................................... 64
Tabla 4-10 Fracciones activas de hemolinfa de L. eximia, separadas por HPLC............. 68
13
Introducción
Los insectos conforman uno de los grupos animales más exitosos. Desde su aparición
hace 400 millones de años (1), han colonizado todos los hábitats a excepción del mar y
se estima que conforman el 90% de la biodiversidad animal (2).
La diversidad bioquímica y molecular que han alcanzado ha sido aprovechada por el
hombre al incorporar los insectos como fuente alimentaria (3,4), recurso medicinal
(5,6,7), en la agricultura y de manera reciente en la industria tecnológica, como
inspiración intelectual para el desarrollo e innovación en ingeniería de materiales,
robótica, entre otras(8).
En los últimos años, los estudios sobre fisiología y ecología de insectos se han enfocado
no solo en investigación básica sino también en el área bioprospectiva, permitiendo
explorar el uso funcional de moléculas que estos producen(9). De esta manera, se han
identificado proteínas, péptidos y otras compuestos con actividad antimicrobiana(10),
antiviral y antitumoral(11), analgésica(12), antiinflamatoria(13), entre otros.
Las moléculas aisladas a partir de diversas fuentes como tejidos, venenos y el sistema
inmune de insectos, han sido caracterizadas e incluso modificadas por medio de técnicas
moleculares y de ingeniería genética con el fin mejorar su eficiencia. De esta manera se
han sintetizado por ejemplo, compuestos de interés para la industria médica y
farmacéutica(5,14).
La resistencia a antimicrobianos es considerada como un problema de salud pública por
la Organización Mundial de la Salud desde 1999 (15). En consecuencia, la búsqueda de
14 Determinación de la actividad antibacteriana de extractos y hemolinfa de larvas de
Lucilia eximia (Diptera: Calliphoridae)
compuestos con actividad antibacteriana es uno de los temas de investigación de mayor
relevancia en la actualidad. En este sentido, se han constituido compañías dedicadas a la
búsqueda de moléculas con actividad biológica derivadas de insectos, llevando a cabo
propuestas como el proyecto “Drugs from Bugs” de la División de Entomología de
CSIRO, quienes desarrollan una librería de extractos derivados de insectos para la
búsqueda de moléculas con potencial farmacéutico (goliath.ecnext.com/.../Drugs-from-
bugs-the-promise.html). También se ha conformado recientemente un consorcio francés
para desarrollar entre otras cosas, productos naturales derivados de insectos, mediante
la creación de un “Life Science Corridor” que se propone producir las “innovaciones
terapéuticas del mañana” (www.alsace-biovalley.com/). China es otro de los países
interesados en el área farmacéutica. Compañías como Jiangsu Protelight Pharmaceutical
(www.protelight.com) especializada en la búsqueda de medicamentos basados en
péptidos y el Center of Excellence (COE) con su programa "Research for utilization of
insect properties", están incursionando en el campo bioprospectivo de insectos en la
búsqueda de compuestos no solo con actividad antimicrobiana sino también aquellos con
actividad anticancerígena e inhibidores de crecimiento tumoral(16).
Según Melgarejo y cols.(17), la bioprospección en el área animal en Colombia es un
tema que apenas comienza a ser explorado, donde se destaca el estudio de organismos
marinos.
En cuanto a los insectos, se conoce sobre el uso medicinal de algunas especies (18) y se
encuentra publicado un trabajo en bioprospección que implica la caracterización de un
péptido antimicrobiano presente en el vector de Chagas Rhodnius prolixus, con actividad
biológica contra cepas bacterianas Gram positivas y Gram negativas (19). Aunque se
cuenta con alrededor de 71 grupos de investigación colombianos que trabajan en
bioprospección(20), los estudios prospectivos en insectos son poco abordados en
nuestro país.
15
Las moscas de la familia Calliphoridae son consideradas de importancia ecológica,
médica y sanitaria (21). Su fuerte preferencia por asentamientos humanos y sustratos
como carne u otra materia orgánica en descomposición, permite que estén en contacto
con organismos potencialmente patógenos y por lo tanto se pueden considerar como un
grupo promisorio para la búsqueda de antimicrobianos.
En Colombia, se ha avanzado en el inventario de califóridos debido a su importancia
forense para la determinación de intervalos post-mortem. También se han llevado a cabo
estudios sobre sus ciclos de vida, índice de sinantropia (22) y se dispone de claves
taxonómicas para la determinación de adultos e inmaduros de las especies locales
(23,24). Por lo tanto se puede considerar como un grupo de insectos bien caracterizado
en el país y de potencial interés en bioprospección.
Recientemente se ha documentado la inducción de angiogénesis y la actividad
bactericida y bacteriostática de péptidos y metabolitos de bajo peso molecular aislados
de larvas de Lucilia sericata (Meigen, 1826) (Diptera: Calliphoridae) (25,26). Esta mosca
es de especial interés a nivel mundial como especie de elección en la terapia larval,
terapia de desbridamiento o biocirugía. Un tratamiento terapéutico reintroducido en los
años 80 en Estados Unidos, como alternativa al tratamiento de ulceras varicosas y
heridas crónicas en pacientes que no responden a los métodos convencionales, como en
el caso de infecciones óseas y cutáneas por cepas resistentes a meticilina y
vamcomicina (27).
La eficiencia de L. sericata en la desinfección de heridas infectadas se explica
parcialmente por la presencia de moléculas con actividad antibacteriana presentes en su
hemolinfa, secreciones y excreciones. Estos compuestos han sido descritos como
proteasas, péptidos y moléculas de naturaleza no proteica, con actividad bactericida o
bacteriostática, incluso sobre cepas meticilino-resistentes (25).
16 Determinación de la actividad antibacteriana de extractos y hemolinfa de larvas de
Lucilia eximia (Diptera: Calliphoridae)
Así mismo, se han aislado péptidos antibacterianos de la familia de las defensinas
(Lucifensina I y II), presentes en larvas de L. sericata y L. cuprina (28,29).
L. eximia (Wiedeman, 1819) es una especie neártica y neotropical, de amplia distribución
en Colombia, que ha sido registrada como primera colonizadora de cuerpos en
descomposición en un amplio rango altitudinal. Además, es considerada de importancia
médica y forense en Suramérica y Colombia, donde ha sido utilizada en la terapia larval
como método de desinfección, desbridamiento y cicatrización de heridas ulcerativas en
pacientes en la ciudad de Medellín (30).
En el presente trabajo, mediante técnicas de ultrafiltración y cromatografía de alta
resolución (HPLC), se realizó una búsqueda preliminar de los compuestos con actividad
antibacteriana, presentes en las exosecreciones (secreciones y excreciones) y la
hemolinfa de larvas de L. eximia. Las pruebas de actividad biológica se realizaron sobre
tres cepas bacterianas consideradas como patógenas humanas.
17
1 Objetivos
1.1 Objetivo General
Determinar la actividad antibacteriana de extractos y hemolinfa de larvas de
Lucilia eximia.
1.2 Objetivos Específicos
Caracterizar la actividad antimicrobiana de la hemolinfa de larvas de L. eximia
inmunizadas con bacterias Gram positivas y Gram negativas.
Caracterizar la actividad antimicrobiana de secreciones y excreciones de L.
eximia sobre cepas bacterianas Gram positivas y Gram negativas.
Verificar la actividad antimicrobiana de las diferentes fracciones de la hemolinfa y
extractos de larvas de L. eximia.
18 Determinación de la actividad antibacteriana de extractos y hemolinfa de larvas de
Lucilia eximia (Diptera: Calliphoridae)
2 Estado del Arte
Las moscas de la familia Calliphoridae comparten una línea evolutiva común cuyo estado
ancestral es la saprofagia, es decir, el desarrollo de individuos sobre materia en
descomposición (31). En esta familia ha ocurrido una diversificación de hábitos que
incluye además de la saprofagia, el parasitismo facultativo, en el cual los estados
inmaduros se desarrollan sobre tejido necrosado de animales heridos y el parasitismo
obligado, que consiste en el desarrollo de individuos sobre tejidos sanos de vertebrados
inclusive en el hombre. Este último caso se conoce en el ámbito medico sanitario como
miasis(32).
La terapia larval o biocirugía es una miasis controlada, que consiste en la aplicación de
larvas de moscas sobre heridas cutáneas(33). Surgió como terapia clínica a partir de las
observaciones de los efectos beneficiosos que resultaron de las infestaciones por parte
de larvas, en lesiones de soldados heridos durante la época napoleónica (34). Tales
efectos consistieron en la aceleración del proceso de cicatrización y la prevención del
desarrollo de infecciones, debido a la presencia de larvas que se alimentaban del tejido
necrosado (27). Actualmente, la terapia larval es utilizada en pacientes que no responden
a los tratamientos antibióticos convencionales o que tienen su sistema inmune
comprometido como en el caso de pacientes diabéticos (35).
19
En Colombia se han registrado 12 géneros y 29 especies de califóridos, de las cuales por
lo menos 13 están asociadas a cadáveres en descomposición (23,24). Por lo tanto, se
presume que tienen una estrategia inmune eficiente que les permite sobrevivir en
ambientes potencialmente patógenos. En este sentido, las especies de la familia
Calliphoridae son un recurso valioso no sólo para la búsqueda de especies alternativas
en bioterapia sino también de compuestos antimicrobianos.
De particular interés se considera el género Lucilia representado en el país por cinco
especies de amplia distribución geográfica, dos de las cuales han sido utilizadas en
terapia larval (30,36). Así mismo, de manera reciente se ha avanzado en el estudio de las
propiedades antibacterianas y composición molecular de la hemolinfa y exosecreciones
de Sarconesiopsis magellanica, una especie que en nuestro país está asociada a
cadáveres en descomposición (37,38).
L. sericata, es una especie parásita facultativa, que tiene preferencia por el tejido
necrosado. Desde 1931, es la especie de uso convencional en bioterapia debido a que
fue la primera especie que se utilizó con éxito en seres humanos, probada en pacientes
con osteomielitis crónica (39). Además se distribuye en un amplio rango geográfico lo
que ha permitido colonizarla en países como Inglaterra, Alemania, Estados Unidos y
Colombia.
La investigación científica en el contexto de la terapia larval se ha enfocado en la
búsqueda y selección de especies alternativas(27,30), así como en la comprensión del
mecanismo de acción de las larvas sobre la herida (40) y el aislamiento y caracterización
de los compuestos implicados en potenciamiento del proceso de cicatrización (41,42) y la
actividad antibacteriana (25,26,43,44). Al respecto se destaca el desarrollo de hidrogeles
utilizados para prevenir la infección de pieles en proceso de cicatrización, que contienen
péptidos antimicrobianos aislados de califóridos(45,46).
20 Determinación de la actividad antibacteriana de extractos y hemolinfa de larvas de
Lucilia eximia (Diptera: Calliphoridae)
2.1 Características generales de Lucilia eximia
L. eximia es una especie neártica y neotropical frecuentemente encontrada en áreas
urbanas, que se alimenta primariamente de carroña, pero también de frutas y desechos
urbanos (22). En el Neotrópico se encuentra en Argentina, Brasil, Colombia, Costa Rica,
Ecuador, Guatemala, México, Panamá, Puerto Rico, Guyana y Trinidad y Tobago (47).
Ha sido registrada como causante miasis primaria en animales (48), pero también ha sido
utilizada desde el 2002 en la terapia larval como método de desbridamiento y para
disminuir el mal olor resultante de la descomposición bacteriana en úlceras de gran
tamaño debidas a tumores o escaras(30). En Colombia es considerada de importancia
forense, debido a que se ha registrado como primera colonizadora de cuerpos en
descomposición (49,50).
L. eximia atraviesa por cuatro estados de desarrollo, huevo, larva con tres estadios, pupa
y adulto. Las hembras pueden ovipositar hasta 92 huevos, durante por lo menos dos
momentos de su ciclo de vida. Según observaciones en campo sobre trampas cebadas
con hígado, las hembras tienen preferencia de ovipositar a la sombra (datos no
publicados).
Las larvas son de comportamiento gregario. Atraviesan por tres estadíos denominados
L1 a L3 diferenciados por características como la presencia de una a tres hendiduras en
las placas espiraculares posteriores y el desarrollo del esqueleto cefalofaríngeo (Figura
2-1). La duración del estado de larva es de aproximadamente 100 horas bajo una
temperatura promedio de 28ºC. El periodo de pupación puede durar, bajo esta misma
temperatura, diez días.
Los adultos son de coloración variable, desde verde hasta azul con visos violáceos y
rojizos, siempre con brillo metálico. La diferenciación entre machos y hembras puede
hacerse a simple vista debido a que en los machos los ojos llegan a unirse uno con el
21
otro mediante una delgada sutura (ojos holópticos) mientras que en las hembras están
separados (ojos diópticos). La identificación taxonómica de los adultos se basa en
características como el ancho relativo de la frente y la forma de los genitalia en los
machos (47).
2.2 Excreciones y secreciones (E/S) de larvas medicinales
El uso de larvas para el tratamiento de heridas tiene tres efectos importantes en el
proceso de restauración: (a) desbridamiento del tejido necrosado, (b) estimulación para la
formación del tejido de granulación y (c) acción antiséptica debido a las secreciones y
excreciones antibacterianas de las larvas (34).
B
TDI
TD
M
TDE TVE
TVM
TVI
D E
B
C
(A) Hembra de L. eximia. (B) larva L3. (C) Segmento terminal de larva L3 de L. eximia. (D) placa espiracular de
una larva en L3, tratada con KOH al 10%. Fotografía en microscopía óptica. 40X aumento. TD: tubérculos
dorsales;TDI: tubérculos dorsales internos; TDM: tubérculos dorsales medios; TDE: tubérculos dorsales
externos; TVE: tubérculos ventrales externos; TVM: tubérculos ventrales medios; TVI: tubérculos ventrales
internos. (E) Vista lateral del esqueleto cefalofaríngeo de una larva en L3, tratada con KOH al 10%. (dc: Cuerno
dorsal; vc: Cuerno ventral; tnt phgm: Fragma tentorial; hyp: Hypostoma; de: Dentículo; md: Esclerito mandibular).
Fotografía en microscopía óptica. 10X aumento. Fotografías Paula Giraldo.
A
Figura 2-1 Caracteres morfológicos de importancia taxonómica en L. eximia
22 Determinación de la actividad antibacteriana de extractos y hemolinfa de larvas de
Lucilia eximia (Diptera: Calliphoridae)
Las E/S larvales se componenen de productos secretados por el intestino y las glándulas
salivales. Contienen principalmente las enzimas proteolíticas necesarias para la
degradación del sustrato alimenticio y posterior ingestión (51). También están presentes
compuestos con actividad antibacteriana lo cual fue demostrado por Simmonns (52) en
los años 30. Así mismo se comprobó la destrucción en el tracto intestinal de las bacterias
ingeridas por las larvas, estimando el número de células de E. coli viables en las
diferentes secciones intestinales de larvas de L. sericata, mediante microscopia confocal
(40), lo que permite pensar que existen sustancias antibacterianas en el intestino que
pueden ser secretadas en el sustrato alimenticio de las larvas.
A la fecha se han realizado diferentes estudios sobre las propiedades antimicrobianas de
las exosecreciones de las especies utilizadas en terapia larval. Estos estudios han
demostrado que las E/S son más eficientes sobre bacterias gram positivas que sobre
gram negativas (25,26,53). Los trabajos iniciales sobre las propiedades de las E/S
describieron características fisicoquímicas y biológicas como, la estabilidad térmica,
condiciones óptimas de pH, resistencia a proteasas y actividad antimicrobiana sobre
cepas patógenas humanas, entre ellas algunas con conocida resistencia a
antibióticos(28,29,40).
Las moléculas con actividad antimicrobiana aisladas de estas especies reportadas en la
literatura, han sido identificadas básicamente según su peso molecular. Se han
encontrado moléculas entre 3 y 10 kDa, de naturaleza proteica, dos de las cuales han
sido identificadas como péptidos antimicrobianos tipo defensinas con marcada actividad
sobre bacterias Gram positivas y sobre Candida albicans (28,29,40). Estos péptidos al
parecer se expresan de manera constitutiva en las glándulas salivales de las larvas de
primer estadio y se mantienen hasta el momento previo a la pupación, lo que explicaría
su presencia en las exosecreciones. Así mismo han sido encontrados en el intestino y
tejido graso de larvas expuestas a ambientes infecciosos(28,54).
23
También se han encontrado moléculas de bajo peso molecular (menor a 1 kDa) con
actividad sobre cepas resistentes a meticilina (26). Entre ellos aminoácidos libres como el
L- valinol y ácidos orgánicos como el ácido hidroxibenzoico (138 Da) y el ácido (p–
hydroxifenil) acético (152 Da) y dímeros de prolina(42,55).
Los estudios recientes sobre E/S de larvas medicinales apuntan hacia la caracterización
de enzimas proteolíticas (56) y a la identificación de compuestos que estimulan el
proceso de cicatrización mediante la degradación de la matriz extracelular y la
atenuación del proceso inflamatorio(42). También se ha diseñado un prototipo de
hidrogel que contiene exosecreciones de L. sericata, el cual acelera el cierre de heridas
mediante al promover el crecimiento de fibroblastos y queratinocitos, in vitro (45).
2.3 Sistema Inmune en insectos
La inmunidad se refiere a todas aquellas funciones biológicas que le confieren protección
a un organismo contra los efectos nocivos de factores de diversos tipos como, moléculas,
células, órganos y organismos(57).
La inmunidad puede ser innata o adquirida. La inmunidad innata se refiere a la capacidad
intrínseca de un organismo para detectar y contrarrestar los efectos potencialmente
nocivos de factores ajenos a él (58), mientras que la inmunidad adquirida, se desarrolla
en respuesta a una infección y su intensidad y capacidad defensiva aumentan, después
de cada exposición subsiguiente a un determinado agente(59).
Los insectos han desarrollado estrategias de respuesta innata eficientes que les ha
permitido habitar ambientes diversos, algunos de los cuales están enriquecidos con
microorganismos potencialmente patógenos. Estas estrategias son de tipo humoral y
celular. La respuesta humoral consiste en moléculas efectoras solubles que incluyen
péptidos antimicrobianos (AMP por sus siglas en inglés), proteínas y productos
generados por cascadas de complejos proteolíticos como especies reactivas de oxígeno
24 Determinación de la actividad antibacteriana de extractos y hemolinfa de larvas de
Lucilia eximia (Diptera: Calliphoridae)
e intermediarios de nitrógeno que se producen durante la melanización, la cual es
inducida por la activación de la cascada de la Profenoloxidasa (pro-PO por sus siglas en
inglés), (10,60).
La respuesta celular se refiere a mecanismos como la fagocitosis, encapsulación y
formación de nódulos, en los cuales intervienen directamente los hemocitos (61).
Aunque se pensaba que los insectos carecen de inmunidad adaptativa, un estudio
reciente con moscas adultas de Drosophila melanogaster indica la existencia de un
mecanismo de respuesta similar a la memoria adaptativa en vertebrados (62). En esa
investigación se demostró que la inmunización de moscas adultas de Drosophila con una
dosis subletal de Streptococcus pneumoniae fue suficiente para proteger los individuos
expuestos a una segunda exposición con S. pneumoniae, pero no para protegerlos de
infecciones con otras cepas patógenas. El efecto protector de la inmunización con S.
pneumoniae fue específico y persistente durante la vida de la mosca.
2.3.1 Respuesta Celular
2.3.1.1 Hemocitos
La respuesta celular en insectos está mediada por células especializadas presentes en la
hemolinfa, que reconocen, controlan y eliminan patógenos cuando estos han traspasado
las barreras estructurales como la cutícula de exoesqueleto y el tejido epitelial y han
alcanzado el hemocele.
La comprensión actual del desarrollo de los hemocitos y las respuestas de defensa
celular se deriva principalmente del estudio de insectos modelo como D. melanogaster
(63), algunos Lepidoptera de importancia en la agricultura (64) e insectos vectores (65).
25
Los hemocitos también han sido descritos en especies de órdenes como Orthoptera,
Blattodea, Coleoptera, Hymenoptera, Hemiptera y Colembolla (61). Sin embargo la
mayor parte de estos estudios son de carácter morfológico y carecen de información
suficiente sobre su función. Por lo tanto diferentes morfotipos celulares pueden tener
funciones similares. Un ejemplo de ello es la tipificación de los Plasmatocitos, las Células
Cristalinas y los Lamelocitos en Drosophila, los cuales a su vez son morfológica y
funcionalmente similares a los Granulocitos, Oenocitos y Plasmatocitos en Lepidoptera,
respectivamente(66). En las Tabla 2-1 y Tabla 2-2 se listan los tipos de hemocitos que
han sido descritos en diferentes insectos (67).
En larvas de Drosophila los hemocitos se diferencian en tres tipos:
Plasmatocitos. Son células fuertemente adherentes in vitro que representan el
90-95% del total de hemocitos maduros en la hemolinfa. Participan en la
fagocitosis de bacterias y cuerpos apoptóticos (68) y en procesos de cicatrización.
También producen péptidos antimicrobianos y secretan componentes de la matriz
extracelular (ECM por sus siglas en ingles), (69).
Células cristal ó hialinas. Son células no adherentes que comprenden
aproximadamente el 5% de los hemocitos en circulación y expresan componentes
de la cascada de las Fenoloxidasas (PO por sus siglas en inglés), los cuales a su
vez son importantes para la activación del mecanismo de melanización(70).
Lamelocitos. Son hemocitos planos de gran tamaño y adherentes. Están
prácticamente ausentes en larvas de Drosophila sanas, pero se ha observado que
se diferencian rápidamente a partir de Prohemocitos en larvas expuestas al
ataque de parasitoides y durante la metamorfosis. Su función es la encapsulación
de parasitoides y otros cuerpos extraños de gran tamaño (71).
26 Determinación de la actividad antibacteriana de extractos y hemolinfa de larvas de
Lucilia eximia (Diptera: Calliphoridae)
Tabla 2-1. Tipos de hemocitos en insectos
Hemocito Acrónimo Hemocito Acrónimo
Plasmatocitos PLs Vermicitos VEs
Granulocitos GRs Podocitos POs
Esferulocitos SPs Coagulocitos Cos
Adipohemocitos ADs Lamelocitos Las
Espinocitos SNs Trombocitoides THs
Oenocitoides Oes Prohemocitos PRs
Los hemocitos se producen durante la embriogénesis de la cabeza o el mesodermo
dorsal y durante el estado larval o ninfal en órganos hematopoyéticos derivados del
mesodermo (72). Los órganos hematopoyéticos en Drosophila son ganglios linfáticos que
se forman bilateralmente a lo largo de la parte anterior del vaso dorsal durante la
embriogénesis. Contienen precursores de prohemocitos (pre-prohemocitos) los cuales se
diferencian en los tres tipos de hemocitos anteriormente mencionados. Los hemocitos
diferenciados que se encuentran en circulación también proliferan y ayudan a mantener
las poblaciones de hemocitos (73). En figura 2-1 se ilustran los tipos de hemocitos en
Drosophila.
27
Tabla 2-2: Categorización de los hemocitos en diferentes insectos.
Investigadores Organismo Subtipo de Hemocito reportado
Yeager (1945) Prodenia eridania
Proleucocytoides, células cromofilicas derivadas de
proleucocitoides, OEs, PLs, POs, VEs, Cystocitoides,
Esferoidocitos, células eruptivas inestables y células
degradadas.
Jones (1959) Prodenia eridania PRs, OEs, PLs, Pos, Ves, GRs, cystocitos, Esferoidocitos y SPs.
Jones (1962) Insectos PRs, PLs, GRs, Ads y OEs.
Gupta (1979) Insectos Tipos de Hemocitos, su estructura, sinonimias, relaciones y
significancia taxonómica.
Zachary et al.,
(1973)
Calliphora
erythrocephala PLs, OEs, THs.
Arnold (1982) 85 especies de la
Familia Noctuide
PRs, PLs, GRs, Ads and OEs, the VEs, POs, Cos, Los, THs y
SNs tambien han sido documentados.
Ashhurst (1982) Galleria mellonella
4 tipos de celulas funcionales; PLs, GRs, SPs y OEs con base
en estudios de inmunohistoqúimica.Mas tarde se confirmó la
presencia de PRs, PLs, SPs, ADs y OEs.
Mishra (1999) Dysdercus koenigii PRs, PLs, GRs, ADs y OEs, presencia de VEs en estados
específicos del desarrollo.
Pandey et al.,
(2003) Papilio demoleus
PRs, PLs, GRs, SPs, ADs y OEs. POs y VEs como variantes de
PLs.
Tulin et al.,
(2003) Calliphora vicina
PRs,PLs, Oes, POs, Histolisocitos y Células con inclusiones
cristalinas.
Pandey y Tiwari
(2005) Danais chrysippus
PRs, PLs, GRs, SPs, ADs y OEs, presencia de POs VEs en
estados específicos del desarrollo.
Tiwari at al.,
(2006) D. koenigii PRs, PLs, GRs, ADs y OEs. No se encontraron SPs.
Pandey et al.,
(2010) Antheraea mylitta
PRs, PLs GRs, SPs, ADs and OEs. Los VEs y POs fueron
encontrados en estados larval y pupal como variantes de PLs.
28 Determinación de la actividad antibacteriana de extractos y hemolinfa de larvas de
Lucilia eximia (Diptera: Calliphoridae)
Figura 2-2. Subtipos de hemocitos en Drosophila (74)
Los plasmatocitos se asemejan al linaje de macrófagos de monocitos de mamíferos y están involucrados en
la fagocitosis, encapsulación y la producción de péptidos antimicrobianos. Los Lamelocitos, que rara vez se
ven en larvas sanas, son más grandes que otros hemocitos y están involucrados en la encapsulación de los
patógenos invasores. Muchos Lamelocitos derivan directamente de plasmatocitos, como se indica por la
flecha. Las células cristal se rompen para liberar componentes de la cascada de fenoloxidasa, que participan
en el proceso de encapsulación de los organismos invasores, la coagulación y la cicatrización.
No existe evidencia de hematopoyesis en el estado adulto de Drosophila, sin embargo,
se sabe que tienen una población fija de hemocitos sésiles, localizada principalmente en
la porción anterodorsal del abdomen, los cuales solo tienen función fagocítica (75).
En estudios morfológicos sobre hemocitos de larvas y pupas jóvenes de Calliphoridae, se
han registrado cuatro tipos morfológicos, prohemocitos, oenocitoides, plasmatocitos y
trombocitoides. Además se ha descrito la presencia de filopodocitos, células cristal e
histolisocitos, los cuales poseen una serie de características específicas y representan
tres líneas de células independientes, lo cual apoya la hipótesis poligénica de la
hematopoyesis en los insectos (76,77).
Los plasmatocitos de Calliphora vicina, tienen actividad citotóxica análoga a las células
natural killers (NK) en mamíferos. Reconocen las células blanco como no propias,
29
mediante la formación de un conjugado e induciendo el proceso de apoptosis que
conduce a la muerte del blanco celular. Así mismo, el aumento en el número de
plasmatocitos en la hemolinfa en el estado previo a la metamorfosis, sugiere que pueden
inducir apoptosis en las células de las larvas utilizando el mismo mecanismo citotóxico
(78). Aunque las células NK están presentes en otros Phyla de invertebrados, solo han
sido descritos en Calliphoridae (79).
Los mecanismos de respuesta celular fagocitosis, nodulación y encapsulación son
inducidos por la presencia de organismos patógenos que son reconocidos por proteínas
de superficie presentes en los hemocitos, algunos de los cuales tienen homólogos en
mamíferos. En la Tabla 2-3 se presentan los receptores celulares involucrados en el
reconocimiento de patógenos en Diptera.
Tabla 2-3 Receptores celulares homólogos en insectos y mamíferos involucrados en la respuesta inmune
(80)
Receptor Función que activa Drosophila Mosquitos Mamíferos
Intreginas Encapsulación + + +
Dscam Fagocitosis Bacterias + + +
Nimrod Fagocitosis + + +
PGRP-CL Fagocitosis Gram + + + +
dSR-Cl Reconocimiento Gram +/- + - -
Croquemort Fagocitosis de cuerpos apoptóticos + - +
Eater Fagocitosis Gram +/- + - +
Draper Fagocitosis de cuerpos apoptóticos + - +
Peste Reconocimiento de Mycobacterias + - +
LRP Fagocitosis - + +
Noduler Nodulación - - -
30 Determinación de la actividad antibacteriana de extractos y hemolinfa de larvas de
Lucilia eximia (Diptera: Calliphoridae)
2.3.1.2 Fagocitosis
La fagocitosis es una respuesta de defensa altamente conservada. Se refiere al
reconocimiento, captación y la destrucción intracelular de patógenos, cuerpos
apoptóticos (81) y objetos pequeños por hemocitos individuales (61). En insectos, es
llevada a cabo principalmente por los plasmatocitos, granulocitos y oenocitoides que
circulan en la hemolinfa (82,83).
La fagocitosis requiere múltiples interacciones sucesivas entre el fagocito y el patógeno,
así como eventos de transducción de señales secuenciales. Se induce cuando los
receptores de la superficie de los fagocitos son activados por células diana, seguido por
la formación de un fagosoma y la internalización del blanco a través de un mecanismo de
polimerización dependiente de actina. Finalmente, el fagosoma madura a fagolisosoma a
través de una serie de eventos de fisión y fusión con endosomas y lisosomas(84).
Los hemocitos de insectos pueden fagocitar diferentes tipos de bacterias, hongos,
levaduras y protozoos, aunque la respuesta depende del organismo blanco. Por ejemplo,
en Anopheles albimanus y Aedes aegypti, la respuesta inicial de los hemocitos a la
presencia de Escherichia coli es la fagocitosis. Mientras que frente a Micrococcus luteus
inicialmente ocurre melanización y luego fagocitosis (85,86). También se ha observado
que existen diferencias en la eficacia y la rapidez con la que ocurre la fagocitosis.
Estudios en líneas celulares de An. gambiae y hemocitos aislados de Ceratitis capitata,
demuestran que E. coli es fagocitada más fácilmente que Staphylococcus aureus (82,87).
2.3.1.3 Encapsulación
La encapsulación se refiere a la unión de hemocitos a cuerpos extraños de gran tamaño
tales como parásitos, protozoos y nemátodos, que no pueden ser fagocitados, e implica
31
la adhesión de múltiples capas de hemocitos que rodean el organismo invasor así como
la inducción de la respuesta de melanización (61).
Se conocen dos tipos de encapsulación. La encapsulación celular, ampliamente descrita
en Lepidoptera (64) y la encapsulación melanótica (humoral), mediada por la actividad de
la profenoloxidasa (PO), que puede ocurrir sin la participación de hemocitos (88).
Se ha observado que la introducción de parasitoides, por ejemplo huevos de
Hymenoptera en larvas de Drosophila, induce cambios morfológicos en los plasmatocitos
y en sus propiedades adhesivas, permitiendo que formen una cápsula alrededor de la
matriz extracelular, de manera similar al proceso de agregación plaquetaria que ocurre
durante la trombosis en mamíferos. Los plasmatocitos adheridos comienzan a apilarse
sobre el huevo y a unirse ente si formando capas delgadas de plasmatocitos, hasta
separar el huevo del hemocele (89). Dentro de la cápsula el invasor muere a causa de la
producción local de los radicales libres citotoxicos como ROS y RNS o por asfixia.
2.3.1.4 Nodulación
La nodulación es el mecanismo de defensa celular predominante en los insectos y se
refiere a los agregados multicelulares de hemociticos que atrapan un gran número de
bacterias. También se pueden formar de agregados de hemocitos que se asemejan a los
nódulos, en presencia de lipopolisacárido (LPS) y glicoproteínas. La formación de
nódulos es un proceso mediado por lectinas, eicosanoides, la profenoloxidasa y la
dopadescarboxilasa (DDC), (88).
2.3.2 Respuesta Humoral
La respuesta humoral implica la inducción rápida de cascadas proteolíticas en la
hemolinfa, que inducen la melanización y coagulación, así como la síntesis de péptidos
antimicrobianos en el tejido graso, equivalente funcional del hígado de los mamíferos.
32 Determinación de la actividad antibacteriana de extractos y hemolinfa de larvas de
Lucilia eximia (Diptera: Calliphoridae)
La respuesta humoral se origina en presencia de patrones moleculares que son
característicos de los polisacáridos presentes en hongos y bacterias (90). La inyección de
peptidoglicano ó bacterias completas en larvas de Manduca sexta y Bombyx mori
estimula la síntesis de proteínas como lisozimas, cecropinas y hemolina por el tejido
graso (64). Lo que sugiere que existen receptores de peptidoglicano en las células del
tejido graso. Así mismo, han sido identificados compuestos termoestables de naturaleza
hidrofóbica, menores de 3 kDa, que son secretados por el tejido graso en larvas de
Calliphora vicina y en epiteliocitos del integumento, que liberan factores humorales para
la síntesis de péptidos en respuesta a la infección con bacterias(91).
Esquema que representa la respuesta inmune ante la exposición a diferentes antígenos. Los recuadros
denotan los principales receptores y vías de señalización.
Figura 2-3 Esquema de la respuesta inmune en insectos (135).
33
2.3.2.1 Péptidos Antimicrobianos
Los péptidos antimicrobianos (AMPs por sus siglas en inglés) son antibióticos naturales
producidos por casi todos los organismos desde bacterias hasta plantas y animales(92).
Están conformados por aminoácidos y pueden ser sintetizados en diferentes tejidos de
un mismo organismo. Los péptidos AMPs de la clase RAMPs - por su mecanismo de
producción vía ribosomal- incluye aquellos con actividad antimicrobiana a excepción de
las enzimas producidas por bacterias y hongos (no RAMPs), que eliminan
microorganismos mediante su actividad hidrolitica y en cuya síntesis se incorporan
aminoácidos inusuales, que pueden ser modificados por procesos como por ejemplo la
glicosilación (93).
Los péptidos antimicrobianos se caracterizan por su interacción hidrofóbica y
electrostática con las membranas microbianas, resultando en dos posibles mecanismos,
de acción, dependiendo del péptido y de la especie de microorganismo. Pueden causar
lisis celular ó la formación de poros transmembranales que permiten su transporte al
interior de las células donde inhiben la síntesis de ARN y algunas proteínas entre las
cuales se encuentran aquellas asociadas a la síntesis de la pared celular (94). Los
detalles sobre los mecanismos de acción de los péptidos antimicrobianos han sido
ampliamente descritos por diferentes autores(10,95,96).
Se han descubierto numerosos péptidos antimicrobianos en insectos. El primero de ellos
de la familia de las cecropinas, fue aislado y caracterizado inmunizando pupas de
Hyalophora cecropia con cepas bacterianas. Desde entonces, se han aislado y descrito
alrededor de 300 péptidos antimicrobianos en insectos principalmente de los órdenes
Hymenoptera, Lepidoptera, Diptera y Coleoptera (10,95). En la Figura 2-4 se presenta el
porcentaje de péptidos antimicrobianos de diferentes órdenes de insectos que se han
registrado en la base de datos APD (97).
34 Determinación de la actividad antibacteriana de extractos y hemolinfa de larvas de
Lucilia eximia (Diptera: Calliphoridae)
La expresión de los péptidos antimicrobianos en insectos es regulada
transcripcionalmente mediante las rutas de señalización Toll e Imd, como respuesta a la
infección por hongos y bacterias gram positivas y bacterias gram negativas
respectivamente, ó con la exposición a patrones moleculares asociados a patógenos
(PAMPS) (95). Aunque al igual que las Lisozimas los péptidos pueden encontrarse de
manera constitutiva en la hemolinfa (98).
Figura 2-4 Identificación de péptidos antimicrobianos en diferentes órdenes de insectos
El orden Hymenoptera representa el mayor número de péptidos antimicrobianos caracterizados, no solo en
hemolinfa, sino también en sus venenos, los cuales han sido estudiados para la búsqueda de
antimicrobianos, antivirales, antitumorales y péptidos con actividad insecticida, debido al gran número de
especies parásitas y depredadoras de otros insectos, representadas en este orden.
En insectos hemimetábolos, los AMP son producidos por hemocitos en individuos sanos
y son secretados a la hemolinfa cuando ocurre una infección (99). En insectos
holometábolos los AMPs son inducibles en el tejido graso al inicio de la etapa larval
donde son secretados posteriormente a la hemolinfa. También se expresan en células
epiteliales de los tejidos que están en contacto con el ambiente y en los cuales se
22%
9%
11% 42%
1% 6%
1% 5% 3%
Porcentaje de péptidos antimicrobianos
caracterizados en insectos.
Diptera
Lepidoptera
Coleoptera
Hymenoptera
Orthoptera
Hemiptera
Isoptera
Trichoptera
Odonata
35
pueden encontrar microorganismos patógenos como en el tracto respiratorio (98), la
región oral y el tracto digestivo (100), los túbulos de Malpighi y los tractos reproductivos,
tanto en machos como en hembras (101,102). Los AMPs no solo son activos contra
microorganismos sino además contra virus y células tumorales (11).
D. melagnogaster es uno de los modelos de estudio en insectos mejor caracterizado en
cuanto a su respuesta inmune. En el género Drosophila se han identificado 20 genes
codificantes para péptidos antimicrobianos con sus respectivos productos (103), los
cuales se agrupan en 7 familias, Diptericinas, Drosocinas y Ataccinas, producidas como
respuesta a bacterias gram negativas; Defensinas y Cecropinas que son activas contra
microorganismos gram positivos y las Drosomycinas y Metchkowinas que tienen
actividad antifúngica y solo han reportado en Drosophila. En la Figura 2-4se esquematiza
los sitios de expresión de AMPs en larvas de Drosophila, los cuales también pueden ser
inducidos en regiones particulares de la superficie epitelial, como respuesta a la infección
local y sistémica (98).
La infección sistémica induce la expresión de siete tipos de genes que codifican péptidos antimicrobianos en
el tejido graso. La infección local desencadena la expresión de subconjutos de AMPs, según la región
afectada.
Figura 2-5 Sitios de expresión de péptidos antimicrobianos (AMP) en larvas de
Drosophila (103)
36 Determinación de la actividad antibacteriana de extractos y hemolinfa de larvas de
Lucilia eximia (Diptera: Calliphoridae)
Según su estructura y composición los AMPs en insectos se dividen en tres grupos: (a)
péptidos que conforman hélices alfa (102,104,105); (b) ricos en un aminoácido particular
como Glicina ó Prolina (106,107) y (c) péptidos estabilizados por puentes disulfuro
(108,109).
A continuación se describen los principales péptidos antimicrobianos que se encuentran
en Diptera.
2.3.2.1.1 Cecropinas
Son los péptidos alfa-helicolidales mas abundantes conformados por cadenas de 29-42
residuos. En Diptera conforman un grupo particularmente homólogo con mas del 70% de
identidad entre sus secuencias. En la Figura 2-6 se observa el alineamiento de
secuencias de cecropinas en especies de Diptera representativos.
Las cecropinas no solo son activas contra bacterias, sino tambien contra hongos y
protistas. Además, han mostrado actividad lítica sobre lineas celulares de leucemia e
inhibición de la adhesion celular en el carcinoma hepatocelular humano BEL7402 (110).
Las membranas bacterianas, al igual que en las tumorales, estan cargadas
negativamente debido a la presencia de LPS y lípidos aniónicos en bacterias, lípidos
aniónicos y el aumento de la glicosilación en células tumorales. Por lo tanto, estas
moléculas aniónicas facilitan la unión de la Cecropina a la membrana mediante
interacciones electrostáticas, mientras que las células normales con carga neutra no son
afectadas (6).
La Sarcotoxina 1A es una Cecropina alfa helicoidal presente en Sarcophaga peregrina,
que tiene actividad bactericida, siendo las bacterias gram negativas mas suceptibles. La
Sarcotoxina 1A, ha sido utiizada para el diseño de plantas tránsgénicas de tabaco,
potenciando la resistencia a patógenos como Erwinia carotovora subsp. carotovora y
Pseudomonas syringae pv tabaci (111).
37
Las cecropinas toman su nombre de Hyalophora cecropia, primer insecto del cual fueron aisladas. Sin
embargo se conocen en otras especies como; Bactericidinas, Lepidópterinas, Sarcotoxinas, etc., que están
estructuralmente relacionados. (A) Sarcotoxina 1A; (B) Cecropina 1; Los modelos estructurales fueron
extraídos de http://pfam.sanger.ac.uk/family/Cecropin. (C) Alineamiento de secuencias de Cecropinas
aisladas de dípteros representativos. Se observa el carácter conservado de sus secuencias. El alineamiento
fue realizado a partir de secuencias registradas la base de datos APD. Cada aminoácido está diferenciado
por un color.
2.3.2.1.2 Defensinas
Las defensinas se han encontrado en todos los insectos que se han estudiado hasta hoy.
Son péptidos cationicos, estabilizados por puentes disulfuro, compuestos por 33 a 46
residuos. Al igual que las cecropinas, la defensinas en Diptera son moléculas con
secuencias muy conservadas, con porcentajes de identidad entre el 70 y el 100%, con un
patrón de puentes disulfuro Cys1–Cys4, Cys2–Cys5 y Cys3–Cys6 (figura 2-7). A este
grupo pertenecen péptidos como las Sapencinas (111), Formicinas (112) y Lucifensinas
(28,29). Las defensinas son expresadas de manera constitutiva en el tejido graso,
intestino y glándulas salivales (28,113).
Las defensinas son activas principalmente contra bacterias gram positivas aunque
algunas pueden ser activos contra bacterias gram negativas y hongos (10).
A B
C
Figura 2-6 Cecropinas en Diptera
38 Determinación de la actividad antibacteriana de extractos y hemolinfa de larvas de
Lucilia eximia (Diptera: Calliphoridae)
Estudios realizados con Formicinas recombinantes han demostrado que estos péptidos
afectan de la permeabilidad de la membrana citoplasmática de M. luteus, resultando en la
pérdida del potasio y disminución del ATP citoplasmatico, además de la despolarización
parcial de la membrana interna e inibición del proceso de respiración. Estudios con
liposomas soportan la hipótesis de que las defensinas de Phormia afectan la
permeabilidad formando canales en la membrana de M. luteus (114).
Las Lucifensinas son defensinas aisladas de larvas de mosca del género Lucilia
utilizadas en terapia larval. Estas defensinas se expresan de manera constitutiva en el
tejido graso. Se han encontrado además en el intestino, glándulas salivales y en las
secreciones y excreciones de las larvas. Por lo tanto, se considera que las Lucifensinas
son uno de los factores antimicrobianos que actúan en el control de la infección por lo
menos de bacterias gram positivas, en la terapia larval (28,29).
Figura 2-7 Conformación estructural de las defensinas en insectos.
A. Esquema de la estructura secundaria de la Lucifensina I(115). B. Conformación estructural de Defensinas
en insectos. Los círculos amarillos representan los residuos de Cisteínas que conforman los puentes
disulfuro característicos de esta familia de péptidos (Fuente, www.uniprot.org).
2.3.2.1.3 Péptidos ricos en Glicina.
En esta categoría se encuentran péptidos que tienen un porcentaje entre 14 y 22% de
Glicina, como la Sarcotoxina IIA, las Atacinas y las Diptericinas. Las Diptericinas se
diferencian por tener un dominio pequeño de prolina en la region amino terminal y una
región de mas o menos 60 residuos de glicina en la region carboxi terminal. Ambos
A
B
39
dominos presentan una O-glicosilación necesaria para su actividad biológica (116). Los
péptidos ricos en glicina son activos contra bacterias gram negativas. En la Tabla 2-4 se
presenta la secuencia de algunas Diptericinas que se encuentran anotadas en la base de
datos Uniprot (www.uniprot.org).
Tabla 2-4. Diptericinas de diversas especies de insectos dípteros
ESPECIE NOMBRE SECUENCIA
Musca domestica Diptericina
MKYLWAIVLLCALSAALVVADDKSQPPPPQIKDPQVRVDVGGSPKDGYNV
NADVRKNIWTSDNGRHSFDATAGYGQHLGGPYGNSRPDYRGGGIYTYRW
Drosophila melanogaster
Diptericina DDMTMKPTPPPQYPLNLQGGGGGGSGDGFGFAVQGHQKVWTSDNGRHE
IGLNGGYGQHLGGPYGNSEPSWKVGSTYTYRFPNF
Stomoxys calcitrans
Diptericina A
MKTIFVAALIVAVFGALGSARPSRDDSKPFEINRAEVTHTHGKGTDVYVDGQ
ARVYQSDN KRHEVYVNGQYGQHLGGPYGNSRPSYGGGVSYTHRF
Phormia terranovae
Diptericina A DEKPKLILPTPAPPNLPQLVGGGGGNRKDGFGVSVDAHQKVWTSDNGGH
SIGVSPGYSQHLPGPYGNSRPDYRIGAGYSYN
Phormia terranovae
Diptericina D MKLFYLLVICALSLAVMADEKPKLILPTPAPPNLPQLVGGGGGNRKDGFGVS
VDAHQKVWTSDNGRHSIGVTPGYSQHLGGPYGNSRPDYRIGAGYSYNFG
2.3.2.2 Melanización
La reacción de melanización es la respuesta inmune más inmediata contra la invasión de
patógenos. Además de ser importante para la cicatrización de heridas, la melanina puede
encapsular y secuestrar los agentes patógenos en Lepidoptera (70) y Diptera como
Drosophila (117). En mosquitos, es una respuesta inmune importante contra el parásito
de la malaria (118). La melanización se hace visible mediante el oscurecimiento del sitio
de la herida, que resulta de la síntesis y deposición de melanina. Los intermediarios
reactivos de la reacción de melanización son tóxicos para los microorganismos (119).
40 Determinación de la actividad antibacteriana de extractos y hemolinfa de larvas de
Lucilia eximia (Diptera: Calliphoridae)
La melanización es dependiente del metabolismo de la tirosina. Durante la melanización,
la enzima fenoloxidasa (PO) cataliza la oxidación de fenoles a quinonas, las cuales se
polimerizan de manera no enzimática para formar la melanina. En Drosophila y otros
artrópodos, la PO se produce y se libera en la hemolinfa como un zimógeno inactivo
llamado profenoloxidasa (PPO). En estudios bioquímicos de especies de insectos más
grandes se han identificado proteasas implicadas en la melanización, como la enzima
activadora de PPO, (PPAE) la cual se escinde y activa la PPO, después de la infección
microbiana(120).
Los metabolitos derivados de la dopamina ya sea por la vía de la PO ó por medio de
otras enzimas, también son usados en otras rutas metabólicas asociadas con la
neurotransmisión y la esclerotización cuticular (121).
41
3 Metodología
Durante el desarrollo de este trabajo fue preciso mantener grupos de larvas asépticas,
bajo un régimen alimentario esterilizable reduciendo la exposición de los individuos al
contacto con bacterias con el fin de realizar ensayos de inmunización con bacterias
específicas (Gram +/-) y así observar las posibles diferencias en cuanto a los
componentes antibacterianos encontrados. De igual manera, se utilizaron individuos
alimentados con hígado fresco de cerdo, el cual es el sustrato de cría convencional para
las especies necrófagas de la familia Calliphoridae, con el propósito de mantener la
colonia y obtener secreciones y excreciones de larvas expuestas a microorganismos.
Los factores antimicrobianos estudiados se obtuvieron a partir de muestras de hemolinfa
y secreciones y excreciones (E/S) de larvas en tercer estadío (L3). La separación de los
componentes se llevó a cabo mediante las técnicas de ultrafiltración y cromatografía
líquida de alta precisión (HPLC).
La actividad biológica fue evaluada mediante ensayos turbidimétricos (TB) en microplaca
y difusión en agar doble capa.
A continuación se detalla la metodología.
42 Determinación de la actividad antibacteriana de extractos y hemolinfa de larvas de
Lucilia eximia (Diptera: Calliphoridae)
3.1 Colección de especímenes y mantenimiento en
laboratorio
Se estableció una colonia de Lucilia eximia en el laboratorio del Grupo de Ecología y
Sistemática de Insectos en la Universidad Nacional de Colombia sede Medellín, a partir
de huevos y adultos colectados en el campus (N:06°15'91'', W:075°34'51''). Para la
captura se utilizó una trampa para moscas adultas cebada con hígado fresco de cerdo
Figura 3-1.
Los adultos fueron mantenidos en jaulas metálicas de 30x30x30 cm bajo condiciones de
humedad relativa y temperatura ambiente (53% - 64% HR; 24ºC - 28ºC), fotoperiodo
12:12h y alimentados con leche en polvo azucarada y agua. Como sustrato para la
oviposición se les proporcionó hígado fresco de cerdo.
El repoblamiento de la colonia se llevó a cabo a partir de individuos criados en hígado de
cerdo. Las larvas fueron mantenidas a temperatura ambiente (24ºC - 28ºC) hasta su
estado postalimentario e inmediatamente transferidas a tarros plásticos con arena
esterilizada para facilitar la pupación.
La identidad taxonómica de la especie se determinó a partir de la propuesta de Whitworth
(47) para individuos adultos y Flórez y Wolff (24) para larvas en tercer estadío.
3.2 Aislamiento de compuestos antibacterianos
Las masas de huevos procedentes de hembras de la colonia fueron removidas del
sustrato y sumergidas en sulfito de sodio al 0,05 % agitándolas hasta individualizar los
huevos. A continuación, fueron aclarados con agua estéril y desinfectados mediante
43
Figura 3-1. Trampa para insectos adultos, cebada con hígado fresco de cerdo.
Foto. Paula Giraldo
tratamiento con formaldehido al 2,5 % durante 3 minutos, enjuagados con solución
amortiguadora PBS y sembrados en medio de cultivo artificial esterilizable compuesto por
leche en polvo, germen de trigo, levadura y Agar, según la propuesta de Zhang y
cols.(122). Los huevos fueron incubados a 26°C con el fin de obtener larvas asépticas
para los ensayos de extracción e inmunización con bacterias. La esterilidad de los
huevos sembrados en agar fue evaluada por triplicado mediante siembra de huevos en
agar LB.
Una vez los individuos alcanzaron el tercer instar (L3), fueron removidos del sustrato y
dispuestos en grupos para obtener las secreciones, excreciones ó hemolinfa Figura 3-2.
3.3 Inducción de la respuesta inmune
3.3.1 Preparación de inóculo bacteriano
La preparación de los inóculos se llevó a cabo ajustando los protocolos establecidos por
Apidianakis y cols. (123) y Bulet (124) para modelos de infección bacteriana de D.
melanogaster.
Se eligieron las cepas Escherichia coli ATCC 25922 y un aislado clínico de Bacillus
subtilis, como modelos Gram negativo y Gram positivo respectivamente, debido a que
44 Determinación de la actividad antibacteriana de extractos y hemolinfa de larvas de
Lucilia eximia (Diptera: Calliphoridae)
son modelos bacterianos utilizados frecuentemente en laboratorio en razón a su fácil
mantenimiento, rápida tasa de desarrollo y requerimientos nutricionales simples
(125,126).
Se inoculó un volumen de 5 mL de caldo Luria Bertani (LB) a partir de 4 ó 5 colonias de
E. coli ó B. subtilis provenientes de cultivos en agar Luria Bertani (LB) de 24 horas de
crecimiento. El inóculo fue incubado over nigth (O/N) a 35°C y 220 r.p.m. para B. subtilis
y 37° 220 r.p.m para E. coli. Al día siguiente, se realizaron subcultivos (1:100) del inóculo,
en 5 mL de caldo LB hasta ajustar el cultivo a una turbidez de 0,05 a OD600nm. Una vez
ajustado, el cultivo se incubó por 6 horas hasta obtener una turbidez de 3,0 medida a una
OD600nm, lo cual corresponde a 4-5 109 UFC mL-1 (123).
Se centrifugó 1 mL de cada cultivo por 3 minutos a 11.000 gravedades. Se descartó el
sobrenadante y el pellet obtenido fue lavado y centrifugado nuevamente en 1 mL de
MgSO4 (10 mM), con el fin de remover restos de caldo LB. Se determinó la turbidez
OD600nm.
Finalmente mediante dilución seriada del cultivo en MgSO4 se preparó un inóculo de
OD600nm igual a 0,03 lo cual corresponde a 3-5 106 UFC mL-1, con el cual se procedió a
infectar las larvas. Esta concentración permitió tomar menos de 100 UFC por vez con
lancetas, parar inócular cada larva. Con esta cantidad de inóculo fue posible observar
infección a nivel local y la sobrevivencia de los individuos por más de 24 horas.
3.3.2 Inoculación de especímenes
Se seleccionaron grupos de larvas en estadío L3 (38 horas después de la eclosión de los
huevos aproximadamente) provenientes del cultivo aséptico. Se enjuagaron con agua
destilada y posteriormente fueron adormecidas en frio (4°C 12 min). Se inocularon las
larvas con cada cepa bacteriana, punzándolas suavemente en la región posterior, con
45
una lanceta previamente sumergida en el pellet de la bacteria de interés (E. coli ó B.
subtilis), de esta manera, las larvas fueron infectadas con un promedio de 50 UFC, lo
cual fue comprobado sembrando en agar LB muestras de la bacterias tomadas con la
lanceta. Según los protocolos consultados (123,124), cuando se utiliza la técnica de
punción para infectar insectos se recomienda que la dosis empleada sea menor a 100
UFC por individuo. Esta metodología es considerada de buena reproducibilidad, además
permite la infección del espécimen a nivel local y la valoración de los efectos de la
infección tanto a nivel local como sistémico.
La extracción de los factores antibacterianos se realizó 24 horas después de la infección
de los especímenes, tiempo suficiente para que la proliferación bacteriana induzca una
respuesta local y sistémica (127).
Figura 3-2 Grupos de tratamiento para obtención de muestras.
Larvas medio convencional
(hígado) Incubación en agua
Colección secreciones y excreciones
Larvas medio esterilizable
Colección de hemolinfa de larvas
sin inmunizar
Inmunización
Colección de Hemolinfa de larvas
inmunizadas con E.coli
Colección de Hemolinfa larvas inmunizadas con
B.subtilis
Incubación en agua Colección
secreciones y excreciones
A
46 Determinación de la actividad antibacteriana de extractos y hemolinfa de larvas de
Lucilia eximia (Diptera: Calliphoridae)
3.4 Colección de secreciones y excreciones (E/S)
La colección de extractos (E/S) se realizó a partir de la metodología modificada de
Bexfield (25,26) y Kerridge (128) según la cual se removieron del cultivo larvas (L3) y se
deprivaron de alimento por 24 horas. Posteriormente fueron enjuagadas con etanol al
70% y PBS, e incubadas por 3 horas a 28°C en 6 mL de agua destilada. El líquido
sifonado fue centrifugado a 10.000 g x 5 min con el fin de precipitar contaminantes y
restos celulares. La purificación del sobrenadante se realizó utilizando filtros de celulosa
de 0,2 µm. Los ensayos de actividad antibacteriana fueron realizados como se describe
mas adelante. Los extractos que mostraron indicios de actividad, fueron liofilizados y
conservados a -20ºC para ser sometidos a ultrafiltración y posterior fraccionamiento
mediante cromatografía HPLC.
3.5 Colección de hemolinfa
Grupos de larvas fueron adormecidos a 4ºC por 15 minutos y mantenidos en hielo para
ser disectados.
Se retiraron las piezas bucales cuidadosamente con el fin de no romper las glándulas
salivales. A continuación de comprimió suavemente la región posterior del especimen
para expulsar suavemente la hemolinfa sin romper el intestino. La hemolinfa fue
colectada en tubos capilares y transferida a tubos eppendorf con buffer anticoagulante
(10% citrato de sodio pH 7, suplementado con 200 μM de feniltiourea como inhibidor de
melanización y 40 μg/ml de aprotinina como inhibidor de proteasas,(129).
Posteriormente se eliminaron los hemocitos por centrifugación a 500 x g por 7 minutos. El
sobrenadante fue llevado nuevamente a centrifugación a 20.000 x g por 15 minutos a 4ºC
con el fin de remover restos celulares y bacterias.
47
En el caso de los individuos inmunizados, la colección de hemolinfa se realizó 24 horas
después de la inmunización(123) .
3.6 Pre-purificación y fraccionamiento de exosecreciones y
hemolinfa
Con el fin de limitar el rango de búsqueda de las moléculas de interés, los extractos y la
hemolinfa fueron fraccionados mediante la técnica de ultrafiltración, utilizando filtros
Amicon® Ultra (Millipore) con puntos de corte de 10000 MWCO y 3000 MWCO,
siguiendo las instrucciones del fabricante. Esto permitió separar los compuestos menores
a 10000 y 3000 Da respectivamente, que fueron estudiados en este trabajo.
Una vez comprobada la actividad antibacteriana de las fracciones seleccionadas, se
procedió a realizar una extracción en fase sólida (SPE por sus siglas en inglés) de las
fracciones, utilizando cartuchos Sep-Pak C18 (Waters). La elución de los compuestos fue
realizada utilizando un gradiente lineal de 10% a 80% de Acetonitrilo (AcN) en agua
acidificada con ácido trifluoroacético (TFA 0,1%) y nuevamente se realizaron ensayos
para evaluar las fracciones con actividad sobre bacterias. Las fracciones activas fueron
congeladas -80ºC, liofilizadas y conservadas para ser separadas mediante RP-HPLC.
3.7 Fraccionamiento de exosecreciones y hemolinfa y
purificación por HPLC
Las fracciones activas fueron separadas mediante cromatografía líquida de alta precisión,
en fase reversa (RP-HPLC por sus siglas en inglés), utilizando un cromatógrafo (Agilent
1200 series). La elección de este método se debió a su alta eficiencia en la separación
de péptidos y polipéptidos (8). Las fracciones activas obtenidas por SPE fueron
resuspendidas en 0,05% de TFA y dispuestas en una columna semipreparativa (Eclipse
XDB-C18, 9.4x250 mm; 5 µm). La elución se realizó con un gradiente lineal de AcN del
48 Determinación de la actividad antibacteriana de extractos y hemolinfa de larvas de
Lucilia eximia (Diptera: Calliphoridae)
0,5% al 40% durante 60 minutos para los extractos y 0,5% al 60% durante 60 minutos
para las hemolinfas, mediante el registro de cambios en la absorbancia a 220 nm. Las
muestras se recogieron manualmente a una velocidad de flujo de 1 ml min-1. Las
fracciones obtenidas fueron congeladas y secadas al vacío. Posteriormente cada fracción
fue resuspendida en 100 µl de agua desionizada, para realizar los ensayos de actividad
antibacteriana.
3.8 Ensayos de actividad antibacteriana
La actividad antibacteriana de los extractos crudos, fraccionados por tamaño y separados
en fase sólida fue evaluada mediante ensayos turbidimétricos.
La actividad antibacteriana fue evaluada en E. coli y B. subtilis, cepas con las cuales se
llevó a cabo la inoculación de las larvas. Además se incluyó la cepa de Staphylococcus
aureus ATCC 25923 debido a que es especies patógena en humanos, con conocidos
problemas de resistencia a antibióticos(15,130,131). Las cepas fueron cultivadas en
caldo LB durante toda la noche (entre 12 a 24 horas), hasta su fase logarítmica de
crecimiento. Pasado este tiempo, se midió la densidad óptica a 600 nm (DO 600 nm)
hasta alcanzar valores de absorbancia entre 0,75 y 0,8, lo cual corresponde
aproximadamente a 1x108 UFC mL-1, equivalente a 0,5 en la escala de Mcfarland (132) A
partir de estos cultivos se realizaron diluciones en caldo LB al 1% desde 1×103 hasta
1×104 UFC mL-1). La actividad antimicrobiana se evaluó utilizando placas de polipropileno
estériles de 96 pozos (Nunc), a los cuales se les agregaron 50 µl de la suspensión
bacteriana (1×103 - 1×104 UFC mL-1) y 50 µl de cada extracto. Como control positivo los
extractos o hemolinfas fueron reemplazados por Triton x-100, detergente que causa lisis
celular en bacterias (133). Las placas se incubaron a 30 y 37°C, según la requerimientos
de cada cepa, durante 24 horas en un lector de placas de ELISA acoplado a
espectrofotómetro (Multiskan GoTM Thermo) y se tomaron medidas de absorbancia a 600
49
nm, con intervalos de 1 hora. Se calculó el porcentaje de bacterias viables en el cultivo
mediante el índice de sobrevivencia (25,26) según el cual se tomaron los puntos de
densidad óptica correspondientes a la fase log del control y el valor correspondiente a
cada uno de ellos en los tratamientos y se aplicó la siguiente fórmula.
IS =DO600 tratamiento en el punto correspondiente * 100
DO600 control en fase logarítmica
La actividad antibacteriana de cada muestra obtenida mediante separación por HPLC,
fue evaluada sobre las cepas de E. coli, B. subtilis y S. aureus, mediante la técnica de
difusión de gota en doble capa, según la metodología de Cerovsky cols. (28).
Brevemente, se dispusieron 20 mL de agar LB en de cajas petri (90 mm de diámetro).
Una vez solidificado, sobre su superficie se adicionaron 2 mL de agar LB semisólido
(caldo LB + 0,5% agar), el cual fue previamente inoculado con 1x107 UFC mL-1 de cada
cepa a evaluar. De cada fracción (cada una resuspendida en 100 µl de agua ultra pura)
se adicionaron 2 µl sobre el agar semisólido. Las placas se incubaron a 37ºC por 24
horas. Se midieron los halos de inhibición de las fracciones activas.
3.9 Análisis de resultados
Los resultados se presentan en términos de la Media ± Desviación estándar de tres
repeticiones independientes con tres observaciones por cepa para los extractos crudos, y
dos repeticiones por cepa con dos observaciones, para los extractos fraccionados por
tamaño.
Para el análisis de datos se elaboró un diseño experimental completamente aleatorizado
de dos factores, con efectos fijos: Donde es el índice de
sobreviviencia la media general es el efecto del valor A (cepa) el efecto del valor B
(tipo de extracto) efecto de la interacción de ambos factores, el efecto de error
aleatorio. =3.
50 Determinación de la actividad antibacteriana de extractos y hemolinfa de larvas de
Lucilia eximia (Diptera: Calliphoridae)
Se plantearon las siguientes hipótesis para cada diseño y así probar el efecto de cada
factor y el efecto de la interacción de los mismos.
Se realizaron análisis de la varianza y comparación de medias utilizando la prueba t-
student para muestras independientes, en el caso de las exosecreciones, la prueba no
paramétricas de la U de Mann-whitney para los resultados de las hemolinfas. El nivel de
significancia para todas las pruebas utilizadas fue de 95%.
Los test estadísticos fueron realizados con los paquetes IBM SPSS (IBM Corp) y Minitab
® 15.1.30.0 (© 2007 Minitab Inc).
51
4 Resultados y Discusión
4.1 Actividad antibacteriana de E/S
Mediante método turbidimétrico, se estudió la actividad antimicrobiana de las
exosecreciones de larvas alimentadas con hígado (ESH), las cuales han estado en
contacto con los microorganismos presentes en este sustrato. Esta actividad fue
comparada con la actividad encontrada en exosecreciones obtenidas a partir de larvas
alimentadas con un medio de cultivo esterilizable (ESM), donde se esperaba que las
larvas tuvieran el mínimo contacto con microorganismos.
El análisis turbidimétrico es una medida indirecta del número total de células en una
suspensión, que permite monitorear cambios en el número de células en pequeños
volúmenes. Un aumento en la DO indica generalmente un incremento en el número de
bacterias presentes en suspensión. Mientras que el decrecimiento, el aumento lento en el
tiempo con respecto a los controles ó la ausencia de cambio, podría suponer un efecto
bacteriostático, citotóxico ó que por lo menos, el número de células muertas es mayor
que el número de células viables. Así mismo, bajo ciertas circunstancias, pequeños
aumentos en la DO pueden indicar un incremento en el tamaño de las células, debido al
hinchamiento de las mismas, previo al fenómeno de lisis celular, ó cualquier otro cambio
morfológico que afecte la viabilidad de las bacterias(26,53).
En consecuencia, los resultados se presentan en términos del porcentaje de viabilidad el
cual se refiere al crecimiento de las bacterias tratadas, como un porcentaje del
52 Determinación de la actividad antibacteriana de extractos y hemolinfa de larvas de
Lucilia eximia (Diptera: Calliphoridae)
crecimiento de los controles. Esto debido a que mediante el seguimiento de los cambios
en la absorbancia únicamente, no es posible determinar el efecto bactericida ó
bacteriostático de las E/S. Sin embargo la viabilidad de las bacterias fue comprobada
mediante la resiembra en agar LB después de 24 horas de tratamiento, donde se
observó crecimiento de todas las cepas.
Los cambios en la densidad óptica que se aprecian en la figura 4-1 señalan claramente
un efecto inhibitorio sobre el crecimiento bacteriano causado por las exosecreciones de
larvas expuestas a microorganismos (ESH) y en menor proporción la inhibición causada
por las exosecreciones provenientes de larvas con exposición mínima a los mismos
(ESM). Esto último al parecer se debe a la baja concentración de los componentes
antimicrobianos presentes en la muestra y no a diferencias en cuanto a los componentes
activos presentes en los dos tipos de exosecreciones. Para este escaneo preliminar de
actividad con los extractos crudos, fue necesario repetir el proceso de colección de E/S,
hasta alcanzar una concentración de 160 mg mL-1 de peso seco en el caso de ESH y 280
mg*mL-1 de ESM y así observar el efecto sobre las bacterias.
En la tabla 4-1 se observa el índice de sobrevivencia (porcentaje de células viables) de
cada cepa para los dos tratamientos, con una diferencia aproximada del 10% de
viabilidad entre los mismos. Para estimar los efectos del el tipo de cepa y tipo de
extractos sobre el índice de sobrevivencia se efectuó un análisis de varianza (tabla 4-4),
con el cual se puede constatar que tanto las ESH como las ESM tienen el mismo efecto
inhibitorio sobre las cepas estudiadas.
53
Figura 4-1 Efecto de las E/S crudos de L. eximia sobre el crecimiento bacteriano.
(ESH) extractos de larvas alimentadas con hígado 160 mg mL1; (ESM) 280 mg mL-1; extractos de larvas
alimentadas de medio de cultivo esterilizable. (A) B. subtilis; (B) S. aureus; (C) E. coli. Los cambios en la
absorbancia se utilizaron para calcular el porcentaje de bacterias viables en el cultivo mediante el índice de
sobrevivencia, tomando los puntos de densidad óptica correspondientes a la fase de crecimiento exponencial
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0 5 10 15 20
Ab
sorb
an
cia
OD
60
0n
m
Control positivo
Triton x-100
Tratamiento ESH
Tratamiento ESM
Crecimiento B.subtilis
A
0
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
1 6 11 16 21
Ab
sorb
an
cia
O.D
60
0n
m
Crecimiento S. aureus
Tratamiento ESM
Tratamiento ESH
S. aureus tratada con
Triton x-100
B Tiempo (h)
-0.05
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
0.35
0.40
1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23
Ab
sorb
an
cia
O.D
60
0n
m
Crecimiento E.coli
Tratamiento ESM
Tratamiento ESH
E. coli tratada con Triton
x-100
C
Tiempo (h)
Tiempo (h)
54 Determinación de la actividad antibacteriana de extractos y hemolinfa de larvas de
Lucilia eximia (Diptera: Calliphoridae)
de los controles y el valor correspondiente a cada uno de ellos en los tratamientos. IS = (DO600 tratamiento en
el punto correspondiente/ DO600 control en fase logarítmica) * 100.
Tabla 4-1 Índice de sobrevivencia de cepas tratadas con ESH y ESM de L. eximia
CEPA S.I(%)
ESH
S.I (%)
ESM
B. subtilis 23 ± 4 33 ± 5
E. coli 31 ± 6 42 ± 6
S. aureus 45± 16 51 ±18
Índice de sobrevivencia (I.S) de las cepas tratadas con exosecreciones de larvas expuestas a patógenos
(ESH), 160 mg mL-1 y exosecreciones de larvas no expuestas (ESM), 280 mg mL-1. Los datos se presentan
como la media ± desviación estándar de tres repeticiones por cepa.
Los supuestos de Normalidad para la variable índice de sobrevivencia fueron
comprobados a partir del gráfico QQ-plot (figura 4-2) el test de normalidad de Shapiro-
wilk y la prueba de homogeneidad de varianza de Levene tablas (4-2 y 4-3).
Tabla 4-2 Pruebas de Normalidad para la variable índice de sobrevivencia
Hipótesis Ho: los errores tienen distribución normal y H1: los errores no tienen distribución normal. se acepta
Ho con un nivel de confianza del 95%.
Tabla 4-3 Prueba de homogeneidad de varianza
Estadístico
de Levene df1 df2 Sig.
Índice
Sobrevivencia
Se basa en la media ,002 1 34 ,968
Se basa en la mediana ,012 1 34 ,914
Las varianzas son homogéneas. (p>0.05)
Tipo extracto Shapiro-Wilk
Estadístico gl Sig.
Indice
Sobrevivencia
Extracto Hígado
Extracto medio
,914 18 ,102
,972 18 ,835
55
La normalidad se observa mediante el gráfico Cuartil-Cuartil (QQ-plot) con intervalo de confianza de 95%. Así
mismo, se confirmó el resultado mediante el test de normalidad de Shapiro wilk.
4-4 Análisis de la Varianza para el Índice de sobrevivencia de cepas tratadas con E/S
Origen Tipo III de suma
de cuadrados gl
Cuadrático
promedio F Sig.
Modelo corregido 3310,556a 5 662,111 5,709 ,001
Interceptación 51680,444 1 51680,444 445,649 ,000
Tipo extracto 693,444 1 693,444 5,980 ,021
Cepa 2565,389 2 1282,694 11,061 ,000
Tipo extracto * Cepa 51,722 2 25,861 ,223 ,801
Error 3479,000 30 115,967
Total 58470,000 36
Total corregido 6789,556 35
a. R al cuadrado = ,488 (R al cuadrado ajustada = ,402)
Existen diferencias entre los Índices de sobrevivencia de las cepas tratadas (p< 0,05), y diferencias entre los
índices de sobrevivencia de los tipos de extracto (p< 0,05). No hay un efecto significativo entre la interacción
cepa-tipo de extracto (p>0,05) por lo tanto, la influencia del tipo de extracto sobre el índice de sobrevivencia
es el mismo entre las cepas.
La detección de la actividad antibacteriana de las E/S fue un proceso complejo que
requirió ensayar diferentes metodologías para detectar la inhibición del crecimiento,
concentraciones de extracto y caldos de cultivo. Siendo en nuestro caso, el método
turbidimétrico el más sensible.
Figura 4-2 Cuartil-Cuartil (QQ-plot)
56 Determinación de la actividad antibacteriana de extractos y hemolinfa de larvas de
Lucilia eximia (Diptera: Calliphoridae)
La actividad antibacteriana no solo se vio influenciada por el tipo de microorganismo, sino
también por la concentración de E/S utilizada. En un estudio similar sobre
exosecreciones de larvas de L. sericata (44), fueron necesarias concentraciones de
extracto crudo del orden de 500 mg mL-1 para observar actividad sobre E. coli y 250 mg
mL-1 sobre M. luteus (medida en mm2, mediante la técnica de difusión en agar). Mientras
que Cazander y cols. (134), registraron la inhibición de la formación de biofilm por
Pseudomonas aeruginosa de hasta el 100%, con concentraciones entre 10 y 30 µg mL-1
(en volúmenes de reacción de 200 µl), dependiendo del tipo de material sobre el que se
formaba el biofilm.
Trabajos como los de Bexfield y cols. (25,26) y Thomas et al. (53), en los cuales se
demostró la actividad de E/S de larvas de L. sericata, mediante turbidimetría, no
describen las concentraciones utilizadas. Así mismo, otros autores no solo, no han
detectado actividad antibacteriana con el método turbidimétrico sino que por el contrario
observaron un incremento en la viabilidad de bacterias como S. aureus de hasta el 600%
(43). Con respecto a esta observación, es importante resaltar que la investigación sobre
las propiedades de las exosecreciones de larvas de Calliphoridae, en el contexto de la
terapia larval, han permitido establecer la presencia de moléculas que inhiben la
respuesta inflamatoria de fagocitos, inductores de remodelamiento de matriz extracelular
e inductores de crecimiento de células endoteliales humanas y fibroblastos(38,41), que
podrían incidir en el crecimiento bacteriano.
Después de evaluar los extractos crudos, se realizó una extracción en fase sólida (SPE)
como se describe en la sección más atrás3.6, con el fin de concentrar las muestras y
separarlas según su polaridad. Se colectaron cinco muestras de cada tipo de extracto,
según fueron eluidas con 20, 40, 60, 80 y 100 % de AcN. Se evaluó su actividad
antimicrobiana por turbidimetría con dos repeticiones. Se encontró actividad
antibacteriana sobre E. coli, S. aureus y B.subtilis en las fracciones eluidas con 20 y 40%
57
de AcN. Estas fracciones fueron mezcladas y filtradas para separarlas nuevamente
según su tamaño molecular utilizando filtros con punto de corte entre 3 y 10 kDa y <3
kDa.
En la Figura 4-3 Diagrama de cajas y bigotes del Índice de sobrevivencia se presenta el
esquema de cajas y bigotes, donde se puede observar la variabilidad del indice de
sobreviviencia de las bacterias tratadas con las diferentes fracciones. En las fracciones
de entre 3-10 kDa y aquellas de peso inferior a 3 kDa, provenientes de ambos tipos de
dieta, se encontró un porcentaje de viabilidad cercano al 50%, siendo las bacterias gram
positivas más susceptibles. Las bacterias tratadas con los extractos de tamaño superior
a 10 kDa fueron viables en más del 100%, por lo tanto no fueron estudiadas en
adelante.
Estas observaciones fueron corroboradas a través de la aplicación de la prueba de t.-
student para muestras independientes. De esta manera, fueron comparados los
promedios de la viabilidad bacteriana de cada cepa según fueron expuestas a extractos
de diferente peso y extracto ESH –ESM. El resultado de cada prueba se resume en la
tabla. El detalle del cálculo estadístico se encuentra en el anexo A.
4-5 Comparación de medias entre las fracciones según tipo de extracto
Cepa Fracción p- valor
B. sutilis Mayor 10 kDa 0.078
B. sutilis 3-10 kDa 0,023
B. subtilis Menor 3 kDa 0,035
E. coli Mayor 10 kDa 0,230
E. coli 3-10 kDa 0,137
E. coli Menor 3 kDa 0,031
S. aureus Mayor 10 kDa 0,517
S. aureus 3-10 kDa 0,064
S. aureus Menor 3 kDa 0,000
H0= No hay diferencia en las medias de indice de sobrevivencia; HA= Existen diferencias entre las medias del
indice de sobrevivencia. Se rechaza H0 si p> α (0,05).
58 Determinación de la actividad antibacteriana de extractos y hemolinfa de larvas de
Lucilia eximia (Diptera: Calliphoridae)
El indice de sobrevivencia se refiere al porcentaje de bacterias viables en cada tratamiento. Los extremos
corresponden a los valores máximo y minimo del indice de sobreviviencia. Fracciones obtenidas de
exosecreciones de larvas alimentadas con hígado de cerdo (>10 kDa-H, 3.10 kDa-H, <3 kDa-H). Fracciones
obtenidas de larvas aliemntadas con dieta esterilizable ((>10 kDa-M, 3.10 kDa-M, <3 kDa-M).
Los extractos activos fueron fraccionados utilizando un método cromotagráfico como se
describe en la sección 3.7. Se evaluó la actividad antimicrobiana de cada fracción
mediante la técnica de difusión de gota en agar de doble capa. Esta prueba cualitativa
permite visualizar las fracciones activas utilizando cantidades muy pequeñas de muestra.
En la tabla 4-6, se presentan los porcentajes de acetonitrilo a los cuales fueron
colectadas las fracciones separadas por HPLC y que fueron activas. La actividad se
Figura 4-3 Diagrama de cajas y bigotes del Índice de sobrevivencia de bacterias tratadas con fracciones de
exosecreciones
59
observa como el diámetro del halo de inhibición de crecimiento para cada tipo de
bacteria.
En la fracción 3-10 kDa se encontraron tres fracciones una de las cuales fue capaz de
inhibir el crecimiento de las tres cepas. Mientras que en la fracción menor a 3 kDa se
encontró una sola fracción la cual fue activa sobre las tres cepas, siendo el halo de
inhibición de S. aureus el de mayor tamaño.
Tabla 4-6 Fracciones de E/S con actividad inhibitoria, separadas por HPLC
La elución se realizó con un gradiente lineal de AcN del 0,5% al 40% durante 60 minutos, mediante el
registro de cambios en la absorbancia a 220 nm. Las muestras se recogieron manualmente a una velocidad
de flujo de 1 ml min-1. La tabla presenta el porcentaje de AcN al cual fue colectada la fracción activa, así
como el tamaño en mm del halo de inhibición formado por la fracción, medido a las 24 horas.
Este es el primer trabajo realizado sobre la actividad antibacteriana de exosecreciones de
L. eximia. Estudios similares realizados por diversos investigadores sobre E/S de L.
sericata, presumen la presencia de componentes nutritivos adicionales, que dificultan la
evaluación de los componentes antibacterianos. En por lo tanto, la estimación de la
actividad antibacteriana de E/S realizada en trabajos previos, donde se utilizan diferentes
concentraciones, test de actividad medios de cultivo y procedencia de las exosecreciones
(larvas estériles y no estériles) ha contribuido a la variación en los resultados reportados
a la fecha(25,26,28,43,44,53,128). Nuestros hallazgos se acercan a lo reportado por
CEPA
ESH 3-10 kDa ESH <3 kDa
% AcN Halo inhibición
mm2 % AcN
Halo inhibición
mm2
B. subtilis
7-9
12-13.7
30-34
3
4
3
9-11
3
S. aureus 7-9
30-34
2
3 9-11 4
E. coli 7-9 4 9-11 2
60 Determinación de la actividad antibacteriana de extractos y hemolinfa de larvas de
Lucilia eximia (Diptera: Calliphoridae)
Bexfield y cols. (25,26), quienes evaluaron la actividad antibacteriana de fracciones
moleculares inferiores a 500 Da, encontrando porcentajes de inhibición de crecimiento de
B. subtilis cercanos al 100%, efecto bacteriostático sobre S. aureus con un porcentaje de
inhibición de alrededor del 70% y la inducción de un estado viable pero no cultivable de
E. coli, con índice de sobrevivencia del 30%. Mientras que en nuestro estudio sobre la
fracción menor a 3 kDa, se encontraron porcentajes de inhibición entre el 50 y 90%
según la procedencia de las exosecreciones.
Así mismo, las fracciones separadas por HPLC que fueron activas en nuestro trabajo, se
acercan a aquellas obtenidas por Kruglikova (44), quien determinó la actividad de
fracciones de exosecreciones con el método de difusión en agar utilizando como modelo
Gram positivo M. luteus y E. coli como modelo Gram negativo y una cepa MRSA,
observando actividad sobre M. luteus en las fracciones que corresponden a 30 y 31% de
AcN y 32 a 34 % en E. coli. Con respecto a la cepa MRSA, observó actividad en las
fracciones menos hidrofóbicas que correspondieron a porcentajes entre 3 y 5 % de AcN.
4.2 Actividad antibacteriana en hemolinfa
Se evaluó la actividad antibacteriana de la hemolinfa extraída de larvas sin inmunizar, así
como de larvas inmunizadas con E. coli y B. subtilis. Se realizaron test de normalidad y
homogeneidad de varianzas (tablas 4-8 y 4-9). Se determinó que los datos no cumplen
con el supuesto de homocedasticidad, se llevó a la prueba no paramétricas de Mann-
Whitney para la comparación entre las medias de dos grupos independientes.
La actividad antibacteriana de la hemolinfa fue significativamente mayor que la
encontrada en las exosecreciones. La actividad de las E/S fue detectada solo con
concentraciones superiores a 120 mg mL-1 de peso seco, mientras que para la hemolinfa
61
procedente de larvas sin inmunizar fue de 1.3 mg mL-1 y entre 0.7 y 1 mg mL1 para las
hemolinfas procedentes de larvas inmunizadas.
Tabla 4-7 Test de normalidad de Shapiro-wilk
Hipótesis Ho: los errores tienen distribución normal y H1: los errores no tienen distribución normal. se acepta
Ho con un nivel de confianza del 95%.
Hemolinfa Shapiro-Wilk
Estadístico gl Sig.
Sin inmunizar ,962 18 ,637
Inmunizada B.
subtilis ,883 18 ,029
Inmunizada E. coli ,922 18 ,141
Figura 4-4 Q-Q plot para el índice de sobreviviencia de bacterias tratadas con hemolinfas de L. eximia
Hipótesis Ho: los errores tienen distribución normal y H1: los errores no tienen distribución normal. No se acepta
Ho con un nivel de confianza del 95%.
62 Determinación de la actividad antibacteriana de extractos y hemolinfa de larvas de
Lucilia eximia (Diptera: Calliphoridae)
Tabla 4-8 Prueba de homogeneidad de varianza de Levene
Estadístico de
Levene df1 df2 Sig.
Indicesobreviviencia Se basa en la media 11,709 2 51 ,000
Se basa en la mediana 5,692 2 51 ,006
Coa significancia del 95%, se rechaza la hipótesis nula. Las varianzas no son homogéneas.
En la figura 4-5 se puede apreciar los cambios en la DO de los cultivos bacterianos con
los diferentes tratamientos. La fase de crecimiento exponencial de las bacterias tratadas
con hemolinfa de larvas sin retar, se retrasó con respecto al crecimiento de los controles
según lo esperado, debido a la acción de componentes antimicrobianos que hacen parte
de la inmunidad básica de las larvas. De igual manera, al comparar los porcentajes de
viabilidad de los cultivos tratados con hemolinfa proveniente de larvas inoculadas, se
observa una disminución en la viabilidad. La hemolinfa base inhibió el crecimiento de E.
coli en un 35% (índice de sobrevivencia 65%) mientras que la hemolinfa de larvas
retadas con E. coli provocó un aumento en el porcentaje de inhibición de hasta 77% (1-%
sobrevivencia). Así mismo el porcentaje de inhibición de E. coli alcanzó el 70 % cuando
fue tratada con hemolinfa que provenía de larvas retadas con B. subtilis. En cuanto a las
bacterias gram positivas, la sobrevivencia de B. subtilis paso de 52% a 24% y 13% en el
tratamiento con hemolinfa retada con E. coli ó B. subtilis respectivamente. S. aureus, al
contrario de lo esperado obtuvo los niveles más bajos de de sobrevivencia (8%) cuando
se sometió a tratamiento con hemolinfa de larvas retadas con E. coli y 20% con la
hemolinfa de larvas retada con B. subtilis. El diagrama de cajas y bigotes de la figur, pa
4-6 proporciona un panorama general de esta la variación. Los extremos de las cajas son
los valores mínimos y máximos del Índice de sobrevivencia.
63
Para estimar si tales observaciones son significativas, se realizó la prueba de Mann-
Whitney contrastando los porcentajes de viabilidad obtenidos a partir del tratamiento de
hemolinfa base Vs los tratamientos de hemolinfa retada, para cada cepa tabla 4-9
Figura 4-5 Efecto de las hemolinfas sin fraccionar sobre tres cepas bacterianas.
Cepas (A) B. subtilis, (B) S. aureus, (C) E. coli.
0.00
0.10
0.20
0.30
0.40
0.50
0.60
0.70
1 6 11 16 21
Ab
sorb
an
cia
O.D
60
0n
m Crecimiento B. subtilis
Sin inmunizar
Inmunización E.coli
Inmunización B. subtilis
B. subtilis tratada con
Triton X-100
Tiempo (h)
-0.05
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
0.35
0.40
0.45
1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23
Ab
sorb
an
cia
O.D
60
0n
m
Crecimiento S. aureus
Sin inmunizar
Inmunizada E. coli
Inmunizada B. subtilis
S. aureus tratada con Triton
x-100
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
0.35
1 6 11 16 22
Ab
sorb
an
cia
O.D
60
0n
m
Crecimiento E. coli
Sin inmunizar
Inmunización E. coli
Inmunización B.
subtilis
Control positivo
triton x-100
A
B
C
Tiempo (h)
Tiempo (h)
64 Determinación de la actividad antibacteriana de extractos y hemolinfa de larvas de
Lucilia eximia (Diptera: Calliphoridae)
Figura 4-6 Diagrama de cajas y bigotes de los índices de viabilidad de bacterias tratadas con diferentes
clases de hemolinfa de L. eximia.
Tabla 4-9 Comparación de Índices de sobrevivencia entre las cepas tratadas con diferentes hemolinfas
procedentes de L. eximia.
Cepa tratada Muestras comparadas p-valor
B. subtilis
Hemolinfa + B. subtilis – Hemolinfa sin inmunizar 0,0027
Hemolinfa + E.coli - Hemolinfa + B. subtilis 0,0030
Hemolinfa + E.coli - Hemolinfa sin inmunizar 0,0004
E. coli
Hemolinfa + B. subtilis – Hemolinfa sin inmunizar 0,0004
Hemolinfa + E.coli - Hemolinfa + B. subtilis 0,1327
Hemolinfa + E.coli - Hemolinfa sin inmunizar 0,0004
S. aureus
Hemolinfa + B. subtilis – Hemolinfa sin inmunizar 0,0004
Hemolinfa + E.coli - Hemolinfa + B. subtilis 0,0169
Hemolinfa + E.coli - Hemolinfa sin inmunizar 0,0004
Se utilizó el test de Mann-whitney para muestras independientes, bajo las hipótesis: H0= No hay diferencia
entre las medianas los de índices de sobrevivencia; HA= Existen diferencias entre las medianas los índices
de sobrevivencia. Se rechaza H0 si p> α (0,05). Existen diferencias estadísticamente significativas entre los
índices de sobrevivencia de las cepas, excepto para E. coli, donde el índice de sobrevivencia no fue
significativamente diferente cuando se trató con hemolinfa procedente de larvas inmunizadas tanto con B.
subtilis como con E. coli.
65
Se realizó una extracción en fase sólida de cada tipo de hemolinfa, utilizando un
gradiente de elución de AcN de 20 a 100%. Las muestras fueron liofilizadas y
resuspendidas en agua ultra pura para los ensayos de actividad. Las fracciones eluidas
con 20, 40 y 60% de AcN presentaron actividad antimicrobiana sobre las tres cepas. Las
fracciones fueron reunidas y sometidas a ultrafiltración según se describió previamente,
obteniendo tres grupos de fracciones, mayores a 10 kDa, entre 3-10 kDa y menores a 3
kDa.
En la figura 4-7 puede observarse que los factores con actividad antimicrobiana que se
circulan en la hemolinfa de L. eximia, tienen pesos moleculares menores a 10 kDa, y son
activos tanto para el modelo Gram positivo como para el modelo Gram negativo
utilizados en este estudio. La mayor actividad se presenta en la fracción 10-3 kDa. Rango
en el cual según la literatura se encuentran péptidos antimicrobianos (10,28,29,44,79).
Los extractos activos con pesos moleculares entre 3-10 kDa y 3 kDa fueron fraccionados
utilizando un método cromotagráfico como se describe en la sección 3.7 y se evaluó la
actividad antimicrobiana de cada fracción mediante la técnica de difusión de gota en agar
de doble capa. En la tabla 4-10, se presenta los porcentajes de AcN a los cuales fueron
colectadas las fracciones separadas por HPLC y que fueron activas. La actividad se
observa como el diámetro del halo de inhibición de crecimiento para cada tipo de
bacteria.
Las fracciones obtenidas por HPLC indican la presencia de moléculas antimicrobianas en
un amplio rango de hidrófóbicidad. Los compuestos en la fracción menor a 3 kDa, son
poco hidrofóbicas, con rangos de elución entre 3 y 8 % de AcN, mientras que la fracción
de entre 3-10 kDa, contiene compuestos de mayor hidrofobicidad, con halos de inhibición
de mayor tamaño.
66 Determinación de la actividad antibacteriana de extractos y hemolinfa de larvas de
Lucilia eximia (Diptera: Calliphoridae)
Figura 4-7 Diagrama de cajas y bigotes del Índice de sobrevivencia de bacterias tratadas con hemolinfa
fraccionada de L. eximia.
Los extremos corresponden a los valores máximo y minimo del indice de sobreviviencia de bacterias tratadas
con fracciones de hemolinfa de larvar retadas con B. subtilis ( ) E. coli ( ), ó sin inmunizar ( ).
Con respecto a la diferencia en la presencia de compuestos inducidos por la infección
diferencial de bacterias Gram positivas o Gram negativas, podemos decir que aunque las
bacterias Gram positivas fueron más susceptibles a la hemolinfa, el número de fracciones
activas sobre B. subtilis fue mayor que el numero de fracciones activas sobre S. aureus.
Sin embargo, una fracción eluída entre el 30-34% del gradiente de AcN, parece ser un
factor común tanto en la hemolinfa base asi como en la hemolinfa retada con el Gram
modelo positivo y en la fracción 3-10 kDa de las exosecreciones obtenidas de larvas
alimentadas con hígado. Este hallazgo es de particular interés debido a que se acerca en
cuanto al rango de tamaño y porcentaje de hidrofobicidad reportado para los péptidos
Lucifensina I y II (28,29) que fueron aislados de Lucilia sericata y Lucila cuprina
respectivamente.
67
En cuanto a la hemolinfa proveniente de larvas expuestas a E. coli fue posible observar
actividad en una fracción eluida con 47% de AcN, que no fue encontrada en la hemolinfa
sin inmunizar. Así mismo, al comparar las fracciones activas entre hemolinfas y E/S, hay
coincidencia en cuanto a la presencia de moléculas poco hidrofóbicas, con actividad
sobre S. aureus (tabla 4-10).
Estos hallazgos coinciden con lo reportado con Kruglikova (44), quien encontró
fracciones activas a partir de hemolinfa inmunizada con una mezcla de bacterias Gram+/-
en las fracciones eluidas entre 30 y 33 % de AcN contra M. luteus y 28-38 % contra E.
coli.
Los resultados presentados en este estudio son un ejemplo del potencial bioprospectivo
que representan los insectos. Y en particular de las larvas de Calliphoridae. Otros
estudios sobre hemolinfa de larvas de califóridos revelan la presencia de péptidos
antimicrobianos del tipo defensinas (28,29) con actividad sobre bacterias Gram positivas.
Cecropinas, diptericinas y péptidos ricos en prolina con actividad sobre gram negativas
(79), los cuales están siendo utilizados para el desarrollo de productos farmacéuticos
(45,79). Asi mismo se han encontrado moléculas con actividad antitumoral y antiviral
como por ejemplo aloferonas (Calliphora vicina), las cuales han sido utilizadas para el
desarrollo un prototipos de vacunas contra el herpes genital y la hepatitis B (11), (Federal
Drug Application Guide, 5 edición, Moscú, 2004, sección 20.1.2.2.3.2).
68 Determinación de la actividad antibacteriana de extractos y hemolinfa de larvas de
Lucilia eximia (Diptera: Calliphoridae)
Tabla 4-10 Fracciones activas de hemolinfa de L. eximia, separadas por HPLC.
La elución se realizó con un gradiente lineal de AcN del 0,5% al 60% durante 60 minutos, mediante el
registro de cambios en la absorbancia a 220 nm. Las muestras se recogieron manualmente a una velocidad
de flujo de 1 ml min-1. La tabla presenta el porcentaje de AcN al cual fue colectada la fracción activa, así
como el tamaño en mm del halo de inhibición formado por la fracción, medido a las 24 horas.
CEPA
3-10 kDa
Sin inmunizar
3-10 kDa
Inmunización E. coli
3-10 kDa
Inmunización B. subtilis
% AcN Halo inhibición
mm % AcN
Halo inhibición
mm % AcN
Halo
inhibición
mm
B. subtilis
40
30- 33
27-29
3
3
4
41
3
3
5
16-18
43
11-20
28-31
4
7
7,5
3
S. aureus 30-32
11-20
2
3
4
12-14
5
3
4-7
15
4
3
E. coli 12-14 4 47
5-8
3.8
5 15 2
CEPA
<3 kDa
Sin inmunizar
<3 kDa
Inmunización E. coli
<3 kDa
Inmunización B. subtilis
% AcN Halo inhibición
mm % AcN
Halo inhibición
mm % AcN
Halo
inhibición
mm
B. subtilis 4-6 3 3-8 4 28 2
S. aureus 4-5 2 6-7 2 6-8 3
E. coli 6-7 2 4-7 2 3-5 2
69
5 Conclusiones y recomendaciones
5.1 Conclusiones
Se encontraron dos fracciones con actividad antibacteriana en exosecreciones de larvas
expuestas a patógenos, en un rango de pesos entre 3-10 kDa y una fracción con un peso
menor a 3 kDa.
Las diferencias en cuanto a la inhibición del crecimiento de las bacterias tratadas con E/S
expuestas y sin exposición a patógenos, se debieron a la concentración de extractos
utilizados en los ensayos y no diferencias en la composición de las mismas. Por lo tanto,
es posible sugerir que la actividad bacteriostática fue una consecuencia de la baja
concentración de las moléculas con actividad.
Se obtuvieron ocho fracciones con actividad antimicrobiana en la hemolinfa proveniente
de larvas inoculadas y sin inocular con bacterias, siendo la hemolinfa proveniente de
larvas inoculadas más activa sobre las cepas estudiadas.
La metodología utilizada para la inoculación de larvas con E. coli y B. subtilis permitió
obtener la hemolinfa suficiente inhibir el crecimiento de las bacterias y encontrar
diferencias con respecto a la hemolinfa base. Sin embargo, es necesario utilizar una gran
cantidad de individuos para colectar cantidades suficientes de cada de uno de los
compuestos y así poder determinar actividad biológica in vitro.
70 Determinación de la actividad antibacteriana de extractos y hemolinfa de larvas de
Lucilia eximia (Diptera: Calliphoridae)
Fue posible detectar actividad sobre E. coli de una fracción eluida con 47% de
proveniente de hemolinfa inmunizada con esta cepa y que no fue detectada en la
hemolinfa sin inmunizar.
Al comparar las fracciones activas entre hemolinfas y E/S, hay coincidencia en cuanto a
la presencia de moléculas poco hidrofóbicas, con actividad sobre S. aureus.
Una fracción eluida entre 30-34% de AcN, parece ser un factor común tanto en la
hemolinfa base asi como en la hemolinfa retada con el Gram modelo positivo, y en la
fracción 3-10 kDa de las exosecreciones obtenidas de larvas alimentadas con hígado.
Esta fracción se acerca en cuanto al rango de tamaño y porcentaje de hidrofobicidad de
péptidos aislados de otras especies del género Lucilia.
Las cepas Gram positivas fueron más sensibles a la exposición tanto de hemolinfa como
de E/S provenientes de larvas de L. eximia de tercer estadio.
5.2 Recomendaciones
Los hallazgos de este estudio corresponden a una búsqueda preliminar de compuestos
antibacterianos en L. eximia. El paso siguiente consiste en la purificación e identificación
de los compuestos que se encuentran en las fracciones que demostraron actividad
antimicrobiana, mediante HPLC y espectrometría de masas.
Finalmente, como se pudo determinar a partir de la revisión bibliográfica, es posible
encontrar moléculas con otro tipo de actividad biológica en las muestras obtenidas y por
lo tanto es deseable diseñar experimentos para la evaluación de actividad sobre otro tipo
de organismos como parásitos, hongos e incluso virus y células tumorales.
71
Anexo A
A. Anexo
B. subtilis
Prueba de Levene de calidad de varianzas prueba t para la igualdad de medias
F Sig. t gl Sig. (bilateral) Diferencia de medias
Diferencia de error estándar
95% de intervalo de confianza de la diferencia
Inferior Superior
<3 kDa ,329 ,587 -2,126 6 ,078 -11,50 5,40 -24,73 1,73
3-10 kDa ,988 ,359 -3,044 6 ,023 -14,750 4,845 -26,60 -2,89
>10 kDa ,007 ,936 -2,713 6 ,035 -20,250 7,46 -38,51 -1,98
E. coli
Prueba de Levene de calidad de varianzas prueba t para la igualdad de medias
F Sig. t gl Sig. (bilateral) Diferencia de medias
Diferencia de error estándar
95% de intervalo de confianza de la diferencia
Inferior Superior
<3 kDa 2,436 ,170 -1,336 6 ,230 -8,00 5,98 -22,64 6,64
3-10 kDa ,283 ,614 -1,715 6 ,137 -9,75 5,68 -23,65 4,15
>10 kDa 4,457 ,079 2,796 6 ,031 61,00 21,81 7,614 114,38
S. aureus
Prueba de Levene de calidad de varianzas
prueba t para la igualdad de medias
F Sig. t gl Sig. (bilateral) Diferencia de medias
Diferencia de error estándar
95% de intervalo de confianza de la diferencia
Inferior Superior
<3 kDa ,020 ,0892 -8,723 6 ,000 -24,25 2.78 -31,05 -17,44
3-10 kDa 4,109 ,089 -2,268 6 ,064 -16,50 7,27 -34,29 1,29
>10 kDa ,476 ,516 1,183 6 ,281 13,50 11,40 -14,41 41,41
La hipótesis nula de la prueba de Levene es la homoscedasticidad (igualdad de varianzas). La significación estadística en todas las pruebas indicó homogeneidad de varianzas p> 0,05.
72
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