UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO

CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

DOUTORADO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

Desenvolvimento de um biossensor para detecção e

identificação do vírus da dengue em fluídos biológicos

Tese de Doutorado Orientando: Fernando Sérgio Rodrigues Ribeiro Teles

Orientador: José Luiz de Lima-Filho

Co-orientador: Duarte Miguel França dos Prazeres (IST / UTL, Lisboa-Portugal)

Recife, 2006

UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO

CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

DOUTORADO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

Desenvolvimento de um biossensor para detecção e

identificação do vírus da dengue em fluídos biológicos

Tese de Doutorado

Orientando: Fernando Sérgio Rodrigues Ribeiro Teles

Orientador: José Luiz de Lima-Filho

Co-orientador: Duarte Miguel França dos Prazeres (IST / UTL, Lisboa-Portugal)

Recife, 2006

FERNANDO SÉRGIO RODRIGUES RIBEIRO TELES

Desenvolvimento de um biossensor para detecção e

identificação do vírus da dengue em fluídos biológicos

Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas da Universidade Federal de Pernambuco para obtenção do grau de Doutor em Ciências Biológicas (área de concentração de Biotecnologia).

Orientando: Fernando Sérgio Rodrigues Ribeiro Teles

Orientador: José Luiz de Lima-Filho

Co-orientador: Duarte Miguel França dos Prazeres (IST / UTL, Lisboa-Portugal)

SUMÁRIO Agradecimentos ------------------------------------------------------------- i Resumo ------------------------------------------------------------------------ ii Abstract ------------------------------------------------------------------------ iii Abreviaturas ----------------------------------------------------------------- iv Lista de figuras -------------------------------------------------------------- v 1. Introdução ----------------------------------------------------------------- 1 1.1 Dengue ----------------------------------------------------------------- 1 1.2 Biossensores ----------------------------------------------------------- 7 1.2.1 Conceito -------------------------------------------------------- 7 1.2.2 Caracterização ------------------------------------------------- 11 1.3 Imobilização de biomoléculas em superfícies --------------------- 15 1.4 Transdutores ----------------------------------------------------------- 17 1.4.1 Transdutores piezelétricos ------------------------------------ 18 1.4.2 Transdutores óticos -------------------------------------------- 20 1.4.3 Transdutores eletroquímicos ---------------------------------- 23 1.5 Áreas de aplicação dos biossensores ------------------------------- 35 1.5.1 Monitoramento e controle de bioprocessos ---------------- 36 1.5.2 Monitoramento ambiental / Guerra química e biológica - 38 1.5.3 Agricultura e veterinária -------------------------------------- 39 1.5.4 Diagnóstico clínico -------------------------------------------- 39 1.6 Biossensores de DNA ------------------------------------------------ 42 1.6.1 Biossensores de DNA com transdução ótica -------------- 46 1.6.2 Biossensores de DNA com transdução piezelétrica ------ 52 1.6.3 Biossensores de DNA com transdução eletroquímica ---- 55 1.6.4 Novos biossensores de DNA --------------------------------- 68 2. Objetivos ------------------------------------------------------------------- 82 2.2 Objetivo geral --------------------------------------------------- 82 2.3 Objetivos específicos ------------------------------------------- 82 3. Publicações ---------------------------------------------------------------- 83 3.1 “Trends in dengue diagnosis” ---------------------------------- 83 3.2 “Electrochemical detection of a dengue-related

oligonucleotide sequence using ferrocenium as a hybridization indicator” --------------------------------------

84

4. Conclusões ----------------------------------------------------------------- 85 5. Bibliografia ---------------------------------------------------------------- 87 6. Anexos ---------------------------------------------------------------------- 106

i

AGRADECIMENTOS

São devidos agradecimentos às seguintes entidades:

• José Luiz, por me ter aceito como seu orientando de doutorado no LIKA,

e Miguel Prazeres, por me ter aceito como seu co-orientando;

• Coordenação do Doutorado em Ciências Biológicas, por me ter aceito

como aluno de doutorado do CCB / UFPE;

• Fundação para a Ciência e Tecnologia, FCT, do Ministério da Ciência,

Tecnologia e Ensino Superior de Portugal, por me ter concedido a Bolsa

de Doutorado que permitiu a minha vinda e manutenção no Brasil;

• Professores Madalena Areias e Marcelo Navarro, do DQF / UFPE, pela

ajuda inestimável que me deram, não apenas pelo suporte material

indispensável que me concederam para a realização do trabalho

experimental, como também pelas sugestões profícuas;

• Aos colegas do laboratório, principalmente à Rosa Dutra (professora na

UPE), à Neide Shinohara e à Rosângela Frade pelo convívio quotidiano

agradável e pelas sugestões e colaborações informais. Agradeço

especialmente ao Jorge Brito pela atenção e orientação desinteressadas

que me dispensou na iniciação do meu trabalho de laboratório.

• A todas as pessoas que, mais ou menos diretamente, contribuíram para a

finalização bem-sucedida deste trabalho.

ii

RESUMO

A dengue, uma doença emergente, é atualmente a mais importante arbovirose

humana, manifestando-se na forma de quatro sorotipos relacionados antigenicamente

(DENV 1-4). É endêmica e / ou epidêmica em todas as regiões tropicais e subtropicais,

e uma ameaça potencial para regiões mais temperadas. Dos 100 milhões de casos

anuais, 450000 correspondem à forma mais grave, hemorrágica, com alta letalidade.

Devido à inespecificidade dos sintomas iniciais e à inexistência de vacinas e drogas

eficientes e devidamente testadas, o diagnóstico precoce é a principal estratégia de

sobrevivência à dengue hemorrágica. As técnicas laboratoriais de diagnóstico clínico

convencional, contudo, apresentam limitações significativas. Com a tecnologia de

biossensores produzem-se dispositivos simples, rápidos, baratos, sensíveis, específicos e

miniaturados para diagnóstico descentralizado. Neste trabalho, desenvolveu-se um

biossensor eletroquímico de DNA para detectar, por voltametria cíclica, um

oligonucleotídeo sintético relacionado com o genoma do vírus da dengue, hibridizando-

o especificamente com a sua seqüência complementar, imobilizada num eletrodo de

carbono vítreo modificado com quitosana. O ferroceno foi usado como indicador

eletroativo de hibridização por se ligar ao ssDNA e ao dsDNA com diferentes

afinidades e, assim, gerar picos de corrente distintos. Este biossensor conseguiu

discriminar significativamente o dsDNA do ssDNA, na gama de detecção de mg/ml

(submicromolar). A maior afinidade relativa do ferroceno por dsDNA foi confirmada

pela obtenção de maior constante de decaimento voltamétrico (kd) e menor período de

meia-vida (t1/2) em relação ao ensaio com ssDNA. A identificação específica do

sorotipo deverá requerer somente substituição da seqüência conservada (genérica) por

seqüências específicas de cada sorotipo.

Palavras-chave: diagnóstico de dengue; biossensor de DNA; detecção eletroquímica;

indicador de hibridização; eletrodo de carbono vítreo; imobilização de quitosana.

iii

ABSTRACT

Dengue, an emerging disease, is nowadays the most important human

arboviruses, appearing in the form of four antigenically-related serotypes (DENV 1-4).

It is endemic and / or epidemic in all tropical and subtropical regions, and a potential

threat to more temperate regions. From the 100 million annual cases, 450000

correspond to the more serious, haemorrhagic form, with high lethality. Due to the non-

specificity of early symptoms and to the inexistence of efficient and properly tested

vaccines and drugs, early diagnosis is the main strategy of survival to haemorrhagic

dengue. Conventional laboratory techniques of clinical diagnosis, however, exhibit

significant limitations. With biosensor technology, simple, rapid, cheap, sensitive,

specific and miniaturised devices for decentralised diagnosis are produced. In this work,

an electrochemical DNA biosensor was developed to detect, through cyclic

voltammetry, a synthetic oligonucleotide related with dengue virus genome, to hybridise

with its complimentary sequence, immobilised in a chitosan-modified glassy carbon

electrode. Ferrocene was used as an electroactive hybridisation indicator for its ability

to bind ssDNA and dsDNA with different affinities, thus generating distinct current

peaks. This biosensor was able to significantly discriminate dsDNA from ssDNA, in the

detection range of mg/ml (submicromolar). The higher relative affinity of ferrocene to

dsDNA was confirmed by the obtention of a higher voltammetric decay rate constant

(kd) and a lower half-life period (t1/2), compared to the ssDNA assay. The identification

of the specific serotype will only require substitution of the conserved (generic)

sequence by its serotype-specific counterparts.

Keywords: dengue diagnosis; DNA biosensor; electrochemical detection; hybridisation

indicator; glassy carbon electrode; chitosan immobilisation.

iv

ABREVIATURAS

AdSV Adsorptive Stripping Voltammetry --------------------- Voltametria de Redissolução Adsorptiva

AdTSV Adsorptive Transfer Stripping Voltammetry ----------- Voltametria de Redissolução Adsortiva após Transferência

AFM Atomic Force Microscopy -------------------------------- Microscopia de Força Atômica

AIDS Acquired Immuno Deficiency Syndrome -------------- Síndrome da Imuno Deficiência Adquirida

BAW Bulk Acoustic Wave -------------------------------------- Onda Acústica Interna

BIA(core) Biospecific Interaction Analysis ------------------------- Análise de Interação Bioespecífica

BLM Bilayer Lipid Membrane ---------------------------------- Membrana Lipídica de Bicamada

BOD Biochemical Oxygen Demand --------------------------- Demanda Bioquímica de Oxigênio

cDNA Complimentary DNA ------------------------------------- DNA Complementar

DNA Deoxyribonucleic Acid ----------------------------------- Ácido Desoxirribonucléico

dG Deoxyguanosine ------------------------------------------- Desoxiguanosina

dsDNA Double-Stranded DNA ------------------------------------ DNA de Cadeia Dupla

dU Deoxyuridine ----------------------------------------------- Desoxiuridina

ENFET Enzyme-Based Field Effect Transistor ----------------- Transistor de Efeito de Campo Baseado em Enzima

FIA Flow Injection Analysis ----------------------------------- Análise de Injeção de Fluxo

HIV Human Immunodeficiency Virus ------------------------ Vírus da Imunodeficiência Humana

IgG Immunoglobulin G ---------------------------------------- Imunoglobulina G

ISFET Ion-Selective Field Effect Transistor -------------------- Transistor de Efeito de Campo Seletivo a Íons

IUPAC International Union of Pure and Applied Chemistry -- União Internacional de Química Pura e Aplicada

kb Kilobase ----------------------------------------------------- Quilobase

Mr Relative Molecular Mass --------------------------------- Massa Molecular Relativa

μTAS μ (Micro) Total Analytical System ---------------------- μ (Micro) Sistema Analítico Total

MWNT Multi-Wall Carbon Nanotube ---------------------------- Nanotubo de Carbono em Multicamada

NADH Nicotinamide Adenine Dinucleotide (H-) -------------- Nicotinamida Adenina Dinucleotídeo (-H-)

NASBA Nucleic Acid Sequence-Based Amplification --------- Amplificação Baseada na Sequência de Ácido Nucléico

PCB Polychlorinated Biphenyl --------------------------------- Bifenil Policlorinado

PCR Polymerase Chain Reaction ------------------------------ Reação em Cadeia da Polimerase

PNA Peptide Nucleic Acid -------------------------------------- Ácido Nucléico Peptídico

QCM Quartz Crystal Microbalance ----------------------------- Microbalança de Cristal de Quartzo

RNA Ribonucleic Acid ------------------------------------------ Ácido Ribonucléico

RT-PCR Reverse Transcription-PCR ------------------------------ Trancrição Reversa-PCR

SAM Self-Assembled Monolayer ------------------------------ Monocamada Auto-Organizada

SAW Surface Acoustic Wave ----------------------------------- Onda Acústica de Superfície

SCE Saturated Calomel Electrode ----------------------------- Eletrodo de Calomelanos Saturados

SPR Surface Plasmon Resonance ----------------------------- Ressonância de Plasma em Superfície

SSB Single Strand DNA-Binding Protein -------------------- Proteína de Ligação ao ssDNA

ssDNA Single-Stranded DNA ------------------------------------- DNA de Cadeia Simples

STM Scanning Tunnelling Microscopy ----------------------- Microscopia de Tunelamento

SWNT Single-Wall Carbon Nanotube --------------------------- Manotubo de Carbono em Monocamada

TCNQ Tetracyanoquinodimethane ------------------------------- Tetracianoquinodimetano

TSM Thickness-Shear-Mode ----------------------------------- Modo de Cisalhamento em Espessura

UV Ultra-Violet ------------------------------------------------- Ultra-Violeta

v

LISTA DE FIGURAS Figura 1 – O mosquito Aedes aegypti, principal vetor da dengue (retirado de

www.canalciencia.ibict.br).

Figura 2 - Seqüência dos últimos 400 nucleotídeos correspondentes à seqüência não-codificante

3’ do genoma do vírus da dengue (sorotipos 1-4). As áreas escuras representam seqüências

homólogas entre os sorotipos (retirado de Houng et al., 2001).

Figura 3 - Estrutura do vírus da dengue (retirado de www.prefeitura.sp.gov.br).

Figura 4 - Relação entre temperatura corporal, viremia e quantidade de IgM anti-dengue num

quadro clínico típico de dengue (retirado de www.cdc.gov).

Figura 5 - Distribuição da dengue no mundo (retirado de www.anvisa.gov.br).

Figura 6 - Número de casos de dengue notificados nas várias regiões do Brasil, em 2004/2005

(retirado de www.cienciaviva.org.br).

Figura 7 - Principais etapas operacionais num biossensor: a) biocatálise; b) transdução; c)

amplificação; d) processamento; e) exibição visual (retirado de www.pharmacon.us).

Figura 8 - Cristal de quartzo e respectivo suporte (retirado de www.tms.org).

Figura 9 - Funcionamento de um aparelho de SPR (retirado de www.fz-juelich.de).

Figura 10 - Estrutura do ferroceno (retirado de de.wikipedia.org).

Figura 11 - Perfis eletroquímicos típicos de voltametria cíclica. Em cima: potencial aplicado ao

longo do tempo. Em baixo: corrente de resposta em função do potencial aplicado (retirado de

www.sg0.chem.upenn.edu).

Figura 12 - Esquema da dupla-camada elétrica. (A) Na ausência de eletrólito, a queda de

potencial entre os dois eletrodos é linear. (B) Quando um eletrólito é adicionado, forma-se uma

bicamada junto à superfície de cada eletrodo; deste modo, a queda de potencial acontece

principalmente junto às bicamadas, assim minimizando a queda de potencial no seio da solução,

vi

Vs (Vs = corrente que atravessa a solução, i × resistência da solução, Rs) (adaptado de Diamond,

1998).

Figura 13– Variações do potencial aplicado e da corrente de resposta ao longo do tempo em

voltametria de pulso (adaptado de Diamond, 1998).

Figura 14 – Decaimento temporal das correntes total (itotal) e de carga da dupla-camada (idc) em

voltametria de pulso (adaptado de Diamond, 1998).

Figura 15 - Perfil de potencial aplicado ao longo do tempo em voltametria de pulso diferencial

(retirado de www.epsilon-web.net).

Figura 16 - Esquema de célula eletroquímica (retirado de chemistry.binghamton.edu).

Figura 17 - Esquema de um eletrodo de Ag/AgCl (retirado de www.ktf-split.hr).

Figura 18- Princípio de funcionamento de um detector FIA. Depois de a amostra e o reagente

se misturarem e reagirem, os produtos resultantes são detectados oticamente ou

eletroquimicamente ao serem eluídos por um capilar (retirado de www.llnl.gov).

Figura 19 – Lado esquerdo: vários formatos de biossensores comerciais para determinação de

glucose. Lado direito: como eram exclusivamente realizados os diagnósticos clínicos antes do

surgimento dos biossensores – num laboratório (retirado de www.chemsoc.org).

Figura 20 - Esquema genérico de um biossensor de DNA. A hibridização de uma cadeia-alvo

com uma cadeia-sonda imobilizada numa superfície transdutora gera um sinal elétrico

específico que é depois medido (retirado de www.nature.com).

Figura 21 - Biossensor em formato microfluídico (μTAS) para detecção de hibridização de

DNA (retirado de www.aist.go.jp).

Figura 22 - Mecanismo de transferência eletrônica em biossensores baseados em polímeros

condutores (retirado de Gerard et al., 2002).

Figura 23 - Esquema de uma SAM de alcanotióis (cadeias em V) numa superfície de ouro.

Esferas escuras: átomos de ouro. Esferas claras: átomos de enxofre (retirado de Freire et al.,

2003).

vii

Figura 24 - Processo de detecção de hibridização usando dendrímeros de ácidos nucléicos

imobilizados (retirado de Wang & Jiang, 1998).

Figura 25 - Estruturas químicas de um PNA e de um DNA homólogos (retirado de www.dkfz-

heidelberg.de).

Figura 26 - Etapas de manufatura de um eletrodo de pasta de carbono (retirado de

www.epsilon-web.net)

Figura 27 - Princípio de detecção eletroquímica de hibridização de DNA em eletrodos de

carbono. (A) A sonda de DNA é adsorvida na superfície do eletrodo por aplicação de um

potencial positivo. (B) Hibridização da sonda com o alvo complementar. (C1) Transdução

usando o sinal de eletrooxidação dos resíduos de guanina. (C2) Transdução usando o sinal de

eletrorredução de um indicador redox pré-concentrado na superfície do eletrodo (retirado de

Pividori et al., 2000).

Figura 28 - Estrutura da quitosana (retirado de www.ualberta.ca).

Figura 29 - Ligação do ferroceno (em cima, à direita) a um sulco maior do dsDNA (retirado de

rincewind.usask.ca).

Figura 30 - Esquema da técnica de AdTSV para detecção de DNA. Através da aplicação de um

potencial elétrico, o ssDNA é acumulado na superfície do elétrodo, e este lavado com água e

solução do eletrólito. Finalmente, o elétrodo modificado com ssDNA é transferido para uma

célula voltamétrica convencional, onde é feita a medição (retirado de

www.biologicalprocedures.com).

Figura 31 - Princípio de funcionamento de um biossensor multianalito para identificação

específica dos sorotipos do vírus da dengue. É usada uma sonda-repórter genérica, ligada a um

lipossomo encapsulando moléculas de um corante, e 5 sondas de captura – uma relativa a uma

região conservada do genoma viral e as outras específicas para os 4 sorotipos. Quando um RNA

viral específico está presente, forma uma ‘sanduíche’ com as duas sondas (repórter e de

captura), sendo o número de lipossomos capturados na região de detecção proporcional à

quantidade de RNA viral presente (retirado de Zaytseva et al., 2004).

viii

Figura 32 - Esquema em ‘sanduíche’ de biossensor para detecção genérica do genoma do vírus

da dengue e identificação específica do sorotipo (retirado de Baeumner et al., 2004b).

Figura 33 - Esquema de um biochip de DNA. Os diferentes alvos de DNA, obtidos de

fragmentos habitualmente clonados em plasmídeos e depois amplificados, são imobilizados no

chip. As sondas de RNA ou cDNA, obtidas de células em diferentes condições de crescimento,

são marcadas com um fluoróforo. Após hibridização das sondas com os alvos, um laser faz a

leitura do mesmo, sendo gravadas e registradas as localizações específicas, no chip, onde a

hibridização ocorreu. Finalmente, os dados são analisados (retirado de

www.kbrin.louisville.edu).

Figura 34 - Detecção de hibridização de DNA num nanoporo de α-hemolisina. (a) Visão

transversal do nanoporo heptamérico de α-hemolisina ligado a um ssDNA. O sinal ⊕ indica um

potencial positivo aplicado no lado trans da membrana, para o qual é impulsionado o ssDNA

(carregado negativamente) a partir do lado cis. (b) ‘Assinatura’ de corrente típica de um duplex

de DNA totalmente complementar formado entre o ssDNA imobilizado (oligo-1) e uma cadeia

recém-chegada (oligo-2G); B representa os eventos individuais de ligação específica entre o

oligo-1 e o oligo-2G, e T os eventos de translocação do oligo-2G que não se ligou ao oligo-1. (c)

‘Assinatura’ de corrente relativa à ligação parcialmente complementar entre o oligo-1

imobilizado e o oligo-2C recém-chegado. Neste caso, apenas se observam eventos T (retirado de

Niemeyer, 2002).

1

1. INTRODUÇÃO

1.1 DENGUE

A dengue é atualmente a mais importante arbovirose humana e uma das grandes

doenças emergentes contemporâneas, sendo propagadas a humanos por fêmeas

infectadas dos mosquitos Aedes aegypti e Aedes albopictus (figura 1).

Figura 1 – O mosquito Aedes aegypti, principal vetor da dengue

(retirado de www.canalciencia.ibict.br).

O vírus da dengue pertence ao gênero Flavivirus e à família Flaviviridae,

podendo apresentar-se na forma de quatro sorotipos (DENV 1-4) relacionados

antigenicamente. Apesar da grande variabilidade genética entre eles, a região não-

codificante 3’ é relativamente conservada entre eles, como mostra a figura 2.

2

Figura 2 - Seqüência dos últimos 400 nucleotídeos correspondentes à seqüência não-

codificante 3’ do genoma do vírus da dengue (sorotipos 1-4). As áreas escuras

representam seqüências homólogas entre os sorotipos (retirado de Houng et al., 2001).

O seu genoma é um ssRNA de 11 kbs e Mr = 4000 que contém seqüências para

codificação de proteínas estruturais e não-estruturais, incluindo uma glicoproteína-E,

responsável pelo reconhecimento e ligação específica às células hospedeiras. Estas

proteínas estão integradas numa bicamada lipídica que envolve a nucleocápside viral

(Teles et al., 2005), como se pode observar na figura 3.

Figura 3 - Estrutura do vírus da dengue (retirado de www.prefeitura.sp.gov.br).

3

Os primeiros sintomas da dengue, após um período de incubação de até duas

semanas, são bastante inespecíficos, confundindo-se com os da malária, leptospirose,

influenza, febre amarela e várias encefalites. Entre eles, incluem-se febre alta, dores

musculares e articulares, cefaléia, náuseas, vômitos, fraqueza e erupções cutâneas – é a

febre de dengue clássica. Principalmente em casos de pacientes jovens ou reinfectados

com um novo sorotipo, a patologia pode evoluir para febre hemorrágica de dengue,

caracterizada por febre muito alta, hepatomegalia, colapso circulatório e manifestações

hemorrágicas. Este quadro clínico é uma situação emergencial e, se não for tratado

prontamente, pode degenerar em síndrome de choque da dengue, que tem alta taxa de

letalidade (Teles et al., 2005). O período de duração da febre, de 2-7 dias, corresponde a

extensa disseminação da infecção e à produção de anticorpos de IgM e IgG anti-dengue

(Castleberry & Mahon, 2003). Este período febril correlaciona-se com maior viremia e

antecede o aparecimento, no sangue, de anticorpos IgM anti-dengue (figura 4).

Figura 4 - Relação entre temperatura corporal, viremia e quantidade de IgM anti-

dengue num quadro clínico típico de dengue (retirado de www.cdc.gov).

Em indivíduos com infecção primária e em não-imunizados com uma vacina

flaviviral, a resposta imunológica consiste na produção massiva de anticorpos IgM

específicos, atingindo um pico de concentração sanguínea aproximadamente 2 semanas

após o início dos sintomas, e retornando a níveis indetectáveis por ELISA ao fim de 2-3

meses (Nogueira et al., 1992; World Health Organization, 1997). A evolução temporal

4

do perfil de IgG é semelhante, embora os seus níveis sanguíneos sejam sempre bastante

inferiores aos de IgM. A situação é inversa durante uma infecção secundária, na qual o

pico de IgG supera o de IgM. Numa infecção secundária ou em indivíduos já

imunizados com uma vacina flaviviral, os níveis de IgM são muito menores do que

numa infecção primária, podendo mesmo ser praticamente nulos (Rossi et al., 1998;

World Health Organization, 1997). Mesmo vários meses após a infecção secundária,

ainda é possível detectar o sorotipo infectante, embora os anticorpos da infecção

primária possam participar em reações cruzadas e, assim, impedir um diagnóstico

correto desse sorotipo (Putnak et al., 2003). A inespecificidade dos sintomas,

principalmente no estágio inicial da doença, compromete significativamente o êxito de

muitos métodos para o seu diagnóstico precoce, pelo que a reprodutibilidade de

resultados de diagnóstico entre laboratórios diferentes é freqüentemente preferida à

exatidão dos mesmos.

A dengue afeta mais de 100 países em regiões tropicais e subtropicais do

planeta, sendo também uma ameaça potencial para regiões mais temperadas

(Castleberry & Mahon, 2003; Gascon et al., 1998; Rodriguez-Tan & Weir, 1998; World

Health Organization, 1997), como se constata da figura 5.

Figura 5 - Distribuição da dengue no mundo (retirado de www.anvisa.gov.br).

5

A sua incidência anual atinge 100 milhões de casos, dos quais 450000

correspondem à forma hemorrágica, mais grave; estima-se que cerca de metade da

população mundial esteja em risco (Monath, 1994; Rigau-Perez et al., 1998). Fatores

como o aumento drástico das viagens aéreas, a pressão humana sobre os ecossistemas

tropicais, o colapso de programas de controle de pragas, o grande aumento populacional

nas regiões tropicais e a deterioração das condições medico-sanitárias nessas regiões

têm intensificado o contato humano com o vírus da dengue e, assim, a expansão da

doença (Guzman & Kouri, 1996; Lupi & Tyring, 2003). Depois do grande surto

epidêmico que afetou Cuba em 1981 (World Health Organization, 1997), o caso mais

dramático da história da dengue na América, grandes surtos ocorreram noutras regiões

do continente americano, na Ásia e em ilhas do Pacífico (Halstead, 2002). Foi no

sudeste asiático que se notificaram, pela primeira vez, as formas mais graves da doença

- nas décadas de 1950 e 1960 -, as quais aumentaram abruptamente no continente

americano nas últimas décadas. Aqui se incluem surtos epidêmicos, por exemplo, no

Brasil, Venezuela, Colômbia e Guiana Francesa (Gubler & Trent, 1994). A doença

tornou-se endêmica no Brasil, correspondendo à circulação dos sorotipos 1 e 2.

Recentemente, porém, também o sorotipo 3 foi introduzido no país, manifestando-se no

surto epidêmico mais severo registrado no Brasil até agora (Miagostovich et al., 2006;

Nogueira et al., 2005). A figura 6 indica o número total de casos notificados de dengue

nas várias regiões do Brasil entre 2004 e 2005.

Figura 6 - Número de casos de dengue notificados nas várias regiões do Brasil, em

2004/2005 (retirado de www.cienciaviva.org.br).

6

Ao nível individual, a prevenção da dengue faz-se geralmente recorrendo a

repelentes de insetos e a mosquiteiros (Kuno et al., 1990); ao nível populacional, o

controle químico (através de inseticidas) e o controle biológico (através, por exemplo,

de bactérias) de populações de mosquitos têm sido as principais formas de prevenção da

doença (Priest, 1992). Por outro lado, o tratamento é meramente sintomático e paliativo,

habitualmente com recurso a analgésicos, no caso da febre de dengue, e a administração

de soro, no caso da variante hemorrágica. Na ausência de drogas eficazes e específicas e

de uma vacina multivalente (isto é, ativa contra os quatro sorotipos), o diagnóstico

precoce assume importância primordial no combate à dengue, especialmente à forma

hemorrágica. No entanto, os métodos convencionais de laboratório para diagnóstico

clínico da dengue apresentam limitações significativas. A detecção do vírus por

isolamento em cultura (seguido geralmente de imunofluorescência com anticorpos

monoclonais), apesar de ser o método mais direto e conclusivo (Yamada et al., 2002),

requer equipamento sofisticado e mão-de-obra qualificada, além de ser pouco útil em

diagnóstico precoce, visto que são necessários vários dias para isolar e classificar o

vírus (Guzman & Kouri, 1996; Teles et al., 2005). Esta limitação é extensiva aos

métodos sorológicos para detecção de anticorpos anti-dengue específicos. Apesar da sua

maior simplicidade, a sorologia, em infecções primárias, só permite detectar o nível de

anticorpos sanguíneos 4-5 dias após a infecção (Teles et al., 2005). Normalmente,

considera-se que o resultado de um diagnóstico sorológico é positivo para um

determinado sorotipo quando se registra, para o anticorpo específico, um aumento do

seu nível basal em quatro vezes, ou mais. Em infecções secundárias, podem ainda

ocorrer reações cruzadas do anticorpo para a infecção atual com o anticorpo da infecção

anterior, ou até de outra flavivirose, resultando em resultados errôneos (Schwartz et al.,

2000; Soler, 1998). A detecção de antígenos específicos da partícula viral por

imunofluorescência (com anticorpos monoclonais) é geralmente ineficiente devido à

reprodução lenta do vírus da dengue em cultura, que resulta numa concentração viral

demasiado baixa para poder ser detectada (Guzman & Kouri, 1996). A RT-PCR

(utilizada para sintetizar cDNA a partir do RNA viral e, depois, amplificar o primeiro

através de uma polimerase) e técnicas derivadas, embora sejam mais simples, rápidas,

sensíveis e específicas do que a hibridização convencional de ácidos nucléicos, exigem

manipulação meticulosa e são sujeitas a fácil contaminação da amostra biológica

(Sarkar & Sommer, 1990). Um método ‘ideal’ de diagnóstico da dengue deverá poder

7

suprimir as limitações dos métodos convencionais atuais. Algumas inovações

tecnológicas têm sido desenvolvidas no sentido de utilização in situ (diagnóstico

descentralizado), mas as técnicas atualmente conhecidas e disponíveis continuam a não

preencher os requisitos necessários para o diagnóstico bem-sucedido de doenças

infecciosas nos países tropicais e subdesenvolvidos: simplicidade, baixo custo, rapidez e

precisão (Kuno et al., 1998). Para um diagnóstico eficiente da dengue, antevê-se a

necessidade de desenvolver técnicas e / ou dispositivos capazes de, não só detectar o

vírus, mas também discriminar, num único ensaio multianalito, os quatro sorotipos

(Mehrvar & Abdi, 2004); a elevada variabilidade genética entre os sorotipos,

especialmente quando isolados de regiões geográficas distintas, tem dificultado e

atrasado o desenvolvimento e produção de tais dispositivos (Tadeu et al., 1987). Novos

sistemas bioanalíticos, potencialmente miniaturáveis e portáteis para detecção in situ de

agentes patogênicos têm sido recentemente desenvolvidos, produzidos e

comercializados. Os formatos mais recentes destes dispositivos consistem em módulos

integrados nos quais um elemento de reconhecimento biológico, um transdutor físico e

um detector se encontram compactados numa única unidade funcional. Estes sistemas

caracterizam-se, em geral, por possuírem elevada seletividade, sensibilidade, rapidez e

linearidade do sinal de resposta, além de poderem ser operados por pessoal não

qualificado, inclusive pelo próprio paciente, fora de grandes e especializadas

instituições clínicas (Cabral et al., 2003; Teles et al., 2005). A partir do momento em

que se desenvolva suficientemente a tecnologia que permita a sua produção com custos

mais competitivos, eles deverão constituir, no futuro próximo, uma nova abordagem ao

diagnóstico de doenças hereditárias e infecciosas, com vantagens acrescidas sobre os

menos versáteis e complexos sistemas atuais de diagnóstico clínico (Griffiths & Hall,

1993; Teles et al., 2005).

1.2 BIOSSENSORES

1.2.1 Conceito

O conceito de biossensor é, hoje em dia, utilizado correntemente no meio

científico, embora nem sempre de forma inequívoca. Porém, todos os biossensores

possuem a capacidade de reconhecer moléculas biológicas específicas, o que os tem

8

tornado tão divulgados e aplicados, por exemplo, em diagnósticos clínicos e controle

ambiental. Admitindo que mecanismos ou princípios biológicos são comumente

utilizados para o reconhecimento molecular de substâncias, pode afirmar-se que os

biossensores constituem um subgrupo dos sensores químicos, embora muito mais

seletivos do que os últimos (Cammann et al., 1991). Segundo uma primeira definição da

IUPAC, aqui traduzida da língua inglesa, “sensores químicos analíticos são transdutores

miniaturados que respondem seletivamente e reversivelmente a compostos químicos ou

íons e geram sinais elétricos que dependem da concentração”. De acordo com esta

definição estrita, tubos e tiras (fitas)-teste (test-strips) para testes de diagnóstico devem

ser considerados dosímetros e não verdadeiros sensores, visto que, através deles, não é

possível detectar oscilações de concentração do analito. Além disso, estes instrumentos

carecem de um sinal contínuo e proporcional à concentração. É também consensual na

IUPAC que grandes instrumentos analíticos acoplados a uma sonda externa ou a um

sistema de FIA não devem ser considerados como sensores. Idealmente, um sensor

químico deverá ser mais barato e versátil do que os tradicionais aparelhos analíticos

mais complexos. Adicionalmente, a definição da IUPAC não considera outras formas

importantes de transdução do sinal biológico – piezelétrica, acústica, ótica, etc. -, ainda

que o sinal do transdutor seja sempre convertido, no final, num sinal elétrico (Cammann

et al., 1991; Spichiger-Keller, 1998). Por estes motivos, foi proposta recentemente pela

IUPAC uma definição mais abrangente: “Um sensor químico é um aparelho que

transforma informação química, desde a concentração de um componente específico na

amostra até à análise da composição total, num sinal analiticamente útil”. Uma outra

discussão conceptual clássica refere-se à distinção entre sensor químico e transdutor

físico. Segundo alguns autores, um transdutor físico é um aparelho que monitora a

variação de uma propriedade física particular no ambiente em seu redor através de um

sinal eletrônico. Nesta categoria incluem-se, por exemplo, os aparelhos para medição de

temperatura (termômetros, termístores, etc.), cristais piezelétricos para medição de

pressão e medidores de densidade luminosa (fotodiodos, fotomultiplicadores, etc.). Um

sensor químico, por outro lado, pode conter um transdutor físico ou um eletrodo de

referência, mas as suas características de reconhecimento são geralmente determinadas

por outros elementos seletivos presentes no componente sensorial, tais como um filme

ou uma membrana seletiva. A composição e a forma deste elemento seletivo são

cruciais no desempenho do sensor, pois deles depende não só a seletividade, como

também a sensibilidade, estabilidade e tempo de resposta do sensor. De acordo com

9

estes pressupostos, um sensor químico pode definir-se como “um aparelho que fornece,

ao utilizador, informação sobre o seu ambiente; ele consiste num transdutor físico e

numa camada quimicamente seletiva” (Diamond, 1998), numa tentativa de salientar

tanto a natureza da amostra em teste como a do processo de reconhecimento. Esta é

também a problemática essencial na distinção entre um sensor químico e um biossensor.

Atualmente, a definição mais comum de biossensor enfatiza a natureza da espécie

envolvida no reconhecimento seletivo em detrimento da natureza da espécie sob

medição; assim sendo, um biossensor é qualquer aparelho de medida que incorpore uma

espécie biológica como parte essencial do processo de reconhecimento. Esta definição

permite incluir, na categoria de biossensor, muitos aparelhos analíticos atualmente em

desenvolvimento para aplicações não biológicas, e excluir as designadas biosondas, isto

é, todos os sensores ou transdutores que, embora detectem espécies de natureza

biológica ou espécies importantes em sistemas biológicos (exs.: eletrodos seletivos para

íons presentes em fluidos orgânicos), não possuem um componente biológico para o

reconhecimento (Diamond, 1998).

Para efeitos práticos, define-se aqui um biossensor como um aparelho analítico

compacto que converte uma resposta biológica, resultante de uma reação bioquímica

específica entre um elemento biológico imobilizado na superfície do sensor (por ligação

covalente ou não covalente) e o elemento biológico a detectar, num sinal elétrico

mensurável que é comparado com um sinal-padrão (referência) produzido por um

sistema similar, mas sem o biomaterial ativo; a diferença dos dois sinais é então

amplificada, processada, exibida visualmente e gravada (Walker & Gingold, 1993), tal

como esquematizado na figura 7.

Figura 7 - Principais etapas operacionais num biossensor: a) biocatálise (conversão de

substrato, S, em produto, P); b) transdução; c) amplificação; d) processamento; e)

exibição visual (retirado de www.pharmacon.us).

10

Os biossensores diferem dos equipamentos analíticos-padrão pelo seu propósito

muito específico de determinar uma única substância ou grupo de substâncias, pela sua

evolução tendencial no sentido da miniaturação e pelo fato de o resultado final ser uma

informação definitiva, isto é, que não carece de processamento adicional (Moses &

Cape, 1999). Um biossensor incorpora um elemento biológico de reconhecimento,

catalítico ou não (exs.: enzima, anticorpo, ácido nucléico, célula), associado a um

transdutor físico-químico, donde resulta um sinal elétrico discreto ou contínuo,

geralmente proporcional à concentração do analito específico (ou grupo de analitos) a

ser detectado. A especificidade dos biossensores de enzimas, por exemplo, é baseada na

grande especificidade da ação enzimática. O transdutor, por outro lado, deve responder

na escala de concentração desejada e num intervalo de tempo suficientemente rápido, de

até alguns minutos, e deve compensar internamente desvios na resposta causados por

fatores externos, como a temperatura (Sethi, 1994). A combinação física bem sucedida

do transdutor com o elemento biológico é conseguida por engenharia de superfícies, a

qual cria um `ambiente molecular` semelhante àquele em que o bioelemento opera em

condições fisiológicas (Sigrist & Gao, 1999). Os transdutores dos biossensores são

normalmente muito eficientes, ao contrário do desempenho modesto da maioria dos

componentes de reconhecimento molecular, devido ao seu curto tempo de vida ou à

complexidade do processo de geração do sinal (Spichiger-Keller, 1998). A conexão das

biomoléculas com os transdutores exige a retenção das propriedades físicas do material

transdutor em presença da biomolécula; além disso, a transdução do sinal deve manter-

se funcional no meio onde a biomolécula expressa a sua função biológica (Sigrist &

Gao, 1999). Além dos elementos de detecção e de transdução, os biossensores possuem

freqüentemente um dispositivo eletrônico a jusante do transdutor (por exemplo, um

conversor analógico-digital) para minimizar interferências eletromagnéticas externas ou

para fazer convergir simultaneamente sinais de vários sensores na mesma unidade de

processamento de dados (Camman et al., 1991).

Os primeiros biossensores começaram sendo fabricados há cerca de 40 anos e

consistiam em enzimas imobilizados em conjunção com um eletrodo de oxigênio ou de

pH; a reação era seguida pelo monitoramento do consumo de um substrato ou da

formação de um produto. De grande relevância eram os eletrodos de glicose oxidase e

de uréase para medição dos teores de, respectivamente, glicose e uréia. Após o início da

pesquisa e produção de biossensores com proteínas imobilizadas na sua superfície,

11

iniciou-se a sua miniaturação por imobilização em suportes de silício (litografia). A

investigação e fabricação de sensores planares em silício têm visado a produção de

aparelhos idênticos, com características reprodutíveis, de baixo custo e em larga escala

(Diamond, 1998). Uma das principais metas desta indústria é a fabricação de eletrodos à

base de tintas condutoras e pastas de carbono aplicadas por técnicas de impressão

screen-printing (Cabral et al., 2003). Com base na produção industrial em larga escala

de chips (circuitos integrados) de silício, têm-se intensificado a pesquisa e a produção

de biochips (também designados por arrays) (Dittrich et al., 2006) que, essencialmente,

diferem dos chips convencionais por possuírem biomoléculas manipuladas em vez de

condutores e isoladores inorgânicos e polímeros orgânicos, de modo a diminuir-se o

tamanho do chip. As proteínas, por exemplo, situam-se na escala nanométrica, centenas

de vezes menores do que a escala habitual dos materiais litográficos. Porém, existe um

limite mínimo de tamanho, definido pelas dimensões da biomolécula – ainda que, na

prática, o tamanho mínimo possível de um biossensor seja superior em várias ordens de

grandeza (Griffiths & Hall, 1993) -, para que a pastilha de silício funcione como um

circuito eletrônico. Sendo assim, as pesquisas subseqüentes têm incidido sobre a taxa de

transferência eletrônica entre moléculas com o fim de aumentar a velocidade de

propagação de informação. Relativamente aos chips microeletrônicos convencionais, os

biochips requerem controle da transferência de massa, ou seja, o acesso de analitos e

reagentes à superfície de biorreconhecimento do chip (Ruf et al., 2006). Biochips de

segunda geração deverão ser parte de futuros sistemas analíticos integrados e totalmente

automatizados em sistemas de fluxo para medições em tempo real (Bean, 2001).

1.2.2 Caracterização

Ainda que um biossensor ideal não exista realmente, uma vez que todos eles se

desviam mais ou menos da idealidade, é possível definir algumas características gerais

de idealidade, embora elas dependam grandemente da aplicação desejada. Uma das

características de um biossensor `ideal` é possuir elevada seletividade, conferida pelo

biomaterial ativo que lhe está associado; isto significa uma grande capacidade de

discriminar analitos diferentes, embora estes possam ser estruturalmente e

funcionalmente semelhantes. Possuir elevada seletividade significa afirmar que, embora

possam estar presentes em solução substâncias interferentes, a sua contribuição para o

12

sinal global é mínima (Spichiger-Keller, 1998). A seletividade de um biossensor pode

ser incrementada tanto por aumento da exclusividade de ligação entre o receptor

biológico e o transdutor, de modo a reduzir interferências indesejáveis, como pelo

desenvolvimento de novos receptores biológicos com diferentes e maiores afinidades. A

concepção de novos receptores baseados em biomoléculas, assim como uma maior

compreensão das interações moleculares que ocorrem na interface receptor / transdutor,

têm sido possibilitados por avanços nas técnicas computacionais de modelação (Turner,

1996). O bom desempenho de um biossensor requer, ao nível da superfície de

reconhecimento, alta concentração da biomolécula, baixa interação não específica e

estabilidade da camada biológica (Sigrist & Gao, 1999). O incremento da seletividade e

das capacidades de reconhecimento do biossensor depende fortemente do conhecimento

fundamental da relação estrutura / função dos biomateriais (Willner & Willner, 2001).

Em teoria, um biossensor é capaz de detectar um tipo particular de molécula em

solução, mesmo quando outras substâncias estão presentes em concentrações

significativamente superiores (Walker & Gingold, 1993). A seletividade dos

biossensores pode ainda ser aumentada por inclusão das etapas de purificação e de

modificações químicas no processo analítico, equiparando-se assim aos métodos e

aparelhos convencionais de análise. Deste modo, obtêm-se dispositivos miniaturados

portáteis e funcionalmente equivalentes a laboratórios químicos completos, passíveis de

serem utilizados in situ (Regnier et al., 1999). Estão atualmente em desenvolvimento

sistemas microfluídicos que integram, num único dispositivo miniaturado (de tipo

μTAS), todas as etapas básicas de um processo de análise química, com as vantagens de

baixo consumo de reagentes, pequeno volume necessário de amostra e produção de

arrays de biossensores para análise simultânea de múltiplos analitos (Regnier et al.,

1999; Sethi, 1994; Sigrist & Gao, 1999; Willner & Willner, 2001). As várias operações

analíticas integradas num biossensor miniaturado permitirão obter rápidos resultados

quando acopladas a análise computacional em tempo real (Sethi, 1994). Em geral, a

análise de misturas de substâncias por meio de um biossensor não requer prévia

separação dos seus componentes antes da detecção, embora micro-separações

cromatográficas ou eletroforéticas possam ser necessárias para analisar certas misturas

complexas (Regnier et al., 1999; Sethi, 1994). A miniaturação é também adequada para

medições in vivo, visto que é menos susceptível de interferir indesejavelmente na

estrutura e função dos organismos vivos. A viabilidade de monitoramento in vivo

prolongado, todavia, poderá estar limitada pela necessidade de esterilização e

13

manipulação asséptica do biossensor, pela toxicidade dos seus componentes e por

dificuldade de calibração, parcialmente relacionada com a biocompatibilidade entre o

aparelho e o material biológico. A especificidade é outra característica que um

biossensor ‘ideal’ deve possuir; é também uma medida da capacidade discriminatória de

um biossensor e caracteriza a capacidade única de uma biomolécula para gerar um sinal

ou mudança de sinal por interação com um substrato ou produto específico (Spichiger-

Keller, 1998).

A sensibilidade, que determina o limite de detecção do biossensor, deve também

ser maximizada. Apesar de, muitas vezes, a seletividade (ou a especificidade) e a

sensibilidade serem muito semelhantes às do biocatalizador livre, o biossensor

geralmente é preferido quando outras vantagens estão presentes, tais como grande

rapidez de resposta, elevada estabilidade e tempo de vida, capacidade de reutilização e

baixo custo. Em algumas aplicações – por exemplo, em tecnologia ambiental -, alta

seletividade e sensibilidade não são os principais requisitos, mas sim capacidade de

detectar classes de compostos químicos e concentrações-limite; a variedade de

substâncias poluentes em águas subterrâneas, por exemplo, tem tornado ineficientes os

biossensores para detecção de um único analito e, por isso, é urgente o aparecimento de

biossensores de mais largo espectro (Moses & Cape, 1999; Spichiger-Keller, 1998).

Genericamente, um biossensor deve ter um baixo tempo de resposta, o que possibilita a

sua aplicação em monitoramento e em detecção em tempo real. Adicionalmente, deve

possuir elevada estabilidade, tanto operacional como de armazenamento, o que depende

significativamente do método de imobilização físico ou químico escolhido para o

bioelemento (Cabral et al., 2003; Mulchandani & Bassi, 1995). Em particular, o

desenvolvimento dos biossensores enzimáticos, principalmente baseados em

oxidorredutases (peroxidases, oxidases e desidrogenases), tem sido limitado pela

instabilidade de muitas enzimas à temperatura ambiente de trabalho, mas a utilização de

enzimas estáveis a altas temperaturas, obtidas de microorganismos termofílicos, tem

solucionado parcialmente o problema (Luong et al., 1988). Ainda mais comuns são a

refrigeração e secagem no gelo, que possibilitam aumentar quase indefinidamente a

estabilidade das enzimas imobilizadas (Cammann et al., 1991). Os biossensores

baseados em organismos vivos intactos oferecem geralmente maior estabilidade do

elemento biológico do que os biossensores enzimáticos, porque dispensam as etapas de

extração e purificação das enzimas, causadoras de perda da sua atividade (Cammann et

al., 1991; Walker & Gingold, 1993). Além disso, outras substâncias necessárias para a

14

reação enzimática, tais como cofatores, não têm que ser adicionados, pois já estão

presentes nas células vivas, o que torna as células microbianas mais baratas. Elas são

também menos sujeitas a inibição e a variações de pH e de temperatura do que as

enzimas isoladas (Walker & Gingold, 1993). A potencial reutilização é uma vantagem

adicional, uma vez que as células podem ser continuamente realimentadas durante o seu

tempo de vida (Diamond, 1998). Estes biossensores têm, contudo, as desvantagens de

baixa seletividade, longos tempos de resposta causados pela alta resistência difusional

das membranas celular e subcelulares e maior tendência para libertação do bioelemento

(Diamond, 1998; Higgins et al., 1987; Moses & Cape, 1999; Walker & Gingold, 1993).

Uma abordagem mais recente no sentido de obter sensibilidades mais altas é a dos

biossensores baseados em receptores individuais ou estruturas receptoras de organismos

vivos imobilizados sobre o transdutor. Contrariamente aos biossensores enzimáticos,

que se baseiam em bioatividade, os biossensores baseados em receptores operam por

reconhecimento específico de um ligante pelo seu receptor (Diamond, 1998). Além de

maior sensibilidade, os biossensores baseados em receptores têm, relativamente aos

enzimáticos, a vantagem de menores tempos de resposta. As principais desvantagens

são o isolamento das moléculas receptoras e a sua instabilidade após a imobilização,

incluindo labilidade à temperatura ambiente (Cammann et al., 1991; Diamond, 1998).

Um biossensor deve ainda, se possível, ser passível de reutilização múltipla, o que,

além de diminuir o gasto de reagentes e conseqüentemente o custo de cada ensaio,

geralmente assegura maior reprodutibilidade dos resultados, ainda que biossensores

descartáveis, produzidos com base na tecnologia de microtransdutores eletrônicos,

permitam solucionar o problema típico da baixa estabilidade dos biossensores

(Cammann et al., 1991; Walker & Gingold, 1993). A experiência adquirida com

avaliação de qualidade em química clínica, relacionada com os diferentes níveis de

conhecimento entre os técnicos de saúde, sugere que resultados precisos, idênticos e

reprodutíveis entre diferentes laboratórios possam ser mais úteis do que resultados

exatos (Spichiger-Keller, 1998). Por outro lado, elevada estabilidade e capacidade de

reutilização permitem minimizar os custos de fabrico dos biossensores, particularmente

dos enzimáticos (Cabral et al., 2003). A dificuldade de reutilização tem sido um

problema recorrente em imunossensores, pois a elevada afinidade da ligação antígeno-

anticorpo não permite a sua separação após o evento de reconhecimento. Uma técnica

referida para o desenvolvimento de imunossensores reversíveis e reutilizáveis emprega,

sobre um transdutor eletroquímico ou piezelétrico (ver a secção 2), uma camada

15

antigênica de reconhecimento que, por fotoisomerização, muda de um estado com

propriedades antigênicas para outro estado sem essas propriedades, permitindo o

desligamento do anticorpo e a regeneração do antígeno ativo (Willner & Willner, 2001).

1.3 IMOBILIZAÇÃO DE BIOMOLÉCULAS EM SUPERFÍCIES

O processo de imobilização de biomoléculas em superfícies é fundamental para

a construção e especificidade dos biossensores. O desempenho de um biossensor

depende criticamente do modo e da eficiência da ligação do elemento biológico à sua

superfície (Sethi, 1994). A escolha do método de imobilização mais apropriado depende

fundamentalmente do bioelemento a ser imobilizado, da natureza da superfície sólida à

qual o bioelemento deve aderir e do mecanismo de transdução. Independentemente do

método de imobilização escolhido, devem ser tidos em conta alguns requisitos

fundamentais, entre os quais a necessidade de retenção da atividade, especificidade e

estabilidade da biomolécula após a imobilização, mesmo depois da reutilização e

armazenamento. São também exigidas simplicidade e elevada reprodutibilidade do

método de imobilização, visando inclusive a produção do biossensor em larga-escala.

Adicionalmente, devem ser minimizadas as ligações não-específicas e evitadas

condições-ambiente extremas (de pH, temperatura, etc.), embora biomoléculas mais

estáveis possam ser produzidas por modificação química ou genética e por organismos

extremófilos (Diamond, 1998). As ligações não-específicas, por outro lado, podem ser

minimizadas bloqueando a superfície do sensor, funcionalizada com a biomolécula, com

uma proteína, como a caseína ou a albumina de soro bovino, antes da ligação do analito

(Janshoff et al., 2000).

Uma das principais formas de imobilização utilizadas na construção de

biossensores é a ligação covalente, segundo a qual certos grupos químicos da

biomolécula a ser imobilizada, não essenciais para a sua atividade biológica, se ligam a

suportes ativados quimicamente. A ativação ocorre freqüentemente por silanização,

podendo os grupos funcionais assim introduzidos serem ligados à biomolécula

diretamente ou, indiretamente, através de um reagente que se ligue por ligações

cruzadas (por exemplo, o glutaraldeído). Os suportes podem ser polímeros, tanto

naturais como sintéticos, ou substâncias inorgânicas, como vidro, metais e cerâmicas.

Através de uma ligação covalente obtêm-se superfícies estáveis e resistentes a grandes

16

variações de pH, temperatura e força iônica, mas com significativa desnaturação e perda

de bioatividade devido à grande rigidez da ligação (Diamond, 1998; Moses & Cape,

1999).

A oclusão é outra estratégia de imobilização de biomoléculas, geralmente em

membranas ou matrizes de géis como a sílica-gel e a poliacrilamida. Estas substâncias

polimerizam por reações cruzadas, sendo assim capturada a biomolécula a imobilizar.

Este método oferece a vantagem de se poder controlar o grau de porosidade; os poros

devem permitir a difusão de substratos e produtos mas, simultaneamente, impedir a

perda da biomolécula, geralmente de elevada massa molecular (Sethi, 1994). Os géis de

poliacrilamida proporcionam elevada retenção da atividade enzimática. Em alternativa,

a polimerização pode ser induzida pelo próprio biossensor, ocorrendo junto à superfície

do eletrodo à medida que a biomolécula vai sendo ocluída, o que permite controlar a

espessura e a porosidade do filme. Outra forma de oclusão é através da formação do

filme por absorção da biomolécula a partir da solução; o filme assim formado é bastante

fino e uniforme (Moses & Cape, 1999).

A imobilização por adsorção física é simples e suave, mas pouco reprodutível e

confiável devido à facilidade de a biomolécula se libertar do sensor durante o

armazenamento em longo prazo, visto que as ligações geralmente são fracas e pouco

estáveis, o que depende muito de mudanças no pH, temperatura e força iônica. A fácil

desorção também é freqüente quando um excesso de biomoléculas forma múltiplas

camadas instáveis na superfície do sensor. A adsorção física tem sido utilizada sobre

suportes de alumina, argila, vidro e resinas de troca iônica. A adsorção química, mais

forte do que a física, ocorre freqüentemente com substâncias orgânicas hidrofóbicas

mais afins para o ambiente igualmente hidrofóbico da superfície de um eletrodo do que

para o ambiente hidrofílico hostil do seio de uma solução aquosa (Bard, 1983). A

adsorção não-específica, predominantemente causada por interações hidrofóbicas, pode

ser reduzida pela adição de detergentes (Uttenthaler et al., 1998).

A imobilização de biomoléculas pode ainda efetuar-se por interações biológicas

altamente específicas e fortes, tais como as conferidas por agentes bifuncionais

indutores de reações químicas intermoleculares cruzadas com suportes sólidos (exs.:

avidina / biotina), ou ligações como DNA-DNA, DNA-RNA, anticorpo-antígeno e

enzima-substrato.

As biomoléculas também podem ser imobilizadas em camadas de polímeros, por

simples imersão do eletrodo em solução do polímero, seguida de evaporação do

17

solvente (revestimento por imersão). As camadas poliméricas também se podem formar

por aplicação de um potencial elétrico sobre moléculas poliméricas pré-existentes

(eletrodeposição) ou sobre monômeros que, sob esse estímulo, são induzidos a

polimerizar junto à própria superfície do elétrodo (eletropolimerização), uma técnica

vantajosa por ocorrer à temperatura ambiente e por permitir um controle rigoroso da

espessura do filme polimérico imobilizado, variando apenas o potencial ou a corrente ao

longo do tempo (Gerard et al., 2002). Por outro lado, os próprios polímeros utilizados

podem ser eletroativos e participar em reações redox, ou podem ser eletrólitos que,

devido aos seus grupos iônicos, podem atrair substâncias ionizadas da solução,

imobilizando-as por atração eletrostática. As camadas de polímeros não eletroativas

também podem ser usadas para produzir eletrodos seletivos a determinada(s) espécie(s)

química(s), permitindo que apenas ela(s) chegue(m) à superfície do eletrodo (Bard,

1983). Neste caso, a sua espessura não deve ser muito grande, para permitir uma

eficiente transferência eletrônica. A exclusão seletiva de interferentes em elétrodos

seletivos baseia-se geralmente em propriedades moleculares como a carga, tamanho,

forma e polaridade. Atualmente, os eletrodos revestidos com polímeros são altamente

atrativos para o desenvolvimento de novos sensores mais específicos, não apenas por a

variedade de polímeros disponíveis permitir uma correspondente multiplicidade de

processos eletroquímicos, mas também pela possibilidade de construir sensores

tridimensionais (Diamond, 1998).

1.4 TRANSDUTORES

O transdutor é o aparelho eletrônico que, ligado a jusante do suporte de

imobilização de um biossensor, converte uma variação fisico-química provocada pela

reação biológica ou bioquímica, relacionada com um determinado tipo particular de

energia, num sinal que é comunicado ao detector.

Existem três tipos principais de transdutores com potencialidades para

aplicações comerciais: os eletroquímicos, os piezelétricos e os óticos. Cada tipo de

transdutor define, com o mesmo nome, o tipo particular de biossensor a que está

associado.

18

1.4.1 Transdutores piezelétricos

Alguns cristais, como o quartzo, podem polarizar-se por possuírem cargas

positivas e negativas que se separam quando ele é sujeito a um estresse mecânico,

estabelecendo-se um campo elétrico que provoca a vibração do cristal com uma

freqüência oscilatória fixa, a qual depende da composição, da espessura e do ângulo de

corte do cristal; este é o efeito piezelétrico. O princípio de funcionamento dos

biossensores piezelétricos baseia-se no fato de a freqüência de ressonância de um cristal

piezelétrico normalmente diminuir quando o analito se liga especificamente à molécula

imobilizada na superfície do cristal, provocando uma deformação mecânica (Sethi,

1994). Através da técnica de QCM, é possível medir pequenas diferenças de massa (na

ordem de ng/cm2) entre diferentes analitos (Walker & Gingold, 1993). A detecção

baseia-se na propagação de ondas acústicas no interior do cristal (BAW), em oposição

ao princípio de propagação de ondas acústicas ao longo da superfície (SAW), neste

último caso quando a oscilação do cristal se situa em freqüências muito altas,

geralmente entre 50 MHz e alguns GHz (Diamond, 1998; Janshoff et al., 2000). Nestes

sistemas, as interações moleculares são detectadas por registro de mudanças na

velocidade das ondas acústicas, predominantemente causadas por variações de massa ou

de viscosidade após ligação do analito (Sigrist & Gao, 1999). Apesar de os sistemas

BAW serem, em geral, menos sensíveis do que os sistemas SAW, são mais

habitualmente utilizados devido à sua robustez e à disponibilidade da eletrônica

(Janshoff et al., 2000). Em QCM (também designada por BAW ou TSM, atendendo ao

mecanismo de propagação das ondas acústicas), é utilizado um instrumento de medida

constituído basicamente por dois conjuntos de eletrodos metálicos, depositados sobre

ambas as superfícies circulares de um cristal de quartzo, na forma de um filme muito

fino, e conectados a dois contatos elétricos presos a um suporte de cerâmica (figura 8).

19

Figura 8 - Cristal de quartzo e respectivo suporte (retirado de www.tms.org).

A aplicação de um estímulo elétrico a um dos conjuntos de eletrodos gera uma

onda acústica que é recebida pelo outro conjunto de eletrodos no outro lado do cristal, a

alguns milímetros de distância, e convertida novamente num sinal elétrico. As variações

de freqüência são medidas em relação a um cristal de referência, tratado de modo

semelhante ao primeiro, mas sem o analito ligado. Um circuito oscilador excita o cristal

e mantém a oscilação (freqüência) característica – assim compensando as perdas de

energia -, sendo feita a medição da freqüência através de um contador de freqüência

(Silva, 2004). O modelo matemático mais conhecido para a relação massa / freqüência

num transdutor piezelétrico, em meio gasoso, baseia-se na equação de Sauerbrey

(Sauerbrey, 1959):

Δf = - 2.3 × 106 f02 Δm / a (equação 1).

Esta equação (em que f0 é a freqüência de ressonância do cristal, Δm é a massa do

material depositado na sua superfície e a é a área do cristal) prevê o aumento da

freqüência de ressonância do cristal com o aumento da massa da molécula que a ele se

liga. Todavia, numerosas interferências podem ocorrer num biossensor piezelétrico –

resultante de utilizar o transdutor piezelétrico em meio líquido -, nomeadamente por

efeito da viscosidade, densidade, temperatura e condutividade específica da solução sob

medida (Diamond, 1998; Walker & Gingold, 1993). Estes biossensores sofrem

principalmente de baixa sensibilidade e de ligações não específicas (Mulchandani &

Bassi, 1995). A manutenção da sensibilidade, da reprodutibilidade e da correlação

20

descrita pela equação de Sauerbrey exige meticulosas lavagens e secagens ao ar antes

do uso (Cammann et al., 1991). A equação de Sauerbrey não é válida com filmes

espessos e líquidos viscosos, uma séria limitação em muitas aplicações biológicas. Em

líquidos, de um modo geral, a freqüência de ressonância do cristal de quartzo em

solução é influenciada, por exemplo, pela força iônica e constante dielétrica do eletrólito

e pela rugosidade e hidrofilicidade da superfície; concretamente, superficies muito

rugosas e hidrofílicas facilitam a deposição de moléculas de líquido em pequenas

cavidades, contribuindo para a massa total detectada pelo transdutor (Janshoff et al.,

2000). A utilização de QCM em meios líquidos padece de alguns problemas,

nomeadamente a instabilidade da oscilação do cristal e os efeitos da viscosidade e

densidade do líquido (Damos et al., 2004). Isto acontece porque o movimento de

cisalhamento do cristal gera um fluxo plano-laminar no líquido próximo à interface,

causando uma diminuição da freqüência de oscilação do cristal de acordo com a

seguinte equação (Kanazawa & Gordon, 1985):

Af = - f0 3/2 (ρl ηl / π ρc μc) 1/2 (equação 2).

Nesta equação, ρl e ηl são, respectivamente, a densidade e a viscosidade do líquido, ρc é

densidade do cristal e μc é o módulo de cisalhamento do cristal – o quociente entre a

tensão de cisalhamento (força / área) aplicada ao cristal e a deformação específica nele

gerada. Ainda que esta equação não o preveja, outros fatores – incluindo a estrutura da

interface sólido / líquido, temperatura, caráter hidrofóbico / hidrofílico da superfície do

cristal, uniformidade do filme sobre o cristal e extensão da área do cristal em contato

com a solução influenciam a aplicação de QCM em fase líquida (Damos et al., 2004).

A QCM não parece apropriada para miniaturação, por necessitar de uma área reacional

relativamente grande; todavia, fornece dados importantes e fidedignos a nível cinético e

termodinâmico (Janshoff et al., 2000).

1.4.2 Transdutores óticos

Os biossensores óticos baseiam-se na alteração de propriedades óticas de

algumas substâncias em resposta à reação bioquímica para detecção do analito. Nestes

21

biossensores, um estímulo luminoso incide sobre a camada biológica imobilizada na

ponta, por exemplo, de uma fibra ótica, sendo depois monitorada uma propriedade ótica,

como a absorvância, fluorescência, atividade ótica ou luminescência (Walker &

Gingold, 1993). Depois de a luz incidir na amostra biológica, as moléculas da amostra

absorvem-na em determinados comprimentos de onda, dependendo do número e tipo de

moléculas presente; em seguida, é medido o espectro de luz dispersa ou que atravessa a

amostra, e comparado com um sinal de calibração, de modo a determinar a

concentração de analito. A intensidade do sinal obtido é freqüentemente proporcional à

quantidade de material biológico presente (Sethi, 1994). Muitas técnicas óticas detectam

o índice de refração (n) e a espessura do filme (d) ou, em alternativa, a espessura ótica

efetiva (nd) (Janshoff et al., 2000). Devido à baixa atenuação proporcionada pelas fibras

óticas, é possível a detecção de sinais remotos não elétricos em ambientes perigosos ou

sensíveis, in situ e in vivo (Diamond, 1998; Walker & Gingold, 1993). A natureza não

elétrica dos sistemas óticos confere-lhes importantes vantagens quando aplicados a

biossensores para aplicações médicas, industriais e militares. Os biossensores óticos

podem ainda responder a mais de um analito usando reagentes que absorvam ou emitam

a diferentes comprimentos de onda, ainda que os reagentes opticamente ativos que

utilizam sejam freqüentemente instáveis (Luong et al., 1988). Este tipo de biossensor

explora atualmente a alta qualidade de vários componentes óticos (exs.: fibras óticas,

lasers, detectores e conectores) empregues em tecnologia de comunicações (Diamond,

1998).

Vários biossensores óticos utilizam métodos de variação colorimétrica, de entre

os quais se destacam as tiras-teste utilizadas em numerosas aplicações comerciais; elas

consistem em tiras de papel ou de outro material absorvente impregnado com enzimas e

outros reagentes. A cor produzida é depois comparada com uma escala de cor pré-

existente, ou medida através de um medidor portátil de refletância. Uma das aplicações

mais conhecidas e utilizadas das tiras-teste é na determinação de glicose no sangue e

urina (Cabral et al., 2003; Walker & Gingold, 1993). Os biossensores óticos, contudo,

apresentam tipicamente problemas de interferência da luz ambiente, longos tempos de

resposta, libertação do reagente sob uso contínuo, baixa estabilidade da matriz de

imobilização e alto custo de manufatura e de reagentes, além da inerente complexidade

(Griffiths & Hall, 1993; Sethi, 1994).

22

Certos transdutores óticos têm suscitado ultimamente maior interesse científico e

comercial, geralmente os baseados no efeito de detecção de campo evanescente, em

especial a variante de SPR (figura 9).

Figura 9 - Funcionamento de um aparelho de SPR (retirado de www.fz-juelich.de).

Os biossensores baseados neste efeito são sensíveis a um parâmetro que

correlaciona a massa do analito com o índice de refração da luz que atravessa a fibra

(Diamond, 1998; Sigrist & Gao, 1999). Como a camada biológica de reconhecimento

tem freqüentemente uma massa bastante elevada, a ocorrência de um sinal por variação

de massa exige que o analito também tenha uma massa elevada, pelo que uma alta

sensibilidade está normalmente restrita a analitos tais como anticorpos, vírus e bactérias.

Novos sistemas baseados neste princípio permitem já detectar biomoléculas na gama de

picomolar (Sigrist & Gao, 1999).

A aplicação destes transdutores em biossensores tem ganhado relevância devido

às vantagens proporcionadas pelo desenvolvimento e miniaturação dos transdutores

optoeletrônicos e das fibras óticas, que são caracteristicamente flexíveis, pequenas,

descartáveis e baratas (Sethi, 1994). Como a luz para análise permanece confinada e é

totalmente conduzida no interior da fibra ótica, evita-se assim a necessidade de

equipamento ótico adicional, tornando mais facilmente exeqüível a miniaturação e a

fabricação de aparelhos óticos integrados, nos quais não só o elemento de

reconhecimento, mas também, por exemplo, a fonte luminosa, o detector e um array de

sensores estão espacialmente confinados num chip (Diamond, 1998; Spichiger-Keller,

1998). Em geral, as técnicas óticas são mais sensíveis do que a QCM, à qual são

freqüentemente comparadas, inclusive por requererem um sensor com menor área

superficial (Janshoff et al., 2000).

23

1.4.3 Transdutores eletroquímicos

Nos biossensores eletroquímicos, geralmente a variação de alguma grandeza

elétrica é correlacionada com a concentração de analito na amostra biológica. É deste

tipo a maioria dos transdutores usados em biossensores comerciais, o que está

certamente relacionado com as elevadas sensibilidade e seletividade e com a inerência

de equipamentos de medição mais simples do que os utilizados em outros tipos de

transdução, nomeadamente piezelétrica e ótica (Dutra, 1999). Baseiam-se na ocorrência

de processos redox durante a reação biológica ou bioquímica que define o evento

analítico na superfície do biossensor. A imersão de um eletrodo – a unidade transdutora

básica de um sensor eletroquímico – numa solução eletrolítica resulta na troca de

elétrons entre ele e o analito. O potencial da solução (E) é dado pela equação de Nernst

(Diamond, 1998),

E = E0 + [ R T ln ([Ox] / [Red]) / n F ] (equação 3),

sendo E0 o potencial formal do par redox, R a constante dos gases (8.314 J mol-1 K-1), T

a temperatura absoluta, n o número (constante) de elétrons transferidos na reação redox

elementar, F a constante de Faraday (96487 C mol-1) e [Ox] e [Red] as molaridades das

espécies oxidada e reduzida (respectivamente) do par redox. Na indústria farmacêutica,

em particular, os biossensores eletroquímicos têm sido empregues em vários estágios sa

pesquisa e produção de drogas, apesar da ainda insuficiente seletividade obtida e da

necessidade de pré-isolar a droga antes da sua quantificação. A seletividade, pelo menos

em parte, pode ser melhorada por escolha adequada do potencial a impor e por

utilização de membranas seletivas na superfície do eletrodo (Kauffmann & Viré, 1993).

A resposta de um biossensor eletroquímico é controlada cineticamente quando a

concentração da biomolécula é muito baixa, o que constitui uma limitação analítica na

medida em que as respostas máximas correspondem freqüentemente a concentrações

muito baixas. Quando o controle é difusional, não depende de pequenas variações na

concentração de enzima, mas é uma função da concentração do analito. Nestes

biossensores, além de parâmetros como o pH, temperatura e concentração de analito,

importa considerar parâmetros relativos à construção do eletrodo para o sinal de

resposta; neles incluem-se a concentração da biomolécula imobilizada, a espessura do

filme biológico e a membrana semipermeável que eventualmente envolva a biomolécula

24

imobilizada (Cabral et al., 2003; Diamond, 1998). A detecção eletroquímica é

geralmente adequada para imunoensaios de injeção de fluxo (Gübitz & Shellum, 1993).

Os principais tipos de transdutores eletroquímicos são os condutimétricos, os

potenciométricos e os amperométricos.

Num transdutor condutimétrico, é medida a variação de condutividade elétrica

que ocorre em muitos processos biológicos, provocada pela variação nas concentrações

de espécies iônicas em solução (Walker & Gingold, 1993). A condutividade é medida

por aplicação de uma corrente alternada entre dois eletrodos de metais nobres imersos

em solução, e fundamenta-se no fato de algumas reações enzimáticas gerarem produtos

eletricamente carregados a partir de substratos neutros (Griffiths & Hall, 1993). A

grande desvantagem da técnica é a falta de especificidade, pois a resistência da solução

é determinada pela migração de todos os íons presentes (Sethi, 1994). Na prática, a

condutividade de fundo das soluções biológicas, normalmente elevada e bastante

variável ao longo do tempo, torna a técnica muitas vezes demasiado insensível e

inviável para aplicações analíticas (Moses & Cape, 1999). O princípio de operação

envolve a aplicação de um campo elétrico ao longo de um par de microeletrodos

rodeados por uma solução eletrolítica contendo a enzima e as espécies a detectar. A

fabricação de um biossensor microeletrônico deste tipo requer as operações

normalmente envolvidas na produção de transistores e, adicionalmente, uma etapa de

deposição e imobilização da enzima, sendo o aparelho encapsulado numa resina ou num

filme polimérico. Um exemplo clássico de biossensor condutimétrico é aplicado à

determinação de uréia, também adaptado para detecção de multianalitos. Potenciais

aplicações deste biossensor são, por exemplo, em análise sanguínea in vitro, cirurgia

renal e monitoramento de diálises (Sethi, 1994; Walker & Gingold, 1993).

Os transdutores potenciométricos envolvem processos capacitivos, funcionando

segundo o princípio de acumulação de uma elevada densidade de carga junto à

superfície do eletrodo de trabalho, daí resultando uma elevada diferença de potencial em

relação ao eletrodo de referência, que é mantido a um potencial constante, com uma

corrente faradaica nula e uma corrente capacitiva constante. Basicamente, é medida a

diferença de potencial enquanto se fixa o valor da corrente. Nestas condições, a técnica

é não-destrutiva, pois não há consumo de analito (Griffiths & Hall, 1993). Num eletrodo

enzimático, a reação da enzima com o analito gera uma mudança no potencial devida à

acumulação ou depleção de íons (Mulchandani & Bassi, 1995). A diferença de potencial

gerada é proporcional ao logaritmo da atividade do íon-analito (Diamond, 1998;

25

Griffiths & Sethi, 1994; Hall, 1993; Luong et al., 1988). As variações na concentração

iônica que ocorrem em solução são medidas utilizando eletrodos seletivos a íons. Como,

em muitas reações bioquímicas, o íon hidrogênio é consumido ou gerado, um simples

eletrodo de pH pode ser usado para a sua medição potenciométrica (Walker & Gingold,

1993). O limite de detecção da técnica varia entre 10-6 M e 10-9 M (Spichiger-Keller,

1998). Os biossensores potenciométricos miniaturados são dispositivos de baixo custo e

produzidos em massa, baseados nos transistores ISFET, designando-se por transistores

ENFET; geralmente possuem uma membrana biocatalítica formada por uma fina

camada de um gel com a enzima imobilizada sobre a membrana seletiva para a espécie

sob medição. O efeito de substâncias interferentes pode ser significativo a ponto de

suprimir completamente a resposta do eletrodo (Diamond, 1998). O eletrodo de

referência é um ISFET idêntico, mas sem a membrana biocatalítica. Este tipo de

biossensor padece caracteristicamente de alguns problemas de sensibilidade,

estabilidade e tempo de resposta, além de forte dependência da capacidade

tamponizante da amostra. Porém, é apropriado para miniaturação e fabricação de um

array para multianálise de analitos diferentes. Alguns dos principais exemplos de

aplicação estão na determinação de uréia, penicilina, glicose, creatinina e acetilcolina

(Mulchandani & Bassi, 1995; Sethi, 1994).

Os transdutores amperométricos operam por aplicação de um potencial

constante entre os eletrodos de trabalho e de referência, sendo medida a corrente em

estado-estacionário resultante da reação redox do analito. O resultado é o decaimento da

corrente (i) ao longo do tempo (t), de acordo com a equação de Cottrell (Maloy, 1983),

i = n F A D1/2 C / (π t)1/2 (equação 4),

em que A é a área do eletrodo, D é o coeficiente de difusão característico do analito e C

é a sua concentração. Enquanto a potenciometria descreve o sistema eletroquímico no

equilíbrio (isto é, na ausência de corrente), a amperometria desloca esse equilíbrio e

relaciona o número de elétrons transferidos ao longo da interface eletrodo / solução com

a concentração do analito (Diamond, 1998). A partir da conhecida relação entre corrente

e carga elétricas,

Q = ∫ i dt (equação 5),

26

na qual Q representa a carga elétrica fluindo durante o intervalo de tempo elementar dt e

i a corrente variável resultante, e da 1ª Lei de Faraday,

Q = n F N (equação 6),

em que N é a quantidade de substância reduzida ou oxidada, deduz-se imediatamente

que

dN / dt = i / (n F) (equação 7)

e, portanto, que a corrente medida é proporcional ao consumo de analito ao longo do

tempo. Por outras palavras, a potenciometria mede a energia eletrônica e a

amperometria mede a velocidade da reação redox (Faulkner, 1983). A reação redox, no

biossensor, é mediada por uma determinada enzima redox imobilizada, e dela resultam

as espécies eletroativas detectáveis pelo método. As desidrogenases e as

oxidorredutases são enzimas particularmente usadas em biossensores amperométricos

porque a sua atividade catalítica está relacionada com transferência de elétrons. A

corrente gerada pelo potencial aplicado resulta de transferência eletrônica entre o

eletrodo de trabalho e a solução eletrolítica, e é diretamente proporcional à concentração

das espécies eletroativas, numa gama de detecção de 10-7 a 10-8 M (Sethi, 1994; Silva,

2004). Apesar disso, nem sempre a seletividade dada por um potencial constante

aplicado é suficiente para distinguir as diferentes espécies eletroativas presentes em

solução, pois outras espécies presentes podem sofrer reações redox ao mesmo potencial

que o analito. Alguns biossensores amperométricos comerciais têm solucionado este

problema recorrendo a membranas seletivas para eliminar espécies interferentes ou, em

alternativa, a mediadores de transferência eletrônica que, além de serem

eletroquimicamente reversíveis, diminuem o potencial de trabalho para minimizar a

ocorrência de reações redox indesejadas (Cammann, 1991; Diamond, 1998;

Mulchandani & Bassi, 1995). Derivados do ferroceno (figura 10) e das quinonas – de

que são exemplos o TCNQ e o ácido antraquinonamonossulfônico (Wong & Gooding,

2006) - são compostos muito usados para esse fim, embora os eletrodos que os contêm

tenham geralmente tempos de vida curtos e, conseqüentemente, não sejam adequados

para monitoramento contínuo de bioprocessos em longo prazo (Mulchandani & Bassi,

1995).

27

Figura 10 - Estrutura do ferroceno (retirado de de.wikipedia.org).

Num processo oxidativo, estes compostos bombeiam elétrons dos centros ativos

das enzimas para os eletrodos. Alguns sais orgânicos, no entanto, atuam transportando

elétrons no sentido inverso, ou seja, dos eletrodos para as enzimas. O efeito da

utilização de todos estes compostos é diminuir a distância para transferência de elétrons

e, assim, facilitar a comunicação entre os centros redox da biomolécula imobilizada e o

eletrodo (Willner & Willner, 2001). Uma nova geração de biossensores amperométricos

utiliza a transferência direta de elétrons entre a camada de reconhecimento e a superfície

do eletrodo através do correto posicionamento estereoquímico da biomolécula,

geralmente conseguido por adsorção direta da mesma na superfície do eletrodo. Deste

modo é possível superar as limitações impostas pelas grandes distâncias e conseqüente

baixa velocidade de transferência eletrônica entre as duas superfícies (Cabral et al.,

2003; Diamond, 1998).

De entre as principais técnicas amperométricas, destaca-se, pela sua larga

utilização e possibilidade de análise qualitativa, a voltametria cíclica, que consiste na

aplicação de uma rampa linear de potencial sucessivamente crescente e decrescente (ou

vice-versa). A voltametria, em geral, difere da coulometria pelo fato de, na segunda,

praticamente todo o analito ser convertido noutro estado redox (Skoog et al., 1998). Em

voltametria cíclica, o potencial de um eletrodo de trabalho - ou, mais rigorosamente, a

diferença entre o potencial variável de um eletrodo de trabalho e o potencial constante

de um eletrodo de referência (ver definições adiante) - é variado linearmente ao longo

do tempo e a corrente resultante é registrada, até que a oxidação ou a redução do analito

ocorra; após esse evento, a direção da varredura de potencial é invertida. O

aparecimento de bandas no voltamograma corresponde à ocorrência de reações redox

em gamas de potencial definidas (figura 11).

28

Figura 11 - Perfis eletroquímicos típicos de voltametria cíclica. Em cima: potencial

aplicado ao longo do tempo. Em baixo: corrente de resposta em função do potencial

aplicado (retirado de www.sg0.chem.upenn.edu).

Atendendo à proporcionalidade entre potencial (V) e tempo (t) e à equação 7,

vem

∫ i dE = n F N / k (equação 8),

com dE representando a variação elementar do potencial e k a constante de

proporcionalidade entre t e V. Isto significa, em suma, que as áreas integradas das

bandas redox resultantes são proporcionais à quantidade total da(s) substância(s)

eletroativa(s) entretanto gerada(s) ou consumida(s) na superfície do eletrodo. A

voltametria cíclica é particularmente útil, por exemplo, em detectar irreversibilidade

eletroquímica (caracterizada por uma grande diferença entre os potenciais dos picos de

oxidação e redução), assim como casos em que o produto da reação no eletrodo se perde

por via de uma reação química. Neste último caso, o pico de corrente da curva de

retorno (correspondente, por exemplo, à banda de redução) deverá ter menor

intensidade do que o pico homólogo da curva dianteira (correspondente, no mesmo

caso, à banda de oxidação) (Evans et al., 1983). A sensibilidade da técnica, contudo,

pode ser significativamente limitada pelo fenômeno de carga da dupla-camada,

29

resultante da presença e movimentação de íons do eletrólito junto à superfície dos

eletrodos (figura 12).

Figura 12 - Esquema da dupla-camada elétrica. (A) Na ausência de eletrólito, a queda

de potencial entre os dois eletrodos é linear. (B) Quando um eletrólito é adicionado,

forma-se uma bicamada junto à superfície de cada eletrodo; deste modo, a queda de

potencial acontece principalmente junto às bicamadas, assim minimizando a queda de

potencial no seio da solução, Vs (Vs = corrente que atravessa a solução, i × resistência da

solução, Rs) (adaptado de Diamond, 1998).

Como consequência, é gerada uma corrente adicional no circuito, de natureza

capacitiva, devida à variação gradual do potencial do eletrodo de trabalho. Esta corrente

interfere com a corrente total medida, adicionando-se à corrente faradaica que se

pretende medir; esta, por sua vez, está diretamente relacionada com a mudança do

estado de oxidação da(s) espécie(s) química(s) sob medição, ou seja, com a velocidade

da reação eletroquímica (que, por sua vez, depende da taxa de transferência das

substâncias eletroativas do seio da solução para o eletrodo, isto é, da transferência de

massa, e da taxa de transferência de elétrons entre o eletrodo e essas substâncias, isto é,

da transferência de carga) (Diamond, 1998; Maloy, 1983). A corrente de carga da dupla-

camada contribui mais significativamente para a corrente total nos primeiros instantes

após aplicação de um potencial porque decai mais depressa do que a última. Este fato

tem sido aproveitado em eletroanálise para, em instantes mais tardios, minimizar as

0V

1V 1V

0V

Eletrodo

Eletrodo

Eletrodo

Eletrodo

V

x

Solução Solução

(A) (B)

iRS

30

correntes capacitivas e, desse modo, atingir menores limites de detecção, através de

técnicas eletroquímicas de pulso. Em voltametria de pulso, após manutenção do

potencial num certo valor, este é instantaneamente aumentado (pulso de potencial) e

novamente mantido; ao fim de algum tempo, é medida a corrente (figura 13).

Figura 13 – Variações do potencial aplicado e da corrente de resposta ao longo do

tempo em voltametria de pulso (adaptado de Diamond, 1998).

Se este período de tempo entre a aplicação do pulso e a medição da corrente for

suficientemente longo para que a reação eletroquímica ocorra, a intensa corrente

capacitiva gerada pelo pulso decai para valores desprezíveis. Deste modo, praticamente

toda a corrente medida é faradaica e, portanto, correlacionada com a concentração do

analito (figura 14).

Corrente

Potencial

E0

0 •

Medição da corrente

E1

Tempo

31

Figura 14 – Decaimento temporal das correntes total (itotal) e de carga da dupla-camada

(idc) em voltametria de pulso (adaptado de Diamond, 1998).

No entanto, a maximização da sensibilidade (isto é, da razão corrente /

concentração de analito) exige que esse tempo não seja excessivamente longo, pois a

corrente medida também decai (embora mais lentamente do que a corrente capacitiva).

Deste modo, a elevada sensibilidade conseguida com voltametria de pulso requer a

escolha de um tempo de medição ótimo, nem muito curto, nem muito longo,

tipicamente na gama de dezenas a milhares de segundos (Osteryoung, 1983). Algumas

configurações mais comuns de voltametria de pulso incluem pulso diferencial (figura

15), pulso normal, em degrau e de onda quadrática (Diamond, 1998; Skoog et al.,

1998).

Tempo

Corrente

itotal

Idc

•

Medição da corrente

32

Figura 15 - Perfil de potencial aplicado ao longo do tempo em voltametria de pulso

diferencial (retirado de www.epsilon-web.net).

O equipamento para uma análise voltamétrica é composto basicamente por uma

célula eletroquímica e por um potenciostato. A célula eletroquímica (figura 16) é um

recipiente que contém a solução de eletrólito a analisar e é adaptado para a imersão de

três eletrodos: o eletrodo de trabalho, geralmente sólido, que mede o potencial das

espécies eletroativas em solução; o eletrodo de referência, geralmente de prata / cloreto

de prata (Ag/AgCl) (figura 17) ou SCE (Hg2Cl2/Hg), que deve possuir um potencial

estável com o tempo, temperatura e passagem de pequenas correntes, e em relação ao

qual é medido o potencial do eletrodo de trabalho; e o eletrodo auxiliar, que

normalmente consiste num condutor inerte (platina ou grafite), para completar o

circuito.

Figura 16 - Esquema de célula eletroquímica (retirado de chemistry.binghamton.edu).

33

Figura 17 - Esquema de um eletrodo de Ag/AgCl (retirado de www.ktf-split.hr).

Na solução eletrolítica (que também contém um eletrólito de suporte para a

tornar mais condutiva), a corrente flui entre os eletrodos de trabalho e auxiliar. O

potenciostato é um aparelho eletrônico que controla o potencial aplicado ao eletrodo de

trabalho e permite medir a corrente que o atravessa (Silva, 2004). Em eletrodos de fitas

(tiras), as correntes muito baixas que são geradas, por gerarem quedas ôhmicas muito

baixas, não distorcem o perfil voltamétrico medido, o que permite simplificar o

esquema de detecção, acoplando o eletrodo de referência ao auxiliar. Esta configuração

possibilita que os dois eletrodos utilizados – o de referência / auxiliar e o de trabalho –

possam ser dispostos muito proximamente e, deste modo, reduzir significativamente o

volume necessário de amostra (Turner et al., 1987). Este é também o caso dos

ultramicroeletrodos, de dimensões inferiores a, aproximadamente, 20 μm (Skoog et al.,

1998). A necessidade de utilizar um sensor de referência é comum às várias técnicas

eletroquímicas atrás descritas, o que limita a sua aplicabilidade in vivo, devido à típica

baixa estabilidade em longo prazo de eletrodos de referência; neste contexto particular,

a utilização de biossensores óticos é mais vantajosa, pois o seu sinal de comparação é

gerado com a mesma fonte de luz usada para a amostra (Spichiger-Keller, 1998).

Ainda que a maioria dos biossensores comerciais sejam eletrodos enzimáticos

amperométricos, o seu sucesso em áreas que exigem monitoramento contínuo tem sido

limitado pelo fato de o sinal depender fortemente da transferência de massa das espécies

eletroativas para a superfície do eletrodo, o que pode provocar saturação da superfície e

perda de sensibilidade (Griffiths & Hall, 1993). Não obstante, a sensibilidade inerente

às técnicas de potencial controlado, associada à tendência para o modo portátil e à

34

facilidade de fabricação de ultramicroeletrodos para medições em espaços exíguos,

torna os biossensores amperométricos muito promissores, por exemplo, para aplicações

biomédicas (Wang, 1999). O processo de polimerização oxidativa por via eletroquímica

(eletropolimerização; ver definição adiante) da molécula pirrólica contribuiu

grandemente para o desenvolvimento de biossensores amperométricos miniaturados

porque, durante a sua ocorrência, biocatalizadores e mediadores adicionados à mistura

de polimerização podem ficar retidos numa membrana junto à superfície do eletrodo,

em condições não desnaturantes, o que favorece a microfabricação de chips. No futuro,

as técnicas eletroquímicas e, em especial, as amperométricas, deverão beneficiar não só

da miniaturação da célula eletroquímica integrada num chip, mas também da fabricação

de potenciostatos integrados (Diamond, 1998). Ao contrário dos biossensores

potenciométricos, cuja sensibilidade e seletividade só podem ser aumentadas por

manipulação da camada que contém o bioelemento sensorial, os biossensores

amperométricos miniaturados podem ter a seletividade aumentada por escolha

apropriada do potencial do eletrodo de trabalho, e a sua sensibilidade também

aumentada por maximização das correntes faradaicas e minimização das correntes de

carga, aproveitando a minimização da capacitância proporcionada pelos microeletrodos

(Diamond, 1998; Sethi, 1994). No entanto, os biossensores amperométricos têm a

desvantagem de eventual formação de depósitos da molécula sob medição junto à

superfície do eletrodo, visto que uma parte do analito se consome durante a medição, o

que gera uma atenuação indesejada do sinal (Cammann, 1991). A tecnologia de filmes

finos permite fabricar eletrodos e microeletrodos de carbono, reconhecidos pela sua

elevada estabilidade e conseqüente eficiência em monitoramento de processos contínuos

(Sigrist & Gao, 1999). Devido às desvantagens inerentes ao clássico eletrodo de gota de

mercúrio e aos avanços alcançados em poderosas técnicas espectroscópicas, como a

espectroscopia de absorção atômica, a amperometria entrou em declínio e só

recentemente ressurgiu com o desenvolvimento de técnicas de medição de pulso e de

eletrodos modificados quimicamente (Diamond, 1998). Exemplos típicos deste tipo de

biossensor podem ser encontrados em vários aparelhos para medição de glicose e de

hipoxantina (Walker & Gingold, 1993).

35

1.5 ÁREAS DE APLICAÇÃO DOS BIOSSENSORES

Os biossensores são hoje usados correntemente em várias áreas científicas,

embora continue a haver uma discrepância muito significativa entre o elevado número

de artigos científicos publicados sobre o tema e a modesta quantidade de aplicações

comerciais. Para esse limitado sucesso comercial do mercado de biossensores contribui

certamente o baixo nível de cooperação interdisciplinar entre as várias áreas científicas

implicadas na tecnologia de fabricação de biossensores, nomeadamente a Bioquímica,

Microeletrônica, Engenharia de Superfícies e de Polímeros, Robótica e Automação, etc.

(Cammann et al., 1991). Paralelamente, a baixa estabilidade típica do bioelemento

imobilizado pode também dificultar o sucesso comercial dos biossensores, o que pode

ser ultrapassado com recurso ao armazenamento do biossensor sob refrigeração ou à

imobilização do bioelemento recorrendo a incorporação em membranas ou géis (Sethi,

1994). O sucesso da tecnologia de biossensores depende parcialmente da incorporação

de biomoléculas no método de fabricação dos mesmos, que é essencialmente o de um

aparelho microeletrônico. Em termos gerais, o comportamento das biomoléculas ligadas

a superfícies sólidas é ainda largamente incompreendido, embora as recentes técnicas de

AFM e STM já permitam obter imagens de biomoléculas adsorvidas em superfícies, em

escala de resolução próxima da atômica. Estas técnicas também se têm mostrado úteis,

em indústria microeletrônica, no controle da qualidade dos filmes de microeletrodos

depositados sobre os substratos imobilizados através, por exemplo, da técnica de

impressão por jacto de tinta (inkjet printing) (Diamond, 1998). Quando os biossensores

são reutilizados, o biomaterial pode desligar-se gradualmente ao longo das sucessivas

utilizações, comprometendo a integridade do sensor. Um outro problema é a freqüente

falta de uniformidade e de pureza aceitável da biomolécula purificada de algum

organismo vivo, responsável pela geração de resultados pouco reprodutíveis. O

desenvolvimento de biossensores está também freqüentemente limitado pela sua falta de

seletividade pois, apesar de a especificidade da reação bioquímica ser, por definição,

muito alta, interferências externas podem influenciar o sinal ao nível do transdutor.

Continuam por identificar setores de mercado que compensem os volumosos

investimentos feitos nas áreas de investigação, produção e comercialização de

biossensores, não tanto pela falta de conhecimentos dos mecanismos moleculares

implicados nos processos bioquímicos de reconhecimento, mas principalmente pela

ainda inexistência de uma tecnologia que permita a microfabricação dos mesmos a

36

preços competitivos e pela falta de um claro benefício de utilização por parte dos

usuários (Griffiths & Hall, 1993). O controle da futura expansão da tecnologia de

biossensores dependerá certamente de um equilíbrio entre, por um lado, as vantagens da

tecnologia e as oportunidades de mercado e, por outro, os obstáculos técnicos e

financeiros. Uma grande parte dos biossensores para várias aplicações é produzida

como alternativa às tiras-teste individuais, baratas e descartáveis, em vez de competir

com os complexos instrumentos analíticos de laboratório (Moses & Cape, 1999). Na

ausência, em curto prazo, de vastos mercados para os biossensores, as empresas que os

produzem deverão fabricá-los essencialmente para uso próprio e / ou para

comercialização em pequenos mas numerosos mercados afins. Genericamente, o

desenvolvimento futuro dos biossensores deverá passar pelo monitoramento contínuo e

imediato (on-line) de resultados e por monitoramento em regime de estreita

proximidade dos utilizadores (Griffiths & Hall, 1993). Vários setores de mercado já

utilizam biossensores rotineiramente, de entre os quais se destacam os que se seguem.

1.5.1 Monitoramento e controle de bioprocessos

As fermentações industriais, incluindo as alimentícias e farmacêuticas, exigem

monitoramento constante dos níveis de substrato, produto e biomassa microbiana, mas

os tradicionais métodos off-line são dispendiosos, demorados e sujeitos a contaminações

(Luong et al., 1988). O monitoramento on-line tem sido aplicado mais sistematicamente

em controle de fermentações, mas a inserção do biossensor dentro do biorreator (in situ)

cria alguns problemas, nomeadamente a dificuldade de calibração, de esterilização e a

baixa estabilidade do bioelemento (Keay & Wang, 1997; Moses & Cape, 1999;

Mulchandani & Bassi, 1995). A recalibração dos biossensores in situ não é possível

durante o processo, uma grande desvantagem devido à labilidade de muitos

componentes biológicos dos biossensores (que resulta na sua gradual inativação durante

todo o processo de monitoramento) e às variações na resposta do sensor em função das

variações na composição do meio de cultura. Esta sensibilidade às condições dos

bioprocessos é o motivo de os biossensores serem ainda usados preferencialmente ex

situ como detectores em sistemas FIA (Schügerl et al., 1996), cujo princípio de

funcionamento está indicado na figura 18.

37

Figura 18 - Princípio de funcionamento de um detector FIA. Depois de a amostra e o

reagente se misturarem e reagirem, os produtos resultantes são detectados oticamente ou

eletroquimicamente ao serem eluídos por um capilar (retirado de www.llnl.gov).

Processos de esterilização podem manter um biorreator livre de

microorganismos indesejados, mas também são susceptíveis de degradar as

biomoléculas lábeis do biossensor. Por conseqüência, muitas aplicações utilizam os

biossensores como aparelhos de fluxo off-line. Segundo este conceito, um pequeno

caudal de meio fermentativo flui continuamente do biorreator através de um tubo de

análise (detector) contendo um biossensor não esterilizado. O sinal do sistema – a altura

do pico – é proporcional à concentração da espécie sob medição, sendo a calibração

efetuada ao mudar a solução-teste que flui pelo tubo por uma solução de calibração; este

é o princípio da análise por FIA (Moses & Cape, 1999; Twork & Yacynych, 1990).

Grandes vantagens do FIA em análise on-line são a sua capacidade para autocalibração

automática e para miniaturação e a compatibilidade com uma interface para análise

computacional. O sistema FIA permite ainda obter um baixo tempo de resposta e

utilização do sinal-controle por retroação, além de exigir somente pequenas quantidades

de amostra para análise e de reagentes, com implicações vantajosas nos custos

operacionais (Keay & Wang, 1997; Mulchandani & Bassi 1995; Ružička, 1992; Twork

& Yacynych, 1990). Em contrapartida, podem surgir problemas derivados de rejeição

do analito por contínua obstrução e mudança de tamanho dos poros da membrana,

contaminação microbiana da membrana, necessidade de diluição da amostra,

aparecimento de bolhas de oxigênio na solução e necessidade de recalibrações

contínuas. Apesar de o sistema FIA ser a técnica mais usada para integrar biossensores

com biorreatores, a sua aceitação é mais consensual para culturas de células de

38

mamíferos e plantas do que para fermentações microbianas, estas últimas mais rápidas e

exigindo a recente tecnologia de arrays de sensores para detecção simultânea de vários

analitos (Mulchandani & Bassi, 1995). Mais recentemente, técnicas de análise de

injeção seqüencial, derivadas do sistema FIA, oferecem vantagens adicionais em

monitoramento de bioprocessos (Cladera et al., 1995). Por outro lado, a análise on-line

apresenta vantagens em monitoramentos freqüentes de culturas, nomeadamente menor

necessidade de mão-de-obra do que em análise off-line e a conseqüente diminuição de

custos (Pol et al., 1996). A tecnologia de biossensores possibilita a realização de

medições contínuas, rigorosas e em tempo real, de substratos e metabólitos não-voláteis,

o que permite aplicar ações corretivas quando necessário, otimizar processos

fermentativos e minimizar o consumo de reagentes dispendiosos (Cammann, 1991;

Mulchandani, 1995). Isto é especialmente importante em fermentações industriais com

culturas de células bacterianas e eucarióticas dispendiosas e delicadas, de modo a

minimizar os custos de produção. Na indústria alimentícia, em particular, a produção de

alimentos e o controle da sua qualidade exigem geralmente o conhecimento da sua

composição química, estado de conservação e contaminação microbiana (Luong et al.,

1988). Exemplos importantes de aplicação de biossensores nesta área incluem a

determinação de glicose em vinho e refrigerantes e a determinação de hipoxantina no

peixe, como medida do seu estado de conservação (Cammann et al., 1991).

1.5.2 Monitoramento ambiental / Guerra química e biológica

Uma grande parte da investigação e desenvolvimento de métodos sensíveis de

detecção e controle de níveis de poluentes na área ambiental tem-se efetuado

recentemente por pressão de legislações restritivas (Moses & Cape, 1999). Estas áreas

caracterizam-se pela necessidade comum de determinação de poluentes no ar, solo, água

e efluentes, tais como pesticidas, herbicidas, fertilizantes, PCBs, dioxinas, metais

pesados e vários microorganismos, incluindo agentes patogênicos potencialmente

aplicáveis em situações de terrorismo e guerra biológica e química (Cammann et al.,

1991; Luong et al., 1988; Sethi, 1994). Aplicações vantajosas de biossensores de

microorganismos inteiros são esperadas em monitoramento ambiental da água, de que é

exemplo a medição de BOD (Diamond, 1998; Moses & Cape, 1999). A detecção de

bactérias em solução, por exemplo, é baseada geralmente na ligação específica de um

39

anticorpo imobilizado na superfície do sensor a um antígeno da superfície da célula

bacteriana (Janshoff et al., 2000). Devido à complexidade da interacção de células com

anticorpos e à sua correlação com o sinal medido, tem-se modelado a adesão de células

em superfícies usando vesículas lipídicas dopadas com receptores, para interagir com

ligantes imobilizados (Yun et al., 1998). Os biossensores para detecção e

monitoramento de agentes biológicos e químicos perigosos começam sendo

freqüentemente utilizados para medições em tempo real (Cabral et al., 2003). A vasta

utilização do sistema FIA para uso em monitoramento ambiental deve-se à sua

capacidade para analisar muitas amostras e à facilidade de adaptação a diferentes tipos

de analisadores, havendo a tendência para o desenvolvimento de sistemas FIA portáteis

e automatizados para análises on-line, especialmente da qualidade da água (Keay &

Wang, 1997).

1.5.3 Agricultura e veterinária

A expansão da tecnologia de biossensores nesta área dependerá de avanços

primordiais na área de cuidados de saúde humanos. Atualmente, existe já um grande

mercado potencial nesta área, especialmente no diagnóstico de várias afecções em

animais, com previsível utilização de novos métodos de diagnóstico por pessoas não

especializadas (Sethi, 1994).

1.5.4 Diagnóstico clínico

O mercado de análises e diagnósticos clínicos é atualmente o maior alvo de

investigação e produção de biossensores, representando mais de 50% do mercado

mundial (Cabral et al., 2003; Walker & Gingold, 1993). Além da sua já conhecida

utilização em análises clínicas à urina e ao sangue para medição in vivo e in vitro de

vários analitos (H+, oxigênio, sódio, uréia, etc.), algumas das maiores aplicações futuras

são esperadas no diagnóstico do câncer, doenças genéticas, doenças infecciosas e de

determinadas substâncias em situações de emergência clínica, como a glicose, lactato,

creatinina, uréia e várias enzimas de importância clínica (Luong et al., 1988).

40

Em geral, os equipamentos analíticos de laboratórios centrais já permitem

realizar muitos diagnósticos e análises clínicas rápidas, precisas, confiáveis e de fácil

utilização por pessoal especializado. A estes requisitos, os biossensores permitem, em

teoria, acrescentar algumas vantagens, tais como: baixo custo; desnecessidade genérica

de tratamento prévio das amostras biológicas; possibilidade de operação fora dos

centros de diagnóstico, por pessoal não especializado, e, até, no âmbito domiciliar, pelo

próprio paciente; e capacidade de monitoramento contínuo do nível de várias

substâncias de interesse clínico (Luong et al., 1988). É de esperar que seja nos cuidados

de saúde intensivos e pontuais, ao nível individual, que os biossensores sejam utilizados

de forma mais generalizada (Wang, 1999). A miniaturação tendencial dos biossensores

também abre caminho ao diagnóstico descentralizado, com enorme diminuição do

intervalo de tempo entre a coleta da amostra e a decisão terapêutica para somente alguns

minutos, em contraste com a escala de tempo de horas em química clínica tradicional.

Contrariamente ao que acontece em controle de bioprocessos, em que geralmente a

resposta resulta de variações da concentração de analito, o propósito fundamental em

diagnósticos clínicos é determinar se essa concentração está acima ou abaixo de um

valor pré-fixado (Walker & Gingold, 1993).

Até agora, a tecnologia de biossensores em diagnóstico clínico não tem tido

ainda a difusão comercial que as suas potencialidades e vantagens prometem, em parte

porque existe uma forte corrente de opinião contra a realização de medições químicas

em muitos consultórios médicos por pessoal não treinado, e a favor dos aparelhos

analíticos multifuncionais existentes em grandes laboratórios clínicos (Regnier et al.,

1999). Além disso, de entre a vasta gama de patologias humanas, só a medição de

glicemia para controle da diabetes reúne as duas principais condições que garantem um

grande e imediato sucesso comercial: a existência de um imenso mercado-alvo e a

necessidade de vários monitoramentos constantes e diários. Alguns métodos correntes

para medição de glicemia baseiam-se em variações colorimétricas, uma enorme

desvantagem para muitos diabéticos que, tradicionalmente, têm sérios problemas de

visão. Em conseqüência, biossensores baseados noutros métodos são urgentemente

necessários no mercado (Moses & Cape, 1999). Ainda que seja um aspecto

freqüentemente subestimado, a predominância de métodos invasivos de coleta de

amostra biológica – geralmente sangue – não tem constituído uma vantagem em relação

aos convencionais e bem estabelecidos métodos laboratoriais de análise e diagnóstico. O

desenvolvimento e a aplicação de biossensores para medição de metabólitos em fluídos

41

biológicos que não requeiram métodos invasivos de coleta, tais como saliva ou suor,

facilitam uma coleta mais freqüente da amostra e com menos traumas físicos para o

paciente; isto é especialmente importante em pacientes que necessitem de coletas

diárias, como é o caso dos diabéticos, e / ou com problemas na coleta de sangue, como

os hemofílicos e os recém-nascidos (Guilbault & Palleschi, 1995).

Os biossensores para análises e diagnósticos clínicos podem ser pequenos

aparelhos portáteis na forma de, por exemplo, uma caneta ou um cartão de crédito com

um painel para exibição dos resultados em formato digital (figura 19).

Figura 19 – Lado esquerdo: vários formatos de biossensores comerciais para

determinação de glucose. Lado direito: como eram exclusivamente realizados os

diagnósticos clínicos antes do surgimento dos biossensores – num laboratório

(retirado de www.chemsoc.org).

Para utilização em laboratórios clínicos, os biossensores são tipicamente

maiores, e a realização de análises com sangue não diluído, além de ser mais rápida,

permite evitar erros de pipetagem e diluição, assim como efetuar medições mais

próximas da situação que ocorre in vivo do que quando se analisa soro ou plasma

(Moses & Cape, 1999). A utilização de biossensores pelos próprios pacientes é ainda

controversa entre os técnicos de saúde em patologias e situações graves de saúde, de

que são exemplos o câncer, viroses e a medição de analitos como o colesterol, mas já é

comumente aceite, por exemplo, em testes domiciliares para gravidez, alcoolismo e

pequenas alergias (Griffiths & Hall, 1993; Walker & Gingold, 1993). Vários temas de

química clínica constituem oportunidades promissoras para a tecnologia de

biossensores, nomeadamente o monitoramento de drogas terapêuticas, a determinação

rápida da glicemia, os testes de susceptibilidade a antibióticos, a identificação de

42

leucócitos em doentes com câncer, AIDS e hepatites, os testes virais, etc. (Sethi, 1994).

A formulação e reforço do cumprimento de recentes legislações impondo rigorosos

padrões de controle de qualidade em análises clínicas (à semelhança do que acontece

em vigilância ambiental) deverá dificultar, futuramente, a introdução de novos

biossensores baratos no mercado, embora possa consolidar e ampliar a utilização de

biossensores já estabelecidos e mais competitivos (Walker & Gingold, 1993). Também

a aplicação do sistema FIA em química clínica não tem sido bem sucedida, devido ao

fato de as análises clínicas geralmente exigirem a realização de várias determinações

diferentes em cada amostra (Keay & Wang, 1997).

1.6 BIOSSENSORES DE DNA

Os métodos convencionais para análise de seqüências genômicas específicas

incluem seqüenciamento direto de ácidos nucléicos ou hibridização, sendo esta mais

rotineiramente usada em laboratórios de diagnóstico devido à sua maior simplicidade

(Pividori et al., 2000). Tal como acontece in vivo, a hibridização de ácidos nucléicos na

superfície de um transdutor (suporte sólido) é tanto mais forte e específica quanto maior

for o grau de complementaridade entre as bases das duas cadeias que se ligam. A

especificidade e a estabilidade dessa ligação são máximas quando as duas cadeias são

perfeitamente complementares. Os mecanismos moleculares da hibridização sobre

suportes sólidos, porém, ainda são relativamente desconhecidos e dificilmente

previsíveis, devido à carência de métodos para o seu monitoramento contínuo e à

dificuldade de estimar a exata concentração de ácido nucléico imobilizado. Mesmo

assim, geralmente assume-se que as etapas importantes que ocorrem na interface sólido

/ líquido são a difusão da solução para a superfície do sensor e, nesta, difusão

bidimensional, adsorção e desorção (Chan et al., 1997). Alguns estudos teóricos,

incluindo análise fractal, têm tentado estimar parâmetros relativos, por exemplo, à

cinética de hibridização (Sadana & Vo-Dinh, 1998). Ainda que se assuma a semelhança

dos processos de hibridização em solução e em suporte sólido, a velocidade de

hibridização no segundo caso é normalmente várias dezenas de vezes inferior, para

condições e sequências de DNA idênticas (Gao et al., 2006). A menor eficiência da

hibridização em suporte sólido deve-se, em grande parte, à indisponibilidade para

hibridizar de vários grupos da cadeia imobilizada, por estarem envolvidos nesse

43

processo de ligação à superfície do transdutor. A velocidade de hibridização também

diminui com o aumento do grau da estrutura secundária de uma ou das duas cadeias,

tanto em fase líquida como em solução. Além disso, o mecanismo de hibridização entre

cadeias de DNA com extensas estruturas secundárias é mais complexo do que o descrito

pelo modelo tradicional dos dois-estados (Gao et al., 2006). Tal como acontece em

solução, a hibridização interfacial em fase sólida requer otimização das condições

ambientais, tais como a força iônica e a temperatura (Wang, 2000). A obtenção de altas

sensibilidade e seletividade requer maximização da eficiência de hibridização e

minimização da adsorção não específica (Wang, 2002). O grupo de Wang, trabalhando

com eletrodos de discos de carbono (Wang et al., 1997a), avançou algo mais na redução

da adsorção não específica em hibridização de ácidos nucléicos, ao revestir os eletrodos

com uma membrana semipermeável a oligonucleotídeos e capaz de, in situ, os

selecionar e separar de acordo com o seu tamanho, o que é especialmente relevante em

amostras biológicas contendo grandes fragmentos de ácidos nucléicos celulares de

tamanhos muito diversos. A hibridização de DNA ocorre geralmente entre uma

seqüência conhecida (sonda) e uma seqüência desconhecida (alvo), podendo também

ocorrer hibridização do tipo DNA-RNA ou RNA-RNA (Junhui et al., 1997). As sondas

de DNA podem ser produzidas por um método químico, adicionando monômeros

nucleotídicos a uma cadeia crescente imobilizada num suporte sólido, ou por métodos

de biologia molecular. Neste caso, uma abordagem possível é isolar um determinado

mRNA de células que o produzam em abundância e, depois, produzir a sonda de DNA a

partir dele por transcrição reversa; outra opção é inferir a seqüência de DNA pretendida

a partir da seqüência de aminoácidos da proteína expressa por esse DNA, embora a

validade desta estratégia esteja limitada pela degenerescência do código genético

(Diamond, 1998). A hibridização de ácidos nucléicos em formatos tradicionais, como a

eletroforese em gel e em membrana (southern), é geralmente muito lenta e laboriosa

(Wang, 2002). A hibridização é também o evento de reconhecimento biomolecular

inerente à maior parte dos biossensores de DNA (genossensores) mas, neste caso,

ocorre diretamente sobre a superfície de um transdutor (Vercoutere & Akeson, 2002). O

princípio de detecção está representado na figura 20.

44

Figura 20 - Esquema genérico de um biossensor de DNA. A hibridização de uma

cadeia-alvo com uma cadeia-sonda imobilizada numa superfície transdutora gera um

sinal elétrico específico que é depois medido (retirado de www.nature.com).

Deste modo, o próprio DNA (mais especificamente, a cadeia imobilizada), na

função de receptor, é uma parte do próprio biossensor. Ao contrário de enzimas e

anticorpos, os ácidos nucléicos formam camadas de reconhecimento biológico

facilmente sintetizáveis em laboratório, altamente estáveis e reutilizáveis após ruptura, a

alta temperatura, da ligação entre as duas cadeias de DNA ligadas (Wang, 2000). Neste

sentido, oligonucleotídeos sintéticos curtos são freqüentemente preferidos como os

bioelementos ativos em genossensores, pelo fato de, neles, não ocorrerem as típicas

mudanças conformacionais complexas que diminuem a velocidade, eficiência e

seletividade da hibridização em polinucleotídeos ou DNA genômico. O diagnóstico de

doenças infecciosas com biossensores de DNA possibilita detectar estirpes diferentes de

um determinado microorganismo patogênico por escolha apropriada de sondas de DNA

específicas para cada estirpe; em alternativa, também permite detectar o patôgeno com

uma única sonda de DNA independentemente da sua estirpe pois, de acordo com a

biologia evolutiva, se considera que todas as estirpes de uma mesma espécie possuem

regiões genômicas com seqüências comuns. Os biossensores de DNA para diagnóstico

são, neste aspecto, comparativamente vantajosos em relação aos biossensores de

anticorpos (imunossensores), limitados na distinção de diferentes estirpes da mesma

espécie patogênica. Particularmente em relação a infecções virais, uma vantagem

adicional dos genossensores é a possibilidade de diagnóstico precoce através de simples

identificação dos genes virais com sondas de DNA, atendendo a que os imunossensores

requerem alguns dias desde o início da infecção para que os anticorpos específicos

45

sejam produzidos e possam ser detectados (Diamond, 1998). Um dos propósitos do

desenvolvimento e produção de biossensores é detectar DNA autonomamente e com

alta sensibilidade mas, por enquanto, a presença de ácidos nucléicos em concentrações

muito baixas nos fluídos biológicos exige geralmente prévia amplificação por PCR até

níveis detectáveis pelo biossensor (Junhui et al., 1997). Esta etapa, todavia, pode ser

incorporada em modernos sistemas microfluídicos de análise (também designados

microssistemas de análise total, μTAS, ou sistemas lab-on-a-chip) (Dittrich et al.,

2006) que, adicionalmente, possibilitam que o evento de hibridização ocorra em fase

líquida em vez de numa superfície sólida, em condições similares às do microambiente

in vivo (figura 21). Apesar disso, continua a ser um objetivo primordial dos chips de

DNA a eliminação da etapa e da necessidade da PCR, embora tal ainda não tenha sido

conseguido na generalidade dos dispositivos disponíveis comercialmente (Kerman et

al., 2004a).

Figura 21 - Biossensor em formato microfluídico para detecção de hibridização de

DNA (retirado de www.aist.go.jp).

A detecção do evento de hibridização de duas cadeias de DNA freqüentemente

faz-se por associação da cadeia-alvo a um indicador ou marcador de hibridização,

embora outras alterações no sistema possam também ser medidas (Wang, 2000). Foi

demonstrado (Steel et al., 1999) que a interação de cátions moleculares com ácidos

nucléicos, atuando como indicadores de hibridização por via de atração eletrostática,

não é afetada pela imobilização dos últimos em superfícies sólidas. Como a constante de

46

ligação das duas cadeias é alta, o limite de detecção do marcador é geralmente o fator

limitante da velocidade de hibridização. O marcador não se deve ligar ao alvo em locais

envolvidos nas ligações de hidrogênio para não obstruir a ligação à sonda e não deve

diminuir a temperatura de fusão (Tm) de modo a não alterar as características da

hibridização. Na prática, porém, muitos marcadores têm grupos que se ligam a cadeias

simples de DNA por ligações de hidrogênio, mas em percentagem suficientemente

baixa para não alterar a estabilidade da hibridização (Diamond, 1998). A marcação de

sondas de DNA iniciou-se com marcadores radioativos. Devido ao imenso risco

biológico associado, novos tipos de marcação de DNA para utilização em biossensores

têm sido entretanto desenvolvidos.

Abaixo é feita uma revisão de literatura relevante existente sobre biossensores de

DNA baseados na hibridização de ácidos nucléicos.

1.6.1 Biossensores de DNA com transdução ótica

Muitos biossensores óticos de DNA utilizam uma fibra ótica para transmitir o

sinal emitido por um marcador fluorescente. Em geral, uma sonda de DNA em cadeia

simples é colocada na extremidade da fibra e, após hibridização com a cadeia

complementar, são medidas alterações na fluorescência resultantes da associação

seletiva do DNA de cadeia dupla a um marcador fluorescente. O grupo de Piunno

(Piunno et al., 1994; Piunno et al., 1995) utilizou brometo de etídeo, que se intercala

fortemente entre as bases de DNA de cadeia dupla e nos sulcos maiores da dupla hélice,

como indicador de fluorescência; a intensidade de fluorescência, medida pela reflexão

interna total na fibra ótica revestida pela sonda de DNA, é diretamente proporcional à

quantidade de brometo de etídeo intercalado no DNA. O biossensor manteve-se ativo

mesmo após armazenamento prolongado e lavagens agressivas. Com outros indicadores

fluorescentes (ex.: PicoGreen), obtiveram-se limites de detecção muito baixos, na

ordem de femtomolar. A sensibilidade conseguida com brometo de etídeo, contudo, não

é muito alta em comparação com a obtida por PCR ou em ensaios convencionais de

hibridização de ácidos nucléicos, além de o seu potencial cancerígeno ser muito

elevado. Estes fatos têm motivado a procura de substitutos do brometo de etídeo (Junhui

et al., 1997). Fergusson e colaboradores (Fergusson et al., 1996) desenvolveram um

biossensor de fibra ótica em array para detecção simultânea de múltiplas seqüências de

47

DNA por meio de oligonucleotídeos complementares ligados a um marcador

fluorescente, registrando o aumento da fluorescência após a hibridização. Outra forma

de detectar a hibridização de DNA por fluorimetria baseia-se na utilização de grampos

de DNA - oligonucleotídeos de cadeia simples em forma de grampo de cabelo, com as

extremidades próximas uma da outra e formando uma alça no meio (stem-and-loop);

uma das extremidades é marcada com um fluoróforo e a outra com um extintor de

fluorescência (quencher). Quando as duas extremidades se linearizam e portanto se

afastam após hibridização com uma cadeia complementar, o sistema passa a emitir

fluorescência (Fang et al., 1999). Com estas sondas de grampos de DNA conseguem-se

elevadas especificidade e sensibilidade, sendo possível distinguir diferenças de um

único nucleotídeo entre duas cadeias-alvo diferentes, na gama de picomolar (Liu et al.,

2000). Num outro trabalho (Steemers et al., 2000), microesferas revestidas com uma

sonda de DNA ligam-se individualmente a pontas de um feixe de fibras óticas

(microarray ótico) e são depois identificadas usando combinações de marcadores

fluorescentes. Biossensores semelhantes conseguem atingir limites de detecção na

ordem de zeptomolar. Segundo um outro tipo de transdução ótica, usando um espelho

de ressonância de ondas evanescentes (Watts et al., 1995), sondas de DNA biotiniladas

foram imobilizadas na superfície de um transdutor por meio de estreptavidina, e a

hibridização da seqüência complementar monitorada em tempo real; a detecção baseou-

se na variação de uma propriedade ótica – índice de refração interfacial (e

conseqüentemente do ângulo de ressonância) – após a hibridização. Esta técnica

também permitiu detectar uma concentração de oligonucleotídeo na ordem de

nanomolar (Junhui et al., 1997). Biossensores deste tipo também têm sido utilizados

com o objetivo de detectar mutações genéticas humanas (Feriotto et al., 2001) e

produtos de PCR de organismos modificados geneticamente, na ordem de nanomolar

(Feriotto et al., 2002; Mariotti et al., 2002).

De entre os sistemas comercialmente disponíveis baseados na técnica de SPR, o

mais usado é o biossensor BIAcore, da Pharmacia Biosensor AB, para análise de

eventos biológicos em tempo real e em fluxo contínuo (Diamond, 1998). Este modelo

foi aplicado em detecção de DNA (Wood, 1993) por imobilização de uma sonda

biotinilada num chip previamente revestido com avidina. Num sistema de fluxo

contínuo sobre o chip (superfície do biossensor), inicialmente a sonda foi imobilizada

por complexação avidina-biotina e, depois, o alvo foi hibridizado. Além da alta

especificidade, este sistema permite que a hibridização ocorra em menos de 10 minutos

48

à temperatura ambiente (Diamond, 1998; Junhui et al., 1997). A técnica de SPR serviu

ainda de base para a otimização, em tempo real, de um sensor de DNA imobilizado

numa superfície de ouro previamente funcionalizada com polipirrol (Guedon et al.,

2000). Neste trabalho, visando a fabricação futura de chips de DNA, detectaram-se

simultaneamente vários eventos de hibridização através da técnica de electrospotting,

dispensando o uso de reagentes tiolados e de várias etapas para imobilização.

Recentemente, polímeros condutores têm sido cada vez mais usados para aplicação em

biossensores, por possuírem propriedades eletrônicas vantajosas, incluindo alta

afinidade eletrônica (figura 22).

Figura 22 - Mecanismo de transferência eletrônica em biossensores baseados em

polímeros condutores (retirado de Gerard et al., 2002).

Algumas técnicas, incluindo espectroscopia de fotocorrente e QCM, foram

usadas para seguir, em tempo real, os processos de adsorção e hibridização de DNA

sobre eletrodos modificados com polipirrol (Lassalle et al., 2001a). O polímero de

polipirrol foi também utilizado na construção de um biossensor de DNA adaptável à

imobilização de diferentes biomoléculas (Dupont-Filliard et al., 2001). Com base na

grande afinidade da ligação avidina / biotina, monômeros pirrólicos biotinilados foram

eletropolimerizados na superfície de uma QCM. Após ligação da avidina, um

oligonucleotídeo biotinilado liga-se a esta (que tem capacidade de se ligar

simultaneamente a quatro moléculas de biotina), ficando assim imobilizado. Finalmente,

a cadeia-alvo hibridiza com a anterior e, ligada na outra extremidade a um marcador

fluorescente, é detectada por fluorescência. A versatilidade desta técnica e a capacidade

de reutilização do sensor ficam demonstradas após lavagem, a qual regenera a superfície

sem alterar a matriz polimérica do polipirrol imobilizado. Bidan e colaboradores (Bidan

et al., 2000) usaram um processo de eletrocopolimerização para imobilizar nucleotídeos

49

em superfícies transdutoras. Por esta técnica, uma mistura de pirrol com um

oligonucleotídeo covalentemente ligado a um pirrol é electrooxidada, resultando em

imobilização irreversível das unidades oligonucleotídicas num copolímero polipirrólico.

O processo foi aplicado, juntamente com QCM, à detecção do vírus da hepatite C em

amostras sanguíneas, e à preparação de camadas polipirrólicas funcionalizadas com

biotina, usando microeletrodos de ouro em série (array) num chip de silício. O uso de

suportes poliméricos em genossensores, em virtude da sua versatilidade físico-química,

visa superar as tradicionais limitações de detecção de DNA em superfícies metálicas e

de vidro, nomeadamente, no caso do vidro, a baixa densidade superficial dos grupos

funcionais silânicos, que limita a concentração superficial de oligonucleotídeos

imobilizados. Outra vantagem é o seu baixo custo comparativamente ao vidro ou ao

ouro. A imobilização de oligonucleotídeos deve maximizar a sensibilidade, a

capacidade de imobilização (relacionada com a densidade de ligações), a estabilidade da

ligação ao suporte e a acessibilidade das moléculas interatuantes, assim como minimizar

ligações não específicas (Preininger & Chiarelli, 2001). Neste âmbito, superfícies

hidrofílicas são particularmente favoráveis à hibridização de ácidos nucléicos, pois

facilitam a exposição das bases hibridizantes (Chan et al., 1998; Chen et al., 2002).

Apesar disso, como mostra um trabalho (Delair et al., 1999) sobre imobilização de

DNA em superfícies de látex hidrofóbico (poliestireno) e hidrofílico (poli(N-

isopropilacrilamida)), o aumento da força iônica do meio reduz a adsorção de DNA à

superfície hidrofílica mais drasticamente do que à superfície hidrofóbica. Estudos de

imobilização de albumina humana carregada negativamente em superfícies de látex

aniônico demonstraram, porém, que é possível ligar as duas superfícies criando uma

barreira de potencial positivo entre elas, formada pelos cátions do eletrólito salino

(Gingeras et al., 1987). No entanto, como mostram estudos de imobilização covalente

de oligonucleotídeos modificados com grupos dissulfito em superfícies de vidro

modificadas com mercaptosilano, altamente hidrofóbico, a hidrofobicidade do filme

silânico confina num pequeno volume as alíquotas de solução aquosa do

oligonucleotídeo depositadas sobre ele, por via da tensão superficial, e assim previne a

eventual mistura e contaminação cruzada numa hipotética configuração de microarray

(Rogers et al., 1999). As características de ligação também podem variar

consideravelmente dependendo do grupo funcional; como exemplo, a imobilização de

DNA sobre grupos -COOH, apesar do alto rendimento de reação, é geralmente preterida

em relação à imobilização sobre grupos –NH2 porque a repulsão eletrostática negativa

50

com as moléculas de DNA gera uma baixa concentração destas junto à superfície do

eletrodo (Ivanova et al., 2004). Em geral, têm sido utilizados, em genossensores,

polímeros condutores catiônicos cuja resposta eletroquímica (corrente) diminui após a

hibridização do DNA, presumivelmente devido ao impedimento da troca aniônica ou à

reorganização do polímero (Cha et al., 2003). No entanto, Reisberg e colaboradores

relataram (Reisberg et al., 2005) a detecção de oligonucleotídeos, por voltametria de

pulso diferencial com um eletrodo de carbono vítreo, usando um polímero sintético com

um grupo quinona, trocador de cátions; a possibilidade de imobilização de DNA

(carregado negativamente) neste polímero aniônico foi atribuída à formação, em torno

das sondas de DNA, de um ‘escudo’ eletricamente positivo de cátions da solução. Com

este sensor, obteve-se um aumento da resposta após a hibridização, com óbvia

possibilidade de aumento da sensibilidade de detecção usando polímeros condutores. A

introdução de grupos amina tem sido, no entanto, a estratégia mais usada para

funcionalizar superfícies sólidas com biomoléculas. Esta abordagem pode ser usada

para imobilizar oligonucleotídeos covalentemente em superfícies de silício, uma

alternativa à imobilização direta sobre silício oxidado que, sendo quimicamente

semelhante ao vidro, apresenta iguais desvantagens, principalmente heterogeneidade e

irreprodutibilidade da superfície formada (Strother et al., 2000). Noutro dos muitos

trabalhos existentes sobre ligação de DNA a grupos –NH2, a imobilização de

oligonucleotídeos foi feita usando microesferas de nylon como suporte sólido,

revestidas com polietilenimina (Ness et al., 1991). Alguns trabalhos documentam o uso

concomitante de vários polímeros segundo diferentes estratégias de imobilização,

nomeadamente um gel polimérico composto por polivinil-álcool com ligação cruzada a

cloreto de polialilamina (Preininger & Chiarelli, 2001) e um complexo oligonucleotídeo

/ poli(L-lisina) em superfícies sólidas modificadas com derivados de poliestireno

(Ivanova et al., 2004). Todos estes trabalhos argumentam a obtenção de maiores

eficiências de imobilização e de hibridização dos ácidos nucléicos quando se usam

matrizes poliméricas para adsorver ou ligar covalentemente cadeias de DNA. A

adsorção é muitas vezes preferida à ligação covalente como via de imobilização de

DNA porque as superfícies de determinados transdutores podem conter grupos capazes

de reagir e fragmentar o DNA quando se ligam a ele, alterando a sua estrutura original

(Sukhorukov et al., 1996). A funcionalização de superfícies de transdutores físicos com

moléculas orgânicas contendo grupos funcionais específicos pode ser também

implementada pela técnica de SAM, que resulta basicamente de imergir a superfície do

51

transdutor numa solução diluída (~ 1 mM) de uma substância anfipática a adsorver, à

temperatura ambiente, durante um período de tempo relativamente curto. Este

procedimento gera espontaneamente superfícies muito finas, com quantidades muito

baixas da molécula adsorvida, formando uma única camada altamente ordenada e

compacta, semelhante ao micro-ambiente de uma célula viva. A monocamada adsorve

fortemente à superfície sólida e é termodinamicamente muito estável. A grande

flexibilidade para várias aplicações deve-se à possibilidade de controlar tanto a

funcionalidade (grau de hidrofilicidade) como o comprimento da cadeia (isto é, a

distância), do que depende o desempenho do biossensor, independentemente da

estratégia de imobilização ou do processo de transdução (Chaki & Vijayamohanan,

2002). O caso certamente mais estudado e descrito é de SAMs de alcanotióis

covalentemente ligados a superfícies de ouro (figura 23).

Figura 23 - Esquema de uma SAM de alcanotióis (cadeias em V) numa superfície de

ouro. Esferas escuras: átomos de ouro. Esferas claras: átomos de enxofre (retirado de

Freire et al., 2003).

Aminoalcanotióis bifuncionais permitem ligar, à superfície sólida, moléculas

lineares de DNA. A sensibilidade aumenta quando a cadeia-sonda é imobilizada

perpendicularmente à superfície (Hianik et al., 2001). Chrisey e colaboradores (Chrisey

et al., 1996) imobilizaram oligômeros de DNA modificados com grupos tiólicos numa

das suas extremidades em superfícies previamente tratadas com uma monocamada de

aminosilano. Por outro lado, Zhao e colaboradores (Zhao et al., 1999), através de

medições eletroquímicas e de espectrometria de raios-X, relataram maior eficiência de

imobilização de DNA de cadeia dupla em eletrodos de ouro modificados com SAMs

52

contendo grupos terminais hidroxila do que SAMs com grupos terminais amina ou

carboxila. O grande interesse das técnicas de ondas evanescentes para aplicação em

biossensores advém da desnecessidade de marcação da cadeia-alvo, da rapidez da

reação de hibridização (em poucos minutos) e possibilidade de reutilização da sonda

imobilizada acima de 100 vezes. Uma desvantagem significativa é a sua relativa baixa

sensibilidade, requerendo nanogramas ou até microgramas de DNA em 100 μl de

solução (Vercoutere & Akeson, 2002). A detecção ótica pode ser efetuada por outros

processos de marcação do DNA além da fluorescência. Nanopartículas de ouro

funcionalizadas, por exemplo, têm mostrado maior estabilidade e sinal menos

susceptível a perturbações externas do que a detecção por marcadores de fluorescência

(Fritzsche, 2001). Foi relatado o aumento de sensibilidade da detecção de DNA por

QCM quando se formam filmes de partículas coloidais de ouro sobre eletrodos de ouro

(Lin et al., 2000).

Em geral, os biossensores óticos, especialmente os baseados em fibras óticas,

são adequados para miniaturação, atendendo ao muito pequeno diâmetro das fibras. Ao

transmitirem luz por longas distâncias sem perda de sinal, elas permitem detecção

remota em amostras inacessíveis ou perigosas. A natureza ótica do sinal ainda evita a

interferência dos sinais elétricos e, sendo inofensiva, é recomendável para aplicações in

vivo. Porém, estes sensores apresentam as desvantagens de baixa estabilidade, possível

interferência de luz ambiente e alto custo das fibras óticas de quartzo para transmissão

de luz ultravioleta.

1.6.2 Biossensores de DNA com transdução piezelétrica

Uma seqüência de DNA com algumas centenas de pares de bases normalmente

tem massa molecular suficientemente alta para que o aumento de massa associado à sua

hibridização com uma cadeia complementar possa ser detectado especificamente por um

sensor piezelétrico sobre o qual a primeira cadeia está imobilizada (Junhui et al., 1997).

O grupo de Campbell (Campbell et al., 1993) utilizou o princípio da microbalança de

quartzo para detectar a mudança de massa induzida por hibridização de uma cadeia de

DNA covalentemente imobilizada sobre um cristal piezelétrico modificado com um

polímero. O aumento de massa resultante foi na ordem de 102 Hz relativamente a

cristais-controle aos quais se ligaram alvos não complementares. Noutro trabalho

53

(Lassalle et al., 2001b), a hibridização de DNA sobre uma matriz polipirrólica foi

detectada por QCM e espectroscopia de fotocorrente, com resultados semelhantes. Foi

desenvolvido também um sensor microgravimétrico bastante sensível para diagnóstico

da doença genética de Tay-Sachs (Bardea et al., 1998). Vários estudos (Caruso et al.,

1997; Zhou et al., 2001) relataram aumento da eficiência de hibridização e da

sensibilidade da QCM após imobilização de multicamadas de DNA marcado com

biotina em superfícies de ouro modificadas. A detecção da variação de massa num

cristal piezelétrico foi ainda usada segundo o princípio de SAW para detectar a

hibridização interfacial de DNA em eletrodos de paládio; o incremento na massa foi

correlacionado com as variações da freqüência de ressonância em tempo real (Su &

Thompson, 1995; Su et al., 1993). A mesma técnica foi aplicada no monitoramento da

ligação de drogas anticancerígenas ao DNA, atingindo-se um limite de detecção para as

drogas em torno de 10-7 M (Su et al., 1995). Zhang e colaboradores (Zhang et al., 1998),

usando o princípio de ondas acústicas internas (BAW), construíram um biossensor para

detecção on-line de DNA danificado por luz ultravioleta, baseando-se na diminuição de

massa após fragmentação da molécula induzida pela irradiação. Parâmetros interfaciais

como a viscosidade à superfície, a energia livre e a morfologia podem influenciar a

resposta do sensor (isto é, a freqüência de ressonância), normalmente reduzindo a

sensibilidade (Junhui et al., 1997). Em alguns trabalhos (Okahata et al., 1992; Su &

Thompson, 1995), a variação da freqüência de ressonância foi relacionada com o

processo de hibridização através da variação de viscosidade dependente da concentração

de DNA. Este tipo de biossensores de DNA pode distinguir diferenças num único

nucleotídeo (Furtado & Thompson, 1998). Uma inovação interessante para aumentar a

sensibilidade e a linearidade de biossensores de DNA com detecção por QCM é a

utilização de dendrímeros de ácidos nucléicos - um tipo de estruturas macromoleculares

ramificadas - como sondas para genossensores (figura 24).

54

Figura 24 - Processo de detecção de hibridização usando dendrímeros de ácidos

nucléicos imobilizados (retirado de Wang & Jiang, 1998).

Por possuírem muitas cadeias simples de DNA, estas estruturas esféricas, ao

serem imobilizadas diretamente sobre um transdutor físico, aumentam grandemente a

capacidade de hibridização e, em conseqüência, geram uma resposta significativamente

amplificada (Wang & Jiang, 1998; Wang, 2000). A utilização de PNAs – moléculas

semelhantes a ácidos nucléicos, em que o esqueleto açúcar-fosfato é substituído por

uma estrutura peptídica (figura 25) – como elementos de reconhecimento diretamente

imobilizados na superfície de um transdutor físico trouxe a possibilidade de selecionar

novas condições experimentais e de aumentar, em associação com QCM ou outros tipos

de transdutor, a capacidade discriminatória entre seqüências de DNA diferindo entre si

em apenas um par de bases (Wang et al., 1997b; Wang, 2000).

55

Figura 25 - Estruturas químicas de um PNA e de um DNA homólogos (retirado de

www.dkfz-heidelberg.de).

Num trabalho recente (Le-Floch et al., 2005), foi desenvolvido um esquema de

detecção eletroquímica usando uma sonda de PNA neutra e politiofeno, um polímero

eletroativo catiônico e, portanto, solúvel em água, o que evita as fortes interferências

elétricas causadas pelos habituais polímeros hidrofóbicos em contato permanente com

os elétrodos. Sendo neutra, a sonda de PNA só se liga ao politiofeno quando ocorre a

hibridização com a seqüência-alvo complementar de DNA carregada negativamente,

devido à atração eletrostática entre o politiofeno e o alvo. Além disso, também se

registrou um acréscimo de sensibilidade pelo fato de o sinal de resposta aumentar) em

vez de diminuir) após o evento de hibridização.

1.6.3 Biossensores de DNA com transdução eletroquímica

Em biossensores eletroquímicos de DNA, uma sonda de DNA unifilamentar é

imobilizada numa superfície eletricamente ativa (eletrodo), sendo medidas variações em

parâmetros eletroquímicos (exs.: corrente, potencial, condutividade, capacitância)

decorrentes da hibridização com uma cadeia-alvo. O uso de eletrodos sólidos aumentou

56

significativamente a aplicabilidade dos métodos eletroquímicos para análise de ácidos

nucléicos (La-Scalea et al., 1999). Relativamente a outras formas de transdução, os

biossensores eletroquímicos permitem detecção simples, rápida e barata, além de serem

passíveis de miniaturação e fabricação em massa (Kerman et al., 2004a). A intrínseca

potencialidade de miniaturação, a compatibilidade com técnicas de microfabricação, a

baixa exigência energética e o caráter tendencialmente portátil tornam os biossensores

eletroquímicos especialmente aptos para aplicação em diagnóstico de DNA (Wang et

al., 2000; Wang et al., 2002). Até que a fabricação de biossensores de DNA

descartáveis se torne mais efetiva e barata, a viabilidade dos biossensores atuais

depende grandemente da capacidade de regeneração contínua das suas superfícies para

múltiplas utilizações, com reprodutibilidade na detecção. Para isso, uma grande

inovação veio da utilização de compósitos (pastas) de carbono que, por terem

substituído os antigos eletrodos de mercúrio, incrementaram o desenvolvimento de

novas técnicas voltamétricas e potenciométricas altamente sensíveis para detecção de

DNA, assim como de processos de modificação de eletrodos com DNA e de

biossensores de DNA (Compton, 1999). A rigidez moderada da grafite permite um

polimento fácil e suave (figura 26), além de o DNA poder ser imobilizado por simples

adsorção à superfície, ou até incorporado na pasta.

57

Figura 26 - Etapas de manufatura de um eletrodo de pasta de carbono (retirado de

www.epsilon-web.net).

Os compósitos de carbono também são caracterizados por rápido transporte de

carga e grande área superficial (Diamond, 1998). A agregação das partículas condutoras

de grafite é geralmente conferida por substâncias adesivas por simples mistura manual;

entre estas incluem-se o óleo mineral (Wang et al., 1998a) e resinas epóxi (Pividori et

al, 2003). A utilização destas últimas permite minimizar a adsorção não específica de

DNA à superfície do eletrodo, mesmo sem tratamento com agentes de bloqueio.

Adicionalmente, a alta porosidade dos compósitos de grafite / epóxi e o seu

comportamento funcionalmente semelhante a um array de microeletrodos explicam a

sua elevada sensibilidade, inclusive quando comparada à das clássicas membranas de

nylon, usadas em ensaios genéticos, que atuam como barreiras difusionais para as

espécies eletroativas (Alegret, 1996; Pividori et al., 2003). Dutra e colaboradores (Dutra

et al., 2000), do nosso laboratório, relataram o desenvolvimento de um biossensor

amperométrico para detecção de IgG humana utilizando um eletrodo reutilizável de

58

grafite / epóxi em associação com partículas de prata dispersa e TCNQ como mediador

de transferência eletrônica. Este sistema permitiu reduzir drasticamente o potencial de

trabalho e atingir maior seletividade do que quando simples biocompósitos de grafite /

epóxi são usados. O grupo de Erdem (Erdem et al., 2004) utilizou, mais recentemente,

um novo compósito rígido de carbono como material de transdução para detecção, por

voltametria de pulso diferencial, de hibridização de DNA, com 15 minutos de tempo de

hibridização e 10 mg/ml de DNA-alvo. Os potenciais de oxidação dos resíduos de

guanina e adenina do DNA assim obtidos foram, respectivamente, +0.55 V e +0.85 V,

bastante inferiores aos obtidos em trabalhos anteriores com compósitos de grafite /

epóxi. Este novo compósito permite imobilizar facilmente e rapidamente, por simples

adsorção-úmida, tanto DNA genômico como oligonucleotídeos, uma alternativa

vantajosa em relação aos protocolos habituais para adsorção química ou eletroquímica.

Uma inovação também recente consistiu na utilização de uma grafite expandida como

material de suporte do eletrodo de um biossensor enzimático (Calas-Blanchard et al.,

2003). Esta forma de grafite pode ser facilmente comprimida e agregada sem auxílio de

uma substância adesiva, pelo que apresenta características de condutividade eletrônica e

de área superficial eletroquímica mais favoráveis do que as pastas de carbono. No

entanto, a reprodutibilidade necessita ser melhorada, talvez minimizando e

uniformizando o nível de impurezas entre diferentes lotes de grafite, removendo-as

parcialmente por tratamento eletroquímico. Também os ácidos nucléicos peptídicos (já

mencionados acima) têm incrementado a sensibilidade e a seletividade da detecção

eletroquímica de DNA, além de outras vantagens que incluem alta rapidez e eficiência

de hibridização, baixa dependência da força iônica e maior estabilidade térmica, tanto

em solução como na interface de um sensor (Wang et al., 1996f). A maior

especificidade dos ácidos nucléicos peptídicos em relação aos seus análogos de DNA

permite usar sondas de menor comprimento, vantagem aproveitada pelo grupo de Wang

para detectar potenciometricamente seqüências de 10 a 15 pb em eletrodos de pastas de

carbono (Wang et al., 1996f; Wang et al., 1997c). A imobilização de DNA em eletrodos

modificados com SAMs oferece um possível ganho em sensibilidade e especificidade

em relação a outros métodos de imobilização, pois evita alterações conformacionais

capazes de afetar a atividade do biocomponente ativo imobilizado; desta forma se

assegura maior homogeneidade e reprodutibilidade da superfície do eletrodo. Além

disso, a escala molecular da dimensão da monocamada permite difusão rápida das

espécies eletroativas até à superfície do eletrodo em comparação com a cinética

59

observada em eletrodos modificados com filmes poliméricos finos ou compósitos. As

SAMs também reduzem drasticamente as correntes residuais capacitivas (não

faradaicas), assim como a passivação dos eletrodos, devida à acumulação de substâncias

indesejadas (Freire et al., 2003). Contudo, a aplicabilidade das monocamadas ainda é

limitada devido a problemas de estabilidade das mesmas e à dificuldade da sua

formação. A técnica sonoeletroquímica – combinação de detecção eletroquímica com

irradiação ultrasônica -, além de também reduzir a passivação em eletrodos de carbono,

aumenta drasticamente o transporte de massa, permitindo controlar a extensão da

adsorção de espécies relevantes (Brett & Matysik, 1997; Hagan & Coury, 1994; Zhang

& Coury, 1993).

Um dos métodos tradicionalmente usados para gerar sinais elétricos que

detectem a hibridização de DNA é o emprego de marcadores enzimáticos, tal como

acontece em imunossensores. A enzima, previamente ligada à sonda unifilamentar de

DNA, acopla-se à superfície do eletrodo por via da hibridização específica com a cadeia

complementar e, aí, gera uma alteração eletroquímica diretamente resultante da catálise

de uma reação redox. O grupo de Lumley (Lumley et al., 1996), trabalhando com um

transdutor de fibras de carbono, monitorou o evento de hibridização sobre um condutor

redox polimérico, em conexão com uma cadeia-alvo de DNA marcada com peroxidase

de rábano; foi medida a corrente de eletrorredução do peróxido de hidrogênio por

amperometria, tendo sido detectadas diferenças de um único nucleotídeo. A marcação

de DNA com peroxidase de rábano também foi usada (Patolsky et al., 1999) para seguir

a acumulação, na superfície do eletrodo, do produto fenólico da reação enzimática. A

detecção foi realizada por cronopotenciometria e por impedimetria, atingindo-se limites

de detecção muito baixos após múltiplas amplificações da resposta. Lipossomos

marcados com peroxidase também foram usados para amplificar a resposta ao evento de

hibridização por impedimetria (Alfonta et al., 2001) ou, por técnicas de pulso, para

detectar produtos de PCR (Wojcienchowski et al., 1999) e seqüências relacionadas com

o citomegalovírus humano (Azek et al., 2000). Atualmente, os métodos de detecção de

DNA baseados em marcadores enzimáticos conseguem discriminar diferenças de um

único nucleotídeo entre duas seqüências na gama de picomolar (Patolsky et al., 2001;

Campbell et al., 2002). Uma interessante aplicação da marcação enzimática em

genossensores veio do grupo de Pividori (Pividori et al., 2001), que utilizou peroxidase

para detectar um oligonucleotídeo produtor de β-lactamase em Staphylococcus aureus.

Este genossensor foi adaptado do formato clássico de hibridização por dot-blot, mas

60

com a configuração de um biossensor amperométrico, utilizando um eletrodo de grafite

/ epoxi com uma membrana de nylon. Para a hibridização, utilizaram-se duas sondas

biotiniladas (nas extremidades 5’ e 3’, respectivamente) em vez de apenas uma, o que,

combinado a prévia amplificação por PCR do oligonucleotídeo extraído de células

bacterianas, permite atingir a sensibilidade necessária (~ 105 – 106 bactérias) à obtenção

de um sinal positivo. Com este procedimento, o tempo habitualmente necessário – 4 a 5

dias – para efetuar o diagnóstico microbiológico pelos testes de susceptibilidade

bacteriana pode ser reduzido para cerca de 36h, incluindo o tempo requerido para a PCR

(Pividori et al., 2001). Geralmente, as enzimas marcadoras são conjugadas com uma

única molécula de DNA (Bakker & Qin, 2006), mas recentemente foi descrita uma

configuração utilizando glucose oxidase conjugada com várias seqüências

oligonucleotídicas, por ligação dos resíduos glicosídicos oxidados da enzima com as

extremidades 5’ de oligonucleotídeos aminados (Dominguez et al., 2004). Deste modo,

vários eventos de hibridização sucessivos resultaram numa grande amplificação do sinal

e, portanto, num grande aumento da sensibilidade da detecção.

As primeiras configurações para detecção de hibridização de DNA utilizavam

substâncias eletroativas como indicadores de hibridização, de acordo com o princípio

descrito nas figuras 27A, B e C2.

Figura 27 - Princípio de detecção eletroquímica de hibridização de DNA em eletrodos

de carbono. (A) A sonda de DNA é adsorvida na superfície do eletrodo por aplicação de

um potencial positivo. (B) Hibridização da sonda com o alvo complementar. (C1)

Transdução usando o sinal de eletrooxidação dos resíduos de guanina. (C2) Transdução

usando o sinal de eletrorredução de um indicador redox pré-concentrado na superfície

do eletrodo (retirado de Pividori et al., 2000).

61

Estas substâncias geralmente ligam-se com muito maior afinidade a uma cadeia

dupla de DNA do que a uma cadeia simples e, conseqüentemente, a sua concentração

junto à superfície de um eletrodo aumenta após a ocorrência de hibridização, assim

como a resposta eletroquímica – o pico da banda correspondente à reação redox. Os

indicadores geralmente interatuam com o esqueleto de açúcar / fosfato de uma cadeia

dupla de DNA por atração eletrostática ou, interagindo hidrofobicamente dentro da

dupla hélice, por ligação aos sulcos maiores ou intercalação entre nucleotídeos

adjacentes. Além da discriminação entre ssDNA e dsDNA, um indicador eletroativo

deve possuir um potencial redox baixo e bem definido (Wang, 2002). Os indicadores

eletroquímicos geralmente mais usados para detecção e quantificação de DNA incluem

o Hoechst 33258, corantes heterocíclicos (exs.: brometo de etídeo e azul de metileno),

drogas anticancerígenas (ex.: daunomicina) e complexos organometálicos,

principalmente de Co, Fe, Os, Pt e Ru. Na maior parte dos casos, estes compostos

ligam-se reversivelmente ao DNA por intercalação, com os seus grupos aromáticos

planares encaixados entre nucleotídeos adjacentes. Uma exceção relevante é o Tris(2,2’-

bipiridil) rutênio(II), que se liga ao DNA por atração eletrostática (Pyle et al., 1989).

Como exemplo, os metalointercaladores redox Co(bpy)33+ (bpy = 2,2’-bipiridina) e

Co(phen)33+ (phen = 1,10-fenantrolina) foram usados (Millan & Mikkelsen, 1993) para

detectar, por voltametria cíclica, um oligonucleotídeo(dT) alongado com resíduos dG,

imobilizado num eletrodo de carbono vítreo por ligação covalente, com N-

hidroxisuccinimida e uma carbodiimida como reagentes de ligação. O mesmo

procedimento foi empregue (Millan et al., 1994) sobre um eletrodo de pasta de carbono

modificado com octadecilamina ou ácido esteárico, cujos grupos funcionais permitiram

a imobilização covalente de um polinucleotídeo alongado com resíduos de dG para

construção de um biossensor para a fibrose cística, usando Co(bpy)33+, Co(phen)3

3+ e

Os(bpy)33+ como indicadores de hibridização. Noutro trabalho (Liu et al., 1996), o

brometo de etídeo foi escolhido para detectar um oligonucleotídeo covalentemente

imobilizado num eletrodo de grafite quimicamente modificado com uma amina

primária. Erdem e colaboradores (Erdem et al., 1999) relataram a detecção específica de

pequenos oligonucleotídeos relacionados com o vírus da hepatite B após adsorção

eletroquímica num eletrodo de pasta de carbono polarizado positivamente (pré-tratado)

para aumentar a afinidade ao DNA aniônico, a mesma estratégia de imobilização usada

anteriormente por Wang e colaboradores (Wang et al., 1996b), trabalhando com

62

eletrodos de carbono em pasta e screen-printed para detectar pequenas seqüências de

DNA relacionadas com o HIV, por cronopotenciometria, usando Co(phen)33+ como

indicador. Alguns trabalhos com eletrodos de ouro incluem adsorção física (Zhao et al.,

1997) e química (Hashimoto et al., 1994b) de DNA e detecção eletroquímica da

hibridização com, respectivamente, Co(bpy)33+ e Hoechst 33258, e imobilização

covalente pela técnica de SAM, seguida de detecção com azul de metileno (Kerman et

al., 2002) e daunomicina (Hashimoto et al., 1994a). Alguns trabalhos interessantes

foram realizados pelo grupo de Xu, para detecção voltamétrica específica de DNA com

eletrodos de grafite (Xu et al., 2000), platina (Xu et al., 2001b) e carbono vítreo (Xu et

al., 2001a). Foi realizada acumulação eletroquímica de DNA num eletrodo pré-tratado,

assim como imobilização sobre um filme de quitosana revestindo o eletrodo. O

polímero natural e catiônico de quitosana (figura 28) forma complexos estáveis com os

grupos fosfato das cadeias polianiônicas de DNA, quer nativas, quer desnaturadas,

resultando numa imobilização altamente estável (Hayatsu et al., 1997). A técnica é

também potencialmente mais simples e barata do que as que usam ligação covalente

(Xu et al., 2001a).

Figura 28 - Estrutura da quitosana (retirado de www.ualberta.ca).

Nos três trabalhos, o grupo de Xu usou ferrocenocarboxaldeído e

aminoferroceno como indicadores de hibridização. Estes compostos, ao contrário dos

intercaladores, ligam-se covalentemente às sondas de DNA. Ju e colaboradores (Ju et

al., 2004), por outro lado, usaram ferroceno (na forma monocatiônica) como indicador

para detectar DNA de levedura com ligação covalente a um eletrodo de ouro

funcionalizado com uma SAM. O ferroceno liga-se aos sulcos maiores do dsDNA

63

imobilizado (figura 29), embora também se possa ligar eletrostaticamente (Ju et al.,

2004).

Figura 29 - Ligação do ferroceno (em cima, à direita) a um sulco maior do dsDNA

(retirado de rincewind.usask.ca).

Na senda da procura de novos indicadores redox que discriminem mais

eficazmente um ssDNA de um dsDNA, foi utilizado (Takenaka et al., 2000)

ferrocenilnaftaleno diimida, um intercalador que se liga mais fortemente a um dsDNA

do que os intercaladores usuais e tem afinidade desprezível para o ssDNA. A

sensibilidade da detecção de DNA por este meio atingiu 10 zmol, diminuindo a

quantidade de sonda imobilizada e protegendo a superfície a descoberto com 2-

mercaptoetanol. A utilização de indicadores de hibridização que não se liguem

covalentemente ao DNA possibilita evitar o custo elevado, a morosidade e a maior

complexidade dos procedimentos de síntese, ligação à sonda de DNA (marcação) e

separação do produto.

Mais recentemente, têm-se desenvolvido esquemas de detecção eletroquímica de

hibridização de DNA sem utilização de indicadores (método direto). Eles baseiam-se

em mudanças na eletroatividade intrínseca do DNA, decorrentes do evento de

hibridização. As suas principais vantagens são a simplificação e maior rapidez dos

procedimentos experimentais, pois assim se eliminam as etapas de adição e associação

do indicador, e se evita o inconveniente da perda de sinal pelo fato de o indicador se

desligar gradualmente do dsDNA imobilizado. A maioria dos protocolos para detecção

64

direta de DNA baseia-se na eletroatividade intrínseca das suas bases, os únicos

componentes que sofrem processos redox em eletrodos de mercúrio e de carbono.

Concretamente, são os resíduos de adenina e guanina que sofrem oxidação em eletrodos

de carbono (figuras 27A, B e C1) e, adicionalmente à citosina, redução em eletrodos de

mercúrio a potenciais muito negativos (Paleček, 1996). Em eletrodos de carbono e em

meio ácido, resíduos livres de guanina e adenina geram picos de oxidação bem

definidos a potenciais em torno de, respectivamente, 0.85 V e 1.15 V (Brabec, 1980;

Compton, 1999), em contraste com a má definição dos picos correspondentes numa

cadeia polinucleotídica (Paleček, 1996). A discriminação entre ssDNA e dsDNA

caracteriza-se por um menor pico de corrente de oxidação do dsDNA relativamente ao

do ssDNA, não só devido a os locais de oxidação do dsDNA estarem protegidos por

participarem nas ligações de hidrogênio da dupla hélice, como também à maior rigidez

estrutural de uma dupla hélice, que se liga com dificuldade aos contornos sinuosos da

superfície de um eletrodo (Compton, 1999; La-Scalea et al., 1999). O pico de oxidação

das bases purínicas também aumenta quando o peso molecular dos ácidos nucléicos

(correlacionado com o seu tamanho) diminui. Em ambos os casos, a maior proximidade

física entre os segmentos electrooxidáveis e a superfície do eletrodo facilita a

transferência de carga entre eles (Brabec, 1981; La-Scalea et al., 1999). Este tipo de

detecção, no entanto, não pode ser usado para detectar cadeias-alvo com resíduos de

guanina, pois o seu sinal eletroquímico interfere com o sinal de referência das guaninas

da cadeia-sonda imobilizada. Esta limitação é geralmente obviada pela utilização de

sondas cujos resíduos de guanina são substituídos por análogos de inosina (que também

emparelham com a citosina), sendo então o sinal de hibridização dado exclusivamente

pelo pico de oxidação das guaninas da cadeia-alvo. Ainda que a inosina tenha uma

banda de oxidação característica, ela é bem separada e distinta a banda de oxidação da

guanina (Wang et al., 1998b). A sensibilidade da detecção do duplex de DNA sem

auxílio de indicadores de hibridização pode ser incrementada pela acumulação de ácido

nucléico na superfície de um eletrodo de mercúrio e por diminuição do volume de

solução a utilizar, de acordo com a técnica de AdSV. Nesta técnica, após a pré-

concentração do analito na superfície do eletrodo por adsorção física – freqüentemente

associada a agitação da solução -, a sua detecção é feita através de técnicas

voltamétricas convencionais, sendo o analito redissolvido na solução a partir da

superfície sólida. Com os métodos de redissolução adsorptiva obtêm-se os limites de

detecção mais baixos de entre todas as técnicas voltamétricas (Skoog et al., 1998). Jelen

65

e colaboradores (Jelen et al., 2002) detectaram quantidades de DNA abaixo de 1 pg em

volumes de 3-5 μl de solução, usando eletrodos de mercúrio e de amálgama de cobre.

Nestas baixas concentrações, todavia, pode ocorrer fusão dos picos de redução dos

resíduos nucleotídicos com as bandas de descarga do eletrólito (Paleček & Postbieglová,

1986). Para resolver este problema, foi desenvolvida a técnica de AdTSV (figura 30),

segundo a qual um eletrodo de carbono ou mercúrio é inicialmente modificado por

imersão numa pequena gota de solução de DNA; após ocorrer adsorção do ssDNA e do

dsDNA – mediante, ou não, a aplicação de um potencial para polarização do eletrodo -,

este é transferido para um volume maior de solução de eletrólito sem DNA, onde é

efetuada a medição voltamétrica (Paleček et al., 1993).

Figura 30 - Esquema da técnica de AdTSV para detecção de DNA. Através da

aplicação de um potencial elétrico, o ssDNA é acumulado na superfície do elétrodo, e

este lavado com água e solução do eletrólito. Finalmente, o elétrodo modificado com

ssDNA é transferido para uma célula voltamétrica convencional, onde é feita a medição

(retirado de www.biologicalprocedures.com).

A utilização de AdTSV permite, sem necessidade de construir nenhuma célula

voltamétrica especial, detectar DNA em amostras com volumes muito pequenos, até 5-

10 μl, comparáveis aos usados em géis de eletroforese. Os sinais de ssDNA e dsDNA

sãs tão distintos como em voltametria convencional usando um eletrodo de mercúrio,

sendo suficientes quantidades de DNA inferiores a 1 ng (Paleček, 1996). A detecção de

baixas concentrações de ácidos nucléicos foi feita on-line, num sistema de

amperometria de fluxo (Wang et al., 1996e). Este método permitiu analisar volumes de

amostra de vários microlitros em sistemas de injeção de fluxo, resultando em limites de

66

detecção na ordem de picogramas. Em conjunção com um detector de pasta de carbono,

esta configuração parece atrativa para monitorar ácidos nucléicos em efluentes

cromatográficos. Uma alternativa à voltametria de redissolução é a potenciometria de

redissolução, que apresenta como vantagem o baixo sinal de fundo dos modernos

aparelhos de corrente constante, em comparação com as altas correntes de fundo dos

aparelhos voltamétricos análogos (Wang et al., 1996a). O grupo de Wang realizou

vários trabalhos respeitantes à detecção de ácidos nucléicos por potenciometria de

redissolução em eletrodos de carbono ativados por pré-tratamento eletroquímico. Nestes

trabalhos incluem-se a detecção cronopotenciométrica em eletrodos de pasta de carbono

(Wang et al., 1996c) e eletrodos microfabricados por screen-printing (Wang et al.,

1996a), ambos relatando a detecção de DNA com alta sensibilidade, na gama de

nanogramas. Também se incluem a detecção de vestígios de RNA na presença de

excesso de dsDNA, com limite de detecção de 10 pg (Wang et al., 1995), e a detecção

de DNA em eletrodos de pasta de carbono aquecidos, resultando num grande aumento

do sinal devido à etapa de acumulação, e possibilitando a utilização de volumes muito

pequenos, uma conseqüência dos movimentos de convecção térmica perto da superfície

do eletrodo (Wang et al., 2000). Parâmetros eletroquímicos relativos à interface eletrodo

/ eletrólito também têm sido objeto de estudo para detectar DNA. Os transdutores

capacitivos baseiam-se na teoria da dupla camada elétrica, segundo a qual a interface de

um transdutor eletroquímico é composta por duas fases condutoras – a superfície do

eletrodo e a solução do eletrólito; quando a interface é modificada por imobilização de

uma sonda de DNA e, depois, de uma cadeia-alvo, a espessura da camada dielétrica

aumenta após deslocamento e substituição das moléculas de água e eletrólito pelas

moléculas de DNA e, portanto, a capacitância diminui. As variações da capacitância

podem então ser monitoradas pela medição da corrente média que flui na célula

eletroquímica durante a descarga do capacitor (dupla camada elétrica). Berney e

colaboradores (Berney et al., 2000) desenvolveram um genossensor com uma sonda

imobilizada num eletrodo de silício por adsorção ou ligação covalente, obtendo um

limite de detecção de 100 pmol sem adição de mediadores para amplificar o sinal.

Noutros trabalhos, foi também documentada a detecção de pequenos oligonucleotídeos

com sondas tioladas e imobilizadas através de SAMs em eletrodos de ouro (Berggren et

al., 1999; Guiducci et al., 2002). O grupo de Cai (Cai et al., 2004) desenvolveu um

método para detecção de hibridização de DNA em eletrodos de silício, usando

espectroscopia de impedância. A detecção fundamenta-se no fato de a desorção de

67

ssDNA ser acompanhada de maiores perdas dielétricas do que a desorção de dsDNA,

devido à maior flexibilidade estrutural do primeiro (Guan et al., 2004). As medições

impedimétricas executam-se com corrente alternada em vez de corrente contínua

(direta) fluindo pela amostra, o que reduz o risco de modificação ou danificação da

biocamada (Cai et al., 2004), embora a aplicabilidade da impedimetria na construção de

biossensores esteja limitada pela sua morosidade (Guan et al., 2004). A aplicação bem

sucedida de biossensores em diagnóstico clínico requer não só a detecção como também

a quantificação de ácidos nucléicos, visto que elevados níveis destas substâncias no

organismo podem prenunciar um estado patológico. A medição da concentração de

ácido nucléico é freqüentemente efetuada pela determinação das concentrações

individuais de guanina e adenina ou pelo seu quociente no DNA. Para isso, foi proposto

(Wang et al., 2002) um método para determinar simultaneamente concentrações

individuais de guanina e adenina com um eletrodo de carbono vítreo após redissolução

adsorptiva de DNA; as duas bases produziram picos de oxidação bem definidos e

limites de detecção em torno de 4 ng/ml. A recente descoberta e utilização de MWNTs

como sensores químicos, combinando propriedades electrónicas únicas e grande área

superficial, foi aproveitada por Wu e colaboradores (Wu et al., 2003) para determinação

eletroquímica direta dos picos de oxidação da guanina e adenina num eletrodo de

carbono vítreo modificado com MWNTs. Devido à elevada capacidade adsorptiva dos

MWNTs, a efetiva acumulação de adenina e guanina aumenta significativamente as

correntes de oxidação das mesmas, permitindo a sua detecção direta (livres ou no DNA)

com alta sensibilidade, rápida resposta, grande simplicidade e reprodutibilidade

excelente. A determinação de bases nucleotídicas na presença de ácido nucléico é,

portanto, possível sem separação prévia das mesmas, em contraste com a habitual

determinação por UV, que deve ser combinada com uma técnica de separação (Paleček,

1996). Num outro trabalho (Kerman et al., 2004b), foi demonstrado que a

funcionalização lateral dos MWNTs em eletrodos de pasta de carbono, em conjugação

com a sua funcionalização nas extremidades, permite obter uma área superficial muito

maior para imobilização de DNA, tendo sido obtido um limite de detecção de 10 pg/ml,

compatível com as exigências de testes genéticos. Nos últimos anos, foi proposta a

determinação de oligonucleotídeos não marcados num eletrodo de grafite pirolítica a

baixos potenciais (Santos-Álvarez et al., 2002), uma vantagem em relação a outros

esquemas para detecção direta de ácidos nucléicos, já que os potenciais a que as bases

normalmente sofrem electrooxidação são demasiado altos e, por isso, fundem-se com as

68

correntes de descarga do eletrólito às baixas concentrações de DNA utilizadas. Neste

trabalho, os picos anódicos voltamétricos resultantes foram atribuídos à oxidação de

NADH (adicionado) pelos produtos de oxidação das unidades adenínicas do

oligonucleotídeo, fortemente adsorvidos na superfície do eletrodo. O procedimento

exibiu sensibilidade acrescida quando foram usados oligonucleotídeos ricos em resíduos

de adenina. Ao contrário dos métodos atrás descritos, o DNA também pode ser

determinado diretamente pela eletrooxidação dos seus resíduos de açúcar em eletrodos

de cobre (Singhal & Kuhr, 1997). O princípio de detecção é baseado no fato de o pico

de oxidação do dsDNA ser maior do que o do ssDNA, devido ao maior número de

resíduos de açúcar acessíveis no lado externo da dupla hélice do que na cadeia simples.

A sensibilidade da detecção é tanto maior quanto maior for o número de resíduos

nucleotídicos e, portanto, quanto maior for o tamanho do oligonucleotídeo. Com este

procedimento, pôde detectar-se DNA na gama de picomolar.

1.6.4 Novos biossensores de DNA

Para o futuro próximo, antevê-se a intensificação do desenvolvimento de

biossensores eletroquímicos, cuja miniaturação é relativamente fácil, e com bom

desempenho. Entre estes, é de esperar um desenvolvimento especial de sistemas de

detecção de DNA sem utilização de marcadores, pois a marcação é uma etapa adicional

no processo de detecção (Bean, 2001). Apesar disso, a utilização de indicadores de

hibridização ainda é provavelmente a melhor opção para detecção eletroquímica de

DNA (Pividori et al., 2000). Neste contexto, formatos em ‘sanduíche’ de nanopartículas

de ouro, DNA e microesferas magnéticas têm sido cada vez mais usados para detecção

altamente sensível de DNA (Merkoçi et al, 2005). A técnica, porém, exige prévia

dissolução química do complexo DNA-nanopartícula para posterior detecção

eletroquímica dos íons Au3+ resultantes e entretanto acumulados, o que, além de

constituir um passo adicional no processo, é feito com solução oxidante de HBr / Br2,

que é altamente tóxica. Além disso, cada nanopartícula de ouro, pelo fato de estar

conjugada a várias cadeias-alvo de DNA, é susceptível de se ligar a diferentes cadeias-

sonda e, portanto, a diferentes microesferas magnéticas, formando uma imensa rede

tridimensional interconectada. Como solução para estes problemas, foi desenvolvido

(Pumera et al., 2005) um método de nanopartículas de ouro em que cada uma se liga a

69

uma única molécula de DNA-alvo; a individualidade dos triconjugados resultantes

assegura maior reprodutibilidade e sensibilidade do que nos formatos tradicionais. A

outra vantagem descrita é a possibilidade de detectar diretamente o conjugado em vez

de o dissolver previamente para detectar somente as partículas de ouro, através de

acumulação das microesferas magnéticas hibridizadas na superfície de um eletrodo

magnético e subseqüente transdução voltamétrica. Entretanto, novas vias para gerar o

sinal de hibridização têm sido testadas. Usando uma técnica de detecção direta, foi

medido o decréscimo da condutividade iônica ao longo de BLMs durante a formação de

um híbrido entre uma sonda de ssDNA contida na BLM e um alvo complementar

(Siontorou et al., 1997); este fenômeno foi atribuído a alterações na permeabilidade

iônica associada a mudanças estruturais na BLM, decorrentes do evento de hibridização.

Aoki e colaboradores (Aoki et al., 2000) desenvolveram um sensor de canais iônicos

para detectar indiretamente a hibridização de DNA com alta especificidade, fazendo uso

da repulsão eletrostática entre ferrocianeto (marcador redox) e uma cadeia-alvo de DNA

negativamente carregada que se liga a uma sonda de ácido nucléico peptídico neutra,

imobilizada num eletrodo de ouro. Uma abordagem semelhante para amplificar o sinal

de hibridização utiliza lipossomos carregados negativamente que, ao se ligarem à sonda

imobilizada, formam uma imensa superfície de carga negativa que repele a cadeia-alvo,

também negativa (Patolsky et al., 2000); o resultante impedimento à transferência

eletrônica interfacial foi medido por espectroscopia de impedância. O grupo de

Baeumner também utilizou amplificação de sinal com lipossomos para detectar DNA

por via ótica. Num dos seus trabalhos (Baeumner et al., 2004b), foi desenvolvido um

biossensor para detecção e identificação do vírus da dengue após amplificação do RNA

viral pela técnica de NASBA, uma variante da PCR para amplificação direta de RNA. O

formato deste sensor inclui uma sonda-repórter de DNA (complementar a uma

seqüência genérica adicionada ao RNA viral durante o passo de amplificação) ligada à

superfície externa de um lipossomo e uma sonda de captura biotinilada e imobilizada

numa membrana de polietersulfona revestida com estreptavidina (a qual possui alta

afinidade de ligação para a biotina). Este sensor permite detectar o vírus genericamente

(isto é, independentemente do sorotipo) ou especificamente, apenas por escolha

apropriada da sonda de captura – complementar a uma seqüência conservada do genoma

viral ou a seqüências específicas para cada um dos quatro sorotipos. O RNA

amplificado e as duas sondas são então misturadas para formar uma ‘sanduíche’ e os

lipossomos marcados com DNA, em número proporcional à quantidade de RNA

70

existente na amostra, são detectados por eletroquimioluminescência com um

refletômetro portátil. Após otimização da sensibilidade e especificidade, o biossensor

foi capaz de detectar o RNA do vírus da dengue em até 15 minutos. Uma ligeira

variação deste sensor foi produzida com a sonda de captura ligada a uma microesfera

magnética e esta, por sua vez, imobilizada num magneto permanente na região de

detecção (Kwakye & Baeumner, 2003). Os lipossomos foram preenchidos com uma

substância corante, do que resultou uma grande amplificação do sinal e da sensibilidade

da detecção por microscopia de fluorescência. Este biossensor foi construído em

formato microfluídico, incluindo, além do módulo de detecção, módulos para extração,

purificação e amplificação de RNA. Com base nestes dois sensores, foi desenvolvido

um biossensor universal (Baeumner et al., 2004a), que engloba imobilização sobre uma

membrana de polietersulfona, uma sonda-repórter universal enriquecida com dG e

detecção ótica usando um lipossomo corado ligado a uma sonda universal rica em dC.

As sondas repórter e de captura podem ser facilmente e rapidamente substituídas para se

tornarem específicas para a seqüência-alvo de ácido nucléico. Após otimização das

condições de hibridização, das concentrações dos componentes e do comprimento da

sonda genérica, foram feitos ensaios com seqüências bacterianas reais, previamente

amplificadas e, com uma simples incubação, a identificação e quantificação não

excederam , no total, 30 minutos. Ao contrário dos biossensores descritos atrás e de

muitos outros atualmente disponíveis, este formato dispensa as etapas habituais de

conversão de um biossensor genérico em específico. Este formato foi posteriormente

aplicado à identificação de um sorotipo específico do vírus da dengue num único ensaio,

após amplificação do RNA viral (Zaytseva et al., 2004), contrariamente aos

biossensores atrás descritos, que requerem quatro análises separadas, isto é, uma para

cada sorotipo. O princípio de funcionamento deste biossensor multianalito está descrito

nas figuras 31 e 32.

71

Figura 31 - Princípio de funcionamento de um biossensor multianalito para

identificação específica dos sorotipos do vírus da dengue. É usada uma sonda-repórter

genérica, ligada a um lipossomo encapsulando moléculas de um corante, e 5 sondas de

captura – uma relativa a uma região conservada do genoma viral e as outras específicas

para os 4 sorotipos. Quando um RNA viral específico está presente, forma uma

‘sanduíche’ com as duas sondas (repórter e de captura), sendo o número de lipossomos

capturados na região de detecção proporcional à quantidade de RNA viral presente

(retirado de Zaytseva et al., 2004).

Figura 32 - Esquema em ‘sanduíche’ de biossensor para detecção genérica do genoma

do vírus da dengue e identificação específica do sorotipo (retirado de Baeumner et al.,

2004b).

A tendência para o futuro é a aplicação das tecnologias de micromecânica e

microfabricação de sistemas na preparação e análise de amostras de ácidos nucléicos

através de kits de diagnóstico e sistemas de fluxo (Pividori et al., 2000). Neste contexto,

deve salientar-se a importância crescente que os formatos para análise microfluídica

vêm adquirindo nos últimos anos (Dittrich et al., 2006). O grupo de Wang produziu um

biossensor eletroquímico para determinação de pequenas seqüências de DNA de

72

Mycobacterium tuberculosis por cronopotenciometria de redissolução adsortiva, usando

Co(phen)33+ como indicador de hibridização (Wang et al., 1997d). Este biossensor, de

tiras de carbono microfabricadas por screen-printing, foi comparado com um sistema

similar de pasta de carbono, conseguindo-se, nos dois casos, curtos tempos de

hibridização (5-15 minutos). A equipa de Wang também detectou a hibridização de

DNA e RNA diretamente, por alterações no pico de oxidação da guanina, usando

potenciometria de redissolução adsorptiva num sensor de filme-espesso screen-printed,

atingindo limites de detecção na ordem de μg/ml (Wang et al., 1996d). O sensor

microfabricado foi incorporado num aparelho portátil operado por uma bateria, tal como

requerido para diagnóstico de DNA in situ. Lamture e a sua equipe (Lamture et al.,

1994) modificaram o processo clássico de detecção com radioisótopos 32P para

desenvolver um sensor que combinasse a química de hibridização de DNA com as

tecnologias de microfabricação eletrônica. Deste modo, sondas oligonucleotídicas foram

covalentemente imobilizadas num filme fino de SiO2 e esta matriz ligada diretamente à

superfície de um aparelho de contagem radioquímica, que detecta o decaimento dos

isótopos 32P das cadeias-alvo de DNA hibridizadas. A detecção de 32P com esta técnica

provou ser cerca de 10 vezes mais rápida do que a atingida com detectores

convencionais de fase gasosa e, pelo menos, 100 vezes mais rápida do que com filme de

raios-X. Também se demonstrou a possibilidade de atingir esta velocidade quando a

matriz oligonucleotídica é ligada a chips descartáveis de SiO2 posteriormente depostos

sobre o aparelho de radiomedição sem prejuízo da especificidade.

Uma das principais linhas de pesquisa em novos sistemas de diagnóstico é a dos

biochips de DNA (figura 33), geralmente associada a técnicas de microfabricação por

screen-printing; elas permitem produzir séries bastante densas de eletrodos de

microbandas revestidos com diferentes sondas para detecção simultânea de diferentes

seqüências-alvo de DNA, com ou sem um indicador redox, impressas no chip por

fotolitografia convencional (Pividori et al., 2000; Wang et al., 1996d).

73

Figura 33 - Esquema de um biochip de DNA. Os diferentes alvos de DNA, obtidos de

fragmentos habitualmente clonados em plasmídeos e depois amplificados, são

imobilizados no chip. As sondas de RNA ou cDNA, obtidas de células em diferentes

condições de crescimento, são marcadas com um fluoróforo. Após hibridização das

sondas com os alvos, um laser faz a leitura do mesmo, sendo gravadas e registradas as

localizações específicas, no chip, onde a hibridização ocorreu. Finalmente, os dados são

analisados (retirado de www.kbrin.louisville.edu).

Usando componentes fotolitográficos convencionais, foi desenvolvida (Park et

al., 2002) uma técnica em ‘sanduíche’ para detecção eletroquímica em fendas de 20 μm

num microeletrodo sobre um chip de silício. Neste sistema, foi usada uma sonda de

DNA para capturar um alvo com uma região complementar a uma segunda sonda de

DNA, esta ligada a uma nanopartícula de ouro. Após 6-15 horas de hibridização, as

nanopartículas ligadas às sondas permaneceram nas fendas, facilitando a formação de

‘pontes’ de prata (entretanto adicionada) condutoras durante um tratamento com

reagentes-padrões formadores de filmes (ex.: hidroquinona). Com este sistema, foi

possível distinguir diferenças de um único nucleotídeo na gama de femtomolar. A

utilização de microeletrodos e de outros componentes convencionais possibilita um fácil

aumento de escala para um formato de array de alta densidade. Apesar de os

microarrays de DNA não poderem ser considerados biossensores – no sentido de

aparelhos de uso simples, de baixo custo e portáteis -, eles atingem alta eficiência de

processamento analítico e utilizam técnicas de microfabricação para imobilização

74

altamente seletiva dos seus componentes de reconhecimento (Baeumner et al., 2004a).

O desenvolvimento de biossensores a partir dos microarrays deverá ser mediado pela

produção de chips descartáveis que permitam obviar as limitações dos microarrays

atuais. Uma das particularidades mais salientes dos arrays de DNA de alta densidade é

a necessidade de endereçamento físico, por técnicas de deposição por microjato, de

volumes na gama de picolitros em localizações discretas e altamente específicas no

chip. Contrariamente à detecção por fluorescência ou por espectroscopia de massa,

muito usadas na detecção de hibridização em microchips de DNA, a transdução

eletroquímica parece ser a solução ideal para progredir no sentido de miniaturar o

aparato instrumental (Wang, 2000). Visando estes dois princípios – endereçamento

específico num chip e detecção eletroquímica -, Fixe e colaboradores (Fixe et al., 2004;

Fixe et al., 2003) apresentaram uma técnica de microarrays de DNA com

endereçamento elétrico. De acordo com esta técnica, a aplicação de um curto pulso de

potencial a um eletrodo resulta num aumento drástico da imobilização covalente

seletiva e da hibridização de DNA numa superfície de filme-fino sobre um suporte de

plástico; esse aumento foi de aproximadamente 109 vezes em relação a um sistema

análogo mas sem o pulso de potencial. O enorme aumento das taxas de imobilização e

hibridização foi atribuído à rápida reorientação espacial do ssDNA adsorvido na

superfície devido à rápida mudança do campo elétrico, o que reduz as barreiras estéreas

e acelera ambas as reações. Outros protocolos semelhantes foram desenvolvidos

anteriormente (Edman et al., 1997), mas com tempos de duração de pulso demasiado

longos (~ 5 minutos), assim desencadeando reações eletroquímicas indesejadas e

passíveis de danificar as moléculas de DNA. No trabalho de Fixe e colegas, foram

usados pulsos inferiores a 1 V durante 4.5 ns, o que é compatível com microfabricação

eletrônica convencional de silício. Isto possibilita o endereçamento eletrônico num

microarray durante a manufatura, de modo a imobilizar covalentemente e seletivamente

um grande número de diferentes moléculas de sonda em locais altamente específicos e

densos. Assim, muitas seqüências-alvo sob estudo podem ser imobilizadas num único

chip manufaturado, em áreas contíguas, cada uma correspondendo a um pixel. Durante

o ensaio experimental, alguns pixels podem ser hibridizados com uma das seqüências-

alvo, sendo a leitura final efetuada apenas depois de a hibridização ter ocorrido em

todas as amostras. Esta técnica deverá permitir reduzir a duração e o custo da produção

de microarrays, assim como aumentar a velocidade de aquisição de dados (Fixe et al.,

2004). Recentemente foi proposto um método para detecção visual, qualitativa e

75

simultânea, num chip de DNA, dos vírus da hepatite B (que, sendo de RNA, teve que

ser sujeito inicialmente a transcrição-reversa para gerar um molde de DNA), hepatite C

e HIV em amostras de sangue infectado (Wen et al., 2004). Os ácidos nucléicos foram

primeiramente amplificados por PCR multiplex para amplificação e detecção simultânea

de várias seqüências genômicas (Chamberlain et al., 1988) e, ao processo, foram

adicionados dUs biotinilados que se ligaram às cadeias em formação. A detecção foi

conseguida por meio de um sistema enzimático, usando fosfatase alcalina ligada a

avidina (fazendo uso da afinidade avidina / biotina). Através da formação de

precipitados púrpuras visualmente discerníveis no chip, utilizou-se o substrato

enzimático (5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfato) e um amplificador de sinal (azul de

nitro-tetrazólio). A originalidade do sistema de amplificação por PCR usado neste

trabalho permitiu solucionar alguns problemas típicos de PCR multiplex,

nomeadamente a maior probabilidade de amplificação não-específica e as menores

eficiência e sensibilidade de amplificação de cada seqüência do que em PCR

convencional, devido a potenciais interações cruzadas e competição entre os diferentes

pares de primers usados para amplificar seqüências diferentes (Brownie et al., 1997;

Polz & Cavanaugh, 1998). A explicação reside no fato de se ter combinado as vantagens

de PCR de primers imobilizados em série (arrayed anchored primer PCR) e de PCR

‘aninhada’ (nested PCR). A PCR de primers imobilizados em série (Westin et al.,

2000) é uma amplificação sobre uma superfície sólida à qual os primers são

imobilizados pela extremidade 5’. O molde de DNA, presente na fase líquida, hibridiza

então com os primers complementares imobilizados e a cadeia nascente é sintetizada

sobre eles por uma DNA polimerase. Como apenas uma hibridização perfeita pode

desencadear a elongação, pois híbridos não complementares não se ligam

eficientemente à superfície sólida, a amplificação não-específica pode ser altamente

diminuída. Por outro lado, a PCR ‘aninhada’ (Albert & Fenyo, 1990) utiliza dois pares

de primers para uma única seqüência: um par externo, que amplifica a seqüência-alvo

tal como em PCR convencional, e um par interno, que se liga ao produto amplificado no

primeiro ciclo e assim gera um segundo produto, de tamanho inferior ao primeiro.

Assim, se uma seqüência errada for amplificada indevidamente no primeiro ciclo, a

probabilidade de ser também amplificada no segundo ciclo é muito baixa. Deste modo,

o número de cópias da seqüência-alvo aumenta exponencialmente sem um aumento

correspondente das ‘falsas amplificações’, resultando no incremento da sensibilidade da

detecção. Esta técnica permitiu detectar cerca de 1 pg de fragmentos de DNA virais no

76

chip (Wen et al., 2004). Em geral, a imobilização de ácidos nucléicos em chips ainda

necessita ser otimizada para maximizar a sensibilidade e a especificidade, minimizar

hibridizações cruzadas e prevenir a baixa eficiência de hibridização devida às estruturas

secundárias do DNA-alvo (Bean, 2001). Embora os biochips de DNA sejam capazes de

detectar um grande número de genes num único ensaio, subsiste a dificuldade de

detecção ao nível celular sem prévia amplificação da(s) seqüência(s) genômicas a

detectar (Wang et al., 2005). No âmbito dos novos biossensores de DNA, deve

salientar-se a importância crescente que os formatos para análise microfluídica vêm

adquirindo nos últimos anos (Dittrich et al., 2006). Estes sistemas permitem evitar as

interferências químicas típicas do confinamento espacial dos elementos de

biorreconhecimento e de transdução, possibilitando, deste modo, que a miniaturação

seja acompanhada de eficiente transferência do sinal e de alta sensibilidade na detecção.

A elevada taxa de transferência de massa assim conseguida resulta da baixa distância

difusional e do elevado quociente superfície / volume (Ruf et al. 2006). Gulliksen e

colaboradores (Gulliksen et al., 2005) desenvolveram um microssistema para detecção

de um marcador cangerígeno (seqüências artificiais de genoma do papiloma virus

humano, susceptível de causar câncer cervical), provavelmente o primeiro relato de

detecção de mRNA amplificado por NASBA em tempo-real num microssistema; a

sensibilidade conseguida foi similar à dos métodos de diagnóstico convencionais, na

ordem de 10-6 μM. O grupo de Wei (Wei et al., 2005) conseguiu reduzir os volumes de

amostra e de reagente para 1 μl e o tempo de hibridização para menos de 10 minutos,

num sistema que integra os conceitos de μTAS e de microarrays; com este sistema

evitaram-se as limitações dos microarrays tradicionais, concretamente a necessidade de

utilizar volumes de reagente e solução relativamente altos, a velocidade difusional

comparativamente baixa das biomoléculas reagentes e o tempo superior a 1 dia

requerido para que a reação de hibridização seja completa; o limite de detecção obtido

foi 19 amol. Num outro trabalho (Smistrup et al., 2005), utilizaram-se dois tipos de

microesferas magnéticas ligadas a diferentes sondas de DNA num microcanal,

utilizando um separador magnético. Neste sistema, as duas microesferas funcionalizadas

conseguiram distinguir diferenças de um único oligonucleotídeo no DNA-alvo. O grupo

de Erickson (Erickson et al., 2005) implementou um método eletrocinético para

discriminar polimorfismos de um único nucleotídeo num sistema μTAS, o que foi

possível pelo controle rigoroso da temperatura na interface do microarray dispensando

o recurso a sensores externos de temperatura, comuns na maioria dos sistemas

77

microfluídicos. A grande vantagem deste sistema é, devido a esse controle apertado da

temperatura e, portanto, da estringência, a eliminação total de hibridização parcial entre

seqüências oligonucleotídicas parcialmente complementares, com óbvio aumento da

seletividade. Um sistema ultrasensível foi desenvolvido (Wang et al., 2005) para

quantificar vestígios de ácidos nucléicos, combinando espectroscopia de fluorescência

confocal, grampos de DNA um reator microfluídico para confinamento molecular num

volume de apenas 1 femtolitro. Este sistema permite detectar fluorescência de uma

única molécula em solução, eliminando assim uma etapa posterior para remoção das

moléculas não ligadas de sonda, com a vantagem adicional de diminuição significativa

do custo dos ensaios de hibridização tradicionais, geralmente muito onerados pelo custo

elevado das sondas. O limite de detecção atingido foi 14 zmol. Recentemente foi

relatado (Liao et al., 2006) um array de sensores microfluídico para detecção específica

de alvos de RNA ribossomal de vários patógenos bacterianos em fluídos humanos.

Depois de extraído das células bacterianas, o RNA foi detectado por

imunofluorescência, através da reação específica da peroxidase de rábano, conjugada a

um anticorpo marcado. O sensor atingiu o limite de detecção de 2600 células

bacterianas em cultura, com um tempo de detecção de 45 minutos. Usando detecção

amperométrica, foi possível obter praticamente 100% de sensibilidade na detecção de

bactérias gram-negativas sem necessidade de purificação nem de amplificação do ácido

nucléico.

Uma área de importância crescente no desenvolvimento de novos sistemas e

procedimentos bioanalíticos é a dos conjugados de DNA – proteína semi-sintéticos, que

podem ser formados tanto por síntese química de ligação covalente como por sistemas

não covalentes de reconhecimento molecular por afinidade, incluindo

complementaridade entre cadeias de DNA. A recente tendência de aumento do custo /

benefício da miniaturação progressiva dos atuais microssistemas produzidos por

fotolitografia tem sido argumentada em favor de uma orientação oposta, isto é, a

montagem de sistemas micromecânicos e estruturas biomiméticas funcionais na gama

de 5-100 nm (Niemeyer, 2001; Niemeyer, 2002). Entre os materiais conhecidos, o DNA

é particularmente atrativo para fabricação de nanossistemas devido a características

singulares que incluem: capacidade de uma cadeia simples com cerca de 20

nucleotídeos de ser especificamente detectada por outra cadeia com o tamanho e a

complexidade de um genoma eucariótico; grande rigidez mecânica de hélices duplas

pequenas, que se comportam como espaçadores rígidos entre dois componentes

78

moleculares eventualmente ligados nas suas extremidades; estabilidade fisico-química

relativamente alta; e susceptibilidade a manipulação e processamento altamente

precisos, ao nível atômico (na gama de ångstrom), por meio de ‘ferramentas’

moleculares naturais extremamente específicas, incluindo ligases, nucleases e outras

enzimas processadoras de DNA (Niemeyer, 2001). Além da utilização já rotineira do

sistema de afinidade avidina / biotina / estreptavidina em sondas de DNA e de ácidos

nucléicos peptídicos, mencionados acima, outros tipos de conjugados DNA–proteína

têm sido pesquisados e aplicados em nanobiotecnologia. Estes conjugados podem

ajudar a resolver alguns problemas básicos e recorrentes dos atuais biossensores, de que

é exemplo a síntese de um conjugado oligonucleotídico com uma lipase fúngica para

gerar uma sonda termoestável aplicável em ensaios de hibridização de DNA e em

biossensores (Kynclova et al., 1995). O grupo de Kerman (Kerman et al., 2005),

trabalhando com eletrodos de carbono screen-printed modificados com SWNTs,

estudou a interação da proteína SSB de Escherichia coli com ssDNA através de

medição dos picos voltamétricos de oxidação da sonda de DNA ligada ao SWNT e da

proteína SSB. Quando a proteína SSB se ligou ao ssDNA – para o qual tem grande

afinidade relativa -, o sinal de oxidação dos resíduos de guanina do mesmo diminuiu,

indicando obstrução provocada pela proteína à transferência de elétrons do ssDNA para

o eletrodo. Paralelamente, aumentaram os sinais relativos à oxidação dos resíduos de

tirosina e triptofano da proteína. Concomitantemente à hibridização da sonda com uma

cadeia complementar, ocorre o desligamento entre o ssDNA e a proteína, aumentando

agora o pico de corrente relativo ao DNA (neste caso, dsDNA) e diminuindo o relativo à

proteína. Mediante a amplificação de sinal gerada pelos SWNTs, atingiu-se um limite

de detecção de 0.15 mg/ml de DNA-alvo. Uma das aplicações mais revolucionárias e

promissoras na área dos conjugados de DNA - proteína é a dos detectores de moléculas

individuais, que visam mimetizar a maquinaria protéica celular, a qual lê e copia uma

molécula de DNA ou RNA de cada vez com extrema precisão, discriminando pares de

bases um-a-um (Vercoutere & Akeson, 2002). Uma abordagem iniciada na

Universidade de Cornell, EUA (Korlach et al., 2002), utiliza uma DNA polimerase

ligada a uma superfície de SiO2. Quando a polimerase incorpora um nucleotídeo

marcado com um fluoróforo numa cadeia nascente de DNA, a síntese pode ser

monitorada em tempo real. Usando quatro tipos diferentes de fluoróforos – um para

cada tipo de nucleotídeo -, deverá ser possível, em princípio, identificar o nucleotídeo

que está a ser incorporado, isolando a luz emitida por cada novo fluoróforo incorporado

79

da luz emitida pelos fluoróforos precedentes; isto pode ser feito por foto-branqueamento

desses fluoróforos precedentes ou ligando cada fluoróforo ao grupo pirofosfato terminal

do nucleotídeo que está a ser lido e que, depois de se formar a ligação covalente com

um novo nucleotídeo, é liberado. Outra abordagem tem sido desenvolvida nas

Universidades da Califórnia e de Harvard, EUA (Voss, 1999), e envolve o conceito de

nanoporo de DNA, que consiste em imobilizar covalentemente uma cadeia simples de

DNA ou oligonucleotídeo no lúmen de um poro nanométrico de α-hemolisina de

Staphyloccocus aureus. Esta estratégia baseia-se em conclusões de trabalhos anteriores

(Henrickson et al., 2000; Kasianowicz et al., 1996), segundo as quais moléculas de

ácidos nucléicos produzem ‘assinaturas’ de correntes iônicas quando atravessam canais

iônicos de α-hemolisina (figura 34).

Figura 34 - Detecção de hibridização de DNA num nanoporo de α-hemolisina. (a)

Visão transversal do nanoporo heptamérico de α-hemolisina ligado a um ssDNA. O

sinal ⊕ indica um potencial positivo aplicado no lado trans da membrana, para o qual é

impulsionado o ssDNA (carregado negativamente) a partir do lado cis. (b) ‘Assinatura’

de corrente típica de um duplex de DNA totalmente complementar formado entre o

ssDNA imobilizado (oligo-1) e uma cadeia recém-chegada (oligo-2G); B representa os

eventos individuais de ligação específica entre o oligo-1 e o oligo-2G, e T os eventos de

translocação do oligo-2G que não se ligou ao oligo-1. (c) ‘Assinatura’ de corrente

relativa à ligação parcialmente complementar entre o oligo-1 imobilizado e o oligo-2C

recém-chegado. Neste caso, apenas se observam eventos T (retirado de Niemeyer,

2002).

80

O conjugado é capaz de detectar, com resolução de uma única base, cadeias-alvo

que passem e eventualmente se liguem à sonda imobilizada, por medição da variação na

corrente iônica que flui pelo nanoporo (Howorka et al., 2001). Porém, o sistema ainda

apresenta algumas deficiências para a seqüenciação de nucleotídeos. Uma delas advém

de cerca de 12 nucleotídeos ocuparem o poro transmembranar e de cada um deles

contribuir para a resistência total observada, o que obscurece o efeito de qualquer

nucleotídeo individual (Meller et al., 2001); a outra deriva de, à temperatura ambiente e

ao potencial de 120 mV, cada nucleotídeo da cadeia atravessar o poro em apenas 2 ms,

um evento demasiado breve e que, por isso, só pode ser resolvido a freqüências bastante

superiores a 10000 kHz. Esta é a freqüência geralmente usada para reduzir o ruído

instrumental e, assim, discriminar diferenças na corrente dependentes da seqüência

nucleotídica. A utilização de freqüências mais altas, porém, pode obscurecer estas

diferenças (Vercoutere & Akeson, 2002). Conseqüentemente, é provável que um

aparelho de seqüenciação de DNA baseado em nanoporos deva, no futuro, incluir uma

enzima que regule a velocidade de translocação do DNA ao longo do poro, diminuindo-

a de microssegundos para milissegundos por nucleotídeo. Seja como for, a resolução de

moléculas individuais com biossensores de nanoporos constitui uma alternativa ao

princípio geral de detecção com microarrays, usando séries extensas de sondas de

DNA. Os nanoporos poderão, assim, representar a próxima geração de biossensores de

DNA (Vercoutere & Akeson, 2002).

O reconhecimento de DNA tem sido considerado lento porque os protocolos

tradicionais de hibridização em filtro demoram cerca de 20 horas (Wolcott, 1992),

embora muitos biossensores atuais já produzam resultados em menos de uma hora. No

entanto, continua por se desenvolver um genossensor verdadeiramente simples, rápido e

de baixo custo para uso rotineiro, o que é especialmente limitativo em aplicações

clínicas (Fortina et al., 2002). Ao se desenvolverem biossensores para aplicações in

vivo, deve tomar-se em consideração o interesse clínico de se monitorar continuamente

um analito particular (Turner et al., 1987). Em muitas aplicações relacionadas com

diagnóstico clínico, os genossensores atuais enfrentam ainda o problema de os ácidos

nucléicos se encontrarem, in vivo, em concentração demasiado baixa para poderem ser

detectados sem prévia amplificação por PCR (Teles et al., 2005). No entanto, atendendo

à elevada estabilidade química do DNA comparativamente a outros elementos de

biorreconhecimento, tais como enzimas e anticorpos, o futuro desenvolvimento de

81

biossensores de DNA, em particular para uso clínico, parece ser altamente promissor

(Junhui et al., 1997).

82

2. OBJETIVOS

2.1 OBJETIVO GERAL

Desenvolvimento de um biossensor para detecção específica de um modelo do

genoma do vírus da dengue e eventual identificação dos quatro sorotipos virais.

2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

• Desenvolvimento de um biossensor eletroquímico de DNA para detecção

específica de uma seqüência oligonucleotídica conservada do genoma do vírus

da dengue, através do pico de oxidação do ferroceno, usado como indicador

eletroativo de hibridização, por voltametria cíclica, utilizando um eletrodo de

carbono vítreo modificado com um filme de quitosana.

• Otimização do biossensor relativamente a vários parâmetros referentes ao meio e

ao eletrodo, incluindo o pH, as concentrações de DNA-sonda e DNA-alvo e os

tempos e temperaturas de imobilização e hibridização.

• Aplicação do biossensor otimizado à identificação específica de seqüências

oligonucleotídicas-modelo do genoma de cada um dos quatro sorotipos do vírus

da dengue.

83

3. PUBLICAÇÕES 3.1 “TRENDS IN DENGUE DIAGNOSIS”

Teles, F.R.R.; Prazeres, D.M.F.; Lima-Filho, J.L. 2005. Reviews in Medical

Virology, 15: 287-302.

Rev. Med. Virol. (in press).Published online in Wiley InterScience (www.interscience.wiley.com).

Reviews in Medical Virology DOI: 10.1002/rmv.461

Trends in dengue diagnosisF. R. R. Teles1, D. M. F. Prazeres2 and J. L. Lima-Filho1*1Laboratorio de Imunopatologia Keizo-Asami (LIKA), Universidade Federal de Pernambuco, Av. Prof.Moraes Rego, 1235, Campus Universitario, Cidade Universitaria, Recife, PE-CEP: 50670-901, Brazil2Centro de Engenharia Biologica e Quımica, Instituto Superior Tecnico, Av. Rovisco Pais, 1049–001 Lisbon,Portugal

SUMMARY

The conventional diagnosis of dengue virus infections includes the detection of the virus in serum or tissue samples,both by isolation in culture or through detection of specific viral molecules (genome RNA or dengue antigens)and detection of specific anti-dengue antibodies (serology). Isolation of dengue virus provides the most direct andconclusive approach to diagnosis, despite the demand for high-level equipment, technical skills and manpower.However, it is useless in early diagnosis because several days are required to isolate and classify the virus. Serology,despite being simpler, is not able to afford an accurate early diagnosis in primary infections because 4–5 days arerequired for the immune system to produce a sufficient amount of antibodies. Moreover, it leads to misleading resultsin secondary infections owing to cross-reactivity among serotype-specific antibodies and with other flavivirusantibodies. The RT-PCR and other PCR-based techniques are fast, serotype-discriminating, more sensitive andeasier to carry out than conventional nucleic-acid hybridisation, but are handicapped by easy sample contaminationand high technological demands. Recently, advances in bioelectronics have generated commercial kits and newtechniques for detection of dengue antibodies and RNA, based on biosensor technology. Most of them are rapid, easyto operate, reusable, cheap, sensitive and serotype-specific. Nevertheless, their accuracy is still questionable becausemost still lack validation and standardisation. This review summarises and describes the techniques currentlyemployed and anticipated in the near future for diagnosis of dengue disease. Copyright # 2005 John Wiley

& Sons, Ltd.

Received: 20 August 2004; Revised: 17 September 2004; Accepted: 3 December 2004

INTRODUCTIONDengue virus belongs to the Flavivirus genus of theFlaviviridae family and is transmitted to humans byinfected Aedes aegypti or Aedes albopictus mosqui-toes. Dengue viruses include four antigenicallyrelated serotypes (DENV 1–4), all of which causedisease. The diameter of the icosahedral nucleo-capsid is 45 nm. The capsid is surrounded by alipid bilayer with three structural proteins, includ-ing a glycoprotein-E responsible for attachment to

host cells which is recognised by specific antibo-dies. Dengue virus contains a single-strandedRNA (ssRNA) of 11 kb in length, Mr 4000, with asingle ORF flanked by two non-translated regionsat each end, plus seven sequences for the synthesisof non-structural proteins [1–3].After an incubation period of up to 2 weeks,

coinciding with the appearance of dengue virusparticles in the blood, non-specific symptomsarise, including high fever, headache, joint pain,nausea, vomiting, retro-orbital pain, weaknessand a rash known as ‘dengue fever’. If the patientis young or is re-infected by a different dengue ser-otype, the pathology may evolve to ‘dengue hae-morrhagic fever’ (DHF), when blood capillariesbecome too permeable, allowing fluid to escape.Bleeding is probably caused by activated plateletsderived from damaged capillary endothelium [4].This leads to extremely high fever, haemorrhagicmanifestations, hepatomegaly and circulatory fail-ure. If treatment is not administered promptly,hypovolaemic ‘dengue shock syndrome’ (DSS),

RR EE VV II EE WW

Copyright # 2005 John Wiley & Sons, Ltd.

*Corresponding author: Dr J. L. Lima-Filho, Laboratorio de Imunopa-tologia Keizo-Asami (LIKA), Universidade Federal de Pernambuco,Av. Prof. Moraes Rego, 1235, Campus Universitario, Cidade Univer-sitaria, Recife, PE-CEP: 50670-901, Brazil.E-mail: Jose_Luiz60@terra.com.br

Abbreviations usedCF, complement fixation; DENV, dengue virus; DHF, dengue hae-morrhagic fever; dsDNA, double-stranded DNA; DSS, dengue shocksyndrome; HI, haemagglutination inhibition; MAC-EIA, monoclonalantibody (IgM) capture—enzyme immunoassay; NASBA, nucleicacid sequence-based amplification; NSI, non-structural protein-1;RIA, radioimmunoassay; RTC, reversible target capture; ssRNA,single-stranded RNA

caused by severe plasma leakage, may appear—which has a high mortality rate. Natural andexperimental infection in humans and primates,respectively, has shown that dengue virus infectsand replicates in vivo within mononuclear phago-cytic cells [2,5]. It is likely that vascular endothe-lium is destroyed both by direct infection and byindirect targeting via mediators released bymacrophages [6].Dengue virus is nowadays the most important

arthropod-spread virus affecting humans existingin more than 100 countries worldwide [7,8]. Thedisease is endemic in most tropical and sub-tropi-cal regions and a potential threat to more tempe-rate countries, even in Europe and USA [9–11].Dengue fever is considered one of the great emer-ging diseases of the near future. It is estimated thataround half of the world population is at risk, withan annual incidence of 100 million cases of denguefever and over 45 0000 cases of DHF [2,12,13]. Thethreat of dengue disease expansion comes fromthe increase in air travel, which has brought tour-ists to endemic areas and also taken new denguevirus strains to susceptible populations. Due tothe spread of both virus and hosts throughoutthe world, dengue has become epidemic, espe-cially in urban areas [12–14]. Tropical habitatshave been subjected to major ecological changesin the past decades, exposing humans to pro-longed contact with dengue virus. Moreover,increasing human populations and the collapseof mosquito control programmes in many coun-tries have led to the spread of dengue virus world-wide [15,16]. In 2001, unprecedented epidemicoutbreaks of dengue disease occurred in the Amer-icas, Asia and Pacific islands [4]. The severe formsof the disease emerged in Southeast Asia in the1950s and 1960s and increased abruptly in theAmericas in the past 20 years. Recent outbreakshave occurred in Brazil, Venezuela, Colombiaand French Guiana [17].At present, neither effective vaccines nor drugs

are available to prevent and treat the diseasecaused by dengue virus. Treatment is merelysymptomatic and, apart from the life-threateninghaemorrhagic and shock pathologies which aretreated by fluid replacement, the treatment of theless severe dengue fever is limited to the use ofanalgesics. Control of vector mosquitoes is cur-rently the most effective measure to prevent thedisease. At the individual level, chemical repel-

lants and mosquito barriers are widely used andrecommended [3]. At the population level, com-mon approaches include chemical control of mos-quito populations and biological control throughthe use of bacteria [18]. A multivalent vaccine, cap-able of stimulating the immune system of an indi-vidual to induce protection against all the fourdengue virus serotypes, is urgently needed. Can-didate laboratory-attenuated strains and plasmidDNA vaccines are still in the early stages of labora-tory testing, production and validation [19–22].Until safe and effective vaccines become available,early diagnosis is the key to survival in the case ofthe more severe forms of dengue disease. None-theless, clinical diagnosis of dengue virus diseaseis often inconclusive since the symptoms areusually non-specific. Specifically in the earlyphase, these symptoms often cannot be distin-guished from those of other infections, such asmalaria, leptospirosis, scrub typhus, measles, yel-low fever, influenza, West Nile, Japanese and StLouis encephalitis. For this reason, a definite con-firmation of the disease requires specific virologi-cal or serological techniques [23]. The dramaticburst of dengue cases in the Americas has raisedthe need for evaluation of diagnostic proceduresamong different laboratories [24]. As an example,the newly introduced DENV-3 serotype in Brazilhas shown the importance of ongoing monitoringof new serotypes and genotypes for surveillancepurposes [25].This article gives an overview of standard and

more recent techniques employed in health-carefacilities and research laboratories for denguevirus diagnosis.

PROFILE OF THE IMMUNE RESPONSEIN THE HOSTIn a typical human dengue infection, about 0.1% ofthe peripheral blood mononuclear cells becomeinfected a few days after the mosquito bite. Theonset of fever, which lasts for 2–7 days, indicatesbroad dissemination of the infection. Anti-dengueneutralising antibodies of IgM and IgG isotypesare produced which do not confer cross-immunityto the other serotypes [8].In individuals never infected before with a flavi-

virus nor immunised with a flaviviral vaccine, theprimary antibody response consists of a massiveproduction of the dominant IgM (Figure 1A).Detectable levels of anti-dengue IgM antibodies

F. R. R. TelesF. R. R. Teles et al.et al.

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by the EIA method (see section below) are presentafter several days of fever, rising quickly until apeak is reached, approximately 2 weeks after theonset of symptoms, and declining to undetectablelevels over 2–3 months [7,26]. Shortly afterwards, alower level of anti-dengue IgG appears. Serologi-cal tests may identify a specific dengue serotypeearly in the disease, since the antibodies producedin that phase are serotype-specific. Months afterinfection, in the convalescent phase, the antibodyspecific for the infecting serotype may be detected[7] but cross-reactive antibodies produced mean-while may mislead determination of the correctserotype. The efficiency of serological diagnosisof dengue infections may be hindered by commoncross-reactive antigenic determinants among thefour serotypes [20].

A secondary antibody response, which corre-sponds to most cases of DHF, occurs in individualspreviously infected or immunised with a flavi-virus. As can be seen in Figure 1B, it is charac-terised by a predominance of IgG, before orsimultaneously with the production of a smalleramount of IgM, whose level reaches a peak atabout 2 weeks after the onset of symptoms. TheIgM levels are much lower (or even absent) in asecondary than in a primary infection, despitesimilarities in the kinetic profile of production[7,27]. Once detected, IgG levels increase rapidly,reaching a maximum about 2 weeks after the onsetof symptoms, and then decrease slowly over 3–6months. These preformed antibodies confer life-long immunity to the specific serotype that caused

the primary infection [28]. Rapidly increasingamounts of neutralising antibodies, during theonset of fever, affect dengue virus recovery fromserum [7]. This immune enhancement phenomen-on probably occurs because antibodies from a pre-vious infection allow the new cross-reactiveserotype a greater access to macrophages, via anti-body-dependent immune enhancement, causingincreased lysis of the infected macrophages, andgreater release of inflammatory mediators. Theenhancing infectivity in dengue disease relies onthe Fc receptor-mediated uptake of immune com-plexes by macrophages [16]. Both in vivo and invitro studies have shown that virus–antibody com-plexes are essential for infection of mononuclearphagocytes by dengue viruses [29]. More infectingviral particles increase the number of infected cells,which is correlated with the more severe forms ofthe disease (DHF/DSS) and involves hyperacti-vation of the complement system [30–32]. In DHF,the combined effects of low-grade persistent infec-tion and weak antibody response lead to chronicimmune-complex formation and eventual deposi-tion of immune complexes in the tissues [30].

CURRENT METHODS FOR SPECIFICDENGUE DIAGNOSIS

SerologyThe infecting dengue serotype is usually deter-mined by measuring a four-fold or greater rise inantibodies to that particular serotype. Serum isusually suitable for testing even after prolongedexposure to a tropical climate because antibodiesare not easily inactivated by harsh treatment ofspecimens. In addition, the techniques are rela-tively simple and some reagents are commerciallyavailable. However, in practice, serological diag-nosis is in general less specific than diagnosis byculture. All too often, the most precise serologicaldiagnosis that many laboratories can provide is‘acute flavivirus infection’ rather than ‘acute den-gue infection’. Specific diagnosis is often only pos-sible in primary infections; in secondary infectionsand in multiple flaviviral infections, the identifica-tion of the specific serotype is frequently impos-sible because of extensive cross-reactivity ofantibodies to flaviviruses, particularly betweendengue viruses [33]. This is a major constraint formost travellers who are prevaccinated againstJapanese encephalitis and yellow fever, in that

Figure 1. Profile of immunoglobulins M (thin line) and G (thick

line) production in the course of dengue virus primary (A) and

secondary (B) infections, a few days after the onset of fever. In

a primary infection, the predominant IgM reaches a peak and

then declines simultaneously with IgG to basal levels. In a sec-

ondary infection, the elicited production of IgG is much more

pronounced than that of IgM. In addition, the time interval dur-

ing which detectable levels of antibodies in the blood are

observed is significantly prolonged for IgG compared with IgM

Trends in dengue diagnosisTrends in dengue diagnosis

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specificity of a serological test is usually lower inprevaccinated individuals [34]. Serum frompatients with autoimmune diseases may showfalse-positive reactions in dengue serologicaldetection tests [35] and polyclonal B-cell activationmay also lead to false-positive results. By specifi-cally detecting anti-dengue IgM responses, amore accurate diagnosis of flavivirus infectionsmay be achieved, although this may not allowdetermination of the specific dengue serotypecausing the infection. Another factor complicatingflavivirus serology is the phenomenon called ‘ori-ginal antigenic sin’, by which B-cells responding toa first flavivirus infection are restimulated tosynthesise antibodies with a greater affinity forthe first than for the current infecting virus inevery subsequent flavivirus infection. A confirma-tory diagnosis requires the use of paired serumsamples, which is more time-consuming [7,23,28].The antigen battery for most of the serological testsshould include the four dengue serotypes, anotherflavivirus, a non-flavivirus (e.g. chikungunya) andan uninfected tissue control antigen [36].The main techniques usually employed in sero-

logical diagnosis of dengue infections are as fol-lows [7].

EIAThe EIA format has been successfully applied foryears to detect and distinguish IgG and IgM anti-bodies to dengue and to other flaviviruses [37,38].The technique is very sensitive and widely usedsince it is readily available as a commercial kit,allowing a large number of determinations simul-taneously and in a short time. This is of mainimportance in laboratories with high volumes oftesting [7,30]. Usually, serum dilutions, platewashers and plate readers are present in mostlaboratories to perform multiple EIA assays [23].In cases where only a single specimen is avail-

able, the test allows diagnosis of recent denguevirus infection even in primary infections. Follow-ing a primary or a secondary infection, this test canmeasure a rise in dengue-specific IgM, even inserum samples collected early in the acute phase(5–7 days after the onset of symptoms). One ofthe main advantages of the test is the ability to dis-tinguish primary from secondary infections basedon the IgM/IgG ratio. In primary infections, theIgM/IgG ratio in acute or convalescent sera usual-ly exceeds 1.5, whereas in secondary infections, the

quantity of IgG antibodies is much higher thanthat of IgM antibodies (Figure 1). By thistechnique, a diagnosis of recent or acute dengueinfection can be made against a set of flaviviral-specific antigens, since anti-flavivirus IgM iscomplex-specific (IgM elicited by a given flavi-virus can be generally differentiated from IgM eli-cited by other flavivirus). This is especiallyadvantageous when undifferentiated symptomsin the early stages of flaviviruses are present.Another advantage of this technique is the possibi-lity of detecting anti-flaviviral IgM in the cere-brospinal fluid which, together with the fact thatIgM usually do not cross the blood–brain barrier,implies replication of dengue virus within the cen-tral nervous system of the host, and not in theblood cells [7].The classical dengue monoclonal antibody

(IgM)—capture EIA (MAC-EIA), recommendedby the World Health Organization for serologicaldiagnosis of dengue infections, is inexpensive,simpler, faster and provides more informationthan other serological tests [38–40]. Nevertheless,wider use is handicapped by the fact that itrequires at least 5 days after infection beforedetectable anti-dengue antibodies can be producedby the immune system of the host [34,41]. Due tothe occurrence of some flavivirus cross-reactivity,results of other serological, virological and epide-miological tests must be considered for a conclu-sive diagnosis [7]. Owing to the persistence ofIgM antibody after a primary infection, false-posi-tive results are frequent even after some months.The test is of great usefulness for clinical surveil-lance in dengue non-endemic regions, where it iscertain that any positive results are recent infec-tions. Despite being slightly less sensitive thanthe HI test (see below) for diagnosis of dengueinfections, the EIA test provides faster results, isless costly and often requires only one blood sam-ple [34,36].New EIA kits for detection of anti-dengue anti-

bodies and antigens have been described[34,35,42–45]. Some of them are less time-consum-ing and technically demanding than MAC-EIA,and claim specific and sensitive detection in bothprimary and secondary infections. Nevertheless,the lack of proper validation and standardisationis still a major problem. The evaluation of thesediagnostic kits requires a multi-institutional study[46,47].

F. R. R. TelesF. R. R. Teles et al.et al.

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HI-testThe haemagglutination-inhibition (HI) test fordengue is simple and more sensitive than electro-phoretic methods, being able to detect less than1 mg/ml of antibodies [30]. Moreover, reagentsmay be prepared locally and the equipmentrequirement is minimal. Some HI antibodies maypersist for long periods, of 50 years or more;thus, the test is suitable for epidemiological stu-dies [36,48]. The test has been successfully appliedin dengue diagnosis for some decades, includingin the form of simple, fast, sensitive and specificserological kits [49,50].

A major drawback of the method is the require-ment for chemical pretreatment to remove non-specific inhibitors of haemagglutination, andfurther absorption with red blood cells to removenon-specific agglutinins. Moreover, the test usual-ly does not discriminate infections caused byclosely related flaviviruses, nor is it serotype-spe-cific, due to cross-reacting dengue antibodies. Itrequires paired sera for optimal use and, if thepaired acute and convalescent sera are collectedless than 7 days apart from each other, the HItest probably will not afford a diagnosis in a pri-mary infection, since there was not enough timefor the HI antibody level to rise. However, someprimary infections may show a response corre-lated with the virus isolated [36]. The response toa primary dengue infection is characterised byslow evolution of the HI antibody. Since the HItest does not differentiate among immunoglobulinisotypes, the detection of a primary antibodyresponse derives from the absence or low level ofdetectable antibody in the acute-phase serum. Incontrast, the evolution of the HI antibody in asecondary antibody response to a dengue infectionis rapid. In this case, since all antibodies arebroadly flavivirus-reactive, a specific and conclu-sive diagnosis requires results from additionaltests [7,16].

CF-testUnlike the IgM or the HI antibodies, which appearwithin 5–7 days, the CF antibody appears later,within 7–14 days after the onset, and persists forshorter periods, a marker of recent infection. Asecondary immune response is characterised by afour-fold rise in the CF antibody when the acuteand convalescent sera are collected within lessthan 2 weeks [7,36].

CF is the least sensitive serological test for den-gue, which explains why it has been replaced byother methods [7]. On the other hand, althoughdelayed compared with other tests, CF is highlysensitive in primary infections [36].

Neutralisation testAfter a primary dengue infection, moderately spe-cific neutralising antibodies are detected in earlyconvalescence. Following a secondary infection,neutralising antibodies are produced, against atleast two and usually all dengue serotypes, andagainst other flaviviruses as well. In many combi-nations of sequential dengue infections, the neu-tralising antibody produced in higher amounts inconvalescent serum is specific to the virus thatcaused the primary dengue infection [7]. In gener-al, the test is not reliable in determining the infect-ing serotype except in primary dengue infections.Since the neutralising test is more sensitive thanthe HI test, neutralising antibodies may bedetected even in the absence of HI antibodies [36].As in the HI test, the neutralisation test has the

potential problems of nonspecific inhibition by ser-um factors other than the specific antibody and therequirement for paired serum samples, thus delay-ing a confirmatory diagnosis [16,23]. Moreover, thetest is expensive, time-consuming and technicallydifficult, thus explaining why it is not routinelyused in many diagnostic laboratories [36]. Unlikethe previous serological methods, the neutralisa-tion test employs live virus, which restricts itsmanipulation to Biosafety Level 3 Laboratories.The neutralisation test measures only neutrali-sation epitopes, which vary between differentflaviviruses. A faster neutralisation test usesmammalian new-born hamster kidney BHK-21cells [51].It seems to be possible to distinguish between

closely related flaviviruses by combining the highspecificity of wild-type viruses with the improvedbiosafety of attenuated viruses. The approachrelies on the use of hybrid chimeric viruses formedfrom an attenuated vaccine strain (e.g. yellowfever) as a backbone virus into which one ormore structural proteins have been replaced bythe corresponding structural proteins of the virusto be tested, e.g. dengue virus [52]. Certain denguevirus strains have also been used as chimeric vec-tors for the testing and production of tetravalentdengue virus vaccines [21,22].

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Dot-blot immunoassayThe immunoblotting technique is relatively newand procedures and reagents continue to evolve.The technique requires virus purification and gelelectrophoresis, which is a major constraint forroutine diagnosis, especially in small laboratories.Moreover, the accuracy of membrane-based tech-niques is strongly dependent on subjective inter-pretation, which is aggravated by nonspecialisedpersonnel operating dengue diagnostic kits. How-ever, similar specificities and sensitivities withthose of more established EIA assays have beenreported [46]. Recently, recombinant purified Bdomains of dengue virus serotypes 1–4 wereapplied in immunoblot strips to detect serotype-specific antibodies in serum samples, stainedaccording to routine procedures by using peroxi-dase-labelled rabbit anti-human serum [53]. Agood correlation between the results of immuno-blot strips and type-specific RT-PCR was observedin primary infections (see below) [54]. Otherimmunoblot kits for dengue diagnosis have beenavailable for several years [3,47,55,56], despitebeing usually unable to detect antibodies to theNS1 protein in primary infections. A recent reportdemonstrated the detection of dengue NS1 antigenin serum or plasma in the absence of anti-dengueIgM antibodies, with some advantages over RT-PCR (see section on PCR-based techniques),namely the possibility of storing the samples at4�C for retrospective testing and the absence ofcontamination due to the higher stability of anti-gens [57].

Virus detection

Isolation in cultureOne of the traditional methods for isolation of den-gue viruses is intracerebral inoculation of newbornmice [58]. However, the lack of a high neurotropicactivity of the virus makes it the least sensitivemethod of isolation [16]. In contrast, inoculationof clinical specimens (serum, plasma and othersterile body fluids) into mosquito cells, larvae oradult mosquitoes is the most sensitive approachfor dengue virus isolation in culture [59]. It is fre-quently followed by specific detection and identi-fication of the virus by immunofluorescence assaysemploying serotype-specific anti-dengue monoclo-nal antibodies (see section on antigen detection).The binding of a specific monoclonal antibody is

revealed with a second, labelled antibody [7,60].The cytopathic effect can also be assayed in mam-malian cells [36]. Unfortunately, some mammaliancell lines have low or no sensitivity for differentdengue virus serotypes and strains may, in turn,require an adaptation period after the inoculationof cell cultures [61]. Mosquito cells are more sensi-tive for the recovery of dengue viruses than mam-malian cells, and are easily grown and stocked atroom temperature. A growing-medium which isstable for at least 2 weeks and simple performanceare further advantages [62–64]. Cells from thegenus Toxorhynchites and Aedes are frequentlyused for inoculation [16,62,65] as in the inoculationof live mosquitoes [64,66]. The advantages of Tox-orhynchites are its large size, thus facilitating inocu-lation and, as with other mosquitoes, a lowercross-contamination of cultures. However, high-sensitivity requires the inoculation of many mos-quitoes, due to the low inoculation volume, andproduction of Toxorhynchites mosquitoes in labora-tory is fastidious, since larvae are carnivorous andrequire co-production of another mosquito speciesas a food source. Adult male mosquitoes of Aedesaegypti and Aedes albopictus species are easier tomaintain but, owing to their smaller size, theyrequire more delicate inoculation techniques.When colonised mosquitoes are not available, theabove mentioned mosquito cell lines can be usedfor inoculation. The sensitivity thus obtained isusually lower than with live mosquitoes, but theutilisation of a larger inoculum volume permitsenough sensitivity for routine virus isolation[7,67]. Furthermore, cell cultures have higher isola-tion rates and do not require special facilities orhigh technical training [16]. Days to weeks arenecessary for successful virus isolation; moreover,the presence of only small amounts of viable virusin the inoculum, the formation of virus–antibodycomplexes and inappropriate handling of samplesmay decrease the efficiency of the technique [28].Owing to the high antibody titre, dengue virus isonly rarely isolated from blood during the acutephase of a secondary infection, thus suggestingthe use of mosquito inoculation or macrophagecell lines as virus recovery systems [29]. Themain disadvantages of dengue virus detection byculture are its inability to provide a successfuldiagnosis in the brief initial period after the onsetof fever, the heat-lability of dengue virus, the highcost of equipping and maintaining laboratories for

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virus culture and the interference caused by largeamounts of antibodies and subsequent immunecomplex formation. Obtaining the specimen earlyin the disease and prompt delivery to the labora-tory greatly affect the performance of virus isola-tion [16].

Antigen detectionDengue viral antigens may be detected in periph-eral blood leukocytes from dengue patients, espe-cially during the febrile phase of illness [7,23]. Ingeneral, visual detection of dengue virus antigensis performed in acetone-fixed leukocytes, snap-fro-zen tissue or in formalin-fixed tissue (to removethe lipids), after partial digestion by proteases toreveal antigens cross-linked by formalin [7]. Viralantigens circulate in the patient’s blood for longerperiods than viral RNA; therefore, detection of vir-al antigens may afford a positive diagnosis insituations where viral RNA is not detectable [57].Monoclonal antibodies may be inefficient for iden-tification of dengue viruses in culture owing to thelow viral replication rate, resulting in low viralconcentration in the tissue [16]. Nonetheless,immunofluorescence tests have become routinelyused in most diagnostic laboratories for denguevirus diagnosis [64,68,69].

Genome detectionThis can be done by nucleic acid hybridisation andPCR-based techniques.

Nucleic acid hybridisation. In situ hybridisationcoupled with electron microscopy has been usedfor ultrastructural studies and diagnosis of dengueRNA detection within mosquito cells [70,71]. Somenucleic acid hybridisation procedures for thedetection of dengue RNA extracted from infectedcell cultures and live mosquitoes using both bioti-nylated and 32P-labelled probes have also beendescribed [72,73]. Radiolabelling has been gradu-ally discarded due to the well-known constraintsof dangerous radioactive materials. The biotinyla-tion method is less sensitive and so not very usefulfor viral identification in clinical samples, unless aprior step of amplification is performed by PCR[16]. This is the main reason why hybridisationhas been replaced by PCR for direct virus detec-tion and identification.

Nevertheless, a novel in situ hybridisation proto-col was developed for detection of dengue RNA in

mosquitoes. The sandwich technique, called rever-sible target capture (RTC) hybridisation, utilisestwo DNA probes: a poly(dA)-tailed capture anda digoxigenin-labelled detector probe. After hybri-disation of both probes to the target dengueRNA, the former probe is captured by oligo (dT)-coated paramagnetic beads and the specific hy-brid is detected through the labelled probe. Thetechnique can be directly applied in the tissue,thus eliminating the steps of extraction and puri-fication of the target genomic material. Goodsensitivity, rapidity and simplicity of operationare claimed [74].

PCR-based techniques. Dengue viral RNA genomemay also be detected in tissue or serum samplesfrom humans or in mosquitoes by reverse-tran-scription–polymerase chain reaction (RT-PCR)amplification technique [7,23,28,75–77]. The detec-tion of dengue virus by this technique is no lesscomplex or expensive than virus culture in mos-quito cells, but is faster, more sensitive and allowsdetection of viral particles in serum containingonly few copies of viral genome or anti-dengueantibodies [77]. The combination of the two re-actions—reverse transcription of the viral RNAgenome to a cDNA copy and subsequent Taq poly-merase-mediated amplification of this cDNA—in a single reaction vessel greatly decreases theassay time and the risk of contamination, whichis traditionally one major handicap in PCR, andfacilitates handling of a large number of speci-mens. The RT-PCR technique is already a verypowerful investigational approach in epidemiolo-gical analysis and evolutionary studies, since thebasic methodology of directly amplifying RNAinto DNA can be used to amplify larger regionsof the genome for rapid sequence analysis [7,28].The technique was useful for detecting and typingdengue viruses in suspected cases, allowing arapid identification of new serotypes in endemicareas [75].The use of dengue-specific oligonucleotide pri-

mers during the cyclic amplification processallows the amplification of only a few dengueRNA molecules among millions of other RNAmolecules. This technique is less time-demandingthan biological amplification through culture (itcan be performed in a few hours) and allows mil-lion-fold enzymatic amplification. It also avoidscontamination from immune complexes, since

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dengue RNA can be purified from proteins in aprior step of specimen preparation. This is espe-cially important in diagnosis during convales-cence, when high titre antibodies usually hamperdengue virus detection. Another advantage ofthe RT-PCR technique is the possibility of directlydetecting not only the presence or absence of thevirus, but also all the four dengue serotypes.This may be achieved by adding four serotype-specific sets of oligonucleotide primers (selectedfrom the published sequence data of the four den-gue virus serotypes [78–80]) to a single reactiontube or, in a two-step strategy, using a universalset of dengue oligonucleotide primers followedby a subsequent classification step with serotype-specific primers [7,28,81]. These serotype-specificprimers are usually designed for targeting sero-type-specific sequences within the regions flankedby the outer, universal primers. The amplifiedsequences of the four serotype-specific primershave different sizes, as revealed by stained agarosegel electrophoresis, of infected culture fluid of iso-lates in dengue patients or in prototype viruses[76]. Prior use of primers homologous to con-served dengue virus RNA sequences assures thatall strains of dengue virus are amplified in thefirst-round amplification reaction. However, thespecificity of the technique is based on the abilityof the type-specific primers to recognise RNAsequences unique to each dengue virus type.According to a previous study [28], no cross-reac-tivity was detected between the type-specific pri-mers and heterologous dengue virus types; onlya single amplified product was obtained in eachtyping reaction. In comparison to hybridisation,another current method for confirmation of theamplification product, the RT-PCR method ismore sensitive and easy to carry out, because itrequires only electrophoresis of the amplified pro-duct, whereas hybridisation requires labelling,purification and standardisation of probes.The current use of the RT-PCR method as a

diagnostic tool, however, is still hindered by themeticulous manipulation required both for opti-mal preparation of specimens and to avoid false-positive results due to contamination [82]. Thestorage of serum samples at �70�C is essentialfor RT-PCR to maintain viral RNA in optimal con-ditions, but this is not feasible in many areaswhere dengue disease is endemic [57]. Whenapplied to dengue diagnosis, it is still necessary

to determine the oligonucleotide primer sequencescapable of detecting all or most dengue genotypesin circulation [7]. Real-time PCR can give informa-tion about the kinetic profile of the amplificationprocess, by monitoring the dynamic change inintracellular dengue virus RNA during the courseof infection [2]. By using a generic fluorogenicprobe highly homologous with all dengue virusserotypes and appropriate sets of serotype-specificprimers, it is possible to detect all the four denguevirus serotypes with high sensitivity and withoutcross-reactivity among the different serotypes.With this procedure, very low detection limits ofthe four dengue serotypes can be achieved [81,83].Many of the reported works claiming detection

of dengue virus based on RT-PCR, and agarosegel for confirmation of the results, use dengue gen-ome coding sequences, namely those responsiblefor the expression of the viral envelope protein-Eand nonstructural proteins NS3 and NS5, as con-served sequences among the four dengue sero-types [28,76,84,85]. However, the sensitivity ofconventional dengue RT-PCR may be low for thesignificant variants that occur, probably becauseof codon degeneracy [81,86]. Recent studies ofnucleotide sequencing of the 3’ non-coding regionof dengue virus strains of the four dengue sero-types isolated in different geographical regions,and subsequent nucleotide sequence alignment,lead to the generation of consensus sequences foreach serotype. The results showed that the 3’ non-coding region contains probably the most con-served sequence in the four serotypes; it is a sec-ondary structure presumably involved in viralreplication, transcription and virulence [87–89].For this reason, these unique dengue 3’ non-cod-ing sequences may be useful as serotype-specificmarkers to detect, differentiate and quantify thedifferent serotypes with high sensitivity and speci-ficity [81,90]. The use of consensus primers toamplify all four dengue virus serotypes, togetherwith four serotype-specific primers, in a single-step PCR, allows discrimination of the four den-gue serotypes after separation of the PCR frag-ments by agarose gel electrophoresis. Since themethod is able to identify dengue virus serotypesby demonstrating defined sequence homologies inthe genomic RNA, it is of special epidemiologicalsignificance to provide information on the distri-bution of dengue serotypes and strains in endemicareas [91,92].

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While the development of real-time TaqMan RT-PCR provides some improvements over conven-tional RT-PCR, it does not avoid the somewhattime-consuming two-step amplification, composedof a reverse-transcription step and an expensive sec-ond thermal cycling step. This two-step strategyenhances sensitivity, but is also responsible forincreased false-positive results due to cross-contam-ination with the PCR products [93]. RT-PCR hasbeen applied for a few years in serum, tissues andmosquitoes for dengue virus detection, but numer-ous protocols under use still lack standardisation andvalidation for routine diagnostic purposes [14,16].

Recently, a NASBA format for detection of den-gue viral RNA in acute viraemic serum was devel-oped. The system was used for amplification ofRNA from all the four dengue virus serotypeswith a set of universal primers and subsequentidentification of the amplified products by sero-type-specific capture probes. The detection of theamplified product was performed by electroche-miluminescence through a probe-hybridisationmethod (Figure 2), and the results comparedwith those obtained with standard mosquito C6/36 cell culture assay with immunofluorescentdetection. By using known culture positive andnegative serum or plasma samples, the NASBAtechnique exhibited excellent sensitivity and speci-ficity, around 100% [93].

NEW HIGHLIGHTS IN DENGUE DIAGNOSISAn ‘ideal’ dengue diagnostic technique shouldovercome the main limitations of the existing tech-niques. Despite the fact that some technologicalimprovements have met the needs for applicationin the field, the available techniques often fail toaccomplish four basic requirements for a success-ful diagnosis in tropical sub-developed countries:simplicity, economy, rapidity and accuracy [46].Biosensors, new bioanalytical systems potentiallyamenable to miniaturisation, have been producedas portable devices for detection of several patho-genic agents. They consist of integrated moduleswhere the biochemical components, the transducer(e.g. electrochemical, piezoelectric, acoustic oroptic) and the detector are packaged in a singleunit. Biosensors are usually designed to be highlyselective, sensitive, fast and, in general, response-proportional [94].

An optical membrane-based DNA/RNA hybri-disation biosensor using liposome amplification

Figure 2. NASBA technique for amplification of viral RNA

has the following steps: (1) a single RNA chain is used as a tem-

plate at 41�C by an avian reverse-transcriptase with DNA poly-

merase activity; (2) primer A hybridises to the RNA chain; (3) a

single DNA chain is formed through elongation of the primer

by the polymerase; (4) the RNA moiety of the DNA-RNA hybrid

is degraded by a RNAase H; (5) primer B hybridises to the newly

synthesised DNA chain; (6) a second DNA chain is formed by the

polymerase through elongation of the primer B, using the first

DNA chain as a template; and (7) the bacteriophage T7 RNA

polymerase, with a promoter sequence codified in the double

stranded DNA-coupled primer A, synthesises new viral RNA

single-stranded molecules by using the double-stranded DNA

as a template. These newly formed RNA molecules, in turn, serve

as templates for a new round of amplification of the target

sequence. Since they are synthesised as antisense molecules to

the targeted sequence, the second round of amplification must

begin with hybridisation of primer B, rather than primer A, to

the RNA template. Detection and identification of dengue viral

RNA can be achieved by using, respectively, a conserved and four

serotype-specific capture probes, as well as a common detector

probe as a primer A-bound label suitable for electrochemilumi-

nescence detection

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was recently used for detection of generic andserotype-specific synthetic dengue genomicsequences. After isothermal amplification of theviral RNA by the transcription-based amplificationmethod, a biotinylated DNA capture probe wasimmobilised on a streptavidin-coated polyether-sulfone membrane and a DNA reporter probewas coupled to the outer surface of a liposome[41]. DNA-coupled liposomes were then mixedwith the amplified dengue virus RNA and themixture added to the membrane. In this way, asandwich was formed between the two probesand the target RNA. Upon passing the capturezone of the membrane strip, the number of repor-ter probe-tagged liposomes was proportional tothe amount of RNA present in the sample, withthe detection being carried out by electrochemilu-minescence with a portable reflectometer. In con-trast, no signal was detected with a nonspecificRNA molecule. The reporter probe was composedof the liposome and an attached DNA oligonucleo-tide sequence that hybridised to a genericsequence added to the dengue RNA during theamplification step. This generic reporter probewas used in the construction of both a genericand four dengue serotype-discriminating biosen-sors. In the generic biosensor, a conserved captureprobe complementary to a conserved region with-in the dengue RNA genome was also used. Tobuild the serotype-specific biosensors, a trickychange was the use of four serotype-specific cap-ture probes, one of them for each of the four bio-sensors. After optimisation with respect tosensitivity and specificity, the biosensors showeda very high correlation with a complex and expen-sive electrochemiluminescence laboratory-baseddetection standard system, by analysis of sevenpositive samples and three negative control sam-ples. Despite the fact that the laboratory-based sys-tem has a much larger dynamic range than thebiosensor, the latter allows a clear distinctionbetween different RNA concentrations andbetween positive and negative samples. After ana-lysis of 11 clinical samples, only dengue serotype-3exhibited some cross-reactivity. After genomicamplification, the biosensor was able to detectthe synthetic dengue virus RNA within 15 minutes[41]. By suitable optimisation of the stringenthybridisation conditions, the assay was able todetermine specific DNA sequences at femtomolarconcentrations [95].

A slight variation of this biosensor was devel-oped for detection of a synthetic dengue RNAsequence, consisting of a biotinylated genericsequence-bound capture probe attached to a strep-tavidin-coated magnetic bead. When the targetRNA was present, the reporter and capture probeshybridised to it, forming a liposome–RNA–beadcomplex that became immobilised on a permanentmagnet in the capture zone of the device. The finalquantification was performed by fluorescencemicroscopy. These liposomes entrap hundreds orthousands of marker dye molecules, thus providingenhanced signal amplification and sensitivity forlow nucleic acid concentrations, much higher thanin single fluorophore detection [96–98]. Accordingto previous studies with membrane strip-based bio-sensors, it should be possible to apply this opticalbiosensor for real dengue RNA detection in thesame hybridisation conditions and with a similarsensitivity, around 100-fold higher (in the picomo-lar range) than with the former polyethersulfonemembrane biosensor [97,98]. This biosensor wasbuilt in a microfluidic format suitable for mass pro-duction of miniaturised devices at the micrometerscale. In addition to the detection module, the sys-tem also includes modules for RNA extraction, pur-ification and PCR-based amplification. Obviousadvantages of this miniaturised molecular assayinclude the need for lower quantities of reagentsand power consumption, increased rates of diffu-sion and mass transport, and a very high through-put. This fully automated, whole-integrated systemis also faster and cheaper than more technologicallydemanding laboratory-based methods for molecu-lar diagnosis [98,99]. It is expected that furtherresearch may produce a truly portable, easy-to-use microfluidic biosensor in which fluorescentdetection can be replaced by electrochemical detec-tion in a multi-analyte, dengue serotype-specificbiosensor [98].Based on the two biosensors previously

described, an improved universal liposome-basedDNA biosensor was developed. It uses a universaldye-entrapping liposome and a universal poly-ethersulfone membrane with immobilised strepta-vidin (see Figure 3). The detection is performed bya portable reflectometer. In relation to the previousmicrofluidic device, a membrane instead of a mag-net was used in biosensor fabrication due tothe high speed, simplicity and nanomolar range-sensitivity of the assay. A set of experiments with

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synthetic target DNA bacterial sequences was per-formed in order to optimise the universal biosen-sor assay and to determine its detection range.The biosensor assay was optimised in relation tohybridisation conditions, concentrations of thecomponents and length of the generic probe.Data thus obtained were used in assays with realDNA sequences isolated and amplified from bac-terial species. Lower limits of detection may beachieved after prior amplification by PCR or NAS-BA. The results showed good agreement withthose achieved with previously reported specificbiosensors [41,97]. When the sequences of thereporter and capture probes are easily and rapidlychanged to be specific for the dengue RNA targetsequence, the biosensor gives a highly specificand sensitive response (detection limit in thefemtomolar range). Furthermore, using only astraightforward incubation, the overall identifica-tion and quantification periods do not last morethan 30 minutes. Unlike other biosensors currentlyavailable, the present format dispenses with theusual steps for conversion from a generic to a spe-cific biosensor. In general, they require expensiveor complex and lengthy procedures in order todetect a new target sequence, namely the finding

of new probe sequences and further labelling.The present biosensor is a good alternative to theslower blot assays [96].From a certain perspective, RNA and DNA bio-

sensors for viral detection seem to be less promis-ing than antibody biosensors (immunosensors).This is because, in vivo, viral nucleic acids arepackaged inside the viral envelope and thus theirconcentration may be too low for a successfuldiagnosis without prior amplification by PCR,unlike the much more abundant and stable viralproteins. Moreover, salt-dependent electrostaticeffects greatly influence the stability, structure,reactivity and binding of nucleic acids in solutionor at an interface [100]. The buffer compositionstrongly influences detection of dengue virus RNAin the former membrane-based biosensor. Sincethe components of the buffer solution may favourhybridisation under appropriate conditions, theirconcentrations were varied for optimisation ofthe microfluidic biosensor [98]. In a recent report,an immunochip for detection of dengue viral anti-gens was fabricated [101]. This biosensor employstwo specific monoclonal antibodies for the glyco-protein-E and NS1 protein, respectively, immobi-lised in a piezoelectric transducer. Multi-antibody

Figure 3. Scheme for a universal biosensor. (1) At 41�C, an incubation of the following mixture takes place: a universal liposome carrying

a dC-rich probe, a reporter probe with a dG-rich terminal and a target-specific sequence, the target sequence (e.g. dengue viral genome)

and a biotinylated capture probe. After the incubation, a polyethersulfone membrane with immobilised streptavidin is added to the

mixture. (2) After a few minutes, a specific detection of the target sequence is performed, with its concentration being proportional to

the amount of bound liposomes in the detection zone

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coating allows the capture of several different anti-gens, thus enhancing the detection signal. The sen-sitivity obtained was 100-fold greater than with theconventional sandwichEIAassay, enabling thedetec-tion of a very low viral antigen concentration (of0.05 mg/ml) in the specimen, and consequentlyaffords an earlier diagnosis when compared withother current methods, especially in the viraemicphase. The immunosensor is also characterised bylow technical demands, easy result interpretationand short response time (30–60min) [101].At present, biosensors for dengue diagnosis are

still in the early stages of development and evalua-tion, which is not surprising given the fact that thefour dengue serotypes are among the most diffi-cult to cultivate and propagate in the laboratory[24]. One reason for this is certainly the high varia-bility between the different serotypes, especiallywhen isolated in various geographical regions[40]. It is believed that an efficient biosensor fordengue diagnosis should be a multi-analyte devicefor detection of the four serotypes [102].Wider utilisation of biosensor technology for

dengue diagnosis in clinical facilities suffers basi-cally from the same constraints faced by otherinfectious pathologies. The majority of the com-mercially available biosensors make use of electro-chemical transduction, which is more suitable formicrofabrication and miniaturisation [103]. Thesebiosensors, however, have problems of interfer-ence from electrochemically active substancesand troublesome electron-transfer pathwaysbetween the redox enzyme and the electrode sur-face. In general, the behaviour of the active biomo-lecules when adsorbed on a surface is highlyunpredictable; together with troublesome interac-tion of matrix compounds, this may complicatedetermination of selectivity, sensitivity, detectionlimit and response time of the biosensor [102].Additionally, mass production of biosensors witha reproducible output requires large amounts ofthe purified biomolecule from a biological sourcewith a reasonable degree of purity, except in thecase of the highly specific monoclonal antibodies.Moreover, certain biological components of thebiosensor may be released over time, thus contam-inating the biological sample. Today’s biosensorsalso have poor stability and difficult sterilisation,thus explaining the increasing interest and invest-ments in single-use disposable devices, by usingcheap integrated chip technology [100,104]. The

modest stability of biomolecules for biosensingunder working conditions, e.g. room temperature,usually limits the good performance of the biosen-sor up to some months [104]. Nonetheless, storageunder refrigeration and immobilisation of the bio-logical sensing element in membranes or gels maybe employed to overcome these obstacles. Othersetbacks in biosensor research and developmentinclude low selectivity due to non-specific interfer-ing signals at the level of the transducer elementand the high costs required to implement thenew technology. In the future, a new generationof biosensors must overcome the usual poor flex-ibility and discriminating power of current biosen-sors by suitable inclusion of purification andchemical modification steps in the analyticaldevice, namely in a microfluidic format [103].Research about the effects of interfering substanceshas been performed in pure synthetic samples, likemodel-DNA sequences, rather than in complexreal samples while prior knowledge of the selec-tive molecular recognition processes is needed[104]. Constraints about the interpretation ofresults by non-clinical laboratory staff and mainte-nance of historical patient records must also beconsidered in biosensor-based diagnosis. How-ever, the still limited availability of biosensors inthe market may be due mainly to a lack in theappropriate technology for their manufacture at acompetitive cost rather than a lack of fundamentalknowledge [100]. Future advances in biosensortechnology will require integration of analyticalchemistry, surface chemistry, materials engineer-ing, biological sciences, microelectronics, micro-fabrication and automation before these devicescan become more widely accepted by the clinicalcommunity as valuable diagnostic tools for diag-nosis of dengue and other infectious diseases.

ACKNOWLEDGEMENTSThe authors acknowledge the Fundacao para aCiencia e Tecnologia (FCT), Portugal, for supportfor this work in the form of a PhD grant (ref.:SFRH/BD/6186/2001) to Fernando Teles, Finan-ciadora de Estudos e Projetos (FINEP), Brazil.

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F. R. R. TelesF. R. R. Teles et al.et al.

Copyright # 2005 John Wiley & Sons, Ltd. Rev. Med. Virol. (in press).

84

3.2 “ELECTROCHEMICAL DETECTION OF A DENGUE-RELATED

OLIGONUCLEOTIDE SEQUENCE USING FERROCENIUM AS A

HYBRIDIZATION INDICATOR”

Teles, F.R.R.; Prazeres, D.M.F.; Lima-Filho, J.L. Analytica Chimica Acta

(submetido).

1

ELECTROCHEMICAL DETECTION OF A DENGUE -RELATED

OLIGONUCLEOTIDE SEQUENCE USING FERROCENIUM AS A

HYBRIDIZATION INDICATOR

F.R.R. Teles1, D.M.F. Prazeres2 and J.L. Lima-Filho1*

1 Laboratório de Imunopatologia Keizo-Asami (LIKA), Universidade Federal de

Pernambuco (UFPE), Av. Prof. Moraes Rego, 1235, Campus Universitário, Cidade

Universitária, Recife, PE – CEP: 50670-901, Brazil.

2 Centro de Engenharia Biológica e Química, Instituto Superior Técnico, Av. Rovisco

Pais, 1049-001, Lisbon, Portugal.

* Corresponding author: Dr. J.L. Lima-Filho, Laboratório de Imunopatologia Keizo-

Asami (LIKA), Universidade Federal de Pernambuco (UFPE), Av. Prof. Moraes Rego,

1235, Campus Universitário, Cidade Universitária, Recife, PE – CEP: 50670-901,

Brazil.

E-mail: Jose_Luiz60@terra.com.br

Abstract

A simple method for electrochemical detection, after nucleic-acid hybridization,

of a synthetic 20-bp oligonucleotide target sequence related with dengue virus genome

was developed. A complimentary DNA probe sequence was stably immobilized onto a

glassy carbon electrode previously modified with chitosan oligomer via strong

electrostatic interactions. Electrochemical detection of hybridization between probe and

target strains was performed by cyclic voltammetry, using ferrocene (in the form of

ferrocenium ion, Fc+) as a hybridization indicator. Ferrocene binds DNA with different

intensities whether single or a double strands are present, thus originating distinct

voltammetric peak currents. After hybridization of the complimentary chain, the peak

2

current response of ferrocene oxidation increased around 26%. A higher voltammetric

decay rate constant (kd) and a lower half-life period (t1/2) for the interaction of ferrocene

with double-stranded DNA (dsDNA) compared to those with single-stranded DNA

(ssDNA) also confirmed the two different strengths of interaction with the two types of

DNA. Thus, by combining the simplicity of DNA immobilization onto a chitosan film

and suitable voltammetric detection of hybridization concomitant with ferrocene

attachment to DNA, good results were obtained towards discrimination between ssDNA

and dsDNA.

Keywords: modified glassy carbon electrode; DNA electrochemical biosensor; DNA

immobilization; hybridization indicator; chitosan; dengue diagnosis

1. Introduction

Biosensors have found many applications in both research and industry, namely

in the fields of agriculture, pharmaceutics, environment, food, forensics and clinical

diagnosis, for the detection of specific biomolecules of interest. Concerning clinical

diagnosis, many reports have been published in recent years on the detection and

quantification of nucleic-acids in biological samples in order to identify inherited and

infectious diseases of bacterial or viral origin. The assays described often make use of

the peculiar ability of DNA or oligonucleotide complimentary chains to hybridize, not

only in vivo, but also in vitro. This allows discrimination between ssDNA and dsDNA,

as well as, by the reversible nature of the process, the development of reusable

biosensors. In most cases, the use of a previously labeled nucleic-acid probe is required.

The most traditional labeling method – enzymatic labeling with 32P or 125I radioisotopes

-, despite its high sensitivity, has been progressively discarded due to the potential

dangers of radioactivity. New labeling procedures, including avidin/biotin [1],

digoxigenin [2], fluorescent dye [3] and a chemiluminescent agent [4], have replaced

the radioactive method but, in general, they are complex and time-consuming.

Furthermore, these techniques have been mainly applied to the classical southern

transfer and dot-blot formats [5]. The PCR method was a major advancement for easy,

specific and sensitive detection of infectious pathogens, despite its greater efficiency for

3

qualitative rather than quantitative DNA detection [6]. More recently, DNA biosensors

with optical [7,8], piezoelectric [9,10,11], acoustic [12,13] and electrochemical

transduction have been developed for sequence-specific DNA detection. Among them,

electrochemical biosensors have gained particular interest for commercial purposes

because they are rapid, sensitive, cheap and amenable for in-the-field detection. In

parallel with the detection technique, surface-immobilization methods have become

increasingly important for the design of electrochemical DNA biosensors, despite the

related problems of optimal immobilization of DNA and screening of highly sensitive

indicators of DNA hybridization onto electrode surfaces [14,15].

The direct method [16,17,18] of DNA electrochemical detection consists in

detecting the redox activity of the nitrogenated bases of DNA, especially adenine and

guanine. Yet, since DNA as a whole is highly redox-inactive, an electrochemical

hybridization indicator is usually needed (indirect method); it may bind DNA through

physical intercalation between base pairs or through electrostatic interaction, in well-

defined binding sites [19]. The effect is an accumulation of the indicator in the DNA

layer near the surface of the electrode. The degree of the accumulation is usually

different if a single or a double-chain is attached, which correlates with different

voltammetric peak currents [20]. The electrochemical indicators more widely used for

DNA detection and quantification are Hoechst 33258, heterocyclic dyes (ethidium

bromide, methylene blue, anthracyclines, phenotiazines and acridine derivatives),

anticancer drugs (e.g., daunomycin) and organomettalic complexes (mainly from Co,

Fe, Os, Pt and Ru). In general, these compounds bind DNA reversibly through

intercalation, with its planar, aromatic groups stacked between base pairs. One

exception is Tris(2,2’-bipyridyl) ruthenium(II), which binds electrostatically to the

negatively-charged sugar phosphate backbone of DNA [21].

Cyclic voltammetry has been used to detect dT-oligonucleotides enzymatically

elongated with dG residues by covalent attachment to a glassy carbon electrode through

N-hydroxysuccinimide and a water-soluble carbodiimide as coupling reagents, using the

metallointercalators Co(bpy)33+ and Co(phen)3

3+ (bpy = 2,2’-bipyridine; phen = 1,10-

phenanthroline) as electrochemical indicators [19]. Short, synthetic oligonucleotides are

ideal chemical recognition elements since they provide highly sequence-selective

hybridization, which is not hindered by the complex conformational changes that occur

in the long-size polynucleotides or genomic DNA. The same group used a similar

immobilization procedure onto a carbon paste electrode added with octadecylamine or

4

stearic acid, which provided functional groups for the covalent attachment of a dT-

polynucleotide elongated with dG residues, to build a biosensor for cystic fibrosis by

using Co(bpy)33+, Co(phen)3

3+ and Os(bpy)33+ as hybridization indicators [20]. In

another work, ethidium bromide was used as the electroactive intercalator to detect an

oligonucleotide covalently immobilized in a graphite electrode chemically modified

with a primary amino group [22]. Erdem et al. [23] reported the detection of short

oligonucleotides related to the hepatitis B virus after electrochemical adsorption on a

pretreated carbon paste electrode, the same immobilization strategy previously used by

Wang et al. [24], working with carbon paste and strip electrodes, to detect short DNA

sequences related to HIV by chronopotentiometry, using Co(phen)33+ as the indicator.

Some works with gold electrodes include physical [15] and chemical [6] adsorption of

DNA with electrochemical detection of hybridization with, respectively, Co(bpy)33+ and

Hoechst 33258, and covalent immobilization through molecular self-assembly (SAM),

followed by DNA detection with methylene blue [25] and daunomycin [5]. Interesting

works were carried out by Xu’s team towards sequence-specific voltammetric detection

of PCR-derived DNA with graphite [26], platinum [14] and glassy carbon [27]

electrodes. They promoted electrochemical accumulation of DNA onto a previously

polarized (pretreated) electrode, as well as DNA immobilization over a chitosan film-

modified electrode. The natural cationic chitosan polymer forms stable complexes with

the polyanionic phosphodiester backbones of either native or denatured DNA [28], thus

providing a very stable immobilization. Moreover, the technique is potentially simpler

and less costly than covalent DNA immobilization’s approaches [27]. In all the three

works, Xu’s group used ferrocenecarboxaldehyde and aminoferrocene as hybridization

indicators. These compounds, unlike the intercalators, covalently label the DNA probes.

In another approach, Ju et al. [29] used ferrocenium ion as a groove-binder to detect

yeast DNA covalently attached to a gold electrode through SAM. In this way, Fc+ was

able to interact with the major grooves of immobilized dsDNA by π-electron

conjugation, due to its planar, aromatic groups. Fc+ may also interact with immobilized

DNA by electrostatic binding [29]. The use of a non-covalent DNA hybridization

indicator (intercalator, electrostatic binder or groove-binder) avoids the costly and

labor-intensive procedures to synthesize the derivatives, label them to the DNA chain

and separate the product.

Dengue fever is one of the most threatning emerging diseases of the near future.

It is a mosquito-borne disease of viral origin and affects more than 100 countries, being

5

endemic and epidemic in most tropical and subtropical countries and also a potential

threat to temperate regions worldwide [30,31]. Its annual incidence reaches 100 million

cases, from which more than 2% correspond to its more severe and acute form, dengue

hemorrhagic fever [32,33]. Until an effective vaccine becomes available, diagnosis has

a major importance, especially in the early, non-specific symptom’s phase [34]. Since,

however, the conventional virological and serological tests are usually lengthy, a

reliable biosensor for viral detection and quantification, combining simplicity, economy,

rapidity and accuracy [35], is urgently needed. Some biosensors for detection of short

dengue-related DNA sequences were already assayed, but the methodologies employed

are somewhat tedious, namely due to the use of biotin-labeled DNA probes and DNA-

tagged liposomes [36,37].

The present paper proposes a simple method to specifically detect a 20-bp

oligonucleotide from the most conserved dengue genomic sequence, the 3’-noncoding

region [38], thus envisaging detection of all the four antigenically-related dengue virus

serotypes (DENV1-4). One major novelty of this work is the simplicity of DNA

immobilization onto a chitosan-modified glassy carbon electrode, combined to a

straightforward detection of the hybridization event through the oxidation peak current

of the ferrocenium ion indicator by cyclic voltammetry. In accordance to Ju et al. [29],

but contrarily to other works (including those mentioned above), we readily included

the indicator into the voltammetric solution itself, thus avoiding the previous binding

step. Promising results were obtained concerning discrimination between ssDNA and

dsDNA.

2. Experimental

2.1 Apparatus

Cyclic voltammetry measurements were performed in a MQPG-01 potentiostat

(Microquímica Indústria e Comércio, Brazil) coupled to a PC. Experiments were carried

out in an electrochemical cell composed by a 0.5 ml acrylic vessel and three artisan, lab-

made electrodes: a working glassy carbon electrode (tightly packed into a glass body)

with 3.0 mm of diameter and an electrical contact provided by a copper wire, an

Ag/AgCl (with 3M NaCl) reference electrode with 4.0 mm of diameter, also with a

6

copper wire contact, and a platinum wire as the counter electrode (diameter of 0.5 mm).

An USC750 ultrasonic bath (UltraSonic Cleaner, Brazil) and a thermostated bath

(BioEng, Brazil) were also used.

2.2 Reagents

The synthetic dengue-related oligonucleotide sequence 5’-GGT TAG AGG

AGA CCC CTC CC-3’ (target) and its complimentary counterpart, 5’-GGG AGG GGT

CTC CTC TAA CC-3’ (probe), were purchased as a lyophilized powder from

Invitrogen. Sodium hydroxide was purchased from Merck, ferrocenium

hexafluorophosphate (FcPF6) was obtained from Aldrich, sodium chloride was acquired

from Anidrol (Brazil) and EDTA was purchased from Grupo Química (Brazil).

Chitosan and SDS were obtained from Sigma. Hydrochloric acid, hydroxymethyl

aminomethane (Tris), icy acetic acid and sodium citrate were acquired from Vetec

(Brazil). Monobasic sodium phosphate (NaH2PO4.H2O) and dibasic sodium phosphate

(Na2HPO4.7H2O), both used to prepare the phosphate buffer, were supplied by,

respectively, CAQ - Casa da Química (Brazil) and Vetec. All reagents were of

analytical grade. All solutions were prepared with deionized (milli-Q) and sterilized

water. Alumina suspension with particle size of 0.5 μm and a polishing cloth were

obtained from Fortel Indústria e Comércio (Brazil).

2.3. Methods

Electrode preparation

The surface of the glassy carbon electrode was polished with the alumina

suspension using a polishing cloth to a mirror finish. The electrode surface was then

cleaned in an ultrasonic bath for 15 minutes and washed with deionized water. The

electrode was finally sterilized under UV-light for 1h. This procedure was repeated after

each voltammetric experiment. Other materials, including glassware, containers, pipette

tips and the electrochemical vessel, were heat-sterilized prior to use.

7

Probe immobilization

The electrode surface was uniformly coated with 2 μl of 1% chitosan solution in

1% acetic acid and air-dried, after which it was immersed in 50 μl of 0.1M NaOH (to

stabilize the chitosan film [27]) and again air-dried. The electrode surface was then

immersed in a 3.1 mg mL-1 of DNA-probe solution in 0.01 M TE buffer (10 mM Tris-

HCl + 1 mM EDTA) pH=8.0 for 2h. After rinsing with 1 ml of 0.1 M phosphate buffer

pH=7.0 with 0.1% SDS, to remove unbound DNA, the electrode surface was immersed

in the TE buffer until further use.

Hybridization

The DNA-probe modified electrode was immersed in 2×SSC hybridization

buffer (0.3 M NaCl + 0.03 M sodium citrate, pH=7.0) containing 2.6 mg mL-1 of target

sequence. The set was incubated at 42ºC in a water-bath for 1h so that hybridization

could occur. The electrode was finally washed with 1 ml of 0.4 M NaOH with 0.1%

SDS to remove adsorbed (unhybridized) DNA-target [26]. Control experiments of DNA

hybridization (immobilization assays) were performed like the ‘true-hybridization’

assays, but with target-free 2×SSC hybridization buffer.

Indicator binding and electrochemical detection

Cyclic voltammetry assays, simultaneously with indicator-binding, were carried

out at 25ºC by immersing the DNA-modified electrode in 0.01 M TE buffer pH=8.0

with 0.4 mM FcPF6, at 50 mV s-1, in the scan range from -0.1 V to 0.5 V.

3. Results and discussion

The principle of DNA electrochemical detection underlying this work relies on

the fact that ferrocene is an electroactive DNA-binder, exhibiting greater affinity for

8

dsDNA than for ssDNA due to its tight binding to the major grooves of the DNA

double-chain. Since the different affinities to ssDNA and dsDNA provide different local

Fc+ concentrations near the electrode, the presence of a single or a double DNA-chain

correlates with distinctive voltammetric redox peak currents. According to the literature

[14,27], a chitosan support film improves the efficiency of DNA immobilization onto

glassy carbon electrode surfaces by electrostatic interaction between the polycationic

chitosan oligomer and the polyanionic DNA backbone (Fig. 1).

In this work, the immobilization and the hybridization event were distinguished

through the voltammetric peak of Fc+ oxidation. In order to do so, we carried out cyclic

voltammetry on a dsDNA-modified, a ssDNA-modified and a bare glassy carbon

electrode at 50 mV s-1, between -0.1 V and 0.5 V. As can be seen in Fig. 2,

immobilization of the DNA probe yielded an oxidation peak current around 3.1 μA at

394 mV, probably due to the ferrocene directly adsorbed onto the ssDNA-modified

electrode. The nearby hybridization curve shows a 26% higher peak of 4.2 μA at 396

mV, which implies an increased affinity of ferrocene to dsDNA when compared to

ssDNA. The reason for this is a higher Fc+ concentration available for oxidation near

the electrode surface when dsDNA is attached instead of ssDNA. The figure also shows

an oxidation band of ferrocene in the bare electrode; despite being non-negligible, this

band is lower when compared with the two bands of the DNA-modified electrode. The

higher inclination of the bare electrode voltammetric curve also indicates a higher

hindrance of the electronic transport in the bare electrode, which is somewhat

overwhelmed when the electrode is modified with ssDNA or dsDNA.

In order to assess the different interaction strengths of ferrocene with ssDNA

and dsDNA, the model of first-order reaction kinetics was used to determine a

voltammetric decay rate constant (kd), in agreement with the relation Ip = (constant) .

exp(-kd.t), where t is the voltammetric decay period and Ip is the oxidation peak current

at time t. This was performed by recording the Ip values of consecutive scans in both the

hybridization and the immobilization assays and plotting their logarithms against t (Fig.

3). The half-life period (t1/2) for both the immobilization and the hybridization assays

was also determined from these data. For the ssDNA-modified electrode, we roughly

estimated kd = 1.9.10-3 s-1 and t1/2 = 353 s and, for the dsDNA-modified electrode, kd =

4.2.10-3 s-1 and t1/2 = 150 s. According to the previous statements, the greater affinity of

ferrocene to dsDNA than to ssDNA may be inferred from the higher voltammetric

oxidation peak obtained, at nearly the same potential, in the former case. On the other

9

hand, kd corresponds to the dissociation rate constant of ferrocene from the DNA

molecule to the bulk solution. Its value is predictably higher with dsDNA than with

ssDNA – as confirmed by the experimental results – since, according to theory, the

decay of the ferrocene oxidation peak would not occur in the ssDNA-modified electrode

if there was no ssDNA-bound ferrocene, which is not the case, as seen in Fig. 2. The t1/2

depletion observed when passing from the ssDNA-modified electrode to the dsDNA-

modified one is also explained by the existence of only a few ssDNA-bound ferrocene

ions. According to theoretical predictions, t1/2 for the ssDNA-modified electrode should

be nearly infinite.

4. Conclusions

This paper describes a very simple method to detect a specific short 20-bp

dengue-related oligonucleotide sequence by cyclic voltammetry with a glassy carbon

electrode, simultaneously with the use of Fc+ as a hybridization indicator, and chitosan

oligomer as a binding layer for improved efficiency of DNA immobilization. In order to

detect all the four antigenically-related dengue virus serotypes (DENV1-4), the

oligonucleotide sequence was chosen among the most conserved region of dengue virus

genome, the 3’-noncoding region. Based on the different affinity abilities of Fc+ towards

ssDNA and dsDNA, the method was able to discriminate them by a significant 26%

increase in the oxidation voltammetric peak current of Fc+ when dsDNA was

immobilized instead of ssDNA. This result shows that, unlike in other reports, the

oxidation instead of the reduction peak of Fc+ can be successfully used to detect DNA

hybridization. The higher affinity of Fc+ for dsDNA was further demonstrated by a

more pronounced decay of the voltammetric oxidation peak than in the case of ssDNA-

Fc+ interaction, corresponding to a higher kd and to a lower t1/2. Due to the significant

liability of native DNA under storage and operational conditions, the use of short

synthetic oligonucleotides, as in the case of this work, becomes advantageous. The use

of chitosan as an immobilization support and of Fc+ as a non-covalent DNA marker for

hybridization allow to avoid the common drawbacks of covalent binding, namely

complexity, morosity and expensiveness. A reported highlight of using a chitosan film

to immobilize DNA is that a high ionic strength of the ssDNA solution may be

employed to minimize nonspecific DNA adsorption [14]. In theory, the method may be

10

successfully used to specifically detect each one of the four dengue serotypes by

appropriate choice of four serotype-specific oligonucleotide sequences among the viral

genome; this may be one of our working headlines in the near future. Being aware of

the still early stages of biosensors research and production for clinical purposes, the

method here proposed may be a significant contribution for future diagnosis of dengue

and other infectious pathogens envisaging rapidity, simplicity, low-cost and in-the-field

detection with small, portable devices.

Acknowledgements

We acknowledge the Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT), Portugal,

(through co-financing of Programa Operacional Ciência e Inovação – 2010, POCI 2010,

and Fundo Social Europeu, FSE) for supporting this work with a PhD grant (ref.:

SFRH/BD/6186/2001) to Fernando Teles, and to Financiadora de Estudos e Projetos

(FINEP), Brazil, for partial support on the infrastructure. We also acknowledge Prof.

Marcelo Navarro, from the Department of Fundamental Chemistry (DQF) of UFPE, for

having gently lend us the glassy carbon electrode, as well as to Dr. Madalena Areias,

also of DQF, and to Dr. Rosa Dutra, of our group, for helpful suggestions.

11

Fig. 1

-0.1 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5-4.0

-3.0

-2.0

-1.0

0.0

1.0

2.0

3.0

4.0

5.0

Cur

rent

/ 1e

-6 A

Potential / V

Fig. 2

NH3+ NH3

+ NH3+

PO4-- PO4

-- PO4--

: : :

i DNA h DNA

GCE Chi

Fc FcFc

12

0,9

1,1

1,3

1,5

0 20 40 60 80 100 120

t / s

ln I p

Fig. 3

13

Fig. 1. Scheme of the molecular mechanisms underlying electrochemical DNA

detection with ferrocene. After chemical modification of the glassy carbon electrode

(GCE) surface with chitosan (Chi), the free amino groups (NH3+) of chitosan monomers

electrostatically bind the outer phosphate groups (PO4-) of a single-stranded DNA

(iDNA) which, by this way, becomes immobilized on the surface of the electrode.

Afterwards, a second, complimentary DNA chain (hDNA) hybridizes with the former

and the ferrocene indicator (Fc) binds double-stranded DNA through its major grooves

or electrostatic interactions.

Fig. 2. Cyclic voltammograms of 0.4 mM FcPF6 in 0.01 M TE buffer pH=8.0 at bare

(dotted line), ssDNA-modified (dashed line) and dsDNA-modified (solid line) glassy

carbon electrode, scanned between -0.1 V and 0.5 V (vs. Ag/AgCl), at 50 mV s-1.

Fig. 3. Linearized time-dependence of oxidation peak currents (Ip) of ferrocene in the

ssDNA-modified (▲) and in the dsDNA-modified (■) glassy carbon electrode.

14

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85

4. CONCLUSÕES

• A emergência da dengue a nível mundial como problema de Saúde Pública,

principalmente da sua forma mais grave (hemorrágica), justifica o incremento

não só da disponibilização de meios e recursos humanos, mas também de

pesquisas fundamentais visando combater a doença, erradicando-a e / ou

minimizando os seus efeitos.

• Até que uma vacina efetivamente segura, validada e multivalente seja produzida,

o diagnóstico assume importância crucial no combate à dengue.

• As restrições significativas de aplicabilidade e eficiência dos métodos

convencionais atuais de diagnóstico da dengue tornam premente o

desenvolvimento e produção em larga-escala de pequenos aparelhos portáteis

para diagnóstico descentralizado, combinando rapidez, baixo custo, alta

sensibilidade e especificidade (sorotipagem) e simplicidade operacional.

• O biossensor eletroquímico desenvolvido neste trabalho, através do pico de

corrente de oxidação do ferroceno em voltametria cíclica, foi capaz de detectar

claramente o oligonucleotídeo-alvo, na gama de mg/mL (submicromolar), por

hibridização com a sonda complementar imobilizada no eletrodo de carbono

vítreo previamente modificado com quitosana, obtendo-se um pico de corrente

de oxidação 26% superior ao de um ensaio análogo sem a cadeia-alvo.

• A obtenção dos valores kd = 4.2.10-3 s-1 e t1/2 = 150 s para o eletrodo modificado

com dsDNA, em comparação com os valores 1.9.10-3 s-1 e 353 s

(respectivamente) para o eletrodo modificado com ssDNA, é uma confirmação

experimental da maior afinidade do ferroceno para cadeias duplas do que para

cadeias simples de DNA.

• O revestimento da superfície do eletrodo de carbono vítreo com um filme

oligomérico de quitosana permitiu uma ligação forte e estável do

86

oligonucleotídeo unifilamentar, por simples interação eletrostática dos grupos

NH3+ da quitosana com os grupos PO4

- da cadeia oligonucleotídica.

• Ao contrário do que acontece na generalidade de outros formatos para detecção

eletroquímica de DNA através de indicadores eletroativos de hibridização, os

resultados aqui apresentados foram obtidos mediante adição do indicador

diretamente à solução de medição voltamétrica; isto permite simplificar o

processo global de detecção, pois assim se eliminam as etapas prévias de ligação

do indicador à superfície do eletrodo e de secagem da mesma, antes da

voltametria.

• Ainda que a detecção de DNA em quantidades muito pequenas exija

normalmente a utilização de eletrodos comerciais padronizados de alta-

fidelidade, a presente aplicação demonstrou a possibilidade de se utilizar

também um simples eletrodo manufaturado de carbono vítreo para a

determinação de oligonucleotídeos na gama de submicromolar.

• Ao contrário da redução do ferroceno (Fc+ → Fc), utilizada correntemente, o

sistema de detecção desenvolvido mostrou que a sua oxidação (Fc+ → Fc2+)

também pode ser utilizada para discriminar satisfatoriamente uma cadeia dupla

de uma cadeia simples de DNA.

• A versatilidade da técnica de detecção eletroquímica de hibridização de ácidos

nucléicos manifesta-se na possibilidade de, não só detectar o vírus da dengue,

como também identificar o sorotipo infectante, para tal bastando, em princípio,

substituir a seqüência oligonucleotídica genérica do vírus por seqüências

específicas de cada sorotipo, e hibridizá-las com seqüências complementares.

87

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6. ANEXOS

INSTRUCTIONS TO AUTHORS ANALYTICA CHIMICA ACTA

An international journal devoted to all branches of analytical chemistry

(1) Submission of manuscripts It is a condition of publication that all manuscripts must be written in clear and grammatical English and be submitted to the Analytica Chimica Acta Web site at http://ees.elsevier.com/aca. Authors are requested to transmit the text and art of the manuscript in electronic form to this address. Each manuscript must be accompanied by a cover letter, preferably on headed paper, that explains the analytical novelty of the research, the key findings of the research and their significance to real sample matrices. If you are unable to provide an electronic version, please contact the editorial office prior to submission at e-mail: aca@elsevier.com; tele-phone: +353 61 709635; or fax: +353 61 709111. Authors are encouraged to identify four persons who are qualified to serve as reviewers. Authors are requested not to suggest reviewers with whom they have a personal or professional relationship, especially if that relationship would prevent the reviewer from having an unbiased opinion of the work of the authors. A working e-mail address for each reviewer is essential for rapid review in the event that reviewer is selected from those that are identified by the authors. You may also select reviewers you do not want to review your manu-script, but please state your reason for doing so. Manuscripts are accepted for review with the understanding that the same work has not been published (except as an abstract, or as part of a lecture, review, or academic thesis), that it is not under consideration for publication elsewhere, and that its submission for publication has been ap-proved by all of the authors and by the institution where the work was carried out; further, that any person cited as a source of personal communica-tions has approved such citation. Upon acceptance of an article, authors will be asked to transfer copyright (for more information on copyright, see http://authors.elsevier.com). This transfer will ensure the widest possible dissemina-tion of information. A letter will be sent to the corresponding author confirming receipt of the manuscript. A form facilitating transfer of copy-right will be provided after acceptance. If material from other copyrighted works is included, the author(s) must obtain written permission from the copyright owners and credit the source(s) in the

article. Elsevier has preprinted forms for use by authors in these cases: contact Elsevier Global Rights Department, P.O. Box 800, Oxford OX5 1DX, UK; phone: (+44) 1865 843830, fax: (+44) 1865 853333, e-mail: permissions@elsevier.com. (2) Types of contributions Analytica Chimica Acta publishes original papers, and reviews dealing with every aspect of modern analytical chemistry. Reviews are normally written by invitation of the editors, who welcome sugges-tions for subjects. Topics should be broad enough to appeal to a wide audience. Suggestions should be accompanied by a statement saying why the topic should be on interest to the readership of the journal and a proposed table of contents. Note: Analytica Chimica Acta does not distinguish between papers submitted individually or via a symposium. Consequently symposium papers are subject to the same stringent refereeing procedures as other papers. (3) Manuscript preparation The language of the journal is English. Authors are given every latitude, consistent with clarity and brevity, in the style and form of their papers. Title and initial layout. All manuscripts should be headed by a concise but informative title fol-lowed by the names of the authors and the address of the laboratory where the work was carried out. The author to whom correspondence should be addressed must be indicated by an asterisk. Abstract. All papers, reviews, and Letter articles begin with an Abstract (50-250 words) which should comprise a factual account of the contents of the paper, with emphasis on new information. The abstract should be followed by 4-6 keywords. Experimental. The experimental methods should be described after the introductory material. De-tailed experimental descriptions should be re-stricted to one section of the paper. Sufficient detail should be given to allow any experienced worker to implement the procedures described. Procedural steps should not be numbered. Results and Discussion. These may be treated together or separately. Conclusions. This should include key findings of the research, quantitative analytical perform-ance figures (if appropriate) and their significance to real sample matrices.

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Acknowledgements. These should be kept as short as possible. References. The references should be collected at the end of the paper, numbered in the order of their appearance in the text (not alphabetically), and typed on a separate page. Titles of papers should not be given, but all authors should be named. References given in tables should be numbered according to the position of the table in the text. Every reference listed must be cited in the text. Reference numbers in the text are set in square brackets on the line. In the list of references, the following forms should be adopted: [1] R.D. Lowe, R.D. Snook, Anal. Chim. Acta, 250 (1991) 95. [2] H. Grosjean, C. Houssier, in: C.W. Gehrke, K.C.T. Kuo (Eds.), Chromatography and Modifi-cation of Nucleosides, Part A (Journal of Chroma-tography Library, Vol. 45A), Elsevier, Amster-dam, 1990, p. A255. Tables. All tables should be numbered with Arabic numerals and have brief descriptive head-ings; they should be typed on separate pages. The layout should be given serious thought. Column headings should be brief, but should include the units in parentheses, where relevant. Footnotes to tables are denoted by superscript a, b, c... The following usage is recommended: e.g., if molar absorptivities are listed, the heading should be (104 l mol-1 cm-1) so that a number 2.32 in the column signifies 23 200. Alphanumeric computer output is usually unsuitable for reproduction and should therefore be retyped and presented as tables; capitals can be used to simulate computer output if such simulation is essential for illustra-tion. Computer programs. Algorithms should be described clearly and concisely by means of a suitable algorithmic notation, although a standard high-level programming language may also be used. Complete program listings are not normally admissible. Flow charts should be avoided in favour of a textual or tabulated description of the program or data flow. Statements on the portability of the software described to other computer sys-tems, as well as on its availability to interested readers, should be given. Figures. Figures should be suitable for direct reproduction and as rich in contrast as possible. Attention should be given to line thickness, letter-ing (which should be kept to a minimum), and spacing on axes of graphs, to ensure suitability for reduction in size on printing. Axes of a graph should be clearly labelled, along the axes, outside the graph itself. All figures should be numbered with Arabic numerals, and require descriptive legends which should be typed on a separate page of paper. Simple straight-line graphs are not acceptable,

because they can readily be described in the text by means of an equation or a sentence. Claims of linearity should be supported by regression data that include slope, intercept, standard deviations of the slope and intercept, standard error, and the number of data points; correlation coefficients are optional. Figures that are subdivided into subfigures should have uniform designation with lowercase letters. For instance: 3a and 3b. Photographs should be as rich in contrast as possi-ble. Line diagrams are generally preferred to photographs of equipment. Colour illustrations in print are reproduced at the author's expense. However, if together with your accepted article, you submit usable color figures, then Elsevier will ensure, at no additional charge, that these figures will appear in color on the Web (e.g., Science Direct and other sites) regardless of whether these illustrations are reproduced in color in the printed version. For color reproduction in print, you will receive information regarding the costs from Elsevier after receipt of your accepted article. For further information on the preparation of electronic artwork, please see http://authors.elsevier.com/artwork. [Please note: Because of technical complications that can arise in converting color figures to "gray scale" (for the printed version should you not opt for color in print), please submit in addition usable black-and-white files corresponding to all the color illustrations.] Nomenclature, abbreviations, and symbols. Please use L for litres. Always leave a space between units and use superscripts rather than /. For instance: use mg mL-1 and not mg/ml. Do not use ppm or ppb to denote solid/liquid concentra-tions. Do not use abbreviations in the title or keywords. Define abbreviations that are not standard in this field at their first occurrence in both the abstract and the main text. Ensure consistency of abbrevia-tions throughout the remainder of the manuscript. In all other cases, the recommendations of the International Union of Pure and Applied Chemis-try (IUPAC) should be followed, and attention should be given to the recommendations of the Analytical Chemistry Division in the journal Pure and Applied Chemistry (see also IUPAC Compen-dium of Analytical Nomenclature, Definitive Rules, 1987). (4) Procedure after acceptance A set of proofs will be sent to the corresponding author to be carefully checked for errors. Correc-tions must be restricted to instances in which the proof is at variance with the manuscript. We shall be obliged to make a charge for all `extra' correc-tions at a rate in accordance with their cost to us.

To ensure fastest possible publication, proofs are sent to authors by e-mail, and corrections must be returned to the publisher also by e-mail. If correc-tions are not returned, the article will be passed for publication with in-house corrections only. Au-thors of Letters will not receive proofs; proofing will be done in-house in order to speed up publica-tion. (5) Author benefits There are no page charges. The corresponding author, at no cost will be provided with a PDF file of the article via e-mail or, alternatively, 25 free paper offprints. The PDF file is a watermarked version of the published article and includes a cover sheet with the journal cover image and a disclaimer outlining the terms and conditions of use. (6) Further information Desk editorial address for 'after-acceptance' corre-spondence Elsevier Ireland, Elsevier House, Brookvale Plaza, East Park, Shannon, Co Clare. Tel: +353 (61) 709600; Fax: +353 (61) 709100. E-mail: aca@elsevier.com