Detección de la multi-resistencia bacteriana

Dr. Germán Bou, Jefe de Servicio de Microbiología del

Complejo Hospitalario Universitario A Coruña (CHUAC);

Director del Grupo de Investigación de Microbiología y

Enfermedades Infecciosas del Instituto de Investigación

Biomédica de la Coruña (INIBIC) en el Área de Genética,

Microbiología y Medicina Molecular; y Profesor Asociado de

Ciencias de la Salud, del Departamento de Microbiología y

Parasitología de la Universidad de Santiago de Compostela.

En el siglo XX, las muertes por enfermedades infecciosas descendieron (patrón

EEUU) debido a la combinación de mejoras en el desarrollo y en los sistemas de salud

como estándares de vida, saneamiento, agua potable, vacunas y medicamentos

antibióticos efectivos.

Los antibióticos ayudaron a mejorar el mundo. La penicilina aumentó la

supervivencia de enfermos con neumonia y bacteremia del 10% al 90%.

Pero un hecho

destacable de las bacterias en general es su rápida evolución a los antibióticos. Tal y

como se muestra en la figura de abajo, es notoria la aparición de un gran número de

enzimas tipo β-lactamasas identificadas tras la introducción de los primeros

antibióticos β-lactámicos. Este patrón evolutivo con semejante rapidez no se observa

en otros modelos biológicos.

Una preocupación especial, desde hace meses es la emergencia de cepas

resistentes a la colistina, único antibiótico que nos quedaba seguro frente a las

bacteria Gram negativas multirresistentes.

Paralelamente, el descubrimiento y desarrollo de nuevos antimicrobianos en los

últimos años ha tenido la evolución contraria. Muy pocos nuevos antibióticos han sido

aprobados en el actual siglo.

Por otro lado, la crisis de la RAM ha llegado ahora por diversas razones:

- Causas relativas a los microbios: evolución rápida - Causas humanas:

Población humana Sobreuso de los antibióticos

- Uso clínico Sobre prescripción Cursos de tratamiento extensos

- Percepción y comportamiento Almacenamiento Compras sin prescripción

- Aplicaciones en la agricultura/ganadería- Presiones comerciales- Reticencia a la vacunación

La RAM va a ser un problema de tremendas dimensiones. Las muertes atribuibles a la RAM para el año 2050 se estima en torno a los 10 millones como se puede ver en lafigura siguiente:

Según un informe de septiembre de

2016 del Banco Mundial (Drug

Resistant Infections. A Threat of Economic Future, World Bank Group) existe también

una repercusión económica importante relacionada las bacterias RAM: Pérdida en el

PIB, entre el 1,1 y el 3,8% (> 5% en los países con ingresos bajos), que conducirá a

28 M de personas a la pobreza, e incremento de los costes de la atención de salud de

$300M a $1000.000M, y afectación del desarrollo sostenible.

Hoy día se tiende a considerar el problema de la RAM, menos de manera médica

individual y más global, integrado, multisectorial, enfocado hacía la Salud, sobre todo

en lo que se refiere a la transmisión de los genes RAM, que afecta a bacterias

humanas, animales y de entornos naturales.

Para enfocar bien el problema, se ha llegando a acuerdos tripartitos como los de la

Food and Agriculture Organization of the United Nations (FAO), World Organization for

Animal Health (OiC) y World Health Oganization (WHO o OMS)

El plan Global de Acción de la OMS se puede resumir así: “mantener la capacidad

de prevenir y tratar infecciones con medicamentos seguros y eficientes … usados de

manera responsable y accesibles para todos"

(WHO, 2015. Global Action Plan on Antimicrobial Resistance.http :// apps.who.int/iris/bitstream/10665/193736/1/9789241509763_eng.pdf?ua=1)

El Grupo Especial de Coordinación Interagencial de la OMS, en mayo 2017,

reconocía que la RAM es compleja y que exige un enfoque multisectorial, y un marco

general de intervenciones, el vínculo entre la RAM y el Plan de Acción Mundial con los

ODS, la necesidad de mejores datos, pero también actuar sobre lo que ya se conoce,

el papel del medio ambiente en la aparición y propagación de la RAM, la necesidad de

investigación y desarrollo relacionada con la RAM, educación para profesionales

relevantes y público en general y participación de la comunidad social.

http:// www.who.int/antimicrobial-resistance/interagency-coordination-group/IACG-firstMtgReport.pdf?ua=1

Frente a este problema , las soluciones pueden ser múltiples y pasan por mejorar el

control d ela infección, planes de optimización del uso de antimicrobianos, protocolos

de seguimiento de microorganismos multirresistentes y optimizar la detección

temprana de los mismos a través de metodología del laboratorio.

Se contemplan y analizan varios métodos actuales y de futuro:

Métodos actualmente más utilizados

Pruebas fenotípicas automáticas y/o

manuales Pruebas proteómicas (MALDI-TOF MS) Técnicas moleculares basadas en ácidos

nucleicos (PCR sobre todo)

Pruebas proteómicas

En línea con las medidas de control, el Dr. Bou y su equipo tienen amplia

experiencia en la detección rápida de bacterias (RAM) con el sistema MALDI-TOF MS.

Algunos resultados a modo de resumen:

Detección de β-lactamasa(carbapenemasa) OXA-48

Desarrollaron un ensayo de espectrometría de masas con el MALDI-TOF MS,

rápido y sensible (100%) que los existentes, para detectar bacterias productores β-

latamasa tipo OXA-48 en 161 aislados clínicos previamente caracterizados. Se

controló el ertapenem para detectar resistencia a carbapenemes, y se incluyó la

temocilina como un marcador para las cepas productoras de OXA-48. Los datos de los

resultados se obtuvieron en un tiempo dentro de 60 min.

J

Clin Microbiol 2016; 54(3): 754–759. doi: 10.1128/JCM.02496-15.

Resistencia a carbapenémicos de bacilos Gram negativos de hemocultivos positivos

Otro nuevo método desarrollado, basado en el MALDI-TOF, fue para la detección

rápida y automática de Enterobacteriaceae, Pseudomonas aeruginosa y Acinetobacter

baumannii productoras de carbapenemasas, directamente a partir de sangre de

hemocultivos positivos. La actividad de la carbapenemasas se determinó en 30

minutos midiendo la hidrólisis de imipenem (0,31 mg/ml) en hemocultivos enriquecidos

con una serie de 119 aislados previamente caracterizados, 81 de los cuales portaban

un tipo de carbapenemasa (10 blaKPC, 10 blaVIM, 10 blaNDM, 10 blaIMP , 26 blaOXA-48-tipo,

9 blaOXA-23, 1 blaOXA-237, 3 blaOXA-24 y 2 blaOXA-58). Este ensayo resultó simple de

realizar, económico, con ahorro de tiempo, universal para bacilos gramnegativos y

altamente confiable (sensibilidad y especificidad generales de 98% y 100%,

respectivamente). El tiempo total de 1 h, incluida la extracción, la incubación y el

análisis del MALDI-TOF.

El procedimiento empleado podría establecerse como un método estandarizado en

laboratorios clínicos ya que no requiere capacitación especializada en espectrometría

de masas.

J Antimicrob Agents 2016; 48: 655-660. http://dx.doi.org/10.1016/j.ijantimicag.2016.08.024

Imipenem–avibactam: combinación para la detección rápida de carbapenemasasen Enterobacteriaceae y Acinetobacter baumannii por MALDI-TOF

En este estudio se propuso un novedoso método basado en MALDI-TOF MS para

detectar Enterobacteriaceae y Acinetobacter baumannii productoras de

carbapenemasas. Se analizaron una serie de 131 aislados. Entre ellos, un total de 115

Enterobacteriaceae: 79 con una carbapenemasa (15 blaKPC, 7 blaNDM, 11 blaIMP, 12

blaVIM y 34 blaOXA-48) y 16 aislados de A. baumannii: 15 con carbapenemasas (10

blaOXA-23, 2 blaOXA-58, 2 blaOXA-24 y 1 blaOXA-237). El resto de los aislados no eran

productores de carbapenemasas (controles negativos). Las bacterias se sometieron a

pruebas de sensibilidad usando una combinación de imipenem-avibactam y se

analizaron mediante el software MALDI-TOF Biotyper Compass (Bruker Daltonik,

Alemania). El ensayo mostró una sensibilidad y especificidad global para la detección

de carbapenemasas del 98% y del 100%, respectivamente. La combinación de

imipenem y avibactam mostró actividad contra Enterobacteriaceae productoras de

KPC y OXA-48, pero no proporcionó ningún beneficio sobre A. baumannii.

Diag Microbiol InfectDis 2016; 87: 129-132.

doi:http://dx.doi.org/10.1016/j.diagmicrobio.2016.10.016.

Detección rápida del determinante de resistencia a quinolonas condicionada porplásmido AAC(6 ')-Ib-cr en Enterobacteriaceae por análisis con MALDI-TOF MS

El objetivo del estudio fue la detección rápida del determinante de resistencia a

fluoroquinolonas condicionada por el plásmido AAC(6')-Ib-cr en Enterobacteriaceae

analizando por MALDI-TOF MS la actividad de la acetiltransferasa. La presencia de la

enzima se midió en una colección de 81 cepas de control isogénicas de Escherichia

coli [10 portanban AAC(6')-Ib-cr durante su exposición a ciprofloxacino, norfloxacino y

levofloxacino] y un análisis adicional de 36 aislados clínicos [25 con AAC(6')-Ib-cr,

además de diferentes combinaciones de mecanismos de resistencia a quinolonas]. El

efecto de la acetilación produce un aumento de 43 Da en la masa de ciprofloxacino y

norfloxacino, pero no de levofloxacino. Se encontró una clara diferenciación entre los

aislados productores de AAC(6')-Ib-cr- y los no productores, todo en un tiempo de

incubación de 30 minutos, tanto en las cepas de control isogénicas como en los

aislados clínicos. El levofloxacino se encontró intacto. Hubo un acuerdo del 100%

entre el ensayo basado en MALDI-TOF-MS y los resultados de la caracterización

molecular de los aislados analizados. Este método es fácil de realizar y no consume

mucho tiempo, ya que los resultados analíticos se pueden obtener en cuestión de

minutos.

J Antimicrob Chemother2017;

72: 1074-1080. doi: 10.1093/jac/dkw552

Detección directa rápida de Enterobacteriaceae productoras de carbapenemasas

en muestras clínicas de orina mediante análisis MALDI-TOF MS

Lo autores procesaron 3 041 muestras de orina mediante citometría de flujo, y se

utilizó un valor de corte de ≥1.5 ×105 bacterias/ml para seleccionar las muestras,

quedando 608 muestras para identificación bacteriana directa. La detección de la

actividad carbapenemasa por análisis con MALDI-TOF MS sólo se realizó después de

la identificación directa confiable de bacilos gramnegativos. Se desarrolló un nuevo

procedimiento para extraer bacterias de muestras de orina utilizando el Sepsityper Kit

(Bruker Daltonik, Alemania). La resistencia a carbapenem se detectó con imipenem

como marcador antibiótico y los resultados se interpretaron automáticamente

utilizando el módulo STAR-BL del software MALDI-TOF Biotyper Compass (Bruker

Daltonik, Alemania). Con el MALDI-TOF MS produjo una identificación directa

confiable de 91% (503/553) de las muestras. El ensayo mostró 100% de sensibilidad

(30/30) y especificidad (454/454) para detectar la actividad carbapenemasa dentro de

los 90 min de recepción de la muestra. Los aislados incluidos en el estudio se

caracterizaron además por PCR y secuenciación, y se detectó blaOXA-48 en todos los

aislados que dieron positivos con el MALDI-TOF MS. El método ahorra al menos 24-48

horas en relación con los métodos de habituales actuales.

J Antimicrob Chemother 2017; 72: 1350–1354. doi:

http://doi.org/10.1093/jac/dkW579.

Hacia la detección temprana de Enterobacteriaceae productoras de β-lactamasas mediante análisis con MALDI-TOF MS

El método se evaluó en términos de sensibilidad, especificidad y tiempo de

respuesta con respecto al antibiótico utilizado (cefotaxima, ceftazidima, ceftriaxona,

cefpodoxima o cefepima) y el rendimiento del software MBT STAR-BL (Bruker Daltonik

GmbH, Alemania) relativo a interpretación cualitativa de los espectros para detectar

resistencia por β-lactamasa usando el MALDI-TOF MS (Bruker Daltonik) en una

colección de 11 cepas de control isogénicas de Escherichia coli que expresan

diferentes tipos de β-lactamasas. Para la validación clínica, se determinó la actividad

β-lactamasa en 100 aislados clínicos en condiciones evaluadas previamente,

caracterizados por PCR y secuenciación.

La validación clínica del ensayo mostró una sensibilidad y especificidad del 100%

para detectar la resistencia a los β-lactámicos en 30 minutos midiendo la hidrólisis de

ceftriaxona (0,50 mg / ml) con el software automático MBT STAR-BL. En cuanto a los

antibióticos evaluados, la ceftriaxona arrojó un 70% más de resultados positivos que la

cefotaxima, un 80% más que la ceftazidima y un 20% más que la cefpodoxima, con un

100% de especificidad. Cefepime reveló una sensibilidad del 100%, pero solo un 27%

de especificidad. Para el mismo tiempo de incubación, el software dió un promedio de

41% más de resultados positivos en relación con la detección de resistencia que la

interpretación cualitativa de los espectros.

Esta validación clínica del método demostró ser altamente confiable, simple de

realizar y de ahorro de tiempo, transformando la detección de resistencia a β-

lactámicos por MALDI-TOF MS en una técnica lista para usar en laboratorios clínicos.

J Antimicrob Chemother 2017; 72: 2259-2262. https//doi.org/10.1093/jac/dkx127.

Métodos moleculares

Estos métodos usados para la detección de bacterias RAM se resumen así:

‒ PCR simple o múltiple

‒ PCR en tiempo real (Sybr green, Taqman, Hybridization probes)

‒ PCR de hibridación inversa

‒ Micromarrays de DNA

‒ Amplificación basada en las secuencias de ácidos nucleicos (NASBA)

‒ Amplificación isotérmica de DNA (LAMP)

Evaluación de un nuevo procedimiento para la detección rápida de Enterobacteriaceae productoras de carbapenemasas (EPC) utilizando equipos de carbapenemasas modulares LightMix®

Los equipos (kits) modulares de PCR multiple dirigidos a la detección de genes de

resistencia los carbapenemes blaKPC, blaNDM, blaVIM, blaIMP y blaOXA-48- se

evaluaron en términos de sensibilidad y especificidad en un conjunto de 118 aislados

clínicos marcados. Entre estos, 96 fueron EPC genotípicamente caracterizados por

PCR y secuenciación. Los límites de detección se calcularon para los diferentes genes

de resistencia en términos de ufc/ml. Además, los kits se usaron para evaluar la

colonización de enfermos mediante EPC al comparar este ensayo con el kit Xpert®

Carba-R en 127 muestras rectales, perirrectales y faríngeas. También se evaluaron

hemocultivos de bacteriemias (4) y hemocultivos enriquecidos (23) con aislados

genotípicamente caracterizados.

La sensibilidad y especificidad global del ensayo de PCR múltiple fue del 99% y del

100%, respectivamente. El límite de detección para blaKPC, blaVIM, blaIMP y blaOXA-

48 es de 60 ufc/ml y para blaNDM 500 ufc/ml. Los estudios de colonización y

bacteriemia revelaron un acuerdo del 100% entre los resultados obtenidos por este

ensayo y los obtenidos por GeneXpert®.

Los autores concluyen que los equipos de carbapenemasas modulares LightMix®

son ensayos altamente confiables y utilizables para enfermos colonizados y sépticos, y

pueden ayudar a mejorar el control de la infección. Su diseño modular facilita la

detección rentable de EPC en entornos hospitalarios.

J Antimicrob Chemother 2016; 71: 3420-3423. doi:10.1093/jac/dkw356.

Conclusiones de los métodos fenotípicos, proteómicos y moleculares

Métodos fenotípicos

Pros ContrasBaratosFáciles de usar

Requiere aislamiento bacteriano24-48 horas de incubaciónTiempo total lento 24-48 horas

Métodos proteómicos

Pros ContrasBajos costos de operaciónIdentificación rápidaFácil de manejar Solo se necesita una colonia Excelente identificación de bacterias

Altos costos iniciales Base de datos incompleta todavíaPoca experiencia aún en detección de RAMNo se aplica a muestras clínicas, excepto muestras de orina y hemocultivos positivosSe necesita más automatización

Métodos moleculares

Pros ContrasRapidezDetección de bacterias exigentesDetectan pequeñas cantidades de bacteriasDetectan genes RAMÚtiles para vigilancia epidemiológica

Interpretación de resultados (colonización vs. Infección, calidad de la muestra, no detección de nuevos patógenos)Coste eficienciaSolo se encuentran los genes que sebuscan

Vacunas

El desarrollo de vacunas, es buena arma frente a los microorganismos patógenos, y

ahora una prioridad para la salud mundial debido a la creciente resistencia a múltiples

fármacos en las bacterias. El Dr. Bou y su equipo también están trabajando en este

campo.

Diseño de vacunas bacterianas atenuadas vivas basadas en la auxotrofia de D-glutamato

La síntesis de D-glutamato es esencial para la formación de la pared celular

bacteriana. El Dr. Bou comenta un artículo publicado en Nature Communication por él

y su equipo una estrategia para generar vacunas eficaces de células enteras

auxotróficas para D-glutamato. Generaron vacunas auxotróficas D-glutamato para tres

patógenos principales, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa y

Staphylococcus aureus. Estas vacunas bacterianas muestran atenuación de virulencia

y crecimiento autolimitado en ratones, y provocan anticuerpos funcionales y de

reactividad cruzada, e inmunidad celular. Estas respuestas se correlacionan con la

protección contra la infección letal aguda con otras cepas de la misma especie,

incluidos clones resistentes a múltiples fármacos, virulentos y/o de alto riesgo, como A.

baumannii AbH12O-A2 y Ab307-0294, P. aeruginosa PA14, y S. aureus USA300LAC

resistente a la meticilina adquirido en la comunidad. Este enfoque puede aplicarse

potencialmente para el desarrollo de vacunas vivas atenuadas para prácticamente

cualquier otro patógeno bacteriano, y no requiere la identificación de determinantes de

virulencia, que a menudo son específicos de patógenos.

Se produce respuesta inmune humoral hasta 293 días post-vacunación, celular

condicionada por IFN-g, IL-4 y IL-17 contra cepas no relacionadas incluyendo MDR, y

clones de alto riesgo internacionales y altamente virulentos, incluídos los veterinarios.

La vacuna protege frente a infecciones agudas letales causadas por A. baumannii, P.

aeruginosa y S. aureus.

Nature Communications 8, Artículo número 15480 (2017). doi:10.1038/ncomms15480

El grupo tecnológico empresarial de las

ciencias de la vida de Galicia (BIOGA) premió

este proyecto como “Mejor Idea Empresarial

Biotech 2016”, y también recibió el premio

Caixa Impulse.