DETECCIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE AMINOÁCIDOS, PÉPTIDOS Y PROTEÍNAS

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DETECCIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE AMINOÁCIDOS, PÉPTIDOS Y PROTEÍNAS Por: Andrés Felipe Lugo Vargas Curso de profundización: Química de alimentos Universidad de la Amazonía Florencia-Caquetá Septiembre de 2015

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Reacciones y metodologías más usadas en la detección y cuantificación de aminoácidos, péptidos y proteínas, y su correspondiente fundamento.

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DETECCIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE AMINOÁCIDOS, PÉPTIDOS Y

PROTEÍNAS

Por: Andrés Felipe Lugo Vargas

Curso de profundización: Química de alimentos

Universidad de la Amazonía Florencia-Caquetá

Septiembre de 2015

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Aminoácidos Libres

Proteínas

Grupos:

• Amino• carboxilo

Grupos R

• Sulfhidrilo• Fenólico• Hidroxilo• Tioéter• Imidazol• Guanidino

son capaces de reaccionar químicamente con otras

moléculasorgánicas.

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Reacciones químicas de los grupos funcionales de las proteínas

• Reacción con Ninhidrina:

Se utiliza a menudo para cuantificar aminoácidos libres, péptidos y proteínas.El aminoácido reacciona con un exceso de ninhidrina, que le causa una desaminación oxidativa y la producción de amoniaco.

producto color púrpura conocido como morado de Ruhemanns

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• Morado de Ruhemanns: absorbancia máxima a 570 nm

• La prolina y la hidroxiprolina dan un producto amarillo que tiene una absorbancia máxima a 440 nm

Estas reacciones coloridas son la base para las detecciones en cromatografía en papel y de capa fina (TLC), así como para la determinación colorimétrica de aminoácidos que se utiliza en los analizadores de aminoácidos para lo cual la proteína se hidroliza primero hasta aminoácidos libres. Los aminoácidos libres son separados utilizando cromatografía de intercambio iónico/hidrofóbica.

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• Reacción con fluorescamina:

Los aminoácidos, péptidos y proteínas que contienen aminas primarias producen, con fluorescamina, un derivado altamente fluorescente con una máxima emisión a 475 nm cuando la excitación se hace a 390 nm

• Este método se puede utilizar para cuantificar aminoácidos, proteínas y péptidos.

• Método muy sensible

• Método no destructivo

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• Reacción con Orto-ftalaldehído

La reacción de aminoácidos con O-ftalaldehído (1,2-benzeno dicarbonal) en la presencia de 2-mercaptoetanolproduce un derivado fluorescente que tiene una excitación máxima a 380 nm y una emisión de fluorescencia máxima a 450 nm

Método con alta sensibilidad: puede cuantificar aminoácidos a niveles de picomoles (10-12 mol).

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Análisis de los aminoácidos de las proteínas

• Paso previo al análisis:

Hidrólisis de la proteína: tanto ácida como básica a condiciones drásticas

Hidrólisis ácida: se somete la proteína a una temperatura de 120ºC, con HCl 6N durante 10-24 horas. El inconveniente que presenta la hidrólisis ácida es que el Trp se destruye completamente, en menor medida se destruyen Ser y Thr. Por otro lado Asn se desamida generando Asp. No se presenta racemización excepto por el caso de la L-Cys.

Hidrólisis básica: se lleva a cabo con NaOH a temperatura de ebullición. No se destruye el Trp, sin embargo se presenta racemización de la mayoría de aminoácidos y la destrucción de un porcentaje de Cys, cistina, Ser, Thr, Asn, Gln y Lys.

Hidrólisis enzimática: Evita las reacciones de degradación de los aminoácidos, sin embargo este método también presenta inconvenientes porque a veces es difícil lograr una hidrólisis completa y las mismas enzimas deben eliminarse antes del análisis.

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• Separación de los aminoácidos correspondientes:

Columnas de intercambio catiónico: La resina mas utilizada es la de poliestireno sulfonado.

Este tipo de resina separa los aminoácidos de dos modos: sus cargas negativas dejan pasar los aminoácidos ácidos y retienen los básicos.

La naturaleza hidrofóbica del mismo poliestireno tiende a retener los aminoácidos hidrofóbicos como la leucina y la fenilalanina.

HPLC: lleva a cabo la separación cromatográfica de los aminoácidos y su cuantificación.

Método rápido y de alta resolución.

Los aminoácidos que salen de la columna se detectan con cualquiera de los tres reactivos (Ninhidrina, fluorescamina y Orto-ftalaldehído)

Microelectroforesis y detección de fluorescencia: Su sensibilidad está en el orden de atomoles (amol, o 10-18 mol).

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Cuantificación de proteínas

Existen diversos métodos para la cuantificación de las proteínas, todos ellos basados en alguna de suspropiedades típicas, como puede ser la absorbancia de los grupos aromáticos a 280 nm, la reactividaddel enlace peptídico o el contenido de nitrógeno total.• Absorbancia a 280 nm:

Las proteínas purificadas son fácilmente detectadas y cuantificadas por sus propiedades de absorbanciaen UV a 280 nm.

La absorbancia depende del número y posición de sus residuos de aminoácidos aromáticos Phe (274.5 nm), Tyr (278 nm), y Trp (260 nm) y puentes disulfuro entre los residuos de Cys. La absorbancia de una proteína puede aumentar cuando se despliega, ya que expone sitios aromáticos que en condiciones normales no absorberían a 280 nm.

El desplegamiento hace posible calcular el coeficiente de absorción molar si se conoce el número de puentes disulfuro y el contenido de aminoácidos aromáticos, a su vez el coeficiente de absorción molar permite calcular la concentración de proteína.

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Ventajas:• Éste es el método más rápido, requiere de muy poca cantidad de proteína y no se afecta por la

presencia de sulfato de amonio.• La muestra no se destruye y puede ser usada en otros análisis.

Desventajas:• Tiene la limitante de que los ácidos nucleicos absorben a 260 nm, por lo que si se conoce la

relación de absorción de la proteína a 280/260 nm es fácil distinguir la interferencia de ácidos nucleicos.

Se usa usualmente como patrón la Albúmina Sérica Bovina (BSA), que es soluble en agua, para construir curvas patrón que sirvan de referencia para cuantificar otras proteínas, que serán más precisas mientras la proteína en cuestión se parezca más a la BSA.

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• La reacción de Biuret:

Es específica para la medición del enlace peptídico, por lo que sólo se recomienda para la cuantificación de proteínas, mas no de hidrolizados, a menos que se conozcan los tamaños moleculares y se adapte la proteína estándar de la curva.

Se utiliza una solución diluida de sulfato cúprico en tartrato fuertemente alcalino, ésta se adiciona a la solución de proteína, resultando un compuesto de color entre púrpura y violeta que absorbe a 540 nm, obtenido probablemente por el acomplejamiento del Cu+2

con dos enlaces peptídidos adyacentes.

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Se llevan a cabo varias reacciones en condiciones alcalinas y el ión cúprico (Cu+2) tiende a oxidar

la cadena peptídica reduciéndose a Cu+.

Desventajas:

• Dado que el grupo -NH del enlace peptídico está involucrado en la reacción, los residuos de Pro no participan y las proteínas con alto contenido de la misma, producen respuestas bajas.

• La técnica de biuret tiene baja sensibilidad, pues se requiere de 20-40 mg de proteína para una adecuada detección y existen varios pigmentos que absorben a 540 nm, longitud de onda de la medición.

• La presencia de NH4+ interfiere así mismo con la reacción. El desarrollo de colores diferente para cada proteína, y los lípidos e hidratos de carbono interfieren al formar complejos con el ión coordinado.

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• Método de kjeldahl para determinación de N total:

Es el más utilizado, e incluso se toma como referencia cuando se usan otras técnicas. El método no hace distinción entre el N que proviene de proteínas (de grupos amino y amida) y el no proteínico (urea, aminoácidos), lo que da lugar a errores en cálculo.

El método consiste en la digestión de la muestra con H2SO4 y la formación de NH4OH que es recibido en ácido para ser titulado con un álcali de concentración conocida. Los compuestos nitrogenados no proteínicos que causan una sobreestimación de la técnica son: glutatión, carnitina, carnosina, dopamina, urea, ornitina, colina y ácido aminobutírico.

Para reducir el error se deben aplicar factores de conversión específicos para cada proteína teniendo en cuenta el porcentaje de nitrógeno que poseen las proteína. Se calculan al dividir 100 entre el porcentaje de N particular de la proteína en cuestión.

El factor que se aplica sin discriminación es 6.25 resultante de una generalización del contenido de N de las proteínas de 16%, por lo que su factor de conversión será la 100/16 = 6.25.

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Desventajas:

• Puede haber pérdidas de nitrógeno debido a la temperatura de digestión y al tipo de catalizador utilizado.

• Debe considerarse el N no-proteínico medido junto con el proteínico.

• El proceso es largo y se utilizan reactivos y condiciones un tanto peligrosas.

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• Métodos de tinción de proteínas:

Azul brillante de Coomassie

R250

G250Se utiliza para cuantificar proteínas en solución ya que el complejo cambia sus propiedades de absorbancia: en condiciones ácidas su absorbancia máxima va de 465 a 595 nm.

Se utiliza principalmente para la tinción de proteínas en geles, esto hace que las proteínas queden fijas e insolubles en el gel. Es posible detectar aproximadamente 0.1 mg de proteína en geles de poliacrilamida.

El más sensible de los reactivos para teñir proteínas fijadas en un gel es la tinción de plata, el cual puede detectar menos que un nanogramo (10-9 g) de proteína.

Tinción con nitrato de plata

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• Electroforesis:

Éste es el método analítico más ampliamente usado para la separación de proteínas y es muy útil para el análisis de proteomas.

Cuando las proteínas se someten a un campo eléctrico pueden migrar hacia el polo de carga contraria a su carga neta a un pH determinado, por un fenómeno conocido como electroforesis. La proteína se desplaza hacia el cátodo o el ánodo, dependiendo del balance global de grupos positivos y negativos a un pH determinado.

Pueden realizarse electroforesis en condiciones nativas en las que las proteínas migran conservando su diversidad y propiedades físicas, especialmente su punto isoeléctrico y peso molecular. También puede llevarse a cabo en condiciones denaturalizantes si se utilizan tiol-reductores fuertes como mercaptoetanol y ditiotreitol (DTT) y un detergente desnaturalizante fuerte: el dodecil sulfato de sodio (SDS)

Es posible utilizarla en una sola dimensión o en dos dimensiones (2D). Se les denomina 1D o 2D-PAGE (por sus siglas en inglés, Electroforesis en Gel de Poliacrilamida).

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SDS-PAGE (1D)

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SDS-PAGE (2D)