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UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ

CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

CURSO DE FARMÁCIA

RAQUEL PEREIRA DALL’ IGNA

DESENVOLVIMENTO TECNOLÓGICO DE CREMES CONTENDO

IDEBENONA

Itajaí

2013

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RAQUEL PEREIRA DALL’ IGNA

DESENVOLVIMENTO TECNOLÓGICO DE CREMES CONTENDO

IDEBENONA

Monografia apresentada como requisito para obtenção do título de farmacêutico pela Universidade do Vale do Itajaí, Centro de Ciências da Saúde. Orientador: Prof. Dr. Daisy Janice Aguilar Netz Co-orientador: Prof. Dr. Tania Mari Bellé Bresolin

Itajaí, Junho de 2013

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A Deus por te me oferecido a oportunidade de viver, evoluir a cada dia e

conhecer pessoas que me apoiaram.

Dedico está monografia aos meus pais (Ana Lúcia C. P. Dall’Igna e Nilo José

Dall’Igna), a minha irmã (Aline Pereira Dall’Igna) que com o amor, carinho e com o

companheirismo sempre me apoiaram e nunca me deixaram desanimar. Suas

palavras nós momentos mais difíceis foram fundamentais para me dar motivação e

força para continuar.

Amo vocês!

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AGRADECIMENTOS

A vida em certos momentos me fez parar, e seguir por outros caminhos. No entanto,

a paixão por essa profissão foi algo que nunca morreu. Mesmo tendo descoberto outros

talentos e aptidões no decorrer da caminhada, ser Farmacêutica é um sonho muito

aguardado.

Em primeiro lugar agradeço a Deus, por nunca ter me abandonado em todos os

desertos que atravessei. Mesmo quando não somos fiéis, Ele permanece fiel. Aleluia!

Agradeço as professoras Daisy Janice Aguilar Netz e Tania Mari Bellé Bresolin, pela

orientação e pela paciência, carinho e pelas muitas explicações que me foram essenciais

para chegar ao fim deste trabalho.

Muito obrigado à todos que contribuíram, seja na parte experimental ou nas

correções. Em primeiro lugar aos professores Renê Artur Ferreira, Vania Foldin, Ruth M.

Lucinda e Ana Elisa de Oliveira e também os colegas Bruno Fonseca dos Santos, Natany

Buratto e em especial ao Fellippe R. Wolff, por ter realizado a parte da determinação do teor

de IDB por CLAE

Agradeço aos meus pais, por toda a paciência nos meus erros (que não foram

poucos) e acertos, por todo amor e por todas as orações em meu favor: Obrigado por terem

me dado “a sorte de um amor tranquilo”. Sua capacidade de amar tende ao infinito. Essa

vitória também é de vocês.

A minha irmã, por ter sido meu apoio constante. Pela torcida, por vibrar com as

minhas conquistas e também a todo o restante da família: os Pereira e os Dall’Igna, que

mesmo não estando próximos fisicamente torcem e vibram com cada conquista minha

Costumo dizer que quem tem amigos, nunca está só. Felizmente, estou longe de ser

uma pessoa sozinha. Não caberia nesse espaço, caso fosse citar um a um os nomes de

todo os que me ajudaram nesse percurso. Portanto meus amigos sintam-se agradecidos.

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De tudo ficarão três coisas: a certeza de que estamos começando, a certeza de que é preciso continuar e a certeza de que podemos ser interrompidos antes de terminar.

Fazer da interrupção um caminho novo. Fazer da queda um passo de dança. Do medo, uma escada. Do sonho, uma ponte. Da procura, um encontro.

Fernando Sabino

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DESENVOLVIMENTO TECNOLÓGICO DE CREMES CONTENDO IDEBENONA

Raquel Pereira DALL’IGNA

Orientadora: Prof. Dra. Daisy Janice Aguilar Netz

Co-orientadora: Prof. Dra. Tania Mari Bellé Bresolin

Defesa em: Junho de 2013

Resumo: A Idebenona (IDB) tem sido empregada no tratamento de patologias sistêmicas, especialmente pelo efeito neuroprotetor e em produtos cosméticos, devido ao grande poder antioxidante, despigmentante, atuando como ativo antissinais do envelhecimento cutâneo. Atualmente, a IDB é comercializada em formulações cosméticas, sendo frequentemente lipossomada e apresentando problemas relacionados à irritação da pele. Portanto, o presente trabalho visou o desenvolvimento de formulações semissólidas contendo IDB e QTS, um biopolímero biocompatível, incorporados nas emulsões, na forma de dispersão coloidal. As formulações foram produzidas pelo método da inversão de fases e as diretrizes preconizadas pela ANVISA, adaptadas, foram utilizadas para o estudo de estabilidade, sendo o teor de IDB determinado por CLAE. Assim, a estabilidade físico-química das formulações compostas por emulsões do tipo O/A contendo 0,5 % (p/p) de IDB, incorporada na fase oleosa (IDB-FO), na forma convencional ou na fase aquosa acidificada com ácido acético com QTS formando uma dispersão coloidal (IDB-QTS) ou sem QTS (IDB-ACT) foi estudada em teste preliminar (de centrifugação e ciclos de congelamento e descongelamento durante 14 dias), estudo acelerado (90 dias em temperatura de geladeira e estufa a 40°C) e de tempo real (90 dias em temperatura ambiente). De um modo geral, as formulações apresentaram-se estáveis quanto ao aspecto organoléptico, após os testes preliminares. No teste acelerado as formulações apresentaram estabilidade quanto ao aspecto organoléptico e quanto ao pH, mostrando discreto aumento de viscosidade ao final do estudo, sendo a formulação que contem IDB-QTS considerada a mais estável e a IDB-FO, a menor estável neste aspecto, pois houve diminuição da viscosidade. Todas apresentaram comportamento tixotrópico, sendo que a IDB-QTS apresentou maior aumento na tixotropia após 90 dias, indicando a formação de uma rede estruturada na emulsão. O teor dos cremes foi mensurado em 109,4%. Conclui-se que as formulações desenvolvidas apresentaram-se adequadas para posterior caracterização do sistema coloidal formado entre o fármaco e a QTS, e para avaliação biológica do efeito deste sistema. Palavras-chave: Emulsões. Idebenona. Quitosana.

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LISTA DE FIGURAS

Figura 1 Estrutura e peso molecular da idebenona (A) e da Coenzima Q10 (B). 29 Figura 2 Estrutura química da quitosana......................................................... 33 Figura 3 Fotografias da microscopia óptica das amostras de emulsões (ocular

400 X): A – Base, B – IDB-ACT, C – IDB FO, D – IDB – QTS.......

42 Figura 4 Aspecto das formulações contendo 0,5% de IDB após os ciclos de

congelamento e descongelamento....................................................

43 Figura 5 Amostras submetidas ao estudo de estabilidade antes e após 90

dias em cada ambiente: G (geladeira), E (estufa), A (ambiente). Figura representativa..........................................................................

45 Figura 6 Perfil de escoamento das amostras A (creme base), B (IDB-FO), C

(IDB-ACT.), D (IDB-QTS durante o estudo de estabilidade de curto prazo. Temperatura ambiente...........................................................

50 Figura 7 Cromatograma da amostra IDB QTS mostrando o pico de IDB (11

min.)..................................................................................................

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LISTA DE TABELAS

Tabela 1 Características organolépticas das formulações contendo 0,5% de IDB, após os ciclos de congelamento e descongelamento..................

43

Tabela 2 Características organolépticas das amostras após o final da estabilidade preliminar e acelerada(90 dias)........................................

45 Tabela 3 Valores de pH durante o estudo de estabilidade acelerada das

formulações. Resultados foram expressos pela média das leituras (n=3) de cada lote (n=3)......................................................................

46 Tabela 4 Valores da viscosidade aparente das formulações no tempo inicial e

final do estudo de estabilidade acelerada..........................................

48 Tabela 5 Parâmetros reológicos avaliados no tempo zero e após 90 dias.

Temperatura ambiente.......................................................................

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LISTA DE QUADROS

Quadro 1 Composição descritiva das formulações contendo 0,5% de IDB na fase oleosa (IDB-FO), contendo 0,5% de IDB incorporada na fase aquosa acidificada (IDB-ACT, e contendo 0,5% de IDB com QTS na mesma formulação)...........................................................................

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LISTA DE ABREVIATURAS

ACT - Ácido Acético

GD - Grau de desacetilação

IDB-ACT- Idebenona com Ac. acético

IDB - Idebenona

IDB-QTS- Idebenona com quitosana

IDB FO - Idebenona fases oleosa

MTT- Brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazol

MW - Massa molecular

QTS - Quitosana

TPP - Tripolifosfato de sódio

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SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ...................................................................................................... 23

2 OBJETIVOS .......................................................................................................... 25

2.1 Objetivo Geral ................................................................................................... 25

2.2 Objetivos Específicos ...................................................................................... 25

3 REVISÃO DA LITERATURA ................................................................................ 27

3.1 Idebenona ......................................................................................................... 27

3.2 Quitosana .......................................................................................................... 31

4 MATERIAL E MÉTODOS ..................................................................................... 35

4.1 Material .............................................................................................................. 35

4.1.1 Reagentes ...................................................................................................... 35

4.1.2 Equipamentos ................................................................................................ 35

4.2 Métodos ............................................................................................................. 36

4.2.1 Preparo da formulação ................................................................................. 36

4.2.2 Avaliação morfológica por microscopia óptica .......................................... 38

4.3 Testes de estabilidade preliminar e acelerada .............................................. 38

4.4. Determinação do teor de IDB nas formulações semissólidas por CLAE....39

5 RESULTADOS E DISCUSSÃO ................................................................... 41

5.1. Avaliação do aspecto das formulações......................................................................41

5.2. Estudo de Estabilidade Preliminar..................................................................43

5.3. Estudo de estabilidade acelerada...............................................................................44

5.4 Determinação do teor de IDB nas formulações semissólidas por CLAE.....51

6 CONCLUSÕES ................................................................................................ 53

REFERÊNCIAS ..................................................................................................... 55

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1 INTRODUÇÃO

A IDB é uma benzoquinona sintética (C19H30O5), introduzida no mercado pela

Takeda Chemicals Industries, em 1986 (WEMPE et al., 2009). Apresenta cor

alaranjada, praticamente insolúvel em água (BUDAVARI, 1996; MARTIN et al.,

2007) e com ponto de fusão de 46 °C (BUDAVARI, 1996; VENKAT et al., 2006). É

um análogo da CoQ10 cuja modificação molecular tornou-a, com relação ao

potencial redox, 100 vezes mais efetiva do que esta (WIELAND et al., 2000).

Embora considerada não tóxica em humanos (BARKWORTH et al., 1984 apud

WIELAND et al., 2000) e nem mutagênica em modelo animal (GEROMEL et al.,

2002), apresenta irritação quando em contato com a pele e olhos. De acordo com

um estudo de permeação em orelha de porco e em melanócitos de rato, o metabólito

acídico da IDB é o responsável pela toxicidade in vitro e pela irritação na pele

(WEMPE et al., 2009).

Graças a seu poder antioxidante (PIGNATELLO; ITRAVAIA; PUGLISSI,

2006), a IDB tem sido empregada e proposta para o tratamento de patologias

sistêmicas, especialmente as neurodegenerativas, como a Ataxia de Friedreich (Di

PROSPERO et al., 2007; FILLA; RINALDI, 2010) e em aplicações tópicas, como

inibidor da melanogênese. Em estudo realizado por Martin et al. (2007), utilizando

células derivadas de melanoma humano com capacidade de síntese de melanina, a

IDB inibiu a síntese de melanina de forma dose-dependente.

Devido sua importante atividade biológica, tem sido empregado em produtos

cosméticos, pois é capaz de proporcionar proteção oxidativa superior a ativos

clássicos como o ácido alfa tocoferol, N6-furfuryladenine ubiquinona, ácido-

ascórbico, ácido lipóico (índices de 95% para a IDB e 80%, 68%, 55%, 52% e 41%

para os outros, respectivamente), apresentando excelentes resultados em estudos

clínicos (com 0,5 e 1,0% de IDB) no tratamento de sinais do fotoenvelhecimento

cutâneo, com redução significativa de linhas de expressão (27 a 29%), aumento da

hidratação (37%), diminuição de Interleucina IL-1b, Il-6 e metaloproteinase MMP-1,

além de aumento de colágeno I (Mc DANIEL et al., 2005a,b).

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Atualmente a IDB é comercializada na forma de lipossomas e algumas

indústrias cosméticas relatam utilizar este fármaco nanoencapsulado, segundo

informações dos rótulos. É o caso do produto Prevage®, da marca Elisabeth Arden,

que contém 0,5% de idebenona lipossomada. Quando incorporada em lipossomas

peguilados, em estudo de Paolino et al. (2009), em comparação com o fármaco livre,

foi capaz de diminuir, em culturas de astrócitos, o efeito tóxico em até 10 vezes,

tendo, entretanto, sua disponibilidade biológica diminuída.

A quitosana (QTS), obtida a partir da desacetilação alcalina da quitina, é um

polímero de baixo custo, baixa toxicidade, biodegradável e não alergênico

(ALENCASTRE et al., 2006). Amorin et al. (2009) demonstraram a eficiência de

nanopartículas de QTS reticuladas com TPP, na incorporação de IDB, por spray

dryer, as quais foram capazes de aumentar a estabilidade da IDB (em estudo de 45

dias, houve perda de 6% na forma de nanopartícula e 60% na forma livre),

preservando a sua atividade antioxidante (decréscimo de 3% contra cerca de 40%

para o fármaco livre) e diminuindo o potencial irritante do fármaco na pele (estudo in

vitro em células L929). Além disso, a coloração alaranjada intensa do fármaco foi

minimizada após a incorporação nas nanopartículas, favorecendo o emprego em

formulações tópicas. Porém em estudos prévios, a incorporação deste sistema em

formulações semissólidas com teor final de 0,5% de IDB mostrou-se inviável devido

à elevada carga de polímero a ser incorporada e as características necessárias de

fluidez das formulações finais (BURATTO et al., 2010).

Portanto, o presente trabalho visou o desenvolvimento de uma emulsão de

uso tópico contendo 0,5% de IDB incorporada na formulação após a formação de

uma dispersão coloidal com a QTS em meio aquoso acidificado com ácido acético e

reticulação com TPP. Foram desenvolvidos estudos de caracterização da emulsão

resultante por microscopia óptica além de outras características físicas e físico-

químicas e teor de IDB incorporado, por CLAE, cuja metodologia foi adaptada de

Amorin et al. (2009) com sucesso, permitindo a quantificação do fármaco nos

cremes. A formulação foi submetida à estudo de estabilidade preliminar, acelerado e

em tempo real durante 90 dias.

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2 OBJETIVOS

2.1 Objetivo Geral

Desenvolver e avaliar a estabilidade físico-química de cremes contendo

idebenona.

2.2 Objetivos Específicos

- Realizar estudos de pré - formulação de cremes contendo IDB e IDB – QTS;

- Analisar a estabilidade física e físico-química das formulações semissólidas em

estudo de estabilidade acelerado e em tempo real;

- Determinar o teor de IDB nas formulações semissólidas por CLAE.

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3 REVISÃO DA LITERATURA

3.1 Idebenona

A idebenona é um composto sintético, com estrutura análoga à da coenzima

Q10 (CoQ10) (GEROMEL et al., 2010), a qual tem sido empregada em medicamentos

e cosméticos devido ao seu potencial antioxidante, ou seja, em função de atuar na

supressão da atividade dos radicais livre, os quais são compostos altamente

reativos, predominantemente oxigenados, gerados nos tecidos do organismo

humano, a partir do metabolismo e de agentes externos. Esses compostos, quando

não são mantidos sob controle, contribuem para a degradação da matriz

extracelular, oxidação de lipídeos, hidroxilação de polissacarídeos e desnaturação

de proteínas, causando inflamações, injúrias, envelhecimento dos tecidos e por

conseguinte, muitas patologias, como as doenças cardiovasculares e em muitos

tipos de câncer (BARBER; HARRIS, 1994).

O impacto do estresse oxidativo sobre a pele, especialmente o gerado pela

radiação ultravioleta, poluentes ambientais e ozônio é muito importante. O ozônio

reage principalmente com lipídios e proteínas das camadas mais superficiais.

Embora a radiação ultravioleta (UVA e UVB) consiga penetrar mais profundamente a

pele e iniciar o estresse foto-oxidativo, os lipídios e proteínas superficiais ficam

expostos a doses mais altas, com maior dano. Dentre os lipídios, o esqualeno é um

dos alvos principais, sendo degradado a hidroperóxido de esqualeno. Embora seja

gerado este metabólito reativo, considera-se o esqualeno como a primeira barreira

antioxidante da pele (THIELE et al., 2007).

Entretanto, é importante salientar que algumas espécies radicalares

são importantes para as imunidades natural e adquirida, uma vez que são agentes

oxidantes potentes, como o óxido nítrico, isolado ou associado ao radical superóxido

(peroxinitrito) e o ácido hipocloroso, os quais possuem importante ação bactericida

(RATNAM et al. 2006).

Para retardar ou prevenir os efeitos do estresse oxidativo, o organismo atua

através de mecanismos de defesa antioxidante, que são classificados em

enzimáticos e não-enzimáticos. O primeiro constitui a barreira de defesa endógena a

agir contra os ataques das espécies reativas de oxigênio e do nitrogênio, evitando o

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acúmulo de ânion radical superóxido e do peróxido de hidrogênio, sendo este

sistema constituído por diversas enzimas, destacando-se a superóxido dismutase, a

catalase e a glutationa peroxidase (RATNAM et al., 2006).

O sistema não - enzimático é acionado principalmente através de compostos

que agem na detoxificação das espécies reativas, doando seus elétrons para as

moléculas de radicalares, interrompendo sua reatividade. As frutas e vegetais são as

principais fontes destes compostos, dentre as moléculas de compostos antioxidantes

destacam-se as Vitaminas E e C. A vitamina E é um antioxidante lipídico,

encontrada nas membranas das lipoproteínas e em tecidos como fígado, rins e

tecido adiposo adrenal. E capaz de estabilizar camadas lipídicas da epiderme e de

inibir a peroxidação lipídica em animais. Já a vitamina C ou ácido ascórbico é uma

vitamina hidrofílica, essencial na síntese de colágeno, que atua como um

antioxidante in vivo e age contra danos causados pela exposição solar. Os

carotenóides compreendem uma família de compostos naturais, são pigmentos

encontrados em alimentos de origem vegetal, com as colorações amarela,

alaranjada e vermelha. Os principais carotenóides presentes nos alimentos são o

betacaroteno, licopeno, glutationa, quercetina e luteína, estes desativam radicais

livres e interagem com espécies reativas inibindo os processos oxidativos

(VANNUCCHI et al., 1998; GUARATINI; MEDEIROS; COLEPICOLO, 2007;

MATSUMOTO, 2008).

A idebenona (Fig. 1A) é um composto sintético pertencente à classe das

quinonas. Esta classe inclui um grande número de substâncias de ocorrência

natural, encontradas nos fungos, plantas, animais e bactérias, sendo de maior

destaque a ubiquinona ou coenzima CoQ10 (Fig. 1B). De um modo geral,

apresentam as seguintes propriedades: sofrem oxidação, são eletrófilas e coloridas,

devido à absorção de radiação ultravioleta e visível. A CoQ10 atua na produção de

energia, dentro da mitocôndria e como antioxidante. Entretanto, o tratamento com

esta quinona apresenta uma limitação clínica: a cadeia alquílica lipofílica limita sua

absorção. Por esta razão, análogos foram sintetizados, os quais apresentam maior

capacidade de absorção e efeitos benéficos. É o caso da idebenona (2 - (10-

hidroxidecil) -5,6-dimetoxi-3-metil-ciclohexa-2,5-dieno-1,4-diona), a qual possui

menor lipofilicidade, em função de apresentar na cauda alquílica com ao invés de 10

repetições de isoprenóides, uma cadeia alquílica com 10 carbonos com um grupo

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hidroxila no final. Foi sintetizada pela empresa Takeda Pharmaceutical Company,

especialmente para o tratamento da doença de Alzheimer e para promover aumento

da memória e das funções cognitivas (OKAMOTO et al., 1988).

Figura 1 – Estrutura e peso molecular da idebenona (A) e da Coenzima Q10 (B).

A B

MW=338,45 MW=863,36

: Mc Daniel (2005a)

A IDB, em estudo em ratos, após a administração oral, atravessou a barreira

hemato-encefálica, sendo distribuída rapidamente com um pico em torno de 15

minutos após, com concentração correspondente a 0,5% da dose. Os principais

metabólitos, denominados de QS-4, QS-6 e QS-10. Em humanos, a administração

de 30-50 mg evoca níveis plasmáticos de 300-400 mg/L após 1 a 2 horas (NAGAI et

al., 1985).

Haefeli (2012) estudou o mecanismo de ação da IDB, tendo relatado que a

mesma atua por vários aspectos moleculares importantes: interações, a nível de

mitocôndria, com a cadeia de transporte de elétrons, interagindo, de modo complexo

com enzimas desta cadeia (piruvato, succinato), aumentando ou inibindo complexos

que mediam a respiração celular, modificando o metabolismo de ácido araquidônico,

bloqueando canais de Ca2+ e estimulando a produção de NGF (fator de crescimento

neural), uma pequena proteína que é importante para o crescimento, manutenção e

sobrevivência de determinadas células nervosas.

O efeito antioxidante foi descrito por Zhai et al (2008), que ao estimar esta

atividade encontrou para a IDB a 3% mostrou resultados de atividade muito

superiores à da vitamina E (30 mM de IDB foram tão eficazes quanto 213 mM de vit.

E). Abdel Baky et al (2010) relataram uma diminuição na lipoperoxidação em função

do aumento dos níveis das enzimas antioxidantes glutationa, superóxido dismutase

e de catalase, atuando de modo competitivo com a CoQ10 e também na oxidação de

NADH.

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Embora sendo considerada, de acordo com o fabricante atual

(TAKEDA/SANTHERA) e em ensaios clínicos um fármaco seguro (BODMER et al.,

2009), não tóxico para humanos (BARKWORTH et al., 1984 apud WIELAND et al.,

2000), nem mutagênico em modelo animal (GEROMEL et al., 2002), trabalhos

recentes expressam a preocupação em relação à sua toxicidade (LUSTYIK;

O´LEARY, 1990; WEMPE et al., 2009). De acordo com Haefeli (2012), os primeiros

utilizaram concentrações muito altas, não alcançadas in vivo (superiores a 75 mM) e

o segundo, o qual utilizou no ensaio de viabilidade células MTT, as quais interferem

diretamente com a IDB.

A despeito da controvérsia quando da toxicidade em uso oral, é comprovado

que a IDB proporciona irritação quando em contato com pele e olhos. Wempe et al.

(2009), realizaram estudo de permeação da IDB e de um éster (IDB linoleato) em

modelo animal, em orelha de porco e a citotoxicidade em células de melanoma de

ratos (B16:F10), em ensaio MTT, relacionando, no modelo in vitro, o efeito irritante

ao metabólito acídico da IDB. A IDB foi permeada, em torno de 4 horas, através da

pele de orelha de porco e foi, na sua maior parte, metabolizada, resultando um

metabólico acídico, considerado o causador do efeito irritante. O derivado foi

metabolizado somente numa pequena fração, sem entretanto causar efeito irritante.

É importante salientar que o efeito irritante da IDB, na pele, em formulações

cosméticas lipossomadas, foi demonstrado em vários relatos de caso, mesmo

quando lipossomada (FLEMING; WHITE; WHITE, 2008; Mc ALEER; COLLINS,

2008). Assim, verificou-se que mesmo lipossomada permenece o desafio na busca

da diminuição do potencial irritante dérmico, fato que muitas vezes induz a

descontinuidade do emprego da IDB tópica.

O emprego tópico da IDB é proposto em função de sua atividade antioxidante,

o que a torna capaz de atuar no combate aos radicais livres e aos sinais do

fotoenvelhecimento, uma vez que também apresenta a capacidade de inibição da

tirosinase, minimizando a presença, na pele, de manchas actínicas. Tais aspectos

biológicos foram avaliados por Mc Daniels et al. (2005 a,b), que compararam, em

modelo in vitro, a ação antioxidante da IDB com antioxidantes clássicos, lipofílicos e

hidrofílicos (Vit. E, Kinetin, ubiquinona, ácido-ascórbico e ácido lipóico), tendo sido

evidenciada a superioridade da IDB. Foi verificada capacidade de atuar na inibição

da ação inflamatória, pela diminuição de Interleucina IL-1b, Il-6 , no aumento da

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capacidade antioxidantes (inibição da metaloproteinase MMP-1). Também em

ensaios clínicos a IDB apresentou excelentes resultados, uma vez que quando

administrada nas concentrações de 0,5%-1,0% foi capaz de atuar promovendo

significativa reversão de linhas de expressão (em torno de 28%), aumento da

hidratação (37%) e no aumento do colágeno tipo I. Em estudo realizado por Martin

et al. (2007) utilizando células derivadas de melanoma humano com capacidade de

síntese de melanina, a IDB inibiu. Assim, em função da grande capacidade

antioxidante e dos importantes resultados clínicos na pele, é reconhecida a

importância da aplicação tópica da IDB na prevenção e na reversão dos sinais do

fotoenvelhecimento. Entretanto, como anteriormente descrito, o uso contínuo é

desfavorecido em função do potencial irritante da mesma. Visando minimizar este

aspecto, Amorim e colaboradores (2010) avaliaram a eficiência de nanopartículas de

QTS reticuladas com tripolifosfato de sódio (TPP), na incorporação de IDB, com

secagem por spray dryer, o que proporcionou o incremento da estabilidade na

magnitude de 10 vezes superior a do fármaco livre, preservando a sua atividade

antioxidante in vitro e diminuindo o potencial irritante do fármaco em modelo in vitro

(Agarose overlay). A IDB, classificada como apresentando “reatividade severa”, após

a incorporação nas nano partículas apresentou drástica redução em sua reatividade

frente às células L929. Estes resultados revelam o potencial do nanosistema

formado com a QTS como carreador da IDB em formulações de uso tópico ou nasal,

sendo essa última via de interesse, uma vez que evitaria o significativo metabolismo

de primeira passagem sofrido pelo fármaco quando administrado por via oral.

3.2 Quitosana

Em termos de materiais poliméricos naturais, como os polissacarídeos, o

Brasil é um país privilegiado por apresentar fontes renováveis desses recursos e

com potencial para desenvolver novos produtos de interesse na área farmacêutica e

cosmética. Polissacarídeos podem ser processados para a formação de sistemas

micro e nanoparticulados, utilizadas na vetorização de fármacos e possuem

vantagens sobre os polímeros sintéticos por serem biodegradáveis, biocompativeis,

além de poderem possuir receptores específicos em certas células (LEMARCHAND

et al., 2004; AJUN et al.; 2009).

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A quitosana (QTS), que é um polissacarídeo derivado da quitina, isolado pela

primeira vez em 1859, teve aplicação inicial, nos países orientais, para o tratamento

de queimaduras e na cicatrização de feridas. Estudos mostram sua

biocompatibidade, uma vez que não manifestou reações alérgicas quando utilizado

na forma de implantes, topicamente ou mesmo em uso oral (COSTA SILVA; Dos

SANTOS; FERREIRA, 2006).

A QTS possui semelhança estrutural com a celulose, porém com a presença

de grupamentos amínicos livres, compostos pelas unidades monoméricas de β-

(1→4)- 2-amino-2-desoxi-D-glicose e β-(1→4)-2-acetamida-2-desoxi-D-glicose. Este

polímero natural possui uma estrutura cristalina altamente organizada, sendo

insolúvel em meio aquoso e na maioria dos solventes orgânicos, tendo baixa

reatividade química. Entretanto, pode ser facilmente solubilizado em soluções de

ácidos fracos diluídos, devido à protonação de seus grupamentos amino, sendo o

ácido acético o solvente mais empregado. Agentes reticulantes, como glutaraldeído,

etilenoglicol diglicil éter, ácido sulfúrico e TPP são utilizados para aumentar sua

estabilidade química e para promover resistência mecânica (LARANJEIRA; de

FÁVARE (2009).

A QTS ocorre em baixíssima escala em alguns fungos pertencentes aos

gêneros Mucor e Zygomicetes (LOPES, 2007) ou pode ser obtida através da

desacetilação alcalina da quitina proveniente da casca de crustáceos

(THARANATHAN; KITTUR, 2003).

A massa molecular média da QTS comercial está situada na faixa de 1,0 x 10

a 1,2 x 106 Da, dependendo do grau de desacetilação, da presença de impurezas e

do método de preparação (LARANJEIRA; de FÁVARE (2009). A Figura 2 ilustra a

estrutura química da QTS.

A QTS possui várias características que a tornam atraente para a utilização

em cosméticos. Pertencente à classe dos biopolímeros chamados de hidrocolóides,

a QTS se destaca por apresentar carga global positiva em pH biológico, ou seja,

apresenta se como um polímero policatiônico, enquanto a maioria dos hidrocolóides

apresentam-se negativamente carregados nas mesmas condições (POLYMAR et al,.

2008). Este aspecto de carga é capaz de proporcionar maior adesão da formulação

na pele, uma vez que a carga global desta tende a se apresentar ligeiramente

aniônica, caráter acentuado em cabelos danificados (NAKANO, 2006).

33

Figura 2 – Estrutura química da quitosana

Fonte: Laranjeira; de Fávare (2009)

Devido as suas propriedades, a adição da QTS em formulações

dermocosméticas pode aumentar a compatibilidade da formulação com a pele,

promover espessamento de fase aquosa ou estabilização da emulsão

(RODRÍGUEZ; ALBERTENGO; AGULLÓ, 2002)

Em protetores solares, a QTS reduz a perda dos filtros UV decorrente da ação

da água ou suor. Essa propriedade melhora a tolerância da pele ao protetor e

protege contra o ressecamento da mesma. A QTS forma um filme sobre a pele que

reduz a quantidade de luz ultravioleta absorvida pela pele, aumentando o fator de

proteção solar. Em batons, a QTS (utilizada nas concentrações de 0,05% a 1%)

aumenta a resistência dos filtros UV e de substancias lipofílicas ativas, protegendo a

pele contra o ressecamento (POLYMAR, 2013)

A QTS pode ser quimicamente modificada sendo por isso uma das vantagens

mais interessantes a sua grande versatilidade, podendo ser empregada em

diferentes formas cosméticas, tais como pós, beads, nanopartículas, géis, crenes-

géis, emulsões e soluções (ANCHISI; MELONI; MACCIONI, 2006; LARANJEIRA; De

FÁVARE, 2009). Finalizando, a QTS é uma substância considerada segura para o

organismo humano; consequentemente, adequada para o emprego em aplicações

médicas, farmacêuticas e cosméticas (KUMAR et al., 2006; RINAUDO, 2006).

34

35

4 MATERIAL E MÉTODOS

4.1 Material

4.1.1. Reagentes -Ácido acético PA, Biotec

-Ácido etilenodiaminatetracético (EDTA), Próton Química

-Água destilada e água ultrapura grau I Milli Q

Álcool cetílico, All chemistry

-Álcool cetoestearilico, Henrifarma

-Butilhidroxitolueno (BHT), All Chemistry

-Dipropilenoglicol, Alpha Química

-Emulium Delta, Gateffossé

-Glicerina, ALL Chemistry

-Idebenona, Attivos Magistrais

-Metanol Grau HPLC, J.T Backer

-Metilparabeno, Vetec

-Monoestearato de Glicerila, All Chemistry

-Oleato de decila, Quimper

-Óleo de silicone, All Chemistry

-PEG 1000, Pharma Special

-Phenonip, Pharma Special

-Quitosana, Purifarma, previamente purificada e caracterizada de acordo com

Fonseca-Santos (2010).

-Triglicerídeos dos ácidos cáprico/caprílico, All Chemistry

-Tripolifosfato de sódio, PA, Sigma

-Tween® 80, Henrifarma

4.1.2. Equipamentos

-Agitador mecânico - Fisatom, 713D

-Agitador Ultraturrax – Quimis

-Centrífuga - Fanem, 206 R

36

-Cromatógrafo (Shimadzu®, SPD-10AVP, equipado com detector tipo diode array

SPD M 10A VP, software Class VP (versão 5.032), sistema de bomba (LC 10AD

VP), sistema controlador (SCL 10AVP), sistema de válvulas (SCV 10AC-VP) e

sistema de injeção manual (looping de 20 µL));

-Estufa – Fanem, 502 C

-Geladeira – Bosch

-Microscópio óptico – Olympus, BX 50

-pHmetro digital –Digimed, D20

-Viscosímetro Rotacional – HAAKE, VT 550-Sensor PK 1 1o

4.2 Métodos

4.2.1. Preparo da Formulação

Anteriormente ao preparo das emulsões, foi realizada a solubilização da QTS

em meio ácido. Para isso foram pesados 1,0 g de QTS previamente purificada e

caracterizada (FONSECA-SANTOS, 2010) e solubilizada em 90 mL de solução de

ácido acético 0,05 M (v/v), pH 4,0. Esta mistura foi mantida sob agitação constante

(400 rpm) por aproximadamente 24 horas em agitador mecânico. Após este período,

submeteu-se à agitação em ultraturrax por 1 min (6000 rpm). Foram adicionados 675

mg de IDB, previamente solubilizada em álcool etílico (2,0 mL) e 3-4 gotas de

Tween 80, para obter-se 0,5% de IDB na emulsão. Esta mistura foi novamente

submetida ao ultraturrax por 1 min a 6000 rpm. Após, a suspensão coloidal obtida foi

mantida sob agitação mecânica (aprox. 350-400 rpm) por um período de 4 horas.

Após, foram adicionados, gota a gota, 1,5 mL do agente reticulante, TPP a 2% (m/v),

sendo esta mantida em agitação (400 rpm) até o momento da incorporação na

emulsão.

Foram elaboradas 3 diferentes variações de formulações, conforme mostre o

quadro 1: a primeira contendo IDB a 0,5% incorporada na fase aquosa ácida

(composta pela dispersão de QTS em ácido acético 0,05 M) a qual foi denominada

de IDB-QTS, a segunda, contendo IDB incorporada na fase oleosa (IDB-FO) e a

terceira, adicionando a IDB na fase oleosa mas usando como veículo de fase

aquosa a solução de ácido acético 0,05 M (denominada de IDB-ACT) e o controle

37

negativo, denominada de Base. Em todas as formulações o pH foi corrigido, se

necessário, para estar entre 4,5 a 5,0.

O método de preparo das emulsões foi o da inversão de fases, com o

aquecimento das fases aquosa e oleosa na faixa de 75-80°C, até ser atingida a

temperatura, sendo vertida a fase aquosa sobre a oleosa, mantendo-se a agitação

em banho maria por aproximadamente 1 minuto e após, em agitador mecânico, a

1000 rpm por 10 min, sendo seguida por agitação manual suave por mais 5 minutos.

Este procedimento foi seguido em função da orientação do fabricante da base

Emulium Delta®. A composição total da base está informado no Quadro 1.

Quadro 1 – Composição descritiva das formulações contendo 0,5% de IDB na fase oleosa (IDB-FO), contendo 0,5% de IDB incorporada na fase aquosa acidificada (IDB-ACT), e contendo 0,5% de IDB com QTS na mesma formulação (IDB-QTS).

Formulações/Ingredientes (%)

Componentes Base IDB-FO IDB-ACT IDB-QTS Função

Idebenona - 0,5 0,5 0,5 Ativo

Emulium Delta 5,0 5,0 5,0 5,0 Emulsionante

Monoestearato de

Glicerila

4,0 4,0 4,0 4,0 Emulsionante

Alcool cetílico 1,0 1,0 1,0 1,0 Espessante

Alcool cetoestearílico 2,0 2,0 2,0 2,0 Espessante

Phenonip 0,5 0,5 0,5 0,5 Conservante

TG ác.cáprico/caprílico 3,0 3,0 3,0 3,0 Emoliente

Oleo de silicone 1,0 1,0 1,0 1,0 Emoliente

Oleato de decila 1,0 1,0 1,0 1,0 Emoliente

BHT 0,1 0,1 0,1 0,1 Antioxidante

Dipropilenoglicol 2,0 2,0 2,0 2,0 Umectante

EDTA 0,1 0,1 0,1 0,1 Quelante

Metilparabeno 0,1 0,1 0,1 0,1 Conservante

Glicerina 6,0 6,0 6,0 6,0 Umectante

Tween 80 0,5 0,5 0,5 0,5 Tensoativo

PEG 1000 0,5 0,5 0,5 0,5 Umectante

Quitosana - - - 0,74 Espessante

TPP 0,022

Água Destilada qsp 45 g qsp 45 g qsp 45g qsp 45 g Veículo

38

4.2.2. Avaliação morfológica das emulsões por Microscopia Óptica

A análise microscópica das emulsões desenvolvidas foi procedida da seguinte

forma: foram pesados aproximadamente 150 mg de formulação e diluída em 5 mL

de água destilada com agitação suave até se obter uma mistura homogênea. Desta

mistura foi utilizada 1 gota, a qual foi cuidadosamente colocada sobre a lâmina, e

sobre esta foi depositada a lamínula. A observação do aspecto das emulsões foi

realizada em microscópio óptico com aumento de 400 X. Com o auxílio de uma

câmara fotográfica foi capturada a imagem visualizada no microscópio.

4.3 Teste de estabilidade preliminar e acelerada

Estes testes, preconizados pela ANVISA (BRASIL, 2004) foram realizados

utilizando-se os seguintes ensaios:

4.3.1 Teste de Centrifugação

Previamente aos estudos de estabilidade, as amostras foram submetidas a

centrifugação e para isso foram pesados aproximadamente 2,0 g de cada amostra e

colocadas em um frasco cônico Eppendorf, o qual foi submetido à centrifugação por

15 minutos a 3500 rpm, à temperatura ambiente (BRASIL, 2004). Após o teste, foi

observado o aspecto das formulações, com relação a possível cremeação ou

separação de fases.

4.3.2 Determinação do valor do pH

Foi determinado em potenciômetro inserindo o eletrodo diretamente na

diluição aquosa 1:10. Para homogeneização da amostra foi utilizado vórtex durante

1 minuto.

4.3.3 Ciclo de congelamento e descongelamento

O ciclo de congelamento e descongelamento foi realizado acondicionando as

amostras em frascos polietileno, de fundo duplo, as quais foram submetidas a 6

ciclos de congelamento e descongelamento, durante 12 dias, nas temperaturas de -

5 °C ± 2 °C e 40 °C ± 2 °C, alternadamente, perfazendo no total 6 ciclos (BRASIL,

2004).

39

4.3.4 Estabilidade acelerada

Amostras de 15 gramas das emulsões consideradas estáveis após o estudo

preliminar de estabilidade foram submetidas a diferentes condições de temperatura:

ambiente (não controlada) ao abrigo da luz (tempo real), estufa (40 ºC± 2,0 ºC) e

geladeira (5 ºC ± 2,0 ºC) (estudo acelerado). As amostras foram analisadas, nos

tempos 0, 8, 15, 30, 60 e 90 dias, quanto aos seguintes parâmetros: caracteres

organolépticos (cor, odor, textura, brilho, homogeneidade, presença de separação

de fases/precipitações), pH e comportamento reológico, itens preconizados no Guia

para Estudos de Estabilidade de Produtos Cosméticos, da ANVISA (BRASIL, 2004).

As análises foram realizadas em triplicata.

4.3.5 Análise reológica

A viscosidade, o índice de comportamento de fluxo e a tixotropia foram

determinados em viscosímetro modelo rotacional acoplado ao termo controlador em

uma temperatura de 25 ºC, empregando sensor cone/placa (PK 1 1), taxa de

cisalhamento entre 0,1300 e 80,00 1/s, rampa de velocidade placa de paralelo

controlada coletando 100 pontos em cada etapa, por um período de 300 s cada. A

análise do índice de fluxo foi estabelecida utilizando-se todos os pontos do

reograma, baseando-se na equação da Lei da Potência, o ponto de ruptura na

equação de Bingham, utilizando-se na curva ascendente valores entre 0,01 e 0,5.

Os dados foram obtidos com o Software RheowinJob® e analisados com o Rheowin

Data®.

4.4 Determinação do teor de IDB nas formulações semissólidas por CLAE

O doseamento por CLAE foi realizado pelo acadêmico Fellippe Wolff em

cromatógrafo (Shimadzu) empregando coluna Phenomenex® 250 mm x 4,6 cm,

empacotada com octadecilsilano quimicamente ligado à sílica porosa, de 5 m de

diâmetro, temperatura do forno de 30 °C. A fase móvel consistiu de metanol:água

40

na proporção de 80:20, com fluxo de 1 mL/min, com detecção em 279 nm. O método

foi adaptado de Amorin e colaboradores (2009) que validaram a metodologia para

análise do teor de IDB em nanopartículas de QTS.

Para a execução do ensaio foi empregado o método da padronização externa,

com o preparo de uma solução referência do pó de IDB, comparando a sua

concentração e área com a área do pico do analito das soluções amostra.

A solução referência foi preparada empregando a IDB mantida em

dessecador pesando-se exatamente cerca de 10 mg e transferindo para balão

volumétrico de 100 mL. Foi adicionado 50 mL de metanol grau HPLC, sonicado por

15 minutos e completado o volume com água, aguardando a temperatura retornar a

25 °C para ajuste do menisco. A solução foi homogeneizada e transferiu-se 1,25 mL

para um segundo balão de 25 mL e completado o volume com a mistura

metanol:água 8:2 (concentração final de 5 μg/mL). Filtrou-se em membrana de

0,45µm e injetou-se em sextuplicata no cromatógrafo.

As soluções amostra foram preparadas pesando-se exatamente cerca de 1,0

g de creme a 0,5% de IDB (em triplicata escolhendo porções diferentes) em um

bequer de 50 mL, adicionando 40 mL de metanol:água 1:1 e sonicando por 20 min a

50 °C. Transferiu-se quantitativamente para um balão volumétrico de 50 mL e

completou-se o volume com o mesmo solvente, aguardando a temperatura retornar

a 25 °C para ajustar o menisco. Sonicou-se novamente por 20 min a 50 °C,

homogeneizou-se e foi transferido 1,5 mL para eppendorf, equilibrando-os em uma

balança e centrifugando a 13.000 rpm por 15 min em temperatura próxima de 4 °C.

Transferiu-se 0,5 mL do sobrenadante para um balão volumétrico de 10 mL e

completou-se o volume com metanol:água 8:2. Filtrou-se em membrana de 0,45 µm

e injetou-se em duplicata no cromatógrafo (conc. teórica 5 μg/mL).

41

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO

Neste trabalho foram desenvolvidas e avaliadas emulsões contendo IDB

associada ou não à QTS. A escolha deste fármaco deveu-se a sua importante

atividade biológica antioxidante e aos desafios que permanecem no tocante a

diminuição de sua irritação dérmica, aspecto que determina para muitos pacientes a

descontinuidade da aplicação tópica (FLEMING; WHITE; WHITE, 2008; Mc ALEER;

COLLINS, 2008).

As formulações desenvolvidas no presente trabalho foram baseadas em

trabalhos anteriores do grupo (BURATO et al., 2010). Várias formulações foram

testadas, incorporando nanopartículas de QTS contendo IDB, sem sucesso, devido

à excessiva quantidade de material sólido necessário a fim de alcançar 0,5% de IDB

no creme. Partiu-se para a incorporação da IDB previamente misturada com a QTS

na forma de uma suspensão coloidal, contendo TPP como agente reticulante.

Optou-se pelo emprego de bases/tensoativos não iônicos, devido ao caráter

catiônico da QTS. A fim de avaliar a influência da QTS no desempenho das

emulsões, esta foi omitida das formulações IDB-FO e IDB-ACT. A incorporação da

IDB previamente dispersa em meio aquoso ácido, sem a QTS também foi avaliada.

5.1 Avaliação do aspecto das formulações

5.1.1 Analise morfológica

As formulações desenvolvidas foram submetidas à analise microscópica (Fig.

3) a fim de melhor compreender a formação do sistema emulsionado e o aspecto do

fármaco nos sistemas.

Por esta análise verificou-se que as emulsões apresentam glóbulos esféricos,

com diâmetro das gotículas aferidas na sua maioria menor do que 10 µm. Na

formulação IDB - QTS observou-se a presença de gotículas esféricas e também de

pequenos aglomerados de gotículas menores. Não foi observada a presença de

cristais de IDB ou qualquer outro material particulado nas formulações sugerindo que

o fármaco tenha sido incorporado completamente solubilizado nas formulações.

42

Figura 3 – Fotografias da microscopia óptica das amostras de emulsões (ocular 400 X),: A- Base, B – IDB-ACT, C – IDB FO, D – IDB – QTS.

5.1.2 Análise organolépticas

As características organolépticas das formulações desenvolvidas foram

descritas como: i) Creme base (controle negativo) de cor branca, com alto brilho,

textura homogênea e leve, não aerada; odor suave, típico dos componentes da

base; aspecto sensorial característico de baixa oleosidade, ausência de

pegajosidade, alta espalhabilidade e deslizamento, sem presença de resíduo ou

travamento; ii) IDB-FO: cor amarela mais intensa, típica da coloração da IDB, textura

homogênea, com alto brilho, textura leve, não aerada, odor típico dos componentes

da base; iii) IDB-ACT: cor amarela, típica da coloração da IDB, textura homogênea,

com alto brilho, textura leve, não aerada e odor levemente ácido; iv) IDB-QTS: cor

amarela, típica da coloração da IDB, textura homogênea, com alto brilho, textura

leve, não aerada em uma das replicatas e levemente aerado em 2 replicatas; odor

levemente ácido. A aeração deveu-se ao fato desta amostra ficar por um tempo

maior sob agitação de 1000 rpm (20 ao invés de 10 min). Esta variação foi

necessária para proporcionar maior consistência a formulação.

43

5.1.3 Ciclo de congelamento-Descongelamento

Uma vez que as formulações desenvolvidas apresentaram-se visualmente

estáveis após sofrerem a centrifugação, foram submetidas aos ciclos de

congelamento e descongelamento e depois, ao estudo acelerado. Na Figura 4 é

mostrada uma figura 4 das amostras após serem submetidas aos ciclos de

congelamento e descongelamento. Todas permaneceram estáveis quanto aos

parâmetros analisados, conforme informa a Tabela 1, com modificação apenas no

brilho e na textura no caso da IDB-FO.

Figura 4 – Aspecto das formulações contendo 0,5% de IDB após os ciclos de congelamento e descongelamento.

BASE IDB-FO IDB-ACT IDB-QTS

Tabela 1 - Características organolépticas das formulações contendo 0,5% de IDB, após os ciclos de congelamento e descongelamento.

Amostra

Brilho Homogeneidade Textura Odor/cor

Base LM NA LM NA/NA IDB-ACT M NA NA NA/NA

IDB-FO M NA LM NA/ LM IDB-QTS M NA LA NA/ LM

NA= não alterado, LM= levemente modificado, M=modificado, LA=levemente aerado

Comparando-se o aspecto organoléptico das bases no tempo zero, ou seja,

24 horas após o preparo e no tempo final, ou seja, após os 7 ciclos de congelamento

e descongelamento conclui-se que não houve alteração importante quanto ao

aspecto organoléptico das amostras, estando estas aptas a seguir com as demais

avaliações.

5.2 Estudo de Estabilidade Preliminar

44

Após 24 horas de preparo, as amostras foram submetidas ao teste de

centrifugação. É reconhecido que a força da gravidade atua sobre os produtos,

fazendo com que suas partículas se movam no seu interior. A centrifugação produz

estresse na amostra, antecipando possíveis instabilidades, que poderão ser

visualizadas, no caso de emulsões, na forma de precipitados, separação de fases ou

coalescência (BRASIL, 2008).

5.3 Estudo de estabilidade acelerada

Vários fatores podem afetar a estabilidade físico-química de um sistema

emulsionado. Destacam-se o tipo e a concentração de agentes emulsionantes, a

compatibilidade entre os excipientes e o(s) ativo(s), a relação de volume de fases, o

modo de preparo (especialmente no que se refere à temperatura e velocidade de

agitação empregados) assim como as condições de armazenamento e

contaminação por micro-organismos.

5.3.1 Aspectos organolépticos

Na Tabela 2 estão descritas as alterações organolépticas visualizadas nas

amostras após o período de 90 dias, no estudo de estabilidade acelerada (estufa e

geladeira) e em tempo real (ambiente). A Figura 5 apresenta as características de

amostra representativas dos 3 lotes desenvolvidos após estudo de estabilidade

acelerada e em tempo real (90 dias). Salienta-se que o aspecto sensorial foi mantido

em todas as amostras contendo IDB, com pequenas alterações da cor, no brilho, na

textura e um ligeiro aumento de consistência mostrando adequada estabilidade.

45

Tabela 2 - Características organolépticas das amostras após o final da estabilidade acelerada e de tempo real (90 dias).

Figura 5. Amostras submetidas ao estudo de estabilidade antes e após 90 dias em cada ambiente: G (geladeira), E (estufa), A (ambiente). Figura representativa.

5.3.2 pH

Alterações no pH de uma formulação podem estar relacionadas

principalmente à degradação de compostos ou com a contaminação microbiana.

Especialmente no caso da diminuição, pode ser um indicativo de oxidação de

formação de hidroperóxidos na fase oleosa ou ainda da hidrólise de triglicerídeos, o

que pode acarretar a formação de ácidos graxos (MASMOUI et al., (2005).

Formulações Brilho Textura Homogeneidade

Cor Odor

A G E A G E A G E A G E Creme base NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA IDB FO LM LM LM LM LM LM/LS LM LM LM NA NA NA IDB Ac. Acético LM N A LM LM NA LM NA NA LM NA NA NA

IDB + QTS NA NA LM LM LM /L A LM/ L A NA NA NA NA NA NA

Legenda : A (ambiente) G (geladeira) E (estufa); N A= não alterado; LM = levemente

modificado; M= modificado; I= intensamente modificado; LA= levemente Aerado; LS- levemente modificado

46

Analisando-se os valores encontrados na verificação do pH (Tabela 3), nota-

se que houve alteração do pH ao longo do período de estudo de estabilidade,

ficando entretanto abaixo de 10% em quase todas as amostras.

A amostra base teve sua alteração máxima na temperatura ambiente, com

10,1% de incremento, com pH de 4,53. IDB-ACT apresentou menor estabilidade da

geladeira, com aumento de 14,68% (5,80) em 60 dias, tendo maior estabilidade na

temperatura ambiente, mas ainda ligeiramente superior a 10% (pH 4,6). IDB-FO teve

o pH inicial de 4,4 e a alteração máxima situada em 4,55, inferior a 10%. A amostra

contendo QTS, com pH inicial de 4,94 apresentou maior incremento no ambiente

geladeira, com pH 5,5, (10,12%).

Tabela 3. Valores de pH durante o estudo de estabilidade acelerada das formulações. Resultados foram expressos pela média das leituras (n=3)

pH

Amostra Ambiente Geladeira Estufa

T zero T 90 T 90 T 90

Base 4,53 (± 0,37) 5,03 (± 1,02) 4,40 (± 0,30) 4,40 (± 0,20)

IDB-ACT 3,59 4,43 (± 1,01) 5,80 (± 1,32) 4,60 (± 1,09)

IDB-FO 4,4 (± 0,26) 4,55 (± 0,21) 4,2 (± 0,12) 4,2 (±0,21)

IDB-QTS 4,94 (± 0,26) 4,83 (± 0,05) 5,5 (± 1,09) 4,6 (±0,35)

De acordo com Corrêa et al. (2005), é aceitável uma variação de pH em torno

de 10%. Entretanto, os autores estabelecem como pH ideal entre 5,5 e 6,5,

classificados por estes como compatíveis com a pele, uma vez que valores baixos

de pH podem estar relacionados ao aparecimento de irritação dérmica cumulativa.

Entretanto, vários autores tem enfocado o aspecto do pH e a função de

barreira da pele, considerando que o pH em torno de 4 a 5 seria o pH mais indicado,

capaz de normalizar o aumento do pH decorrente da idade cronológica

(WIECHERS, 2008; BLAAK; WOHLFART; SCHURER, 2011). Outro aspecto

relevante na escolha de um pH mais ácido foi a manutenção da solubilidade da

47

quitosana na emulsão, uma vez que a mesma poderia precipitar em pH acima de

5,5.

5.3.3 Aspectos reológicos

Estudos sobre a reologia de formulações farmacêuticas de uso tópico têm se

tornado cada vez mais frequente em pesquisas realizadas pela comunidade

científica, uma vez que a reometria pode representar uma importante ferramenta

para a obtenção de informações quanto à caracterização, a aceitabilidade e ao

desempenho de um produto durante a aplicação, assim como é útil também na

avaliação da estabilidade. Estudos reológicos caracterizam as manifestações das

forças que ocorrem no sistema, podendo ser relacionadas a processos como

floculação, sedimentação, cremeação e coalescência (TADROS, 2004; CORRÊA et

al., 2005).

A viscosidade (viscosidade em uma determinada taxa de deformação) é um

parâmetro reológico que indica a resistência de um determinado material em fluir,

determinada pela taxa de deformação sob determinada pressão de cisalhamento

empregada. De um modo geral está associada à consistência do material, sendo

este aspecto importante tanto no aspecto sensorial e de aplicação da formulação,

como também está relacionado com a capacidade do material em se manter estável

frente a variações ambientais, como a temperatura e o deslocamento (REBELLO,

2005). Na tabela 4 estão indicados os valores encontrados para as formulações com

relação aos valores de viscosidade absoluta.

De modo geral, a viscosidade aumentou após 90 dias de armazenamento, em

todos os ambientes, para todas as formulações, com exceção do creme IDB-FO

(Tabela 4).

A formulação Base apresentou um aumento na viscosidade de

aproximadamente 27% na temperatura ambiente, 11% na condição de resfriamento,

e permaneceu quase inalterado na estufa.

A inclusão de ácido acético na fase aquosa (IDB-ACT) conferiu à formulação

um valor inicial de viscosidade inferior (0,704 Pa.s) (semelhante ao creme IDB-QTS).

Passados 90 dias, notou-se incremento da viscosidade de aproximadamente 100%,

50% e 78,5% na temperatura ambiente, geladeira e estufa, respectivamente,

enquanto o creme IDB-QTS sofreu um aumento de viscosidade de 4,2%, 12,60% e

48

aproximadamente 20% na temperatura ambiente, geladeira e estufa,

respectivamente, mostrando-se o mais estável de todos, quanto a este parâmetro.

Tabela 4 - Valores da viscosidade das formulações no tempo inicial e final do estudo de estabilidade acelerada

Viscosidade aparente (Pa.s) média (± desvio padrão)

Formulações Ambiente Geladeira Estufa

T zero T 90 dias T 90 dias T 90 dias

Base 1,068

(*)

1,359

(± 3,39)

1,184

(± 3,68)

1,060

(± 1,2)

IDB-ACT 0,708

(± 1,08)

1,431

(± 2,18)

1,068

(± 208)

1,264

(± 5,50)

IDB-FO 1,003

(± 15,0)

0,850

(± 1,70)

0,835

(± 1,66)

0, 835

(± 1,95)

IDB-QTS 0,690

(± 3,0)

0,719

(± 1,32)

0,777

(± 1,27)

0,828

(± 2,00)

* unicata

O creme IDB-FO apresentou valor inicial de 1,003 Pa.s, um pouco inferior à

formulação base. Após 90 dias em temperatura ambiente, este valor foi de 0,850

Pa.s, ou seja um decréscimo de aproximadamente 15%. Na geladeira e na estufa

sofreram também leve aumento, na faixa de 15%.

Observou-se que a inclusão de QTS foi capaz de alterar a propriedade

reológica, proporcionando uma formulação com viscosidade inicial menor, ou seja,

com maior fluidez e facilidade de espalhabilidade na aplicação e ao mesmo tempo,

mais estável após o armazenamento nas condições do teste.

Observou-se também que, no aspecto sensorial o creme IDB-QTS mostrou-se

menos oleoso. Este aspecto deve ter sido favorecido pela formação de um sistema

49

gel-creme, onde o polímero foi capaz de proporcionar estabilidade provavelmente

pela capacidade de um pequeno aumento da viscosidade da fase aquosa e também

por estabilização estérica das gotículas (JUMAA et al., 2002)

Na Tabela 5 estão relacionados os parâmetros reológicos avaliados nas

amostras no tempo inicial e tempo final, na temperatura ambiente. Todas as

amostras apresentaram fluxo caracterizado como pseudoplástico, uma vez que os

valores do índice de escoamento ou fluxo são menores do que 1 (MARTIN, 1993).

Entretanto, observou-se a existência do tempo de cedência (ponto de ruptura) em

todas as amostras, fato que confere a estas a capacidade de apresentar resistência

inicial ao escoamento. A amostra de creme base apresentou o maior valor inicial de

tempo de cedência (27,82 Pa) enquanto a formulação de IDB-ACT apresentou o

menor valor (11,73 Pa) e a formulação com QTS um valor intermediário (20,95 Pa).

Quanto à tixotropia, o maior aumento, após 90 dias foi apresentado pelo creme IDB-

QTS (cerca de 82%, contra cerca de 8-13% para as demais formulações) (Tabela 6).

Provavelmente isto de deve ao efeito do polímero QTS, o qual pode formar uma

rede organizada com o tempo de armazenamento.

Tabela 5 Parâmetros reológicos avaliados no tempo zero e após 90 dias em

Temperatura ambiente.

Formulações Índice de fluxo Ponto de

ruptura (Pa)

Tixotropia

(Pa.s)

T zero T90 T0 T90 T0 T90

Creme base -0,6015 -0,6106 27,82 15,43 1301 1462

IDB-FO 0,5254 0,5914 19,54 30,33 1648 1759

IDB-ACT -0,5750 -0,5667 11,73 16,69 1427 1549

IDB- QTS -0,6789 -0,6760 20,95 11,42 957,7 1750

Com relação ao perfil de escoamento, pode-se observar o efeito de histerese

em todos os reogramas (Figura 6), sendo este menos aparente na amostra de 90

dias do creme IDB-QTS. Este efeito confirma que as formulações apresentam

comportamento dependente do tempo e a área de histerese é uma indicação do

comportamento denominado de tixotrópico (OLIVEIRA, SOUZA, MONTEIRO, 2008)

Del Blanco e colaboradores (1999) estudaram a capacidade de quitosanas

com diferentes graus de desacetilação como agentes emulsificantes e como

50

doadores de viscosidade. Os autores avaliaram formulações com diferentes

concentrações e concluíram que formulações contendo 1% de QTS, utilizada como

único agente doador de consistência e emulsificante é capaz de proporcionar

emulsões estáveis, de gotículas esféricas, homogêneas e viscosas. Este

polieletrólito é capaz de estabilizar as gotículas em função da formação de uma

película viscoelástica, sendo capaz de manter as moléculas da fase interna com

menor mobilidade, e também, por ser um polímero carregado, pelo mecanismo

eletro-estérico (RODRÍGUEZ, ALBERTENGO, AGULLÓ, 2002).

Figura 6 - Perfil de escoamento das amostras A (creme base), B (IDB-FO), C (IDB-ACT.), D (IDB-QTS durante o estudo de estabilidade acelerada. Temperatura ambiente.

0

2

4

6

8

10

12

14

16

0 20 40 60 80 100

Vis

co

sid

ad

e a

pa

ren

te (P

a.s

)

Taxa de cisalhamento (s-1)

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

0 20 40 60 80 100Vis

co

sid

ad

e a

pare

nte

(P

a.s

)

Taxa de cisalhamento (s-1)

0

5

10

15

20

25

0 20 40 60 80 100

Vis

co

sid

ade

(P

a.s

)

Taxa de cisalhamento (s-1)

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

0 20 40 60 80 100

Vis

co

sid

ad

e (P

a.s

)

Taxa de cisalhamento (s-1)

0

5

10

15

20

25

0 20 40 60 80 100

Vis

co

sid

ad

e a

pa

ren

te (P

a.s

)

Taxa de cisalhamento (s-1)

QTS IDB T inicial

Série1

0

2

4

6

8

10

12

14

0 20 40 60 80 100

Vis

co

sidade (P

a.s

)

Taxa de cisalhamento (s-1)

QTS+ IDB 90 dias

Série1

0

2

4

6

8

10

12

14

16

0 20 40 60 80 100

Vis

co

sid

ad

e a

pare

nte

(P

a.s

)

Taxa de cisalhamento (s -1)

IDB Ac. Ac. T zero

0

5

10

15

20

25

0 20 40 60 80 100

Vis

co

sidade (P

a.s

)

Taxa de cisalhamento (s-1)

ácido acético 90 dias

A

B

C

D

T zero T 90 dias

51

5.4 Determinação do teor de IDB nas formulações semissólidas por CLAE

Em testes preliminares observou-se que a espectrofotometria de absorção no

UV não é adequada para estas amostras devido à elevada absorbância da base no

comprimento de onda de escolha para análise da IDB. Foram testadas várias

metodologias de extração da IDB dos cremes, sem sucesso. Portanto, optou-se pelo

emprego de cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) para o doseamento do

fármaco nos cremes, uma vez que esta técnica permite a separação dos

componentes da formulação e análise quali e quantitativa do fármaco.

O método desenvolvido foi adaptado de Amorin e colaboradores (2009),

empregando-se a mesma coluna, fase móvel e comprimento de onda de detecção,

porém com um método de extração diferenciado daquele empregado pelos autores,

para a extração da IDB das nanopartículas de QTS secas por spray dryer. No

presente trabalho, procedeu-se a uma extração por ultrassom e calor, seguido de

centrifugação a frio, como descrito na metodologia. O emprego desta metodologia

necessita ainda ser validado, porém demonstrou ser seletivo para a IDB presente no

creme (Figura 7) com excelente resolução do fármaco (eluindo em 11 min) em

relação aos demais componentes da base que absorvem no mesmo comprimento

de onda e elevar mais precocemente.

Figura 7 - Cromatograma da amostra IDB QTS mostrando o pico de IDB (TR 11 min)

Empregando esta metodologia, verificou-se que o teor de IDB no creme IDB-

QTS foi de 109,4%, dentro da faixa de 90-110% previamente estabelecida. Esta

metodologia apresentou linearidade na faixa de 2-15 µg/mL, com coeficiente de

correlação (r) de 0,99975 (dados não mostrados). Este método necessita ser

validado quanto à sua precisão, exatidão e robustez.

AU

0,000

0,010

0,020

0,030

Minutes

1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00 7,00 8,00 9,00 10,00 11,00 12,00 13,00 14,00 15,00

10,7

45

52

53

6 CONCLUSÕES

Foram desenvolvidas formulações semissólidas de IDB incorporadas na fase

oleosa, de modo convencional e incorporada na fase aquosa, composta por uma

dispersão coloidal de QTS seguida de reticulação com TPP, esta última com aspecto

opalescente, característico de um nanosistema. Estas formulações foram aprovadas

em estudo de estabilidade preliminar, acelerado e de longa duração quanto às

características físicas e físico-químicas e foi desenvolvido um método por CLAE para

a sua quantificação, o qual necessita ser posteriormente validado segundo normas

oficiais. Tais formulações podem ser avaliadas em estudos posteriores de

citotoxicidade in vitro, a fim de analisar o papel da QTS na diminuição do potencial

irritante do fármaco, empregando uma metodologia de produção dos cremes, de fácil

escalonamento, apresentando uma potencial alternativa prática e econômica aos

sistemas lipossomados atualmente existentes, os quais apresentam ainda

problemas de irritação da formulação.

Os resultados apresentam potencial de inovação na área cosmética

representando uma alternativa prática e de fácil escalonamento, em relação aos

produtos baseados em lipossomas, atualmente comercializados, sob patente

(BIRGIT; EBERHARD; FALKO, 2002). O aproveitamento da QTS, um derivado da

quitina, que representa um sub-produto da atividade pesqueira, abundante nas

regiões litorâneas, oportuniza mais uma aplicação para este biopolímero,

estimulando o setor industrial de excipientes nacionais, na futura elaboração de um

produto cosmético estável, seguro e de fácil obtenção em aumento de escala.

54

55

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