Détection des Anticorps Anti-ADNnatif pour le Diagnostic

du Lupus Erythémateux Systémique

Étude Comparative de 7 Trousses de Dosage Immuno-enzymatique et d'un Test de Farr.

15/06/2001

Historique et épidémiologie de la maladie lupique

Lupus signifie « loup » en latin formes cutanées

Prévalence de 15 à 200 pour 100 000 habitants ;

Fréquence plus élevée chez les sujets non caucasiens ;

Prédominance féminine :

8 à 9 femmes pour un homme ; Pic de fréquence entre 20 et 30

ans ; Étiologies : facteurs génétiques,

endocriniens, immunitaires environnementaux…

Éruption en ailes de papillon

(Hebra 1845)

Mais présence aussi de complications viscérales…

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Diagnostic clinique de la maladie lupique

Définition de Dubois : « Syndrome clinique

- de cause inconnue, - avec atteinte systémique- touchant un ou plusieurs

appareils

Critères de gravité de la maladie : atteinte rénale, cardiaque, neurologique, hématologique (AHAI, purpura thrombopénique);

- évoluant par poussées, - entrecoupé de rémissions

multiples ».

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Diagnostic biologique de la maladie lupique

Anomalies biologiques diverses:

1) Signes hématologiques :

anémie, leucopénie, thrombopénie

2) Signes inflammatoires :

- Hyperglobulinémie polyclonale

- Dissociation VS, CRP ;

3) Cryoglobulinémie (III) ;

4) Activation du complément :

CH50, C3, C4 (C1q).

Grande diversité d’auto-Ac:

- Ac antinucléaires les plus spécifiques :

- anti-ADNnatif (40 à 90%)

- anti-Sm (5 à 30%)

- anti-PCNA (3 à 5%),

- Ac anti-phospholipides (20 à 40% des lupus),

- Ac anti-cellules sanguines

- Facteur rhumatoïde (30%)

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Critères de classification de l’ACR

1 Éruption malaire en ailes de papillon

2 Lupus discoïde

3 Photosensibilité

4 Ulcérations buccales et nasopharyngées

5 Polyarthrite non érosive

6 Pleurésie ou péricardite

7 Atteinte rénale : protéinurie 0.5 g/24 h, cylindres urinaires

8 Atteinte neurologique : convulsions, psychose (sans médicaments inducteurs)9 Atteinte hématologique : Anémie hémolytique avec hyper-réticulocytose

ou leucopénie 4 000/mm3 constatée au moins à 2 reprises

ou lymphopénie 1 500/mm3 constatée au moins à 2 reprises

ou thrombopénie 100 000/mm3 en l'absence de cause médicamenteuse

10 Désordre immunologique : anticorps anti-ADN natif, anticorps anti-Sm, anticorps anti-phospholipides (soit anti-cardiolipine de type IgG ou IgM à taux élevés, ou anticoagulant circulant lupique, ou sérologie syphilitique dissociée)

11 Présence d'un titre anormal d'anticorps anti-nucléaires.

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Rôle dans la pathogénie :

IgG et de haute avidité Atteintes rénales

IgM et de faible avidité Faible activité de la maladie

Intérêt dans le diagnostic :

- Taux élevés = Forte valeur prédictive (94%) mais attention!!

- Diagnostic différentiel de lupus induit (Ac anti-ADNn <5%)

Intérêt dans le suivi :

- Évolutivité : Taux élevés = Indice pronostic péjoratif

8 à 35% de lupus quiescents avec Ac anti-ADNn à taux élevés;

- Prise en charge thérapeutique.

Les Anticorps anti-ADN natif

Ac anti-ADN natif = Anticorps anti-nucléaires dirigés contre l’ADN du nucléosome. Il existe 3 types d’Ac anti-ADN :

- Ac anti-ADN natif dirigés contre l’ADNdb seul ou l’ADNdb et l’ADNsb ; - Ac anti-ADN dénaturé dirigés uniquement contre l’ADNsb.

Discordances :

Pas de règle

100% établie!!

Seuls les Ac anti-ADN natif sont spécifiques du LES :

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Les méthodes de détection des Ac anti-ADN natif

Recherche des anticorps anti-nucléaires par : Immunofluorescence indirecte sur cellules HEp-2.

Aspect nucléaire homogène sur cellules HEp-2

Confirmation de la spécificité « anti-ADNn » et dosage par

3 méthodes distinctes : Test de Farr Immunofluorescence sur

Crithidia luciliaeTechnique ELISA

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Les méthodes de détection des Ac anti-ADN natif

Test de Farr (RIA) IFCL ELISA

Sensibilité +++ ++ ++++++++

Spécificité ++++++ ++ +/-

Avantages -Technique quantitative-Méthode en phase liquide

- Test de référenceTest de référence

-Spécifique de l'ADN natif,

-Simple à mettre Simple à mettre en oeuvreen oeuvre

-Technique -Technique quantitative,quantitative,-Facilité d'emploi,-Facilité d'emploi,-Faible coût-Faible coût

Inconvénients -Présence possible d'ADN dénaturé en solution

-Utilisation de Utilisation de radioisotopesradioisotopes

-Technique semi-quantitative,

-Lecture subjectiveLecture subjective-Phénomène de zone

Présence possible Présence possible d'ADN dénaturé d'ADN dénaturé contaminantcontaminant

Interférences Héparines,Dextrans, Polyanions

Ac anti-histonesViroses, Syndrome des anti-phospholipides

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Objectifs de ce travail

Enquête rétrospective :

Évaluation des performances de 7 coffrets de dosage immuno-enzymatique des Ac anti-ADN natif par rapport au test de Farr utilisé en routine dans le laboratoire d’Immunologie du CHRU de Lille.

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Sérums et patients

Critères biologiques de sélection des 80 sérums :

76 sérums avec un titre en anticorps

anti-nucléaires 1/320e en IFI :

43 sérums Farr +33 sérums Farr –

4 sérums avec taux d’alpha foeto-protéine (AFP) 4000g/L (seuil à 10g/L)

Répartition clinique :

70 pathologies auto-immunes : • 53 lupiques :53 lupiques :

• 17 non lupiques17 non lupiques = autres maladies auto-immunes (SAPL, GS, myasthénie)

10 autres pathologies (Raynaud, pneumopathie, hépatopathie)

N=44 Sex ratio(F/H)=93%Age=15-78 ans (moyenne 42ans)Sévérité : Forme bénigne 18% (8/44)

Forme modérée 48% (21/44)Forme grave 34% (15/44)

Traitement : 43/44 (97%)Association à d’autres MAI : 45.5% (20/44)

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Matériel et méthodes

Les 7 coffrets ELISA : - Test 1 : société Bio AdvanceBio Advance,- Test 2 : société Sanofi Pasteur Sanofi Pasteur

DiagnosticsDiagnostics (Biorad),- Test 3 et 4 : société BMDBMD, - Test 5 : société The binding The binding

sitesite, - Test 6 : société Menarini Menarini

DiagnosticsDiagnostics,- Test 7 : société Pharmacia & Pharmacia &

UpjohnUpjohn. Test de Farr : Société

Ortho Clinical Diagnostic

Méthodologie identique : 1) Incubation des sérums dans les puits coatés

d’ADNbicaténaire,

2) Lavage,

3) Incubation en présence du conjugué,

4) Lavage,

5) Incubation en présence du substrat,

6) Révélation (lecture de DO).

Mais différences entre les trousses :

- Nature de l’antigène, de l’anticorps ;

- Autres : temps d’incubation, dilution

des sérums, nombre de calibrants,

DO de référence et la valeur seuil…

Calcul d’un seuil arbitraire

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Dosages des Ac anti-ADN natifs obtenus par le test de Farr et différents coffrets ELISA chez les

patients lupiques

UI/mL

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

110

220

Seuil arbitraire

Farr

BioAdvance

Sanofi

BMD a

BMD b

The B

inding site

Men

arini

Pharmacia

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Dosage des Ac anti-ADN natifs obtenus par le test de Farr et différents coffrets ELISA chez les

patients non-lupiques

UI/mL

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

110

220

Seuil arbitraire

Farr

BioAdvance

Sanofi

BMD a

BMD b

The B

inding site

Men

arini

Pharmacia

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0

20

40

60

80

100

Farr

Indices informationnels

Sensibilité (%)Spécificité (%)

Performances du test de Farr : Sensibilité=71%Sensibilité=71% Spécificité=78%Spécificité=78%

Ac de haute affinité =Maladie lupique évolutive89% des lupus avec Farr positif = formes modérées ou graves

Corrélation Titres/ Clinique : seulement entre formes bénignes et graves

Discordances clinico-biologiques :

- 28% lupus avec Farr négatif : -supérieur à la littérature (8 à 22%)-rarement formes bénignes -découverte récente -souvent atteinte articulaire-lupus traité

- 18% non-lupiques avec Farr positif :-SAPL le plus souvent

Contre performance?Contre performance?

Phase pré-sérologique?Phase pré-sérologique?

Lupus éteints ou stabilisé sous Lupus éteints ou stabilisé sous traitement?traitement?

Phase pré-clinique de lupus biologique?Phase pré-clinique de lupus biologique?

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Indices informationnels

0

20

40

60

80

100

Farr

BioAdvance

Sanofi

BMD a

BMD b

The Binding si

te

Men

arini

Pharmacia

Sensibilité (%)Spécificité (%)

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Comparaison Méthodes ELISA / Test de Farr

Concordance des résultats : MODESTE

- Dans la population lupique de 43 à 73%,

- Dans la population non lupique de 34 à 82%,

- Meilleure concordance globale avec les tests 2 (68%) et 7 (67%).

Corrélation des titres d’Ac anti-ADNn dans la population lupique : ACCEPTABLE

- Coefficient de corrélation de 0.24 à 0.67,

- Meilleure avec les tests 2 et 6,

- Meilleure pour les titres élevés en Ac anti-ADN natif.

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Comparaison des méthodes ELISA

Grande hétérogénéité des résultats obtenus :

Variation des sensibilités de 15 à 100%

Variation des spécificités de 15 à 94%

Concordance des résultats : MAUVAISE

- Dans la population lupique seulement pour 6 sérums (11%)

Meilleure avec les 4 coffrets les plus sensibles : 82%

- Dans la population non lupique seulement pour 1 sérum (3.7%)!!

Médiocre avec les 5 coffrets les plus spécifiques : 22%

Corrélation des titres avec la clinique : MAUVAISE

Seule UNE trousse (test 2) titres formes graves/ bénignes

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Manque de standardisation global entre les 7 coffrets même si étalonnés par rapport au même standard international : W0 80

Diagnostic biologique incohérent entre la majorité des trousses

Suivi évolutif des patients lupiques non adapté par méthode ELISA

Origines des discordances :

Facteurs extérieurs?

Défaut intrinsèque?- Phase solide=manque de spécificité,

- Imperfections des microplaques,

- Ac anti-plastique.

Différences entre les trousses?- Nombre d’étalons pour la calibration,

- Nature du réactif conjugué (antiglobuline),

- Origine de l’Ag.

Comparaison des méthodes ELISA

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Interférences

Ac anti-Histones/ Ac anti-ADN dénaturé :

Résultats faux positifs avec 6 coffrets

(Farr négatif et patients non lupiques). AFP :

Interférences avec 4 coffrets (tests 3, 4, 5 et 7) Ac anti-phospholipides :

Résultats positifs avec 5 coffrets (sauf tests 5 et 6 )

Phase solide favorise les réactions croisées entre Ac anti-phospholipides et ADN,

Or test de Farr positif pour 4 de ces sérums : présence probable d’Ac anti-ADNn Phase pré-clinique de lupus?

Facteur rhumatoïde et cryoglobuline:

Non représentatif dans notre enquête.

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Intérêt d’une démarche biologique hiérarchisée

Détection par

IF-CL++ --Méthodes ELISA

Confirmation par test de Farr

Adapter selon dialogue clinico-biologique

Suivi évolutif : Test de Farr détecte une augmentation des Ac anti-ADNn dans 85% des cas de rechutes contre 75% pour ELISA et 63% pour l’IF-CL

Associer d’autres paramètres biologiques : CH50 et fractions…

Recherche d’anticorps anti-nucléaires par IFI : Présents dans 99 à 100% des lupus mais non spécifiques de la maladie (connectivites, affections inflammatoires, sujet

âgé)

Recherche d’Ac anti-ADNn

=Test de 1ère intention

Aspect homogène en IFI avec

titre1/320e

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Conclusion

Aucun coffret commercial ELISA n’atteint les performances du test de Farr car :

- Problèmes techniques

- Encore trop de discordances et d'interférences

- Absence de corrélation entre titre et sévérité clinique

Choisir un coffret fiable

Confirmation par test plus spécifique

Importance du dialogue clinico-biologique…