Deteção de lipidos c negro sudao B

Detecção de Lípidos em sementes de Cicer arietinum utilizando a Técnica Histológica Normal com

Negro de Sudão B

Faculdade de Ciências e Tecnologias da Universidade de Coimbra

Métodos e Técnicas em Citologia e Fisiologia

Detecção de Lípidos em sementes de

Cicer arietinum utilizando a Técnica

Histológica Normal com Negro de Sudão

B

Grupo P3L1:Ana Cláudia da Costa Pires

Ana Rita Gonçalves Graça

Daniela Isabel Paiva de Oliveira

1


Negro de Sudão B

Coimbra, 22 de Janeiro de 2008

2


Negro de Sudão B

ÍNDICE

1. Introdução pp.3

pp.

2. Materiais e Métodos pp.9

2.1. Material pp.9

2.2. Métodos pp.9

2.2.1. Fixação pp.10

2.2.2. Desidratação pp.10

3


Negro de Sudão B

2.2.3. Impregnação e Inclusão pp.11

2.2.4. Microtomia pp.12

2.2.5. Coloração pp.13

2.2.6. Finalização pp.14

3. Resultados pp.15

4. Discussão e Conclusão pp.17

5. Bibliografia pp.18

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Negro de Sudão B

1. INTRODUÇÃO

A realização deste trabalho teve como objectivo observar lípidos presentes nos

tecidos vegetais de grão-de-bico, com o auxílio do corante Negro Sudão B.

A planta em estudo pertence à classe Magnoliopsida, ordem das Fabales, família

Fabaceae ou Leguminosae. Esta família é muito variada no que toca a tipos de plantas e

aos seus habitats. Os Fabaceae têm uma maior distribuição nas zonas tropicais,

subtropicais e temperadas, e revestem-se de grande importância económica e alimentar

para o Homem, servindo como matéria-prima para rações animais, medicamentos,

fertilizantes e mesmo corantes, só para enumerar algumas das opções possíveis.

As flores desta família possuem 5 pétalas, que se arranjam dando a ideia da forma

de uma borboleta. Os legumes da Fabaceae adquirem várias formas e aspectos, variando

entre secos ou carnudos, inchados ou comprimidos, esverdeados ou de cores claras, e de

alguns milímetros a 30 centímetros ou mais. As sementes, normalmente, possuem uma

capa dura (Heywood, 1993).

O grão-de-bico é uma leguminosa produzida pela planta

Cicer arientinum, cujo cultivo é feito sobretudo na região do

Mediterrâneo, Médio Oriente e Índia. Cultivados no Egipto e

na Índia e posteriormente na civilização grega, hoje em dia são

exportados em todas as costas mediterrâneas (Bianchini, 1974).

Existem três variedades principais: o deshi, que tem um

tamanho mais reduzido e coloração amarela ou negra; o kabul

ou kabuli, que tem um tamanho médio ou grande e coloração

clara; e por último, o gulabi, que tem um tamanho pequeno,

textura lisa e coloração clara. 3

O grão-de-bico precisa de um período de 4 a 6

meses em condições apropriadas (ambiente seco e

morno) para se desenvolver bem. Esta planta possui

flores pequenas, violetas ou brancas, solitárias ou em

pequenos agregados, irregulares e bissexuais que

desenvolvem uma bainha. No interior destas bainhas

encontram-se 2 a 3 grãos no máximo. Os grãos de cor

castanho-claro (ou também verde) são arredondados, tendo uma pequena “espora”. A

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Figura 1: Planta Cicer arietinum. 1

Figura 2: Grãos castanhos e verdes de Cicer arietinum. 2


Negro de Sudão B

sua periodicidade é anual. Trata-se de uma planta herbácea, que mede entre 20 a 50 cm

de altura. A farinha de grão-de-bico é muito usada em cozinha vegan (Huxley, 1992).

O grão-de-bico é uma excelente fonte de hidratos de carbono, sendo o amido o mais

abundante. Além disso, tem um importante teor de proteínas de origem vegetal. Tem um

baixo teor de lípidos, sendo predominantemente monoinsaturados. Destaca-se também o

conteúdo em fibra alimentar. Relativamente às vitaminas, é relevante o valor em folatos

e vitamina B1. Quanto aos minerais, o grão-de-bico apresenta valores consideráveis de

ferro, fósforo e potássio.

Apesar de existirem outras formas de preparação culinária, na gastronomia

Portuguesa o grão-de-bico é consumido preferencialmente como leguminosa seca, que é

rehidratada e cozida.3

Assim, faremos agora uma abordagem aos lípidos, objectivo de estudo do nosso

trabalho.

Os lípidos são biomoléculas orgânicas constituídas basicamente por carbono e

hidrogénio, podendo também conter oxigénio, fósforo e azoto, porém em baixas

percentagens. Caracterizam-se por possuírem na sua estrutura molecular ácidos gordos

com, pelo menos, 8 átomos de carbono.

Estas biomoléculas formam um grupo de compostos que é caracterizado por serem

insolúveis em água mas muito solúveis em solventes orgânicos, como o éter, o álcool, a

acetona, o sulfureto de carbono e o tetracloreto de carbono. Esta propriedade geral dos

lípidos e compostos relacionados deve-se ao predomínio de longas cadeias

hidrocarbonatadas alifáticas ou anéis benzénicos.

A maioria dos lípidos apresenta a mesma estrutura básica, isto é, a sua grande

maioria são esteres de glicerol (1, 2, 3 – propanotriol) com longas cadeias de ácidos

carboxílicos, R-COOH. Todas as moléculas de glicerol possuem três grupos funcionais

álcool, pelo que três moléculas de ácido carboxílico podem, eventualmente, estabelecer

ligações éster com cada uma das moléculas de glicerol. Nesse caso dizemos que há

formação de triesteres, também denominado por triglicéridos (Lehninger & al., 2000).

Os lípidos distinguem-se entre simples e complexos. Os lípidos simples são os que

por hidrólise originam um álcool e um ou mais ácidos gordos. As ceras e as gorduras

são lípidos simples. Os lípidos complexos, quando hidrolisados, libertam um álcool,

ácidos gordos e ácido fosfórico, entre outros. Os lípidos complexos mais conhecidos são

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Negro de Sudão B

os fosfolípidos. Certos investigadores afirmam a existência de uma outra divisão: os

lípidos derivados. Constituintes deste grupo são os ácidos gordos, álcoois gordos,

vitaminas lipossolúveis e hidrocarbonetos (Campos, 1982).

Os lípidos, também designados por gorduras, são muito importantes no que toca a

armazenar gordura nos seres vivos e, em pequenas quantidades, são fundamentais na

manutenção e crescimento de todos os seres humanos.

Estas substância químicas tornam os alimentos mais saborosos e saciantes. Assim,

após a ingestão pelo ser humano, elas são decompostas de modo a obter energia. Porém,

se forem mais que suficientes, o organismo sintetiza-os em lípidos humanos e acumula-

os em células adiposas sob a forma de reservas de energia. Este sistema não é benéfico

visto que pode causar graves problemas de saúde. Muitos médicos acreditam que a

acumulação de alguns lípidos é mais prejudicial do que a de outros. Os lípidos saturados

possuem menos ligações duplas que os insaturados. Quanto mais saturados forem os

lípidos, maior é a tendência para provocar a obstrução de vasos sanguíneos e provocar

doenças cardíacas. Sendo assim, uma dieta rica em lípidos polinsaturados, segundo os

médicos, é muito mais saudável.

A natureza dos ácidos gordos presentes nos lípidos determina as propriedades e o

estado físico dos mesmos. Num lípido, as proporções em que cada ácido existe é

variável.

Como já foi dito, os lípidos podem ser dissociados por hidrólise, a qual é

normalmente desenvolvida aquecendo o lípido com hidróxido de sódio. Por hidrólise

obtemos, por exemplo, os sabões. Estes são sais de sódio ou potássio de ácidos gordos,

obtidos a partir do aquecimento de lípidos com hidróxido de sódio ou de potássio.

Os lípidos desempenham várias funções biológicas importantes nos organismos

vivos, nomeadamente:

- Armazenamento e transporte de energia,

- Formação de membranas celulares,

- Manutenção da integridade estrutural das membranas celulares,

- Fornecimento de ácidos gordos essenciais para as estruturas celulares,

- Transporte de vitaminas lipo-solúveis

- Mensageiros (hormonas).

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Negro de Sudão B

Para podermos observar os lípidos tivemos que utilizar o chamado método

histológico normal, que será agora resumido.

Este método contém as seguintes etapas: fixação, lavagem em água/tampão,

desidratação, pré-impregnação num agente intermediário, impregnação, microtomia e

por fim a coloração/contrastação.

A primeira etapa, a fixação, tem como objectivo principal preservar os

componentes celulares para que estes se mantenham semelhantes o mais possível ao seu

estado vivo. Assim, é necessário evitar a autólise da célula. Outro objectivo principal é

também endurecer as amostras para que elas possam ser usadas nas etapas seguintes do

processo. Por ultimo, a fixação é muito importante no que toca a aumentar a afinidade

das estruturas celulares para os corantes citológicos. Há dois tipos de fixação: a química

e a física. A fixação química recorre a fixadores simples ou misturas fixadoras, que

variam consoante o estudo que se quer fazer e o microscópio que se vai utilizar. Este

tipo de fixação induz artefactos, logo, surgiu um novo tipo de fixação. A fixação física

pode ser feita pelo calor, sendo esta fixação mais usada em bacteriologia e em

hematologia, ou pelo frio - criofixação. Esta última, apesar de ser mais dispendiosa, é

muito boa pois induz menos alterações nas células e evita a formação de gelo cristalino.

Este provoca um aumento de volume nas células, deformando as estruturas.

Assim, é necessário que a criofixação seja rápida, para que não haja formação de

cristais de gelo, e que as temperaturas sejam muito baixas, para que haja a formação de

gelo amorfo, visto que este não deforma as células. Devem ser usadas amostras de

pequeno tamanho para que o congelamento seja fulminante. Como a água nas zonas

intracelulares não tem solutos dissolvidos, congela mais rapidamente que a água das

células. Os criofixadores impedem a formação de gelo nas zonas intracelulares,

possibilitando assim a fulminação. A fixação do material pode ser feita por imersão, por

disparos de jactos de água de criogénio para o material biológico, ou então pode ser

uma fixação indirecta, onde suportes de metal são arrefecidos pelo criogénio e o

material é colocado por cima.

Depois desta primeira etapa concluída, é necessário que sejam removidos os

excessos de fixador. Para isso usam-se tampões. Estes tampões são soluções aquosas

que contêm vários sais, e têm que possuir, mais ou menos, as mesmas características da

célula, caso contrário haveriam alterações estruturais nesta. Os tampões mais usados são

o fosfato e o cacodilato de sódio.

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Negro de Sudão B

A próxima etapa, a desidratação, é usada porque o material de impregnação que a

seguir vai ser utilizado não é solúvel em água, e quando é usado o microscópio

electrónico de transmissão (TEM) a água não pode entrar dentro da coluna. Pode

remover-se a água usando duas técnicas: sucessivas imersões em álcool etílico (etanol)

ou acetona, em séries crescentes, ou então usando uma criotécnica em que a

desidratação se faz pelo frio. Este último caso pode ser efectuado de duas formas: pela

crio-dessecação ou pela crio-substituição. A crio-dessecação é complementar à

criofixação. Aqui, o material é passado de um criofixador, que se encontra a -180˚, para

um crio-dessecador, que se encontra a -170˚, forma-se um vácuo, o gelo amorfo é

captado e fixado pelo pentóxido de sódio, sublimando instantaneamente. A crio-

substituição é mais demorada. O material sai do criogénio e vai para um crio-

substituidor, onde se encontra acetona anidra, que não tem água, e fica a temperaturas

também baixas (cerca de -80˚). Assim, o gelo amorfo é substituído muito lentamente

por esta acetona.

Este processo pode demorar dias.

Segue-se, então, a inclusão do material biológico num material duro, não

biológico, normalmente parafina, para que se possam fazer cortes finos. A este processo

dá-se o nome de impregnação. A parafina é considerada um bom meio de inclusão, e o

seu ponto de fusão varia entre 56 e 58 ˚C. Mas a parafina não é solúvel no etanol, e

vice-versa, logo, desidratamos o material através de séries de etanol e Isoparafina H.

Esta é um agente pré-impregnante para a parafina, pois tanto é solúvel nesta como em

etanol. Outros exemplos de agentes pré-impregnantes para a parafina são o Toluol,

Xilol e o Clorofórmio (que não são tão utilizados visto serem mais tóxicos).

Na impregnação, colocámos o material biológico a analisar num molde metálico e

ocupamos o espaço restante do molde com parafina. Os moldes com esta preparação

foram ao frigorífico durante quinze minutos.

Depois de prontos, a parafina, no seu

estado sólido, com o material biológico, foram

retirados do molde e iniciou-se a fase da

microtomia. Esta etapa consiste na obtenção de

ténias (cortes finos, com espessura que pode

variar entre 5 a 20 µm) de material biológico

incluído na parafina, para posterior observação.

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Figura 3: Obtenção de ténias num micrótomo tipo Minot. 4


Negro de Sudão B

Usando o micrótomo tipo Minot, colocamos a pirâmide de parafina na estrutura de

suporte e orientação desta, e dando à manivela, e com a estrutura de suporte da lâmina

no local correcto, a pirâmide de parafina sobe e desce, aproximando-se da lâmina e

fazendo os cortes na parafina, originando as ténias. Estas serão recolhidas com a ajuda

de um pincel e colocadas numa base segura, que posteriormente terá de ir para uma

estufa.

Antes de se poder passar à coloração dos cortes, tem que haver uma hidratação do

material biológico. Isto consegue-se com séries decrescentes de Isoparafina H e de

etanol. Para finalizar este processo, é necessário que as preparações estejam submersas

em água corrente.

Concluída a hidratação, passamos assim à coloração. Os corantes possuem dois

constituintes que os caracterizam e diferem uns dos outros: o cromóforo, responsável

pela cor e o auxocrómo, responsável pela afinidade do corante ao material celular. No

entanto, há um outro tipo de corantes, que não possuem auxocrómos, e que são

designados por lisocromos. Estes são lipo-solúveis, ou seja, dissolvem-se nas gorduras,

corando-as. No caso do nosso trabalho, foi usado o Negro Sudão B, que é um lisocromo

que cora os lípidos de uma cor negra ou azul escura.

Para que a coloração ficasse concluída foi necessário mergulhar as preparações

numa série crescente de etanol, seguindo depois para a estufa, onde permaneceram até

ficarem prontas para serem montadas em DPX. Esta montagem é importante porque só

assim somos capazes de as observar ao microscópio óptico (Dinis & al., 2006).

De seguida relatamos em pormenor os métodos e técnicas utilizados nesta

experiência.

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Negro de Sudão B

2. MATERIAL E MÉTODOS

2.1. Material

2.1.1. Material vegetal

Cicer arietinum (semente de grão-de-bico)

2.1.2. Material de laboratório

Lamparina com álcool

Pinça

Bisturi

Micrótomo

Molde de plástico

2.1.2.1. Material de vidro

Conta-gotas

Tina com ranhuras (2x, uma com parafina e outra com água)

Lâminas

Lamelas

2.1.2.2. Reagentes

Parafina

Isoparafina H

Água/ água destilada

Corante Negro de Sudão B

Etanol

DPX

2.2. Métodos

Para se conseguirem observar células mortas num estado de preservação idêntico

ao das células no seu “estado vivo” teremos de as tratar convenientemente. Para isso

usaremos reagentes químicos e/ou colocaremos a célula em condições adversas o que

pode provocar alterações a nível estrutural e da composição química das estruturas

celulares, por isso deve-se evitar o mais possível que estas alterações sejam detectadas

no tipo de microscópio que se pretende utilizar.

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Negro de Sudão B

As etapas deste tratamento são denominadas por técnica histológica normal e são

sempre as mesmas quer se use o MO (microscópio óptico) quer se use o TEM

(microscópio de transmissão electrónica).

2.2.1. Fixação

A fixação citológica tem como objectivo matar as células, mas de uma maneira a

que estas consigam conservar a sua estrutura e composição química a mais idêntica

possível às células no estado vivo.

A fixação pode ser realizada usando substâncias químicas, que se designam

fixadores simples ou misturas fixadoras, neste caso trata-se de uma fixação química. Se

a fixação for realizada por processos físicos como a criofixação, então é denominada

por fixação física.

Neste trabalho o grão-de-bico (Cicer arietinum) foi fixado por uma mistura

fixadora, a formalina aceto álcool (FAA), composta por 18 partes de etanol a 50%, por

ácido acético glacial e formol comercial. O grão-de-bico sofreu uma fixação química.

2.2.1.1. Lavagem do material após fixação

Este passo é realizado para remover o excesso de fixador que se mantém na célula

após a fixação.

São usadas, na generalidade, soluções tamponadas tendo um valor de pH próximo

da neutralidade, esta é uma condição importante porque vai simular as condições

naturais da célula, evitando assim mais alterações. O tampão fosfato é o mais usado

nestas situações.

2.2.2. Desidratação

A desidratação permite a remoção da água através de sucessivas imersões do

material em álcool etílico (etanol) ou acetona, efectuando-se séries crescentes. Realiza-

se de forma gradual para que as estruturas celulares não sofram modificações drásticas.

10 a 30 minutos em Etanol a 70%



45 min a 1 hora em Etanol a 95%, por 2 vezes

1 hora em Etanol puro, por 2 vezes

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Negro de Sudão B

2.2.3. Impregnação e Inclusão

Inclusão do material duro (parafina) que permite obter cortes finos em

microtomia.

2.2.3.1. Pré-impregnação

Este passo é realizado quando o meio de inclusão não é solúvel no agente

desidratante.

Neste trabalho esta situação ocorreu uma vez que o etanol e a parafina não são

solúveis um no outro. Para resolver o problema colocado teremos de encontrar uma

substância pré-impregnante que faça uma ligação entre os outros dois componentes

(etanol e parafina).

Sendo o meio de inclusão a parafina usaremos como agente pré-impregnante a

isoparafina H.

No nosso trabalho os passos realizados foram os seguintes:

O material foi colocado numa solução que continha 2/3 de etanol e 1/3 de

isoparafina H, manteve-se durante algumas horas nesta solução

Passou-se para outra solução com 50% de etanol e 50% de isoparafina H,

manteve-se durante algumas horas nesta solução

Colocou-se noutra solução com 1/3 de etanol e 2/3 de isoparafina H, manteve-se

durante algumas horas nesta solução

O material foi colocado, ainda, numa solução com isoparafina H pura durante

algumas horas

Adicionou-se pedaços de parafina ao agente pré-impregnante (isoparafina H) até

se atingir a saturação

2.2.3.2. Impregnação

Material é submetido a passagens sucessivas por parafina fundida

Coloca-se o material num molde de plástico, facilita a inclusão do material em

parafina, e o espaço restante é preenchido pela parafina fundida, esta acção é efectuada

sobre uma lâmina de vidro

Colocam-se os blocos de parafina realizados na estufa entre os 60 a 70ºC,

durante aproximadamente 48h

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Negro de Sudão B

2.2.4. Microtomia

A microtomia consiste na obtenção de cortes realizados em aparelhos especiais,

designados micrótomos.

Neste trabalho realizam os cortes num micrótomo do tipo Minot, que permite a

obtenção de cortes com uma espessura superior a 1 µm, os cortes finos, estes cortes são

denominados por ténia.

O micrótomo do tipo Minot consta de uma lâmina fixa diante da qual roda o disco

que contem o bloco com o material incluído. Os cortes são feitos através da

movimentação de uma manivela lateral que faz deslocar a “pirâmide” da amostra para a

lâmina segundo uma determinada espessura.

Para obtermos as ténias realizámos os seguintes passos:

Colocámos a “pirâmide” de parafina na estrutura de suporte e orientámo-la

numa posição o mais correcta possível, paralela à lâmina

Fizemos movimentar a manivela de uma forma constante e precisa de modo

a obter boas ténias de material

Foram colocadas na estufa

Depois de realizados os cortes, estes serão transferidos para lâminas de modo a

permitir uma posterior observação ao microscópio óptico. Seguimos os seguintes

passos:

Colocámos uma gota de albumina glicerinada no centro da lâmina. Com o dedo

espalhámos uniformemente pela lâmina até sentir o dedo “preso”.

Colocámos água destilada sobre a lâmina.

Com a ajuda de um bisturi cortámos a “ténia” obtida no micrótomo.

Com o auxílio de uma agulha transferimos os cortes para a lâmina com água. Os

cortes apresentam um lado brilhante e um lado baço. Na lâmina coloca-se a parte

brilhante voltada para baixo.

Colocámos as lâminas numa placa de aquecimento para ser retirado o excesso

de água destilada.

Retirámos o excesso de água com papel de filtro e reajustámos a posição dos

cortes com a ajuda de agulhas.

Colocámos a lâmina novamente na placa de aquecimento até que a água

desaparece-se e os cortes ficassem colados à lâmina.

Guardámos as lâminas na estufa a 25-30ºC.

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Negro de Sudão B

2.2.5. Coloração

Para se conseguir observar as diferentes estruturas que compõem os lípidos

teremos que corar as ténias efectuadas.

A coloração para microscopia óptica é feita com substâncias químicas designadas

corantes que podem ser naturais ou artificiais, básicos ou ácidos e ainda letais ou

“vitais”.

Um corante é composto por cromóforos e auxocrómos que lhes dão a

possibilidade de se ligar aos componentes celulares (auxocrómo) e de os corar

(cromóforo).

2.2.5.1. Hidratação do tecido

Para se puder proceder à coloração dos cortes, teremos que efectuar primeiro a

hidratação do tecido, seguindo estes passos:

Desaparafinação: fusão da parafina á chama

Lavagem com isoparafina H, com um conta-gotas

Mergulhar as lâminas numa tina com ranhuras com isoparafina H (15 minutos)

Passagens sucessivas por:

- Isoparafina H

- Isoparafina H + Etanol

- Etanol absoluto

- Etanol a 95%

- Etanol a 90%

- Etanol a 80%

- Etanol a 70%

Lavar em água corrente durante 15 minutos

2.2.5.2. Preparação do corante Negro Sudão B

Para se preparar o corante junta-se 0,25g de Negro Sudão B em 100 mL de etanol a 70%.

2.2.5.3. Coloração com Negro Sudão B

A coloração nos lípidos é realizada pelos lisocromos que se dissolvem facilmente

nas gorduras. Estes são corantes que não contêm o grupo auxocrómo, por isso a sua

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Negro de Sudão B

acção colorante baseia-se na acção do grupo cromóforo, o grupo azo( -N Ξ N-), não são

considerados “verdadeiros” corantes.

Procedeu-se então á coloração do tecido com Negro Sudão B:

Cobrir as lâminas com uma solução de Negro Sudão B durante 30

minutos

Escorrer e lavar em etanol a 70% durante 5 minutos

Lavar em água destilada

Mergulhar as lâminas em:

- Etanol a 70%

- Etanol a 80%

- Etanol a 90%

- Etanol absoluto

Secar na estufa a 30ºC e fazer a montagem em DPX

2.2.6. Finalização

Depois de coradas e montadas as amostras podem ser observadas ao microscópio

óptico, sendo depois tiradas as fotos para a realização do trabalho.

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Negro de Sudão B

3. RESULTADOS

Figura 5. Observação de células de sementes de Cicer arietinum coradas pelo

Negro Sudão B com ampliação 550x.

LEGENDA:

1 – Parede Celular

2 – Grão de amido

3 – Gotícula lipídica

4 – Citoplasma

5 – Espaço intercelular

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Negro de Sudão B

Figura 6. Observação de células de sementes de Cicer arietinum coradas pelo

Negro Sudão B com ampliação 144x.

LEGENDA:

1 – Parede Celular

2 – Cristais de impurezas

3 – Gotícula lipídica

4 – Citoplasma

5 – Espaço intercelular

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Negro de Sudão B

4. DISCUSSÃO E CONCLUSÃO

Muitas coisas não correram bem ao longo desta experiência. Por exemplo, as

ténias de material obtidas permaneceram tempo demais na estufa e a parafina acabou

por se derreter. Desta forma perdemos as ténias. Depois de solucionado este problema e

já com novas ténias procedemos à observação dos resultados, ou seja, fotografámos as

preparações. Mais uma vez algo correu mal e muitas das imagens captadas foram

perdidas. A certa altura tornou-se difícil perceber a que grupo pertencia cada fotografia.

Apesar de tudo, estes contratempos não foram impedimento para que a

experiência fosse levada até ao fim e com esforço e dedicação da nossa parte este

trabalho é agora um documento completo no que toca ao registo das técnicas levadas a

cabo, material utilizado e conclusões retiradas da observação do material em estudo.

No que toca a este último, temos a comentar que se tornou um pouco difícil

observar as gotas lipídicas nas amostras e fotografias tiradas apesar de tanto umas como

outras terem sido bem efectuadas e terem ficado bastante nítidas. Concordamos que o

baixo teor lipídico do Cicer arientinum não contribuiu em nada para a obtenção de

melhores resultados.

Ao longo da experiência e com o objectivo de melhorar a rapidez da experiência e

diminuir o risco para a saúde algumas alterações foram feitas, Por exemplo, substituiu-

se o Xilol, mais eficiente, pela Isoparafina H, menos tóxica e o Bálsamos de Canadá

pelo DPX. Este é um meio de montagem menos tóxico, mais transparente, menos

espesso, que seca em duas horas e pode ser removido.

Todas estas contrariedades dificultaram a experiência e o seu desenvolvimento

mas não foram impedimento suficiente para a sua conclusão. Assim, podemos afirmar

com toda a segurança que atingimos os objectivos a que nos propusemos, sendo o

principal a detecção de lípidos nas preparações de Cicer arientinum.

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Negro de Sudão B

5. BIBLIOGRAFIA

Bianchini, F; Carbetta, F. & Pistoia, M. 1974. Frutos de la tierra. Editorial Aedos,

Barcelon.

Campos, L. da S. 1982. Manual de Bioquímica. Publicações Europa-América, Portugal.

Dinis, M. D.; Tomé, M. C. & Gonçalves, M. T. (2006). Técnicas de preparação do

material para observação aos microscópios óptico e electrónico. Departamento de

Botânica, FCTUC, Coimbra.

Heywood, V. H. 1993. Flowering plants of the world. B. T. Batsford Ltd., London.

Huxley, A. 1992. Dictionary of Gardening (Vol. I). The MacMillan Press Limited,

London and Basingstoke.

Lehninger, A.L., Nelson, D. L. & Cox, M.M. (2000). Lehninger: Principles of

Biochemestry, 3rd Edition. Worth Publishers, New York.

1 http://www.dkimages.com/discover/previews/809/35012504.JPG

2 http://pt.wikipedia.org/wiki/Gr%C3%A3o-de-bico

3 http://www.nestle.pt/BemEstar/Presentation/Nutricao/Alimentos.aspx?id=140

4 http://www.conganat.org/9congreso/trabajo.asp?id_trabajo=768&tipo=3

20

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http://www.dkimages.com/discover/previews/809/35012504.JPG

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