Descubra la Cromatografía de Convergencia UltraPerformance ... · Fase Normal ©2012 Waters...
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Descubra la Cromatografía de Convergencia UltraPerformance : UPC²™
Waters UPC² Workshop
30 - 31 Mayo 2012 – Cerdanyola del Vallès
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Agenda
09:15 Bienvenida
09:45 Introducción a la Cromatografía Supercrítica
10:00 Presentación del sistema ACQUITY UPC2 y de la tecnología de columnas asociadas
11:00 Pausa
11:30 Sesiones prácticas paralelas en el laboratorio
. Grupo 1: Estudio de una mezcla en UPC2
. Grupo 2: Estudio de una mezcla en fase reversa UPLC
13:00 Comida
14:00 Sesiones prácticas paralelas en el laboratorio
. Grupo 1: Estudio de una mezcla en fase reversa UPLC
. Grupo 2: Estudio de una mezcla en UPC2
15:30 Mesa redonda: Cómo aprovechar las posibilidades que ofrece el sistema UPC2
16:00 Conclusiones
16:30 Fin del seminario
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Introducción a la Tecnología de Fluidos Supercríticos
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Aplicaciones de los Fluidos Supercríticos
Supercritical CO2
Extracción (SFE) Compuestos Bioactivos Nutraceuticos Espécies y aromáticos Decafeinización Descontaminación o lavado Recuperación de compuestos valiosos en residuos
Reacción Hidrogenación Hidroformilación Carboxilación
SF Diseño de Partículas (RESS & SAS) Polymerización Cristalización Impregnación
Cromatografía (SFC) Analisis y Purificación Separaciones Quirales Fase Normal
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Gas – Similar. Su baja viscosidad le confiere difusividad y limita la caída de presión
Liquido – Similar. Su elevada densidad le asegura buenas propiedades como solvente
Alto Coeficiente de Difusión, aumenta el rendimiento cinético de la SFC
¿Que es un Fluido Supercrítico?
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CO2 @ 55°C
& 200 bar
C6H14 @ 25°C
MeOH @ 25°C
MeCl2 @25°C
Densidad (g/cm3)
0.75 0.66 0.79 1.33
Viscosidad (x104 PaS)
0.80 2.94 5.47 4.11
Difusividad (x109 m2/s)
6.0 4.0 1.8 2.9
CO2 vs Solventes
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¿Qué Fluido Supercrítico?
Courtesy of A. Grand-Guillaume Perrenoud, D. Guillarme, Pr J-L. Veuthey, University of Geneva
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CO2 Diagrama de Fases
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CO2 Alcanza el Estado Supercrítico a 31.1ºC y 73.8 bar – Su estado físico es fácilmente manipulable
CO2 es no tóxico y no inflamable
CO2 es químicamente puro, estable y un solvente no-polar, también compatible con detectores de LC
CO2 es un solvente Verde – Se recupera de procesos industriales y plantas de fermentación – Evita la producción de CO2 que habría sido generada por el tratamiento
de los solventes que sustituye – Se necesita menos tiempo y energía para evaporar fracciones para
conseguir los analitos puros
¿Por qué CO2 ?
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Reducción de costes
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CO2 se usa como fase móvil en combinación con uno o mas solventes orgánicos – Gran variedad de fuerza de solventes
– La composición del modificador orgánico puede variar del 0 al 100% (típicamente metanol)
Técnica Cromatográfica similar al HPLC
¿Que es un Cromatógrafo de Fluidos Supercríticos (SFC) ?
Características Únicas Fase móvil comprimible Refrigerador para bomba de CO2 Celda UV resistente a la Presión Regulador de Presión
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Alta difusividad (Dm), mayor velocidad lineal óptima Uopt. El mismo número de picos se pueden separar en menos tiempo.
Misma L, SFC es 3-10 veces mas rápida por la Uopt En el mismo tiempo de análisis, 3-10 columnas mas largas pueden utilizarse en SFC, N es por tanto 3-10 mayor.
Difusividad ~ Velocidad/Eficacia
Velocidad Lineal Óptima p
mopt d
DU 63.1≅
Tiempo de Retención )'1( KULtR +=
Eficacia:
pdLN
2≈
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0
20
40
60
80
100
120
140
160
0 10 20 30 40 50
SFC 5 µm HTLC/Monolith
UPLC 2 µm
HPLC 3 µm
Comparativa Curvas de Eficacia
Courtesy of C. West, E. Lesellier, ICOA – University of Orléans
HPLC 5 µm
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Benzodiazepines I. Midazolam II. Flunitrazepam III. Lormetazepam IV. Clorazepam V. Nitrazepam VI. Oxazepam
AU
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
Minutes 0.00 0.40 0.80 1.20 1.60 2.00 2.40 2.80 3.20 3.60 4.00
Steroids 1. Androstenedione 2. Mestanolone 3. Testosterone 4. Stanozolol
Van Deemter curve H = f(u)
0.0
20.0
40.0
60.0
80.0
100.0
0.0 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0
H (µ
m)
u (mm/s)
uopt
1
2
4
3
0.60 min
1
2 4
3
1.90 min
AU
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
Minutes 0.00 0.40 0.80 1.20 1.60 2.00 2.40 2.80 3.20 3.60 4.00
2.75 min
I II
IV III
V VI 0.85 min
I II
IV
III
V VI
Generic conditions 2-EP, 150 x 4.6mm, 5µm. CO2-MeOH, 3.5mL/min
Oven temp @ 40 C BPR @ 200bar
UV detection @ 220nm
Condiciones Genéricas 2-EP, 150 x 4.6mm, 5µm. CO2-MeOH, 10mL/min
Oven temp @ 40 C BPR @ 200bar
UV detection @ 220nm
3 x uopt
Only 25% efficiency loss
Condiciones de Análisis Rápidas
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El aumento de número de platos en HPLC está principalmente limitado por la presión (El aumento de L y la disminución del dp implica aumento de presión).
La baja viscosidad, disminuye el aumento de presión, permitiendo el aumento del caudal y la longitud de la columna, incluso el acoplamiento de varias columnas para mejorar la separación.
Viscosidad ~ Velocidad/Eficacia
22
250
cpddFLP η
≈∆Aumento de Presión:
Eficacia: pd
LN2
≈
′+
′
−⋅=
2
2
1125.0
kkNRs α
α
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BZD 1. Diazepam 2. Midazolam 3. Flunitrazepam 4. Lormetazepam 5. Flurazepam 6. Alprazolam 7. Triazolam 8. Clorazepam 9. Bromazepam 10. Nitrazepam 11. Clonazepam 12. Oxazepam 13. Lorazepam 14. Clozapine 15. Olanzapine
N
N R2
R3 R4
R5
R1
150 x 4.6mm, 5µm 30bar
2 1 3
4
5 + 6 7
8 9
10 + 11
12 13 + 14
15
Pc = 63
450 x 4.6mm, 5µm
2 1 3
4
6
7 8 9 11 12
13 14
80bar
5 10
15
Pc = 108
Analytical conditions : CO2-MeOH gradient mode, 4mL/min ; PrincetonSFC 2EP 150 x 4.6mm, 5µm; Oven temp @ 40 C ; BPR @ 150bar ; UV @ 220nm
Analisis de Alta Resolución
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Cualquier compuesto soluble en metanol o un solvente orgánico mas apolar.
Ácidos Orgánicos Fuertes y Bases requieren modificador con aditivo (DEA, TFA).
La mayor parte de sales y ácidos orgánicos y bases.
Pequeños péptidos lipofílicos
Se pueden separar solutos apolares como ceras y aceites
¿Qué compuestos pueden analizarse por SFC?
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Mayor velocidad y Productividad
– Mejor forma de pico
– Mejor resolución
– Re-equilibrado mas rápido
– Reducción del ciclo de análisis
– Mas muestras por día
SFC complementa RP-LC
– Técnica de fase normal
– Compatible con MS
– Selectividad Diferente
– Mejor retención de compuestos polares.
SFC mejora la separación de isómeros y enantiómeros, y compuestos de estructura similar.
No substituye completamente el HPLC, pero permite analizar el ~80% de moléculas pequeñas
Ventajas del SFC
Zhao Y. et al. LC GC Europe, 2004, 174 (4), 224-238
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Recordatorio: Partículas menores aumentan la Productividad
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¿Tienen las columnas con química de menor tamaño de partícula (< 2 µm) los mismos benefícios en SFC, que el que tienen en HPLC?
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Curvas de Eficacia en Columnas de SFC
2.5 µm XBridge™ HILIC, 3.0x50 mm
5.0 µm XBridge™ HILIC, 3.0x50 mm
3.5 µm XBridge™ HILIC, 3.0x50 mm
1.7 µm ACQUITY BEH , 3.0x50 mm
Condiciones Isocráticas CO2/Methanol 85:15 130 bar Presión de Salida
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Comparación de Resolución
AU
0.00
0.02
0.04
0.06
0.08
0.10
0.12
0.14
0.16
AU
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
Minutes0.00 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00
1.7 µm
5 µm 3.0x100 mm Column 2 mL/min CO2/Methanol Gradient
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ACQUITY UPC2 – Nuevo Miembro…
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… en la Familia ACQUITY
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Gold Award en Pittcon !
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Rango de caudal – 0.010 a 4.000 mL/min
Máxima presión de trabajo
– 6,000 psi (413 Bar) up to 4mL/min
Convergence Manager que contiene BPA integrado
Cuatro nuevas químicas de columnas de 1.7µm
Software Estandar de Waters (MassLynx™ o Empower™)
Completa compatibilidad con la consola de Empower
Connections INSIGHT®
ACQUITY UPC2 Características de Sistema
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ACQUITY UPC2 System
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3 Configuraciones de sistema
Configuración 1 2 SFC Columns
Configuración 2 4 SFC Columns
Configuración 3 6 SFC Columns
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Calidad CO2
Presión : ~ 60 bar
Calidad alimentaria >99.97% Pureza
Sin necesidad de manoreductor
Una botella estandar de CO2 (B50 sifonado) puede durar ~3-4 semanas.
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CO2 y seguridad
CO2 Monitorización – Un detector de CO2 debe situarse a unos 60cm de altura (a menor altura que la
mesa del instrumento). El detector debe iniciar una alarma a 4500 ppm de CO2. Waters no recomienda ningún distribuidor específico.
O2 Monitorización
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UPC² Químicas de Columna
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Clasificación Unificada
CO2/MeOH 90/10
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Retención en Fases Estacionarias: Compuestos con propiedades similares
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Diferentes Selectividades
1. Coumarin 2. Flavone 3. Caffeine 4. Thymine
5. Papaverine 6. Sulfamethoxazole 7. Cytosine 8. Sulfamethizole
CSH Fluoro-Phenyl
BEH
BEH 2-EP
Minutes 0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00 5.50 6.00 6.50 7.00 7.50 8.00 8.50 9.00 9.50 10.00
1 2
3 4
5 6 7
8
1
1
2
2
3
3
4
4
5
5
6
6
7
7
8
8
Columna: 4.6 x 150mm, 5 µm 5-40% MeOH sin aditivo 3.0mL/min at 40 C, 150 bar Volumen Inyección: 3µL
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ACQUITY UPC² Químicas de Columna
Primer set de químicas de columna sub-2 µm – Diseñadas y testadas para el sistema ACQUITY UPC²
– Alta eficacia y resolución
– Amplio rango de selectividad
3.5 µm Químicas de columna – Máxima flexibilidad para resolver cualquier análisis
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ACQUITY UPC² Químicas de Columna
Columnas disponibles en formato sub-2-µm Disponible en Q2 2012 en tamaño de partícula de 3.5 µm y todas las
columnas HSS Línea Viridis® – Las 4 químicas en 5 µm
BEH 2-EP (2-Ethylpyridine) • Buena retención, forma de pico y selectividad
BEH • Intensa interacción con grupos polares como fosfolípidos
CSH Fluoro-Phenyl • Buena retención de bases débiles • Ordenes de elución alternativos para compuestos ácidos y neutros
HSS C18 SB • Analisis de glicéridos en matrices diversas (Farmacéuticos, alimentación…)
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Todas las columnas ACQUITY UPC² tienen el resultado del test del batch de SFC en el Certificado de Análisis (CoA)
Todas las columnas ACQUITY UPC² tienen un e-Cord™ conectado
Batch Testing
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Sesiones Workshop
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Mesa Redonda