Desenvolvimento de métodos analíticos espectrofotométricos ... · • Otimização das...
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Departamento de Química
RELATÓRIO TÉCNICO-CIENTÍFICO
PROGRAMA INSTITUCIONAL DE BOLSA DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA CNPq
Desenvolvimento de métodos analíticos espectrofotométricos e eletroanalíticos para compostos de interesse farmacológico
(Naftoquinonas).
Aluno: Juliano Leodonio Xavier Lima
Orientadores: Ricardo Queiroz Aucélio Andrea Rosane da Silva
INSTITUIÇÃO DE ENSINO Pontifícia Universidade Católica do Rio de Janeiro
Rua Marquês de São Vicente, 225, Gávea - Rio de Janeiro, RJ - Brasil - 22453-900 Cx. Postal: 38097 - Telefone: (55 21) 3527-1001
Rio de Janeiro, Julho de 2012
Departamento de Química
RESUMO
O estudo das naftoquinonas, principalmente do lapachol (2-hidróxi-3-(3-metil-2-
butenil)-1,4-naftoquinona), desperta o interesse da indústria farmacêutica devido as suas
atividades biológicas como antiinflamatória, antimicrobiana, antiulcerogênica,
anticancerígena, antiviral entre outras. Nos últimos anos tem crescido o interesse pelo
desenvolvimento de sondas analíticas fluorescentes devido às características do fenômeno
fotoluminescente em termos de seletividade e sensibilidade.
O objetivo deste trabalho foi desenvolver uma metodologia analítica para
determinação de lapachol, baseada no quenching de fluorescência da sonda CdTe-3MPA (λex
380 nm). Os parâmetros otimizados para obtenção da melhor condição de trabalho foram pH,
quantidade de solvente orgânico presente na dispersão aquosa e tempo de leitura requerido
para estabilização do sinal fluorescente (aproximadamente 30 min). As dispersões de trabalho
de CdTe-3MPA (4.5 x 10-8 mol/L) foram preparadas em meio aquoso contendo 1 mL de
tampão Tris-HCl, 1 mL de metanol (10% em volume) e quantidades apropriadas de lapachol.
O range linear foi de 10 a 100 µmol/L, com um coeficiente de correlação de 0.9961 e um
limite de detecção de 8 µmol/L. Para estabelecer uma correlação entre o sinal fluorescente e a
concentração de lapachol utilizou-se o modelo de Stern-Volmer e os valores de absorção
foram corrigidos para eliminar a contribuição de efeito de filtro interno. Outras naftoquinonas
como α-lapachona, β-lapachona e β-lapachona sulfonada também foram capazes de induzir o
quenching de fluorescência, contudo o lapachol promoveu uma diminuição de sinal
fluorescente mais intensa (quenching mais efetivo). A sonda foi aplicada na determinação de
lapachol em amostras urina e as médias de recuperação foram satisfatórias.
INTRODUÇÃO
As naftoquinonas são descritas como principais constituintes de plantas do
gênero Tabebuia pertencentes à família Bignoniaceae por serem frequentes e algumas vezes
abundantes em várias espécies deste gênero [1].
O estudo das naftoquinonas desperta o interesse das indústrias farmacológicas,
principalmente no que diz respeito ao lapachol (2-hidróxi-3-(3-metil-2-butenil)-1,4-
naftoquinona), devido a suas ações terapêuticas como atividades antiinflamatória,
antimicrobiana, antiulcerogênica, anticancerígena, antiviral e outras. Por exemplo, a análise
estatística do tempo de resposta ao estímulo ao calor em ratos tratados intraperitonealmente
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com extrato etanólico de T. chysotrichae (planta constituída de lapachol), mostrou
significativa diferença, em relação ao grupo controle. Para o grupo tratado com formulações
tópicas de lapachol, foi possível constatar suas propriedades antiinflamátorias e analgésicas
[2]. Verificou-se também que à medida que se eleva o grau de pureza do lapachol, diminui-se
progressivamente a atividade antimicrobiana dessa naftoquinona, o que pode ser explicado
pelo fato de que outras naftoquinonas eliminadas na purificação do extrato também possuem
atividade antimicrobiana [3]. Estudos indicaram que os fungos são consideravelmente mais
sensíveis do que bactérias, particularmente na presença de β-lapachona. Tanto o lapachol
quanto a β-lapachona foram mais ativos que o cetoconazol, droga de referência utilizada em
grande escala no combate a fungos [4]. Na avaliação da atividade antivirótica do lapachol (in
vitro) verificou-se que esta substância atua no RNA de vírus, tanto sobre os vírus envelopados
quanto sobre vírus sem esta estrutura (por exemplo, o P1S pólio tipo 1), em concentrações de
5 a 10 mg/mL dificultando a sua reprodução [5].
O lapachol é um potente e reversível inibidor da vitamina K epóxido redutase e
vitamina K quinona redutase, sendo que a sua forma oxidada é o verdadeiro inibidor da
primeira enzima, resultando daí o efeito hipoprotrombinêmico do lapachol e de 2-
hidroxinaftoquinonas relacionadas [6].
Além do lapachol é possível destacar a presença em forma natural de outras
naftoquinonas como α-lapachona, β-lapachona e β-lapachona sulfonada (Figura 1), porém em
pouquíssimas quantidades [7]. Portanto a via sintética representa a forma mais viável de
obtenção dessas naftoquinonas [8].
O
O
OH
aO
O
O
b
O
O
OO
O
O
SO3Hc d
Figura 1 – Estruturas das naftoquinonas: (a) lapachol, (b) β-lapachona, (c) α-lapachona e (d) β-lapachona sulfonada (d).
Nos últimos anos tem crescido o interesse pelo desenvolvimento de sondas analíticas
fluorescentes devido às características interessantes desse fenômeno no tocante à detecção
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seletiva e sensível e pela multiplicidade de modos de detectar alterações na sonda (detecção
de comprimento de onda, alteração da intensidade de radiação ou das características de
polarização). As sondas luminescentes constituídas por nanopartículas, em especial aquelas
incluídas na categoria dos quantum dots (QDs) ou pontos quânticos, vem encontrando espaço
em novas abordagens no ramo da espectroanalítica [9].
Nanopartículas luminescentes possuem propriedades diferenciadas dos outros
materiais luminescentes (por exemplo, os corantes orgânicos), pois a luminescência dos QDs
tem perfil estreito (pequeno valor de FWHM) com comprimento de onda máximo ajustável
pelo controle do tamanho da partícula no momento da síntese [10]. Além disso, cabe ressaltar
que os QDs são resistentes a fotodegradação (photobleaching) e possuem elevadas eficiências
quânticas luminescentes, devido à ausência de níveis vibracionais que promoveria rota
alternativa à emissão de luz para a desativação de energia [11].
Os QDs são formados por elementos dos grupos IIB ou IIIA, exemplos CdS, CdSe,
CdTe, GaN e InAs. Muitas das vezes esses QDs apresentam seletividade devido a
revestimentos dos núcleos geralmente com ligantes orgânicos que evitam a oxidação e a
agregação da nanoestrutura fornecendo assim uma característica diferenciada, além de reduzir
sua toxidade. Os sensores formados por QDs são baseadas na resposta fluorescente das
nanopartículas a uma determinada substância ou droga; isto evidência o uso dos QDs como
promissoras sondas analíticas para fármacos e substâncias químicas em geral [12]. A
espectrofotometria de fluorescência ou espectrofluometria compreende a medida da
fluorescência emitida quando substâncias, conhecidas por fotoluminescentes, são expostas à
radiação ultravioleta e visível, promovendo a excitação da molécula pela promoção de
elétrons de valência para orbitais com energia mais elevada. Em condições ideais, após curta
permanência da molécula no estado excitado ela retorna para o estado fundamental emitindo
luz, processo radiativo chamado luminescência (fluorescência ou fosforescência). Processos
de desativação por colisão (sem emissão de luz) também competem na desativação da
molécula para o estado excitado e podem sobrepujar a fotoluminescência se as condições
experimentais (temperatura, presença de espécies químicas desativadoras) não forem ideais e
a estrutura da molécula (ausência de rigidez estrutural e ausência de grupos cromóforos) não
for apropriada.
No processo radiativo, a luz é emitida com comprimento de onda maior que o da
radiação de excitação absorvida por causa das questões relacionadas com a regra de Kasha e
com a probabilidade quântica das transições. A intensidade da luz emitida por uma solução
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fluorescente é, em determinadas condições, proporcional à concentração do soluto, e em
consequência, aproveitável para fins analíticos.
As nanopartículas de CdTe (telureto de cádmio) e CdS (sulfeto de cádmio) apresentam
um forte confinamento eletrônico por se encontrarem em escala nanométrica, quanto menor o
diâmetro dos nanocristais maior será o confinamento quântico. Os QDs são considerados uma
fonte rica de elétrons, estes ao serem excitados em presença de luz ultravioleta (em diferentes
comprimentos) são promovidos da banda de valência (estado fundamental) para a banda de
condução (estado excitado). Quando os elétrons retornam para banda de menor energia
emitem sinal fluorescente intenso, característico das nanopartículas semicondutoras [13].
A extinção ("quenching") de fluorescência refere-se a qualquer processo que provoque
a diminuição da intensidade de fluorescência de um fluoróforo (por exemplo os QDs) em
presença de um analito. Os processos que podem dar origem à extinção de fluorescência são
diversos, como por exemplo: rearranjos moleculares, formação de complexos (extinção
estática) e colisões moleculares (extinção dinâmica). A extinção de fluorescência observada
em consequência de colisões entre moléculas fluorescentes e as espécies que causam tal
extinção (denominado de "quencher") é descrita pela equação de Stern-Volmer (equação 1).
Onde, F0 e F são as intensidades das fluorescências na ausência do analito e na
presença (A), e Ksv é a constante de Stern-Volmer, esta representa a inclinação da curva [14].
PROPOSTA DE TRABALHO
Este trabalho baseou-se na síntese de QDs de CdTe e CdS revestidos com ligantes
orgânicos a fim de dosar um analito de interesse de acordo com as seguintes etapas:
• Síntese dos QDs CdTe-3MPA, CdS-cisteína e CdS-2MPA.
• Testes preliminares para escolha de uma classe de analitos (naftoquinonas,
pesticidas ou fluoquinolonas) capaz de induzir de quenching de fluorescência
em uma das três sondas.
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• Escolha da classe de analitos que proporcionar os melhores resultados de
atenuação do sinal fluorescente (da sonda) e escolha do tipo de sonda
fluorescente que será utilizada.
• Caracterização da sonda fluorescente por métodos ópticos (fluorescência e UV-
vis)
• Preparo das soluções de trabalho.
• Otimização das condições de trabalho (concentração e pH do tampão,
proporção de solvente orgânico e estabilidade da sonda).
• Investigação do quenching de fluorescência utilizando a abordagem de Stern-
Volmer. Monitoramento dos valores de absorção do analito de interesse (a
fim evitar contribuição de efeito filtro).
• Obtenção das curvas analíticas.
• Testes de interferência.
• Aplicação do método desenvolvido na determinação de lapachol em amostras
de urina.
PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL
Síntese dos pontos quânticos de sulfeto de cádmio (CdS)
As nanopartículas modificadas de CdS foram sintetizadas de acordo com o indicado na
literatura [15]. Tipicamente, para os pontos quânticos de sulfeto de cádmio (CdS), adicionou-
se em um balão bitubular quantidade adequada de cloreto de cádmio, ligante (2-MPA, 3-MPA
ou L-cisteína) e água, seguido de ajuste do pH para a faixa básica (7,5 – 8,5) com a adição de
NaOH 0.1 M. Posteriormente, o balão foi fechado com dois septos de borracha, em uma das
saídas foi adaptado um sensor de temperatura e na outra saída foi introduzida uma agulha a
fim de manter o fluxo de nitrogênio e retirar o oxigênio do sistema. Em seguida, foi
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adicionado solução de sulfeto de sódio com auxílio de uma seringa. As reações permaneceram
sob agitação por um período mínimo de 30 min e máximo de 1h.
Para a reação com L-cisteína foi necessário o uso de condensador de refluxo, pois a
reação ocorre com aquecimento.
Síntese dos pontos quânticos de telureto de cádmio (CdTe)
A solução de NaHTe e QDs CdTe foram preparadas como descrito na literatura
[15] com uma ligeira modificação no tempo de reação visando obter um máximo de emissão
em 540 nm. Resumidamente, a uma solução de 0,2 mmol de CdCl2 foram adicionados 0,4
mmol 3-MPA em seguida foi feito o ajuste de pH (pH 10,0) através de pequenas adições de
uma solução de NaOH 1,0 mol L-1 sob agitação. A solução foi em um balão de fundo
redondo de três saídas em uma das saída foi acoplada a um condensador de refluxo, em
seguida, purgou-se N2 no sistema por aproximadamente meio hora sob agitação constante.
Posteriormente 2,0 mL de solução NaHTe preparados concomitantemente foram adicionados
a solução de CdCl2-3MPA, através de uma seringa à temperatura ambiente. A proporção de
Cd:MPA:Te na reação foi de 1:2:0.2. Em seguida, a mistura de reação foi aquecida à
temperatura de refluxo (aproximadamente 100 ◦C) sob atmosfera inerte por aproximadamente
3 h.
Preparação de soluções padrão, dispersões e amostras
Foram preparadas soluções de tampão Tris-HCl 0,02 e 0,05 molL-1 (em diferentes
valores de pH), e soluções estoque em metanol dos analitos pertencentes a classe dos
pesticidas e fluoroquinolonas na concentração 1 x 10-3 mol L-1.
As dispersões de trabalho foram preparadas em balões volumétricos de 10 mL pela
adição de 1mL de tampão Tris-HCl 0,02 molL-1 (pH 7.4), 30µL de dispersão estoque de
CdTe-3MPA, e volumes apropriados de soluções estoque de naftoquinonas (1,0 x 10 -2 mol
L -1 em metanol). Um volume complementar de metanol foi adicionado (até 1 mL) de forma
que todos os balões tivessem a mesma quantidade de solvente orgânico, por fim cada balão
foi avolumado para 10 mL com adição de água ultrapurificada. As leituras foram feitas após
meia hora, repeitando o tempo requerido para estabilização do sinal analítico (branco).
A limpeza das amostras de urina fortificadas com lapachol foi realizada pela adição de
solução de sulfato de amônia seguida por centrifugação (a 300 RPM). O sobrenadante foi
coletado e submetido à extração em fase sólida (SPE), utilizando cartuchos feitos em
laboratório, com 200 mg de um polímero acrílico empacotados em seringas hipodérmicas de 1
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ml de plástico acopladas a filtros de membrana PTFE (0,45). Os interferentes da matriz de
urina foram eluídos com 4 mL de água ultrapura (MILI-Q), em seguida, 4 mL de metanol
foram utilizados para eluição do analito (lapachol). O solvente orgânico eluído foi evaporado
sob fluxo de nitrogênio e a amostra foi redissolvida na dispersão de trabalho. Todas as
medições foram feitas em triplicata.
Instrumentação
Os espectros de absorção UV-vis foram obtidos através do espectrômetro de feixe
duplo Perkin-Elmer Lambda 19. Os espectros de fluorescência foram obtidos em um
espectrômetro de luminescência LS55 da Perkin-Elmer com as medições realizadas com
bandas espectrais de 10 nm e velocidade de varredura de 1500 nm min-1. A excitação foi
realizada a 380 nm e a medição feita em 540 nm (em estudos com naftoquinonas).
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Testes iniciais
Inicialmente foram realizados testes preliminares para verificar a estabilidade dos
pontos quânticos CdS-2MPA, CdS-cisteína e CdTe-3MPA em função do tempo. Alíquotas
apropriadas de cada dispersão de nanopartículas (ver Tabela 1) foram adicionadas a balões
volumétricos de 10 mL e avolumadas com água (até a marca). As leituras foram feitas em
espectrofluorímetro com intervalos de 10 min durante 70 min. Os resultados mostrados na
Figura 2 indicaram que CdS-2MPA apresenta uma estabilidade excelente, praticamente não
havendo variação na intensidade do sinal fluorescente, contudo é necessária a utilização de
uma alíquota de 100 µL de dispersão estoque para que a intensidade máxima do sinal seja de
aproximadamente 380 unidades arbitrárias (u.a.). CdTe-3MPA apresentou uma boa
estabilidade a partir de 30 minutos utilizando-se uma alíquota de somente 40 µL da dispersão
estoque. Já CdS-cisteína (CdS-Cis) não apresentou um bom resultado, pois o sinal não foi
estável em nenhum momento, portanto a utilização desta sonda foi descartada.
Tabela 1
CdS-2MPa CdS-Cis CdTe-3MPa
Volume de QDs em cada dispersão (µL) 100 150 40
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Comprimento onda de excitação (nm) 360 363 380
Comprimento onda de emissão (nm) 510 516 540
Tabela 1 – Dados comparativos entre os QDs quanto a volume adicionado e comprimentos de
excitação e emissão.
Figura 2 – Estabilidade dos QDs em função do tempo.
A escolha pela nanosonda de trabalho baseou-se no menor volume adicionado para
compor a dispersão de trabalho, menor valor de FWHM e na interação com os analitos
pertencentes à classe das naftoquinonas, pesticidas e fluoroquinolonas. Em relação à alíquota
de dispersão estoque, o CdTe mostrou-se muito vantajoso, pois com 40 µL (avolumados para
10 mL) a intensidade máxima do sinal foi de aproximadamente 900 u.a., logo foi possível
utilizar uma alíquota menor ainda (30 µL) nos testes seguintes. Em relação ao FWHM
calculado, obteve-se os valores de 58 nm para dispersão de CdTe-3MPA e 132 nm para CdS-
2MPA, estes resultados indicaram que na dispersão aquosa de CdTe-3MPA as nanopartículas
apresentam melhor uniformidade em relação aos tamanhos dos nanocristais. Por outro lado o
resultado para a dispersão de CdS-2MPA indicou a presença de nanocristais de tamanhos
mais variados devido ao maior valor obtido (132 nm). Portanto CdTe foi considerado até aqui
um sonda fluorescente melhor do CdS-2MPA.
Posteriormente foram realizados testes com adição dos analitos às sondas CdTe-3MPA
e CdS-2MPA. Observou-se que os analitos da classe dos pesticidas não induziram queda nem
aumento do sinal fluorescente, o que inviabilizou qualquer desenvolvimento de metodologia.
Nos testes com analitos da classe das fluoroquinolas, observou-se que havia interferência da
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fluorescência natural destes analitos no comprimento de onda máximo de emissão das
nanopartículas, portanto também não foi possível dar continuidade aos testes com esses
analitos. Por fim os resultados com os analitos da classe das naftoquinonas foram
promissores, pois estes não possuem fluorescência natural e ainda induziram a queda do sinal
fluorescente (proporcional ao aumento da concentração) nas duas sondas. Como a sonda
CdTe-3MPA apresentou boa estabilidade, necessidade de adição de pequenas alíquotas para
compor a dispersão de trabalho e um perfil de emissão bem definido, esta foi escolhida para
continuação do trabalho.
Caracterização QDs CdTe-3MPA
A concentração de QDs CdTe na dispersão estoque foi estimada usando a lei de
Lambert Beer, que relaciona a absorbância no primeiro pico excitônico com o coeficiente de
extinção molar de QDs [16]. A concentração da dispersão estoque de CdTe (considerando a
hipótese de uma solução real) foi de 1,5 x 10 -5 mol L -1.
O tamanho dos nanocristais foi determinado a partir da equação 2, onde D (nm) é o
diâmetro das partículas e λ (nm) é o comprimento de onda do pico de absorção do primeiro
excitônico [17]. O espectro de absorção, mostrado na figura 3A, apresenta o primeiro pico de
absorção em 522 nm, o que indica (ao substituir este valor na equação na equação 2) um
diâmetro CdTe QDs de cerca de 2,8 nm.
O perfil de fluorescência dos CdTe QDs (excitação em 380 nm) é mostrado na
figura 3B, este mostra uma banda de emissão simétrica e acentuada (58 FWHM nm) com
máximo em 540 nm. O rendimento quântico estimado para o QDs CdTe-3MPa à temperatura
ambiente foi de 24%, sendo obtido através da abordagem comparativa com padrão de
fluoróforo (emissão de rondamina B em etanol) [18].
(2)
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Figura 3 – Espectro de Absorção (A) e emissão fluorescente com excitação em 380 nm (B) para CdTe-3MPA QDs.
Otimização das condições experimentais
O ácido 3-mercaptopropionico (3MPA) é ligante popular na modificação de QDs pois
ele aumenta a estabilidade das nanossondas em soluções aquosas e melhora a fotoestabilidade
[18]. As condições experimentais foram ajustadas a fim de obter uma fluorescência estável da
nanossonda de 3MPA-CdTe em solução aquosa. Estas escolhas foram feitas com base em
informações disponíveis na literatura e através da realização de experimentos de
otimização. Primeiro, o volume da disperção-mãe de CdTe-3MPa a ser colocado na solução
de trabalho foi definido em 30 µL (4,5 x 10 -8 mol L -1 para a concentração final, estimada de
nanossonda igual a 10 mL), a fim de permitir fluorescência intensa e não saturação do
detector. O pH da dispersão aquosa (inicialmente cerca de pH 6) foi ajustado para 7,4.
Verificou-se que em sistemas com valores de pH inferiores a 7 (ajustado pela adição de HCl
ou NaOH), a fotoluminescência da nanossonda diminui significativamente. Por outro lado,
em sistemas tamponados com Tris-HCl, a fluorescência observada, a partir de sistemas
ajustados com pH maior que 8,0 (até pH 9), oscilou ao longo do tempo, o que não permitiu
precisão suficiente para medições quantitativas confiáveis. Na faixa de pH 7,1-7,5 (faixa do
pH fisiológico), a fluorescência medida foi intensa e estável, com desvio padrão relativo
(RSD) de 5%. Duas concentrações do tampão Tris-HCl (1 mL 0,02 e 0,05 mol L -1 em um
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volume final de 10,0 mL) foram avaliadas. Não houve diferença na magnitude e na
estabilidade do sinal, portanto, 1,0 mL de tampão de 0,02 mol L-1 foi selecionado para a
composição da dispersão de nanossonda. Finalmente, para garantir a dissolução total das
naftoquinonas quando as amostras são introduzidas na dispersão de trabalho, metanol (10%,
em volume) foi incluído na mistura. Tal proporção de metanol não afetou a intensidade do
sinal e nem a estabilidade da fluorescência medida a partir da solução de trabalho. Nas
condições estabelecidas, um estudo foi feito ao longo do tempo e verificou-se que, em um
intervalo de tempo de 60 min, a estabilidade da fluorescência é obtida após 25 min da mistura
inicial dos componentes (Figura 4).
Figura 4 – Estabilidade do sinal fluorescente do QDs CdTe-3MPA em função do tempo na condição de trabalho (1 mL de tampão tris-HCl 0,02 M, 1 mL de metanol e 30 µL de CdTe-3MPA avolumados para 10 mL) .
Fluorescência da dispersão de CdTe QDs na presença de naftoquinonas
Lapachol é um ácido fraco com pKa de cerca de 6,2 [19], o que significa sua hidroxila
está completamente desprotonado quando dissolvido na sonda de trabalho (cerca de 10-4 mol
L-1) em pH 7,4. O lapachol apresenta um perfil de absorção amplo na faixa do UV-Vis
(Figura 5) característico de naftoquinonas e embora os seus valores de absorbância (levando
em consideração uma concentração de 1 x 10 -4 mol L -1) sejam inferiores a 0,17 e 0,05 em
540 nm (A 540) e 380 nm (A 380) respectivamente, fez-se a correção da pequena contribuição de
efeito filtro [20]. Assim, uma seqüência de espectros de absorção das nanopartículas na
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presença de concentrações crescentes de lapachol (Figura 5) foram obtidos. A contribuição
deve ser levada em consideração ao estabelecer um modelo de extinção (‘quenching’) de
fluorescência para a sonda de nanopartículas.
As respostas das fluorescências medidas na presença de lapachol foram corrigidas
para eliminar qualquer influência do efeito de filtro interno (ver Equação 3), os
valores A 540 variaram de 0,014 a 0,162 e os de A 380 variaram de 0,017 a 0,071. Para
estabelecer uma relação entre a fluorescência medida e concentração de lapachol foi utilizado
o modelo de Stern Volmer, como visto na equação 4, onde F0 corresponde a resposta
fluorescente observada pelo branco e Fcorr a fluorescência observada em presença de
concentrações crescentes de lapachol de 1 x 10 -5 a 1 x 10 -4 mol L -1 (Figura 5).
F corr = F x 10 [(A 380 + A
540) / 2] (3)
F 0 / F corr = 1 + K sv [Lapachol] (4)
Figura 5 – Espectro de absorção UV-Vis do QDs CdTe-3MPA (a) e espectro de Absorção do QDs CdTe-3MPa em presença de concentrações crescentes de lapachol (1x10-5 a 1x10-4 mol L-1, a-h)
A constante de Stern-Volmer (Ksv), calculada por meio desse modelo foi de 3,97 x 103.
Medições de decaimento de fluorescência indicaram que o tempo de vida da fluorescência da
sonda na presença de lapachol τ é 2,98 ns, é o mesmo valor medido para a sonda na
ausência de lapachol τ = 2,97 ns). Estes resultados, juntamente com o fato de que a
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extinção segue o modelo de Stern-Volmer, indicam que uma extinção estática ocorre entre
lapachol e a nanossonda de CdTe-3MPA.
A fim de estabelecer uma comparação entre os prováveis interferentes do lapachol, a
extinção de fluorescência também foi estudada para β-lapachona, α-lapachona e sulfonada
lapachona. A curva de decaimento de fluorescência, usando os valores corrigidos para a
fluorescência na presença de β-lapachona, α-lapachona e sulfonada lapachona produzindo
valores de K sv de 2,18 x 10 3 L mol -1, 1,95 x 10 3 L mol -1 e 1,71 x 10 3 L mol -1
respectivamente. Esses valores indicam que lapachol tem cerca de duas vezes o efeito de
extinção de fluorescência sobre a nanossonda que uma quantidade similar de β–lapachona,
cerca de duas vezes e meio o efeito de extinção de fluorescência de uma quantidade similar de
α-lapachona e cerca de três vezes o efeito de extinção de fluorescência de uma quantidade
similar de β-lapachona sulfonada. Uma das explicações prováveis para este comportamento é
que, embora lapachol, β-lapachona, α-lapachona sejam isômeros, a distribuição espacial das
estruturas moleculares diferem em grande extensão. O lapachol apresenta um grupo de fenol
em sua estrutura (na condição experimental o fenol encontra-se desprotonado) que permite
que esta naftoquinona interaja facilmente com as nanopartículas, formando um complexo e
produzindo um quenching mais eficaz. No caso da β-lapachona e α-lapachona, a complexação
com nanopartículas seria improvável, pois não existe hidroxila fenólica na estruturas desse
analitos. Por outro lado, naftoquinonas são bons aceptores de elétrons, elas podem retirar
elétrons do QDs quando estes são excitados com a fonte de luz. Esta retirada dos elétrons
diminui a fluorescência dos QDs gerando o quenching de fluorescência. Isto explica o fato
dos quatro analitos terem induzido o quenching de fluorescência.
Figuras analíticas de mérito de determinação de lapachol
A resposta linear foi obtida até 1 x 10 -4 mol L-1 (24 mg mL-1) de lapachol (R2 = 0,998
e r = 0,999) com uma equação modelo de log (F0/F) = 3,97 x 103 [lapachol)] - 0,96 (figura
6). O limite de detecção (LOD) baseado na equação xb - 3sb tomando como base o sinal do
branco das curvas de atenuação foi de 8.0 × 10-6 mol L-1 (1.9 µg mL-1), significa que em uma
amostra de 70 µL, o limite absoluto de detecção é de 130 ng de lapachol. O LOD foi
calculado como a concentração de lapachol capaz de reduzir a fluorescência média da
dispersão de QDs (xb), branco, para um valor igual a x b - 3sb, onde sb é o desvio padrão da
leitura de 10 brancos.
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A precisão da medição de lapachol foi calculada como a variação do valor F0/F
levando em consideração 10 soluções independentes (em dois níveis de concentrações de
lapachol). Para obtenção destes resultados, a seguinte equação foi utilizada: s (F0/F) = F 0 / F x
[(s F / F) 2 + s F 0 / F 0) 2] 1 / 2. A s(F 0 / F), em valores percentuais, foi de 1,2% e 2,2% ,
respectivamente, o 3 x 10 -5 mol L -1 e 6 x 10 -5 mol L -1níveis de concentração.
Figura 6 – Resposta fluorescente para o ‘quenching’ do CdTe-3MPA com as concentrações ( (a) 0; (b) 1.0; (c) 3.0; (d) 6.0; (e) 7.0; (f) 8.0; (g) 9.0 x 10-5 mol L-1 e (h) 1.0 x 10-4 mol L-1 de lapachol). A seta indica a diminuição da resposta fluorescente a medida que aumenta a concentração de lapachol.
Interferência das outras naftoquinonas
A seletividade da resposta na presença das naftoquinonas (β-lapachona, α-lapachona e
β-lapachona-3-ácido sulfônico) foi avaliada. Estas naftoquinonas estão presentes em fontes
naturais, em quantidades muito menores do que a do lapachol, portanto, a interferência foi
estudada usando proporção equimolar como proporção máxima entre lapachol e cada uma
dessas naftoquinonas. A interferência foi avaliada pelos valores de F lapachol / F (lapachol +
naftoquinona ), que é a razão entre a fluorescência de uma dispersão contendo a dispersão de QDs
com 1 x 10 -5 mol L -1 de lapachol (F lapachol) e a fluorescência de uma dispersão de QDs
contendo 1 x 10 -5 mol L -1 de lapachol e uma das outras naftoquinonas em concentrações
crescentes (F(lapachol + naftoquinona )). A diferença maior que 5% entre esses sinais (razão maior de
1,05) caracteriza interferência causada pelas naftoquinonas. Na Tabela 2, a relação F lapachol /
F (lapachol +naftoquinona) indica uma pequena contribuição das ouras naftoquinonas no quenching
na fluorescência da dispersão de QDs ocorrendo apenas quando elas estão presentes em uma
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quantidade equivalente (equimolar) ao de lapachol como indicado pelo Flapachol / F (lapachol +
naftoquinona) com valor de 1,05.
Tabela 2
Proporção molar Lapachol:naftoquinona
F lapachol / F (lapachol +naftoquinona)
α-lapachona β-lapachona β-lapachona-3-ácido sulfônico
1:0,5 0,99 1,00 1,00 1:0,6 1,00 1,00 0,99 1:0,7 1,03 1,01 1,01 1:0,8 1,03 1,02 1,02 1:0,9 1,04 1,03 1,04 1:1 1,05 1,04 1,06
Tabela 2 – Avaliação do efeito de ‘quenching’ de lapachol em concentração 1x10-5 mol L-1 na presença de α-lapachona, β-lapachona e β-lapachona sulfonada.
Aplicabilidade do método
Extratos (alcoólicos, chás e comprimidos) contendo lapachol são comercializados para
consumo humano devido às suas propriedades farmacológicas. Suas principais fontes contêm
lapachol em quantidades significantes, enquanto nenhum ou quase nenhuma quantidade
significantes de seus isômeros estarão presentes. Assim, lapachol aparecerá na urina de
consumidores onde ele pode ser detectado sem a interferência de outras
naftoquinonas. Portanto, a nanossonda de CdTe-3MPA foi testado na determinação de
lapachol em amostras de urina, visto que os extratos comercializados no mercado não
apresentaram quantidades possíveis para a determinação direta.
A fluorescência da urina se sobrepõem à da nanossonda de CdTe-3MPA, visto que a
urina apresenta muitas substâncias fluorescentes na sua composição (proteínas contendo
triptofano, por exemplo). A fim de permitir a análise, um procedimento de limpeza da
amostra (clean-up) utilizando extração em fase sólida (SPE) foi otimizado para se permitir a
remoção dos interferentes. Em primeiro lugar, 1 mL de amostra de urina foi fortificada com
lapachol (concentração final de 7 x 10 -5 mol L -1), sendo, a seguir, adicionado 0,2 g de sulfato
de amônio para permitir a precipitação de parte do teor de proteínas. A mistura foi agitada e
centrifugada por 15 min. O sobrenadante foi submetido à extração em fase sólida em um
cartucho. Este cartucho consistiu em 200 mg de polímero acrílico (sintetizado em laboratório)
empacotados em seringas hipodérmicas 1 mL. Os cartuchos foram previamente lavados com
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10 mL de metanol para remover eventuais impurezas, seguido de 5 mL de água
ultrapura. Depois de carregar as amostras em cada cartucho, estes foram lavados passando-se
4 mL de água ultrapura. A seguir, o analito foi eluído de cada cartucho com 4 mL de metanol
em balão volumétrico. O solvente orgânico foi evaporado sob fluxo de nitrogênio, e em
seguida, as amostraa foram reconstituídas na dispersão aquosa de CdTe-3MPA. Verificou-se
uma perda de cerca de 10% do analito durante o procedimento, provavelmente uma fração
residual retida do polímero. Portanto, as soluções de calibração (3 x 10 -5, 5 x 10 -5, 7 x 10 -5 e
1 x 10-4 molL -1) também foram submetidos a este procedimento de SPE. Testes com urina
não-fortificada indicaram que o procedimento eliminou a interferência espectral imposta pela
matriz da amostra na fluorescência do QDs CdTe-3MPA. A recuperação média (três amostras
feitas em triplicata) obtida com a abordagem proposta foi satisfatória, tendo em consideração
a complexidade da amostra (Tabela 3).
Tabela 3 Amostra Concentração (mol L -1) Recuperação (%)
1 6,7x10-5 96,8 ± 4% 2 6,2x10-5 88,0 ± 8,0%
Tabela 3 - Valores de recuperação da determinação de lapachol em amostras de urina.
CONCLUSÃO
A determinação do lapachol através do quenching de fluorescência em dispersões de
CdTe-3MPa foi demonstrada. O método proposto não depende de procedimentos complexos
como a derivatização química e é de aplicação rápida e simples. O limite de detecção
alcançou valores de magnitude na ordem de mg mL -1 sendo na mesma ordem de magnitude
de outros métodos analíticos indicados na literatura. Em termos de capacidade ultra-traço
(detecção de quantidades traço em microamostras), o método pode detectar até 130 ng de
lapachol presente na amostra adicionada na nanossonda de trabalho. A seletividade alcançada
na resposta para lapachol não requer o uso de HPLC para analisar amostras contendo
lapachol, β-lapachona, α-lapachona e β-lapachona-sulfonada (sulfonada lapachona) presente
na proporção esperada em amostras naturais. A aplicação do método em amostras de urina foi
bem-sucedida quando um procedimento SPE foi aplicado para limpeza da amostra.
Recentemente este trabalho foi aceito para publicação em Spectrochimica Acta Part A. A
versão on-line já encontra-se disponível [21].
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ANEXO Versão on-line do paper referente a este trabalho aceito para publicação
http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1386142512003721
Trabalho apresentado no Colloquium Spectroscopicum Internationale XXXVII in Brazil
(2011) - TU 02 = ABS0374 - CdTe quantum dots as a fluorescence probe for determination of
naphthoquinones
http://csixxxvii.org/index.php?pag=programofposter (acesso em 09/07/2012).