Departamento de Bioquímica - Digital CSIC
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Departamento de Bioquímica
Facultad de Medicina
Universidad Autónoma de Madrid
Nuevos mecanismos de regulación de la angiogénesis
por brote capilar e intususcepción: papel de las
oscilaciones de calcio y de la proteasa MT1-MMP
Doctorando: Sergio Esteban Iglesias (Licenciado en Biología, UAM)
Directora de la Tesis: Alicia García Arroyo
Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares- Carlos III (Madrid, ESP)
CERTIFICADO DEL DIRECTOR DE TESIS
La Dra. Alicia García Arroyo CERTIFICA que el doctorando Sergio Esteban Iglesias ha desarrollado y concluido su trabajo de Tesis Doctoral titulado “Nuevos mecanismos de regulación de la angiogénesis por brote capilar e intususcepción: papel de las oscilaciones de calcio y de la proteasa MT1-MMP” bajo su supervisión, en el Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares (CNIC), con la financiación de una beca predoctoral de Formación de Personal Investigador concedida por el Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades.
En Madrid, a 23 de Septiembre de 2018
Fdo: Alicia García Arroyo
Jefa de Grupo
Laboratorio de Metaloproteinasas de Matriz
Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculare-Carlos III
CNIC
Agradecimientos
“El objeto de nuestra enseñanza es que el cerebro
del individuo llegue a ser el instrumento de su
voluntad”
F. Ferrer i Guardia
La parte que todo el mundo lee, así que vamos a ello.
Lo primero agradecer a Alicia las oportunidades y financiación para realizar esta tesis, su
capacidad de trabajo y su disposición durante todos estos años. A mis compañeros de
laboratorio, los que siguen y los que se han marchado. A Cris por su ayuda continua, de
sol a sol, de guardia desde las 7 de la mañana, y por alimentarnos con alimentos ricos en
azúcar (la próxima la tuya). A Vane, con quien fue una alegría trabajar, y que ahora tiene
que molar mucho como profe. A Angel que llego en medio de la tesis y se convirtió en
necesario, aunque “discutamos” a menudo (queda una carrera pendiente y un mus). A
Chuchi por esos ratos cantando en falsete, inventando historias en cultivos y creando
chistes tan gloriosos como el pollo empanado. A Richi y sus bitcoins y a Álvaro cultureta
y divulgador, de ambos he aprendido mucho. A Susana, Mara Magda, Raquel, Diego,
Angela, Aga, Eirini, Cristina SC. A Xenia siempre dispuesta a ayudarnos con nuestra
incompetencia informática, y de la que he aprendido que se puede hablar siempre en
positivo de la gente, junto Angelos forman la pareja de griegos con perfecto español a la
que siempre puedes acudir. Y por supuesto a Pilar, que me ha enseñado y ayudado estos
años taaaaaaaaanto, muchas gracias “jefa”. Acabo, pero no te libraras de mí, algo
encontrare para seguir pidiéndote ayuda.
A los vecinos con los que formamos casi un único labo, los Miguel Angeles (Tere, Dacil,
María G., María A., Garbajosa, Giulio, Quilez, Miguel, Fidel, Inma, Sara F, Sara, Asier,
Ines, Ibón) gracias a todos por las cervezas los cafés, los reactivos y la compañía. Algunos
que merecen mención especial, Rober nuestras vidas seguirán siendo paralelas, nos veo
en el asilo jugando a la petanca, y seguirá siendo un gustazo compartir el tiempo contigo.
A Alberto, sin duda he aprendido de tu compromiso y acción. Mauro nuestra estresada
Lady Gaga de pantalones caídos, y un gran apoyo. A Lucas, una de las grandes amistades
que saco de de la tesis.
A ese grupo de amigos, algunos ya nombrados, que empezamos tomando una birra los
viernes por hacer grupo y ambiente en el labo y hemos terminado siendo un grupo para
cualquier día, con cualquier excusa, y atuendo queda a apoyarse y volcarse unos
“fresquitos”. Ahora somos algo más que un grupo que se junta a tomar algo. Al nihilismo
hecho persona de Montero, Ines, Angel, Amaya, Manuel de todos he aprendido y seguiré
aprendiendo.
Al resto de vecinos, los Juanmis y los Puros especialmente a Silvia, MJ, Sara, Loli y Pablo
que me han ayudado con reactivos, su experiencia y buenos ratos. A Antonio y Yazine
estuvisteis poco tiempo pero suficiente para que la primera os eche de menos. Toda esta
gente y más que me falta ha creado un ambiente de trabajo en nuestra planta que dudo
que vuelva a encontrar en mi vida
A mucha más gente de CNIC que me ha ayudado y de la que me llevo muy buen recuerdo
Dani, Noa, Norman, Lao entre muchos otros.
Pero el CNIC no es solo científicos y yo he tenido la suerte de coincidir con muy buena
gente en mantenimiento, limpieza (de Charo a María pasando por Petri), seguridad
(Tomas, y al indio Victor), informática (Alicia y Eduardo). A cafetería, especialmente a
Angel, el camarero mas rápido y eficiente que puedes conocer. A Cristina G creo que sin
ti no habría hecho papeles suficientes para doctorarme. A Edu, siempre dispuesto a hacer
más de lo que su trabajo requiere, y que nos ha regalado una lección de “anatomía de un
hombre pez”.
A Holger y su laboratorio por acogerme allí y sobre todo a Rodri, Pablo, Santi y Eze por
hacerme pasar tres meses en casa.
A Javito, Oscar, Samu, Jaso, Luiska y Faiz con los que disfrute de un Master que nos
enseñó poco pero que disfrutamos mucho (Andaluza-Antorcha-Ocho y medio, Denia…).
Al Esrasmus, al Borgo, Lucho, Helena, Dani, Niels, Carlos y a Xavi que no vivía allí pero
casi, fue sin duda un gran año que ha marcado nuestras vidas y aunque nos veamos poco
actualmente contar con vosotros después del Erasmus es un lujo.
A un gran grupo de amigos que hice en la universidad con los que seguiré “soñando
siempre armados” Ras, Fer, Sara, Laura, Blanca, Carmen, Guille. A Horse generation
Narro y Alvi, el grupo sin disco ni concierto y casi ni canciones. Y claro, a Jesus y Luci,
todo lo que os diga quedaría escaso, espero disfrutar muchas veces más con vosotros en
Madrid, La Linea, Aleas o La Paz. Por cierto La Paz que gozada conocer este lugar y a la
gente de alli
A Pata, forjamos una amistad en un ambiente surrealista entre birras y horas de curro y
parece que dura unos años. A Laura y al resto de gente que pasó por aquel laboratorio que
tuvo más de campo de trabajo que de laboratorio científico, hasta puede que a Marta, pues
aunque no fuera su intención aprendí bastante de aquel año. A la gente en la que nos
apoyamos sobre todo a Dani.
A David, cuando te conocí nunca pensé que pasaras a ser una persona tan importante para
mí. Seguiremos compartiendo libros revistas y conversaciones de tercios, geopolítica, y
futbol.
A los Dons, Isra, Mario, Elvis, Orlando, Diego, rayo, Santi, Joaquin, Sparrow y Willis
con vosotros he aprendido a perder sobrados de dignidad. Go Dons!!
A Turbinio, un grupo de buenos amigos desde hace muchos años, lo mismo un mus que
un findesemana de futbol burbuja, Dani, litri, Adri, Charli, Diego, yisus, Patxi, Rebe,
Noemi, Jesús, Javi, Isma. A Paco una cabeza prodigiosa y una de las mejores personas
que conozco de la que tengo la suerte de ser amigo. A los dos sabios birreros Acho y
Jonhy cuantos jueves en el parque, Miguel, o Beerseker.
Al Nazari y Vicolo (no a los bares, a la gente de dentro) donde empecé a salir escuchando
Rock&roll “cuando éramos los mejores”, gracias a mi hemana y los que entonces eran
sus amigos, que ahora puedo decir que también lo son míos, Roger, Jonas y Adri, el mejor
Dj de Alcorcón y del que me ha dado muchas lecciones musicales y vitales. A Nando con
quien siempre puedes hablar de Rock&roll, y a Patricia un terremoto de ayuda.
También hay que dar las gracias al Rock&roll en sí, que más de una vez me ha mostrado
las respuestas.
Además hay que quejarse un poco, esta tesis se ha realizado a pesar de los palos en las
ruedas de algunos, que condenan a nuestro sector a la precariedad. Incluso llegaron a
cambiarnos las condiciones contractuales durante nuestros contratos. Pero como no hay
mal que por bien no venga conseguimos darle la vuelta mediante la colaboración.
Demostramos que la precariedad se puede confrontar con asociación y que podemos
llegar a ser trabajadores de pleno derecho el día que luchemos por ello apoyando y
apoyándonos en otros sectores.
A mis padres pues ha sido su esfuerzo el que me ha formado profesionalmente, pero sobre
todo como persona, y continúan haciendo continuamente esfuerzos por mí. Siguen
pendientes de todo desde si estoy malo a si tengo comida y se lo agradezco menos de lo
que debería. A Pilar, mi hermana la persona a la que acudo siempre, para lo bueno y para
lo malo. Aunque todo hay que decirlo la pido más veces ayuda que las alegrías que le
doy. A Quique que hay que meterlo en el apartado de familia, aunque también es colega,
espero vivir contigo muchas más noches como la décima y más psychos, muchas gracias
por tu ayuda.
A José María, porque hay personas que, aunque haga mucho tiempo que no los veas, sus
consejos e influencia te acompañan toda tu vida. Y a Aleas, a la gente y al lugar.
Rodri, la única persona que podría estar en casi todos los grupos anteriores, tío hemos
sido la sombra del otro durante años, nos hemos formado como personas juntos y eres
una parte importante de lo que he terminado siendo.
A lo mejor que me ha pasado en la tesis, Cris, mi Lady Madrid particular. Al inicio de la
tesis te conocí y al apretar el gatillo ya estaba enamorado de ti, ahora vivimos juntos y
compartimos una vida en la que nunca dejara de sonar música por encima de la música.
Solo por ti ha merecido la pena hacer esta tesis. Te quiero.
1
Resumen
La angiogénesis es la formación de nuevos vasos sanguíneos a partir de vasos
preexistentes y tiene lugar fundamentalmente a través de los mecanismos de brote capilar
e intususcepción. En este trabajo nos hemos propuesto la identificación y caracterización
de nuevos actores moleculares implicados en dichos mecanismos. La angiogénesis por
brote capilar se caracteriza por la selección y especificación de dos fenotipos celulares en
respuesta a estímulos angiogénicos: células endoteliales líder (migratorias) y tallo
(proliferativas). Durante este estudio hemos identificado, mediante el análisis a nivel
poblacional y de célula única, dos tipos oscilaciones de Ca2+ asociadas a los fenotipos
líder y tallo durante la respuesta in vitro a VEGF. Además, los eventos de señalización
por oscilaciones de Ca2+ indican que dichas oscilaciones podrían inducir la fijación del
fenotipo líder y tallo mediante la activación de factores de la transcripción como NFAT.
Por otro lado, la angiogénesis por intususcepción es un mecanismo pobremente
caracterizado por el que un vaso sanguíneo se divide en dos vasos paralelos a través de la
formación y expansión de pilares intraluminales. En este trabajo hemos utilizado el
modelo de colitis experimental en ratón para caracterizar el papel en el endotelio de la
proteasa MT1-MMP como un nuevo actor durante la inducción de la angiogénesis por
intususcepción en contexto inflamatorio. Para ello, se usó una línea de ratones con la
deleción específica endotelial de MT1-MMP (MT1iΔEC). Además, combinando ensayos
in vivo e in vitro hemos diseccionado la vía molecular, demostrando que MT1-MMP
participa, a través de su actividad catalítica, en la vía de producción de óxido nítrico y
vasodilatación de los vasos sanguíneos, induciendo angiogénesis por intususcepción. Así,
MT1-MMP mediante corte proteolítico libera la proteína matricelular trombospondina 1,
que incrementa los niveles de producción de óxido nítrico en células endoteliales por la
unión de su fragmento carboxilo terminal al complejo formado por CD47/integrina αvβ3.
La administración in vivo del nonámero de aminoácidos basado en la secuencia de unión
de trombospondina 1 a la integrina αvβ3, redujo la angiogénesis por intususcepción
durante la colitis experimental. Así pues, a la vista de nuestros resultados proponemos
MT1-MMP y la vía TSP1/CD47/integrina αvβ3/eNOS/óxido nítrico como un nuevo eje
en angiogénesis por intususcepción y una nueva diana terapéutica en colitis.
2
Summary
Angiogenesis is the formation of new blood vessels from pre-existing ones and the main
forms of this physiological process are capillary sprouting and intussusception. In this
report we have undertaken to identify new molecular actors for these two mechanisms.
Sprouting angiogenesis is characterized by the selection and specification of tip
(migratory) and stalk (proliferative) endothelial cells. In this study, we have analyzed the
role of Ca2+ oscillations in tip/stalk specification during sprouting angiogenesis and we
have identified, through population and single cell analysis, two different Ca2+
oscillations associated to tip and stalk phenotypes during VEGF in vitro stimulation.
Moreover, Ca2+ oscillation-mediated signaling could induce tip/stalk phenotype fixation
through activation of transcription factors as NFAT.
On another front, intussusceptive angiogenesis is a poorly characterized mechanism
where pre-existing vessels split creating two daughter vessels by intraluminal pillar
formation and expansion. In this study, we have used mice with specific endothelial
deletion of the protease MT1-MMP (MT1iΔEC) in order to identify MT1-MMP as a new
key player in intussusceptive angiogenesis in murine experimental colitis. Furthermore,
combining in vivo and in vitro assays, we have demonstrated the mechanism through
which MT1-MMP increases nitric oxide production and blood vessel vasodilation,
resulting in the induction of intussusceptive angiogenesis. In this way, MT1-MMP
produces the proteolytic release of the matricellular protein thrombospondin 1 which in
turn increases nitric oxide production through its binding via the carboxy-terminal
fragment to CD47/αvβ3 integrin complex. Finally, in vivo administration of a nonameric
peptide based on the thrombospondin 1 binding sequence to the αvβ3 integrin reduced
intussusceptive angiogenesis during colitis in mice. Our results identify MT1-MMP and
the pathway TSP1/CD47/αvβ3 integrin/eNOS/nitric oxide as new players in
intussusceptive angiogenesis and as potential therapeutic targets in colitis.
3
Índice
Abreviaturas y acrónimos ............................................................................................................. 9
Introducción ................................................................................................................................ 11
1 El endotelio .......................................................................................................................... 13
2 Angiogénesis ........................................................................................................................ 14
2.1 Angiogénesis por brote capilar ..................................................................................... 14
2.2 Angiogénesis por intususcepción .................................................................................. 21
3 MT1-MMP en células endoteliales ....................................................................................... 28
3.1 Estructura de MT1-MMP ............................................................................................... 28
3.2 Regulación de MT1-MMP en células endoteliales ........................................................ 29
3.3 Función de MT1-MMP en células endoteliales ............................................................. 30
3.4 MT1-MMP en angiogénesis por brote capilar e intususcepción .................................. 31
Objetivos ..................................................................................................................................... 33
Materiales y métodos ................................................................................................................. 37
1 Cultivos celulares y técnicas in vitro ..................................................................................... 41
1.1 Cultivo de HUVECs ......................................................................................................... 41
1.2 Aislamiento y cultivo de MAEC ..................................................................................... 41
1.3 Estimulación de células endoteliales ............................................................................ 42
1.4 Silenciamiento de la expresión de proteínas mediante ARN de interferencia. ............ 42
1.5 Exposición de células endoteliales a flujo laminar ........................................................ 42
2 Modelos animales y experimentos in vivo ........................................................................... 43
2.1 Líneas experimentales de ratón .................................................................................... 43
2.2 Inducción química de colitis en ratones y medición del índice de colitis. .................... 44
2.3 Inyección de lentivirus in vivo ....................................................................................... 44
2.4 Ensayo de perfusión ...................................................................................................... 44
3 Técnicas de imagen .............................................................................................................. 45
3.1 Tinciones de inmunofluorescencia en células. .............................................................. 45
3.2 Determinación relativa de la concentración de óxido nítrico ....................................... 45
3.3 Determinación relativa de la concentración de Ca2+ y análisis de oscilaciones ............ 45
3.4 Tinción de tejido in toto ................................................................................................ 46
3.5 Tinciones de tejido parafinado ...................................................................................... 47
3.6 Microscopía intravital de músculo cremáster de ratón ................................................ 47
4 Procedimientos experimentales .......................................................................................... 47
4.1 Western Blotting ........................................................................................................... 47
4.2 Retro-PCR cuantitativa (qPCR) ...................................................................................... 48
4
4.3 Citometría de flujo preparativa ..................................................................................... 49
5 Análisis estadístico ............................................................................................................... 50
Resultados ................................................................................................................................... 51
1 Papel de las oscilaciones de Ca2+ en la especificación de células endoteliales en células líder
y tallo durante la angiogénesis por brote capilar .................................................................... 53
1. 1 Análisis de las oscilaciones de Ca2+ en respuesta a estímulos angiogénicos ................ 53
1.2 Análisis de la heterogeneidad de las oscilaciones de Ca2+ en respuesta a VEGF .......... 57
1.3 Impacto de las oscilaciones de Ca2+ en la transcripción génica ..................................... 62
2 MT1-MMP, nuevo actor en angiogénesis por intususcepción en contexto inflamatorio:
papel del flujo y del óxido nítrico ............................................................................................ 65
2.1 Estudio de la angiogénesis por intususcepción en un modelo de colitis experimental
inducida por DSS .................................................................................................................. 65
2.2 Análisis del papel de MT1-MMP en angiogénesis por intususcepción ......................... 68
2.3 Papel de MT1-MMP endotelial durante la transducción de estímulos mecánicos ....... 81
2.4 Efecto de la deleción endotelial de MT1-MMP sobre la vasodilatación ....................... 87
2.5 Función de los dominios catalítico y citoplasmático de MT1-MMP durante la
angiogénesis por intususcepción y la producción de óxido nítrico ..................................... 93
2.6 Caracterización de trombospondina 1 como sustrato de MT1-MMP ........................... 97
2.7 Función de MT1-MMP/TSP1 durante la producción de óxido nítrico in vitro ............ 101
2.8 Impacto funcional de la inhibición de la unión de TSP1 a la integrina αvβ3 sobre la
angiogénesis por intususcepción ...................................................................................... 105
2.9 Implicación de MT1-MMP durante la patogénesis de EII Humanas ........................... 106
Discusión ................................................................................................................................... 109
1 Papel de las oscilaciones de Ca2+ en la especificación de células endoteliales en células líder
y tallo durante angiogénesis por brote capilar ..................................................................... 111
1.1 Inducción de oscilaciones de Ca2+ en células líder y tallo ........................................... 111
1.2 Papel de la vía Dll4/Notch durante las oscilaciones de Ca2+ inducidas por VEGF ....... 113
1.3 Cambios de la expresión de marcadores génicos de células líder y tallo en respuesta a
VEGF .................................................................................................................................. 113
2. MT1-MMP, nuevo actor en angiogénesis por intususcepción en contexto inflamatorio:
papel del flujo y el óxido nítrico ............................................................................................ 115
2.1 Sistema de visualización de angiogénesis por intususcepción en el plexo mucoso ... 115
2.2 Papel de MT1-MMP endotelial durante la patogénesis de colitis experimental ........ 116
2.3 Papel de MT1-MMP durante la respuesta endotelial a flujo sanguíneo ..................... 117
2.4 Función de MT1-MMP durante la vasodilatación y producción de óxido nítrico ....... 118
2.5 Señalización del fragmento carboxilo terminal de TSP1 a través de la integrina αvβ3
........................................................................................................................................... 118
2.6 La vía MT1-MMP/TSP1/integrina αvβ3/eNOS como diana terapéutica ..................... 120
5
Conclusiones ............................................................................................................................. 123
Bibliografía ................................................................................................................................ 127
6
Índice de figuras
Figura 1. Esquema del sistema de selección de células líder y tallo.....................................................17
Figura 2. Esquema de oscilaciones asincrónicas de la transcripción de Dll4 y HES1en células
endoteliales................................................................................................................................ ................ 18
Figura 3. Esquema de la ruta molecular de generación de oscilaciones de Ca2+............................. 19
Figura 4. Componentes codificantes de las oscilaciones de Ca2+.........................................................20
Figura 5. Observación de la formación de pilares intraluminales por molde de corrosión.......... 26
Figura 6. Estructura esquemática de MT1-MMP…………………………………................................ 28
Figura 7. La estimulación con VEGF y TNFα produce el aumento de la concentración de Ca2+
citoplasmático en células endoteliales…............................................................................................... 54
Figura 8. La estimulación con VEGF y TNFα modifica los patrones de las oscilaciones de Ca2+
en células endoteliales.............................................................................................................................. 55
Figura 9. La actividad del canal de Ca2+ ORAI1 es necesaria para la respuesta mayoritaria a
VEGF por oscilaciones de Ca2+ en HUVECs....................................................................................... 58
Figura 10. VEGF produce diferentes patrones de oscilaciones de Ca2+ dependientes de dosis......59
Figura 11. VEGF produce dinámicas de fosforilación de PLCγ1 dependientes de dosis................60
Figura 12. El patrón de oscilaciones de Ca2+ de las células endoteliales en respuesta a VEGF es
dependiente del corte intracelular de Notch...................................................................................... ... 61
Figura 13. Diferentes dosis de VEGF regulan la trasncripción génica de marcadores de célula
líder o tallo................................................................................................................................................. 63
Figura 14. Papel de NFAT en la regulación de la transcripción de genes marcadores de célula
líder y tallo .......................................................................................................... ...................................... 64
Figura 15. Visualización de la vasculatura intestinal........................................................................... 66
Figura 16. Sistema de cuantificación de angiogénesis por intususcepción en la vasculatura del
plexo mucoso intestinal............................................................................................................................ 67
Figura 17. La inducción de colitis con 1% DSS causa angiogénesis por intususcepción en el plexo
mucoso de ratones.................................................................................................................................... 68
Figura 18. MT1-MMP se expresa en las células endoteliales de arteriolas y capilares del colon
durante el desarrollo de colitis experimental....................................................................................... 69
Figura 19. MT1-MMP se expresa en células endoteliales cercanas a tricórneres y eventos de
angiogénesis por intususcepción.............................................................................................................70
Figura 20. Validación de la deleción endotelial de MT1-MM..............................................................71
Figura 21. La deleción endotelial de MT1-MMP disminuye la angiogénesis por intususcepción
durante la colitis inducida por DSS........................................................................................................73
Figura 22. La deleción endotelial de MT1-MMP disminuye la perfusión de la vasculatura
intestinal durante la colitis inducida por DSS...................................................................................... 75
Figura 23. La deleción endotelial de MT1-MMP disminuye la presencia de células
inflamatorias..............................................................................................................................................76
Figura 24. La deleción endotelial de MT1-MMP mejora la progresión clínica en colitis inducida
por DSS...................................................................................................................................................... 78
Figura 25. La deleción endotelial de MT1-MMP durante el desarrollo de colitis mejora la
progresión de los animales enfermos......................................................................................................80
Figura 26. Eficiencia del silenciamiento de MT1-MMP por ARNi en HUVECs............................ 82
7
Figura 27. La ausencia de MT1-MMP en células endoteliales in vitro no altera su polarización en
respuesta a flujo laminar............................................................................................................. ............ 83
Figura 28. Efecto del flujo turbulento y laminar sobre la expresión de MT1-MMP in vivo......... 84
Figura 29. Eficiencia de la deleción de MT1-MMP en el endotelio aórtico...................................... 85
Figura 30. La deleción de MT1-MMP endotelial afecta a la elongación de las células endoteliales
aórticas sometidas a flujo laminar......................................................................................................... 86
Figura 31. La deleción de MT1-MMP endotelial no afecta a la polarización de células endoteliales
aórticas sometidas a flujo laminar......................................................................................................... 87
Figura 32. La deleción endotelial de MT1-MMP disminuye la vasodilatación de arteriolas in
vivo.............................................................................................................................................................. 88
Figura 33. La deleción endotelial de MT1-MMP disminuye la vasodilatación de capilares
dependiente de óxido nítrico in vivo....................................................................................................... 90
Figura 34. La deleción de MT1-MMP en células endoteliales disminuye laroducción de óxido
nítrico y la expresión de eNOS................................................................................................................ 92
Figura 35. Estrategia de transducción lentiviral in vivo...................................................................... 94
Figura 36. La función catalítica de la proteína MT1-MMP es esencial para la producción de
angiogénesis por intususcepción............................................................................................................ 95
Figura 37. La función catalítica de MT1-MMP es requerida para la producción de óxido nítrico
en células endoteliales in vitro................................................................................................................. 96
Figura 38. Caracterización in silico del corte de TSP1 por MT1-MMP......................................... 99
Figura 39. La deleción endotelial de MT1-MMP induce la acumulación perivascular de TSP1
durante la colitis..................................................................................................................................... 100
Figura 40. El silenciamiento de la expresión de MT1-MMP produce una acumulación de TSP1
en HUVECs in vitro............................................................................................................................... 101
Figura 41. TSP1 incrementa la producción de óxido nítrico en células endoteliales in vitro…... 102
Figura 42. El bloqueo del receptor de membrana CD47/IAP y de la integrina αvβ3 disminuye la
producción de óxido nítrico en células endoteliales in vitro.............................................................. 103
Figura 43. El nonámero basado en la secuencia de unión de TSP1 a la integrina αvβ3 disminuye
la producción de óxido nítrico en células endoteliales in vitro......................................................... 104
Figura 44. El bloqueo de la unión de TSP1 a la integrina αvβ3 disminuye la angiogénesis por
intususcepción in vivo............................................................................................................................ 106
Figura 45. Caracterización de la expresión de MT1-MMP durante EII humana......................... 107
Figura 46. Esquema representativo de la participación de las oscilaciones de Ca2+ en la especificación
de células líder y tallo durante angiogénesis por brote capilar............................................................. 115
Figura 47. Esquema de la vía MT1-MMP/TSP1/integrina αvβ3-CD47/eNOS/óxido nítrico en
inducción de angiogénesis por intususcepción durante la patogénesis de colitis................................. 121
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9
Abreviaturas y acrónimos
AI Angiogénesis por intususcepción
ACh Acetilcolina
ADAMTS1 Desintegrina y metaloproteinasa con dominios trombospondina 1
APL1 Apelina
APS Amonio persulfato
BCA Ácido bicinconínico
BSA Albumina de suero bobino
CCL-2 Proteína quimiotáctica de monocitos 1
CSF-2 Factor estimulante de colonias
CXCL12 Motivo C-X-C quimioquina 12
DAG Diacilglicerol
DEANO Sodium 2-(N, N-diethylamino)-diazenolate-2-oxide
DSS Sulfato sódico de dextrano
Dll4 Ligando delta 4
EEM Error estándar de la media
EII Enfermedad inflamatoria intestinal
EphB4 efrinas B4
eNOS Sintasa de óxido nítrico endotelial
EGR1 Respuesta de crecimiento temprana 1
ESM1 Molécula específica endotelial 1
FBS Suero bobino fetal
FGF Factor de crecimiento de fibroblastos
FIH Factor inhibidor de HIF
GAPDH Gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa
GFP Proteína verde fluorescente
GSA Generación de segunda armónica
HBSS Solución salina balanceada de Hanks
HCAEC Células endoteliales de arteria coronaria humana
HIF1α Factor inducible de hipoxia
HPRT Hipoxantina guanina fosforribosiltransferasa
HUVEC Células endoteliales vasculares umbilicales humanas
IAP Proteína asociada a integrina
IB4 Isolectina B4
ICAM2 Molécula de adhesión intercelular 2
IFM Intensidad de fluorescencia media
iNOS Sintasa de óxido nítrico inducible
IP3 Inositol trifosfato
IP3R Inositol trifosfato receptor
MAEC Células endoteliales aórticas de ratón
MT1-MMP Metalloproteinasa de matriz tipo membrana 1
NFAT Factor nuclear de activación de células T
NFκB Factor nuclear κB
NICD Dominio intracelular de Notch
10
nNOS Sintasa de óxido nítrico neuronal
NR No respondientes
OP Oscilación principal
OR Oscilaciones repetidas
PAK1 Quinasa activada por P21
PIP2 Fosfatidil inositol bifosfato
PMCA Bomba de calcio de membrana plasmática
PCDH10 Protocadherina 10
PDGF-BB factor de crecimiento derivado de plaquetas BB
PFA Paraformaldehído
PlGF Factor de crecimiento de la placenta
PLCβ3 Fosfolipasa β3
PLCγ1 Fosfolipasa γ1
RCAN1.4 Regulator of Calcineurin 1 Isoform 4
S1P Esfingosina-1-fosfato
SERCA ATPasa de Ca2+ del retículo sarco/endoplásmico
SFRP Proteínas secretadas relacionadas a frizzled
SOCE Entrada de calcio dependiente de almacenamiento
TBS Buffer Tris-salino
TIMPS Inhibidores tisulares endógenos de metaloproteinasas
TNBS Ácido trinitrobenzenosulfónico
TNFα Factor de necrosis tumoral α
TRPC Canales Receptores de Potencial Transitorio
TSP1 Trombospondina 1
VCAM1 Molécula de adhesión de células vasculares
VEGF Factor de crecimiento endotelial vascular
VEGFR-1 Receptor del factor de crecimiento endotelial vascular 1
VEGFR-2 Receptor del factor de crecimiento endotelial vascular 2
VEGFR-3 Receptor del factor de crecimiento endotelial vascular 3
11
Introducción
12
13
1 El endotelio
Los vasos sanguíneos están revestidos por una monocapa de células endoteliales
quiescentes denominada endotelio. Las células endoteliales son células polarizadas, en
contacto directo por su zona apical con la sangre y con la lámina basal por su región basal.
La lamina basal es una fina y densa capa de matriz extracelular formada por colágeno
tipo IV, lamininas y otros componentes que ejerce de barrera física tanto para el endotelio
como para las células que cruzan la barrera endotelial 1–3.
La principal función del endotelio es ejercer de barrera selectiva al paso
incontrolado de elementos de la sangre hacia el tejido intersticial, dirigiendo el
intercambio de agua y solutos entre el espacio vascular y perivascular. Además de sus
funciones como barrera semipermeable el endotelio es una estructura activa. Se le
considera como el mayor órgano endocrino del cuerpo, el cual participa del
mantenimiento de la hemostasia, de la respuesta inflamatoria a través de la secreción de
citoquinas y quimioquinas o controlando la extravasación a los tejidos de células del
sistema inmune. También regula la agregación plaquetaria y el tono vascular controlando
el flujo sanguíneo 3.
La monocapa de células endoteliales mantiene una estructura cohesionada en
forma de empedrado, que ha propiciado la denominación de las células endoteliales
quiescentes como células falange por su parecido a la formación de batalla griega 4. Esta
estructura es mantenida gracias a las uniones entre células endoteliales a través de
complejos proteicos, que interaccionan entre células adyacentes y con el citoesqueleto
celular otorgando estabilidad a la monocapa endotelial. Los principales complejos
proteicos que integran la unión endotelial son las uniones estrechas, formadas por
ocludinas y claudinas, y las uniones adherentes, formadas por VE-cadherina y
Pecam/CD31 entre otras proteínas de adhesión 5,6.
Sin embargo, el endotelio está lejos de ser una monocapa de células endoteliales
idénticas. Es altamente heterogéneo, y las células endoteliales presentan características
diferentes en cuanto a su expresión génica, morfología y funciones dependiendo tanto del
de tipo de vaso al que pertenezcan como del órgano o tejido en el que se encuentren 2,7,8.
14
2 Angiogénesis
La angiogénesis es la formación de nuevos vasos sanguíneos a partir de vasos
preexistentes, que da lugar a un plexo vascular maduro por procesos de expansión y
remodelado vascular 9,10. El plexo vascular primario se forma por vasculogénesis, proceso
en el que células precursoras del endotelio, denominadas angioblastos, se dividen y
diferencian generando de novo un plexo vascular primitivo. Un mecanismo similar a la
vasculogénesis puede formar nuevos vasos sanguíneos tras el nacimiento, reclutando
células progenitoras del endotelio durante procesos patológicos como el cáncer o la
diabetes 11,12.
La angiogénesis es generalmente iniciada y guiada por hipoxia para suplir la
necesidad de nutrientes y oxígeno en contextos fisiológicos como el crecimiento de
tejidos, el desarrollo embrionario o durante el aumento de la demanda metabólica por
ejercicio físico, y en contextos patológicos como el cáncer, procesos inflamatorios o de
cierre de herida 13.
La angiogénesis tiene lugar a través de diferentes mecanismos, en este proyecto
nos centraremos en la angiogénesis por brote capilar y la angiogénesis por intususcepción.
Además, se han identificado mecanismos angiogénicos propios de tumores en los que,
bien las células tumorales forman vasos sanguíneos tomando la posición de células
endoteliales (mimetización vascular), o bien las células madre cancerígenas se
diferencian en nuevas células endoteliales 14. Por otro lado la formación de vasos
linfáticos tiene lugar por un proceso de características similares a la angiogénesis
denominado linfoangiogénesis 15.
2.1 Angiogénesis por brote capilar
La angiogénesis por brote capilar es el proceso caracterizado por la activación de
células endoteliales y su migración colectiva, ordenada y jerarquizada desde un vaso
preexistente para formar nuevos vasos sanguíneos.
Este proceso se desarrolla a través de las siguientes etapas: a) activación del
endotelio quiescente por un estímulo angiogénico, b) aumento de la permeabilidad
endotelial, c) degradación de la membrana basal, d) migración endotelial, e)
reorganización de las uniones entre células endoteliales, f) reclutamiento de pericitos, g)
15
formación del lumen, h) síntesis de la nueva membrana basal, e i) maduración y
remodelado del nuevo plexo vascular 16,17.
2.1.1 Activación del endotelio quiescente
La activación del endotelio quiescente se produce como respuesta a un estímulo
angiogénico, el más estudiado es el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) que
induce migración, proliferación y supervivencia en células endoteliales. La familia de
VEGF incluye 5 miembros expresados en mamíferos: VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C,
VEGF-D y el factor de crecimiento de la placenta (PlGF), que se unen a los receptores de
tipo tirosina quinasa VEGFR 1, 2 y 3 induciendo su dimerización y autofosforilación 18.
Se ha descrito el papel de VEGFR3 (Flt4) durante la linfoangiogénesis activado por la
unión a VEGF-C o D y en la angiogénesis durante el desarrollo embrionario 19,20. Sin
embargo, se ha demostrado que la actividad de VEGFR3 no es necesaria durante la
angiogénesis postnatal en retinas de ratón, siendo la fosforilación de VEGFR2
(Flk1/KDR) la principal responsable de la inducción de la angiogénesis en contextos
postnatales 18,21,22. Por su parte, la expresión de VEGFR1 (Flt1), pero no su actividad
quinasa, es necesaria para el desarrollo vascular normal durante la embriogénesis de
ratones. Los ratones deficientes para la expresión de VEGFR1 mueren durante el
desarrollo embrionario y presentan una vasculatura excesiva y desordenada. Estos y otros
estudios sugieren la competición con VEGFR2 por la unión a VEGF como la principal
función de VEGFR1 en angiogénesis 23,24.
La fosforilación de VEGFR2 tras su unión a VEGF inicia varias cascadas de
señalización celular, induciendo dos fenotipos diferentes y coordinados en las células
endoteliales, en lo que ha sido definido como un “equipo de trabajo” para la angiogénesis
25. Estos dos fenotipos, denominados células líder y tallo, fueron descritos por primera
vez durante la angiogénesis postnatal de la retina 26.
Las células líder son células endoteliales sobre las que VEGF induce polarización
y migración. Se caracterizan por la presencia de numerosos filopodios y guían el
crecimiento del nuevo vaso, integrando la información de gradientes de señales atrayentes
y repelentes del medio 26,27. Las células líder son además las encargadas de la invasión
del tejido perivascular a través de la degradación de las proteínas de matriz extracelular
de la lámina basal. La célula líder presenta contactos especializados mediante los cuales
16
se une a la matriz a través de proteínas de adhesión o proteolíticas como MT1-MMP para
la degradación de la lámina basal 1.
Tras las células líder, las células tallo proliferan en respuesta a VEGF aumentando
el tamaño del nuevo vaso. Además, mantienen la integridad del brote capilar, forman el
lumen vascular y reclutan pericitos estabilizando el vaso 17,26.
Si bien VEGF es el principal factor angiogénico, se han descrito otros estímulos
capaces de inducir la activación del endotelio quiescente en células líder y tallo en
contextos fisiológicos y patológicos, tales como el factor de crecimiento de fibroblastos
(FGF), el factor de necrosis tumoral α (TNFα), la proteína quimiotáctica de monocitos 1
(CCL2/MCP1), óxido nítrico o la esfingosina-1-fosfato (S1P) 16,28–33.
2.1.2 Sistema de selección y diferenciación de las células endoteliales líder y tallo
La correcta y equilibrada selección de células líder y tallo está guiada por la vía
de VEGF y sus receptores y por el sistema de inhibición lateral Dll4/Notch 34. La ruta de
Dll4/Notch es un sistema de inhibición lateral altamente conservado en la evolución, que
controla numerosos procesos de diferenciación durante el desarrollo. En vertebrados se
expresan cuatro receptores Notch (Notch 1-4) y cinco ligandos transmembrana (Jagged1,
Jagged2, Delta-like 1 [Dll1], 3 [Dll3], y 4 [Dll4]). La señalización comienza con la
interacción de Notch con uno de sus ligandos en una célula adyacente. Esto induce el
corte proteolítico de la región citosólica de Notch (NICD) por parte de la γ-secretasa.
NICD es traslocado al núcleo, donde forma complejo con CSL/RBPJ regulando la
transcripción génica 35. Las células endoteliales expresan los receptores Notch 1 y 4 y
todos los ligandos a excepción de Dll3 36. Ratones deficientes para la expresión de Notch
1, Notch 4, CSL o Jagged1 mueren durante el desarrollo embrionario (E9.5-E10.5) y
desarrollan problemas vasculares debido a la incapacidad de maduración del plexo
vascular primitivo 37–39. Por su parte, los ratones deficientes para la expresión de Dll4
mueren durante los primeros días de desarrollo embrionario, mientras que ratones
haploinsuficientes presentan malformaciones vasculares y un elevado número de células
líder en plexos vasculares como el del saco vitelino y la retina 40,41.
Se ha estudiado la localización de la expresión y función de los receptores Notch
y sus ligandos durante la selección de la célula líder. Dll4 es expresado mayoritariamente
por la célula líder, activando la vía de Notch en las células vecinas. El corte de NICD
desencadena la transcripción de genes implicados en la diferenciación de las células
17
endoteliales al fenotipo tallo, como VEGFR1 o HES1, y la inhibición de aquellos otros
que favorecen el fenotipo líder como VEGFR2 y el propio Dll4. Además de los estudios
genéticos ya mencionados, la inhibición de la vía Dll4/Notch por el bloqueo de Dll4
mediante anticuerpos o por inhibición química del corte de NICD, produce un aumento
del número de células líder y de la angiogénesis 41–46. La activación de la vía de
VEGF/VEGFR2 en las células líder expuestas a elevadas concentraciones de VEGF
aumenta la expresión del ligando Dll4, provocando una retroalimentación positiva entre
ambas vías de señalización. Estas vías regulan así el número de células líder, produciendo
un patrón de distribución de ambos fenotipos denominado “sal y pimienta”. Las células
que presentan mayor expresión de VEGFR2 y Dll4 y menor de VEGFR1 están “mejor
equipadas” para ser células líder e inducirán el fenotipo tallo en sus células vecinas
34,44,47,48 (Figura 1).
Figura 1. Esquema del sistema de selección de células líder y tallo. A. Esquema de la selección de
células líder y tallo y formación de un brote capilar. B. Esquema del modelo de distribución de
fenotipos líder y tallo “sal y pimienta”. Adaptado de Eilken HM and Adams RH; 2010.
Si bien la selección de la célula líder se ha descrito a menudo como un proceso
unidireccional, es en realidad un proceso dinámico. Las células del brote capilar ya
formado compiten continuamente por la posición de célula líder. Una célula tallo toma la
posición de líder cuando está “mejor equipada” para guiar el brote capilar. Incluso, se ha
descrito la yuxtaposición de dos células líder al mismo tiempo en un brote capilar en
retinas y durante experimentos de angiogénesis in vitro e in vivo en el modelo de pez
cebra 49–51.
18
Este sistema de selección puede incrementar los niveles de expresión de unos
genes frente a otros en células líder o tallo. Con el objetivo de identificar estos posibles
marcadores génicos de ambos fenotipos se han realizado estudios usando el modelo de
retina postnatal de ratón. Por un lado, Del Toro y colaboradores compararon el perfil
transcriptómico de retinas haploinsuficientes para la expresión de Dll4, con mayor
número de células líder, frente a retinas de genotipo salvaje. Por otro lado, Strasser y
colaboradores analizaron el perfil transcriptómico del frente de avance aislado por
microdisección frente al resto de la retina. Ambos estudios coincidieron en la
identificación de un número de marcadores de célula líder como la molécula específica
endotelial (ESM1) o apelina (APL1). Sin embargo, no fueron identificados marcadores
de célula líder anteriormente aceptados en la bibliografía como CD34 52–54.
La regulación temporal de la transcripción de los marcadores génicos de células
líder y tallo es actualmente motivo de debate. Recientes estudios in silico basados en datos
previos in vivo e in vitro han propuesto oscilaciones génicas de Dll4 y HES1 en el
endotelio quiescente. HES1 reprime la expresión de Dll4 y su propia expresión,
produciendo oscilaciones asincrónicas. Así, al ser activado el endotelio quiescente por
VEGF, cada célula puede encontrarse en un momento de su oscilación que la hace
competente para dar lugar a una célula de fenotipo líder, tallo o no responder 55,56 (Figura
2).
Las oscilaciones asincrónicas de Dll4 durante el brote capilar han sido
posteriormente confirmadas mediante ensayos angiogénicos in vitro en cuerpos
embrionarios. Estas oscilaciones se vuelven sincrónicas a altos niveles de VEGF,
provocando un excesivo número de células líder y angiogénesis patológica 57,58. Sin
Figura 2. Esquema de oscilaciones
asincrónicas de la transcripción de
Dll4 y HES1en células endoteliales.
Adaptado de Beets K et al; 2013.
19
embargo, se desconocen por el momento las señales por las que VEGF puede inducir
cambios en las oscilaciones génicas.
2.1.3 Señalización temprana durante la angiogénesis por brote capilar
La mayoría de los estímulos angiogénicos, tanto químicos como VEGF, S1P,
TNFα o físicos como los cambios de flujo sanguíneo, producen oscilaciones de Ca2+ en
las células endoteliales, regulando numerosos aspectos de la fisiología celular como
transcripción génica, migración, proliferación y apoptosis 59–61. La vía VEGF/VEGFR2
produce la activación de las fosfolipasas C (PLC), que catalizan la conversión de fosfatidil
inositol bifosfato (PIP2) en diacilglicerol (DAG) e inositol trifosfato (IP3) (Figura 3). En
células endoteliales se expresan mayoritariamente las isoformas PLCγ1 y PLCβ3. PLCγ1
ha sido señalada como la principal responsable de las oscilaciones de Ca2+ en respuesta a
estímulos angiogénicos induciendo migración y proliferación 62. En cuanto a PLCβ3,
estudios in vitro han asociado su fosforilación en células endoteliales de vena umbilical
humana (HUVECs) con la activación de la migración y la inhibición de la proliferación,
como necesaria para el desarrollo normal de la angiogénesis en ratones 63,64. El IP3
producido por las PLCs es el principal agonista de los canales de Ca2+ del retículo
endoplasmático por los que se produce la salida de Ca2+ al citoplasma. La ausencia de
Ca2+ en el retículo cambia la conformación del sensor STIM1, que activa canales de Ca2+
de la membrana extracelular como ORAI1, proceso conocido como SOCE (del inglés
Store-operated calcium entry). El Ca2+ vuelve al retículo endoplasmático y al espacio
extracelular a través de las bombas de Ca2+ del retículo sarcoplásmico (SERCA) y de la
membrana plasmática (PMCA) respectivamente (Figura 3) 65–67.
Figura 3. Esquema de la ruta molecular de generación de oscilaciones de Ca2+. Adaptado de Osama
F et al; 2014.
20
Esta vía genera oscilaciones de Ca2+ con una frecuencia, amplitud y localización
espaciotemporal determinada que pueden ser decodificadas por la célula endotelial
activando diferentes rutas de señalización (Figura 4) 68.
Estudios en los que se utilizan células endoteliales in vitro han identificado la
activación de factores de transcripción por oscilaciones de Ca2+ de una frecuencia y
amplitud de determinadas. Así, se ha observado la translocación al núcleo del factor
nuclear de activación de células T (NFAT) en células endoteliales in vitro estimuladas
con VEGF. Esta activación de NFAT ha sido asociada en células endoteliales y otros tipos
celulares a altas frecuencias de oscilaciones de Ca2+ o una sola oscilación de gran
amplitud y periodo 69,70. Por otra parte, experimentos con células endoteliales humanas
de aorta y cerebro han demostrado la activación de NF-kB por oscilaciones de Ca2+ en un
amplio rango de frecuencias (0-11.7mHz) 71,72.
Durante el desarrollo de este trabajo de tesis doctoral se publicaron dos estudios
que también abordaban el efecto de las oscilaciones de Ca2+ en la selección de células
líder y tallo durante la angiogénesis. Yokota y colaboradores observaron, durante el
desarrollo vascular de pez cebra, oscilaciones de Ca2+ en la célula líder con mayor
frecuencia que en el resto de las células, incluso previamente a ser seleccionada como
líder. Además, se ha descrito un comportamiento similar durante la selección de células
tallo, que presentaron mayor frecuencia de oscilaciones que las células falange. Estas
oscilaciones de Ca2+ eran además sensibles a modificaciones de la vía Dll4/Notch 73. Por
su parte, Noren y colaboradores estudiaron las oscilaciones de Ca2+ en células endoteliales
in vitro durante la estimulación con VEGF. Describieron también dos fenotipos de
oscilaciones diferentes dependientes de la dosis de VEGF, los cuales correlacionan con
comportamientos celulares migratorios asociados a células líder, o de activación de la ruta
de NFAT y proliferación asociados a células tallo 70.
Figura 4. Componentes codificantes de las
oscilaciones de Ca2+. Amplitud y periodo.
21
Estos datos en conjunto indican una función de las oscilaciones de Ca2+ durante
la angiogénesis por brote capilar, así como la posibilidad de ser un punto de inflexión en
la señalización para la toma de decisión celular entre los fenotipos líder y tallo.
2.2 Angiogénesis por intususcepción
La angiogénesis por intususcepción es la formación de nuevos vasos sanguíneos
por duplicación de los vasos preexistentes en respuesta al incremento sostenido de flujo
sanguíneo o estímulos angiogénicos 74,75. Fue descrita a finales de la década de los 80 del
pasado siglo XX, durante el desarrollo de la vasculatura pulmonar tras el nacimiento en
ratas y humanos, donde el área capilar es 30 veces mayor en el adulto 76–78. Desde
entonces se ha descrito en numerosos contextos fisiológicos, como el aumento de la
vasculatura muscular tras ejercicio o la angiogénesis endometrial, y patológicos como la
angiogénesis de la vasculatura intestinal durante enfermedades inflamatorias intestinales
o la angiogénesis tumoral 77,79–83.
Es un proceso más rápido y eficiente metabólicamente que la angiogénesis por
brote capilar, debido a la escasa proliferación requerida. El aumento de volumen vascular
se origina por cambios morfológicos en las células endoteliales. Además, durante el
proceso de división vascular no es necesaria la disrupción de la lámina basal, evitando el
aumento de la permeabilidad en los vasos sanguíneos que puede comprometer la función
del órgano 78,84.
2.2.1 Morfogénesis de la angiogénesis por intususcepción
La división del plexo vascular tiene lugar a través de la formación y expansión de
pilares intraluminales. El aumento del flujo sanguíneo en el lecho capilar produce la
vasodilatación de los vasos sanguíneos. Las células endoteliales del vaso reorganizan su
citoesqueleto y migran en dirección al lumen vascular hasta unirse con el lado opuesto y
reorganizan sus uniones. Las células forman un puente celular en el centro del vaso, rico
en filamentos de actina paralelos. Posteriormente, se forma un poro en el centro del
capilar de 1 a 5 µm que es invadido por pericitos y miofibroblastos. Estas células
depositan fibras de colágeno estabilizando la formación del pilar. Finalmente los pilares
crecen en diámetro y se unen con otros pilares formando una duplicación de dos vasos
paralelos 78,85.
22
La formación de estos pilares intraluminales está implicada además de en los
procesos de crecimiento de la superficie vascular en el remodelado del plexo vascular por
arborización y regresión optimizando el flujo sanguíneo 86–89.
El proceso de angiogénesis por duplicación de los vasos sanguíneos está
pobremente caracterizado, tanto a nivel morfológico como mecanístico, debido
principalmente a la dificultad de los modelos experimentales in vivo y a la escasez de
modelos in vitro. Hasta la fecha, la técnica más utilizada para la visualización de los
pilares intraluminales ha sido la microscopía electrónica combinada con la técnica de
“molde de corrosión”. Esta técnica consiste en la perfusión el sistema circulatorio del
animal con un polímero que solidifica generando un molde del sistema circulatorio. La
sustancia orgánica es digerida para el análisis del molde por microscopía electrónica de
barrido (Figura 5) 90.
2.2.2 Mecanismos de inducción de la angiogénesis por intususcepción
2.2.2.1 Flujo sanguíneo y estrés de cizalla
Las células endoteliales están sometidas de forma continua al flujo sanguíneo, el
cual debido a la geometría de los vasos sanguíneos y la viscosidad de la sangre puede ser
laminar o turbulento. Este flujo sanguíneo genera fuerzas mecánicas que actúan sobre el
endotelio como el estrés de cizalla (del inglés shear stress), que es la fuerza tangencial
ejercida por el flujo sanguíneo sobre las células endoteliales. Esta fuerza es elevada en
casos de alto flujo laminar y desciende en vasos con menor flujo o con flujo turbulento
91. Las células endoteliales responden a estos estímulos mecánicos a través de sistemas
de mecanorrecepción como el complejo CD31/VE-Cadherina/VEGFR2, que transduce el
estímulo físico en una cascada de señalización que desencadena la respuesta celular al
flujo. Así, las células activan la producción de óxido nítrico y se alinean polarizadas en
respuesta a flujo laminar, mientras que responden con procesos de disfunción endotelial
y apoptosis al flujo turbulento 91,92.
El incremento sostenido de flujo sanguíneo de entre el 50 al 60% en la membrana
corioalantoidea de pollo, aumenta el estrés de cizalla y estimula la creación de pilares
intraluminales, dando lugar a la angiogénesis por intususcepción 88. Por otro lado, se ha
observado el aumento del volumen vascular en el músculo esquelético de ratones y ratas
tras la administración de prazosina. La prazosina, un bloqueante de los receptores α1
adrenérgicos, produce un aumento del flujo en el lecho capilar por vasodilatación arterial
23
93. Sin embargo, se ha observado y analizado por modelado matemático en la vasculatura
intestinal que la formación de pilares intraluminales tiene lugar en regiones de los vasos
donde desciende la velocidad de flujo o hay flujo turbulento como las bifurcaciones 94 95.
Estos datos en conjunto indican que, si bien la angiogénesis por intususcepción es
inducida por el aumento de flujo, la formación de los pilares intraluminales tiene lugar en
las regiones del plexo vascular sometidas a un menor estrés de cizalla.
Egginton y colaboradores han usado el modelo de aumento del flujo sanguíneo en
músculo por medio de prazosina para identificar nuevos agentes moleculares en
angiogénesis por intususcepción. Para ello, han comparado mediante un microarray el
transcriptoma de músculos procedentes de animales tratados con prazosina frente a los
procedentes de animales a los que se les había extirpado un músculo sinérgico al
analizado, estimulando así la angiogénesis por brote capilar. Identificaron el aumento de
la sintasa de óxido nítrico endotelial (eNOS) y neuropilina, así como la disminución de
restina y midkine específicamente durante angiogénesis por intususcepción, y el
incremento de VEGF y VEGFR-2 y CD31 en ambos tipos de angiogénesis 96.
2.2.2.2 Óxido nítrico
El óxido nítrico es una molécula de señalización gaseosa con una vida media de
segundos, que promueve la supervivencia endotelial y la vasodilatación vascular por
relajación de las células de músculo liso. Se puede producir por la acción de tres proteínas,
la sintasa de óxido nítrico endotelial (eNOS) en células endoteliales, la neuronal (nNOS)
en neuronas y la inducible (iNOS) en células del sistema inmune. Las 3 sintasas producen
óxido nítrico a través de la reacción enzimática de conversión de L-Arginina en L-
Citrulina. Tanto nNOS como eNOS se expresan constitutivamente a niveles variables
produciendo concentraciones fisiológicas nanomolares de óxido nítrico, mientras que
iNOS aumenta su expresión en respuesta a estímulos inflamatorios produciendo
concentraciones micromolares del gas 97.
En células endoteliales la expresión de eNOS y su actividad están regulados por
el flujo sanguíneo. Así, el aumento del flujo sanguíneo y del estrés de cizalla incrementa
la producción de óxido nítrico a dos niveles. Por una parte, aumenta la actividad de eNOS
por fosforilación y la concentración de Ca2+ citoplasmático, incrementando la producción
de óxido nítrico a corto plazo. Por otra, a largo plazo aumenta la expresión de eNOS y la
24
estabilidad de su mensajero, como se ha observado durante la angiogénesis por
intususcepción en la musculatura de ratones tratados con prazosina 75,98.
Se ha confirmado el papel funcional de la producción de óxido nítrico durante la
angiogénesis por intususcepción inducida por líneas tumorales en la membrana
corioalantoidea de pollo y en la musculatura de ratones tratados con prazosina. En este
último modelo se ha demostrado, por inhibición química y modelos de depleción génica,
la necesidad de la producción de óxido nítrico por eNOS, pero no nNOS, para el
incremento de la vasculatura por duplicación 99,100. Además, en este contexto se ha
observado que el aumento de la producción de óxido nítrico durante la angiogénesis por
intususcepción induce la expresión de VEGF y VEGFR2 75,98.
2.2.2.3 VEGF
VEGF es el regulador de la angiogénesis más estudiado durante la angiogénesis
por brote capilar, y en los últimos años se han realizado estudios para analizar su papel
durante la angiogénesis por intususcepción. En primer lugar, se ha observado la
correlación entre la expresión de VEGF y las etapas de desarrollo de la membrana
corioalantoidea de pollo en que aparece la angiogénesis por intususcepción 101.
Posteriormente, se ha demostrado que la administración externa de VEGF induce
angiogénesis por intususcepción dependiente de dosis en el músculo esquelético de
ratones tratados con prazosina. Si bien, altas dosis de VEGF inducen una angiogénesis
por intususcepción aberrante, produciendo vasos sanguíneos no funcionales tanto en
músculo de ratón como en contextos tumorales. Por el contrario, el bloqueo de VEGF
inhibe la angiogénesis por intususcepción en los músculos de ratón tratados con prazosina
83,102,103.
2.2.2.4 Otros actores moleculares
La vía Dll4/Notch es un conocido regulador de la angiogénesis por brote capilar
que también ha sido implicado en angiogénesis por intususcepción. La deleción de
Notch1 en células de la médula ósea y la inhibición química del corte de NICD producen
un aumento del volumen vascular y del número de pilares intraluminales en el plexo
hepático. Además, el silenciamiento de la expresión de endoglina aumenta la
angiogénesis por intususcepción inhibiendo la vía de Notch. Sin embargo se desconoce
aún si la inhibición lateral en células endoteliales a través de esta vía tiene un papel en la
selección de las células que forman los pilares intraluminales 104–106.
25
Por otra parte, se ha observado que el factor de crecimiento derivado de plaquetas
BB (PDGF-BB) y el receptor de efrinas B4 (EphB4) regulan la angiogénesis por
intususcepción en el músculo de ratón en respuesta a VEGF, modulando la señalización
de la vía VEGF/VEGFR2. PDGF-BB regula la activación de VEGFR2 inhibiendo la
angiogénesis aberrante inducida por altas dosis de VEGF. Por ello, se ha propuesto su uso
terapéutico junto a VEGF como tratamiento proangiogénico 107,108. Por su parte, la
activación del receptor tirosina quinasa EphB4 no regula la actividad del receptor de
VEGF si no su señalización a través de ERK1/2 109. Finalmente, se han propuesto como
nuevos candidatos para la regulación de la angiogénesis por intususcepción factores que
regulan interacciones de células endoteliales con los pericitos, o las uniones entre las
propias células endoteliales como VE-cadherina 110.
En resumen, si bien se ha demostrado que un aumento de la velocidad del flujo
sanguíneo produce angiogénesis por intususcepción de manera dependiente de la
producción de óxido nítrico y VEGF, los mecanismos moleculares por los cuales se inicia
la angiogénesis por intususcepción permanecen sin esclarecerse.
2.2.3 Colitis como modelo de estudio de la angiogénesis por intususcepción
Se ha descrito la angiogénesis por intususcepción en el colon de ratones durante
la inducción de colitis mediante agentes químicos como ácido trinitrobenzenosulfónico
(TNBS) y Sulfato sódico de Dextrano (DSS), convirtiéndose en un modelo experimental
de estudio de este mecanismo angiogénico durante la inflamación. En estos modelos se
ha demostrado un aumento del volumen capilar en el plexo intestinal, produciéndose la
división de un mismo capilar hasta cuatro veces en 31 días de tratamiento 82. La
angiogénesis tiene lugar en el plexo vascular de la capa más interna del colon, llamada
mucosa. El plexo capilar de la mucosa presenta una arquitectura en forma de panal de
abeja rodeando las criptas del epitelio intestinal, y está irrigado por vasos de mayor calibre
presentes en las otras capas intestinales, la submucosa, y la serosa (Figura 5A).
Además de las duplicaciones de vasos tras la inducción química de colitis se han
observado otros marcadores de angiogénesis por intususcepción como vasodilatación y
formación de pilares intraluminales, ya descritos en otros contextos. Se ha demostrado la
formación de pilares intraluminales en las zonas del plexo con menor estrés de cizalla,
que son las bifurcaciones de capilares llamadas tricórneres (Figura 5B) 82,111–113.
26
Durante este proyecto se ha usado como modelo para el estudio de la angiogénesis
por intususcepción la inducción de colitis con DSS. Este químico destruye la barrera
epitelial permitiendo la entrada de los microorganismos comensales del intestino y sus
productos a la lámina propia. La entrada de estos microrganismos induce la respuesta
inmune. Se produce la secreción de citoquinas y quimioquinas proinflamatorias, así como
el reclutamiento de neutrófilos y macrófagos, que inducen la inflamación del tejido. La
inflamación causa cambios en el flujo sanguíneo que junto a la estimulación química
inflamatoria y al aumento de la hipoxia inducen angiogénesis, la cual contribuye a su vez
al aumento de la inflamación 114–116.
Figura 5. Observación de la formación de pilares intraluminales por molde de corrosión. A.
Vasculatura intestinal. Plexo mucoso (PM), submucosa (SM), serosa (S). B. vasculatura del plexo
mucoso en panal de abeja. C. Pilar intraluminal. Adaptado de Konerding MA et al; 2013 y Ravnic DJ
et al; 2007.
La inducción de colitis por DSS induce consecuencias fácilmente observables que
son indicativas de la inflamación intestinal, como la pérdida de peso, el sangrado rectal y
la disminución en la consistencia de las heces 116. Éste junto con otros modelos de
inducción de colitis en ratones mimetiza las lesiones de las enfermedades inflamatorias
intestinales (EII) humanas, proporcionando un método de estudio del daño intestinal y de
la etiología de estas enfermedades. Las principales EII humanas son la colitis ulcerosa
(CU) y la enfermedad de Crohn (EC) que actualmente sufren 1 de cada 200 habitantes
europeos 117. Estas enfermedades afectan al colon y otras regiones del tracto
gastrointestinal, la EC causa ulceraciones transmurales en el intestino delgado y colon,
mientras la CU causa ulceraciones no transmurales restringidas al colon 118–120.
Si bien no se ha podido determinar la participación de la angiogénesis por
intususcepción durante la evolución de las EII humanas, sí que se ha descrito el aumento
del volumen vascular durante su patogénesis 121.
27
2.2.4 Mecanismos moleculares angiogénicos en colitis
En concordancia con el incremento de la vasculatura en el intestino de pacientes
de EII y de ratones tras la inducción de colitis, se ha demostrado el aumento de la
producción de factores proangiogénicos en el colon de pacientes de CU y EC. Los
extractos de mucosa intestinal de pacientes incrementan de manera dosis dependiente la
migración de células endoteliales microvasculares de intestino humanas (HIMECs).
Además, se ha observado un incremento de factores proangiogénicos como PDGF,
VEGF, bFGF en el suero y tejido dañado de pacientes de EII 115,121–124.
Los principales estímulos angiogénicos implicados en la inducción de
angiogénesis por intususcepción han sido descritos como actores moleculares durante la
angiogénesis y patogénesis de las EII. Así, mediante el análisis de ultrasonidos por
Doppler se ha observado el aumento del flujo sanguíneo en regiones activas de EC y CU,
que puede inducir angiogénesis por intususcepción 125,126. Por su parte, VEGF y su
receptor VEGFR2, pero no VEGFR1 aparecen sobreexpresados en pacientes de CU y EC
así como en ratones tratados con DSS. El incremento de la expresión de VEGF por la
infección con adenovirus aumenta la angiogénesis y empeora la evolución de los animales
mientras que la sobreexpresión de VEGFR1 produce el efecto opuesto 127.
En cuanto a la función del óxido nítrico en la patogénesis de EII, se ha observado
el aumento de las concentraciones de óxido nítrico y su coproducto de síntesis (L-
Citrulina), así como de la expresión de eNOS en muestras de pacientes de EII,
correlacionando con la actividad inflamatoria de la enfermedad. 128–130. La función
beneficiosa o perjudicial del incremento de la producción de óxido nítrico y la actividad
de las tres NOS es controvertida. Se han publicado trabajos con resultados contradictorios
del efecto de la inhibición de la producción de óxido nítrico y la deleción de la expresión
de eNOS e iNOS, sobre la patogénesis de las EII 131–134. Sin embargo, en los últimos años
se ha propuesto al óxido nítrico producido por iNOS y eNOS como activador de la
angiogénesis intestinal a través de la expresión de VEGF al igual que en otros modelos
de angiogénesis por intususcepción 115,135,136.
Recientemente se han propuesto numerosas terapias de inhibición de la
angiogénesis inducida por inflamación en pacientes de EII. Los tratamientos basados en
la inhibición de la vía de VEGF no se han mostrado eficaces hasta el momento en EII o
han sido contraindicados al impedir el cierre de las perforaciones intestinales en la EC.
28
115,137,138. Actualmente se utilizan terapias basadas en la inhibición de la angiogénesis
mediante moléculas anti-TNFα, como el anticuerpo infliximab 139,140. Otros tratamientos
están en fases de ensayo clínico como los péptidos ABT-510 y ABT-898, ambos basados
en diferentes secuencias de la molécula anti-angiogénica trombospondina que inhiben
parcialmente la inflamación y la angiogénesis en ratones 141–143. Por tanto, la
identificación de agentes moleculares implicados en la patogénesis de EII puede aportar
nuevas dianas terapéuticas para el tratamiento de estas enfermedades. Un análisis de la
expresión génica a través de microarray ha identificado 15 genes diferencialmente
expresados en el colon de animales tratados con DSS que previamente habían sido
identificados en EII humanas, entre los que destacan citoquinas y quimioquinas como IL-
6, IL-16 o CCL2, y las metaloproteasas MMP3 y MT1-MMP 144.
3 MT1-MMP en células endoteliales
3.1 Estructura de MT1-MMP
Las metaloproteinasas de matriz (MMPs) son un grupo de endopeptidasas
dependientes de Zn2+ capaces de degradar componentes de la matriz extracelular (MEC)
y modular la bioactividad de receptores de membrana y factores de crecimiento
modificando su microambiente. MT1-MMP (MMP14) fue la primera MMP anclada a la
membrana que se describió en células tumorales, capaz de activar el zimógeno de MMP2
durante la invasión y metástasis cancerosas 145. Más tarde fue caracterizada como una
fibrinolisina endotelial, necesaria para la invasión y tubulogénesis durante la angiogénesis
146. MT1-MMP es una proteína de 582 aminoácidos con una estructura similar a la del
resto de miembros de la familia de las MMPs. Consta de 6 dominios: un propéptido (M1-
R111), un dominio catalítico (Y112-G285), una región bisagra (E286-I318), un dominio
hemopexina (C319-C508), un dominio enlace (P509-S338), un dominio transmembrana
(A539-F562) y una cola citosólica (R563-V582) 145,147 (Figura 6).
Figura 6. Estructura esquemática de MT1-MMP. Adaptada de Koziol A et al; 2012.
29
3.2 Regulación de MT1-MMP en células endoteliales
Las células endoteliales expresan MT1-MMP a bajos niveles, incrementados por
estímulos angiogénicos e inflamatorios como IL-1, IL-8, TNFα, bFGF, VEGF, CSF-2,
TGFβ o CCL2 30,148–151. La expresión de MT1-MMP en células endoteliales está regulada
por la unión de factores de transcripción a su promotor. Se ha descrito el aumento de la
expresión de MT1-MMP durante la activación de las células endoteliales por la unión del
factor de transcripción EGR-1152. El cual puede ser desplazado del promotor de MT1-
MMP por SP1153. Por su parte, KLF6 ha sido implicado en la sobreexpresión de MT1-
MMP tras daño vascular154. Además, se ha observado la disminución de la expresión de
MT1-MMP por la unión del factor de transcripción de células endoteliales linfáticas
PROX1155. Asimismo, La actividad de MT1-MMP está regulada además por procesos no
transcripcionales:
1. Corte proteolítico. MT1-MMP es activada a través del corte proteolítico de su
propéptido por convertasas de la familia de las furinas en el trans-golgi.156,157.
2. Inhibidores. La actividad de MT1-MMP en células endoteliales está regulada por
inhibidores, como la familia de los TIMPs y glicoproteína RECK 158–160. RECK ha
sido implicado en angiogénesis tumoral 161.
3. Localización subcelular. estudios previos han indicado que MT1-MMP puede
encontrarse en distintos dominios de la membrana plasmática de células endoteliales.
La localización subcelular de MT1-MMP regula su actividad por formación de
complejos con otras proteínas y el acceso diferencial a sus sustratos. Nuestro grupo
detectó MT1-MMP polarizada y activa asociada a la integrina αvβ3, en caveolas de
filopodios y lamelipodios de células endoteliales en migración. Las caveolas son
regiones de la membrana plasmática ricas en colesterol que contienen caveolin-1 y
cavinas. En este contexto, MT1-MMP coprecipita con caveolina y αvβ3 162–164. MT1-
MMP ha sido descrita activa en otros contextos como en la membrana de podosomas,
degradando la matriz extracelular de la lámina basal durante el inicio de la
angiogénesis por brote capilar 165. MT1-MMP también ha sido observada activa en
otros tipos celulares en las adhesiones focales, donde favorece su reciclado y puede
desarrollar funciones de señalización, 166–168 y en el espacio intracelular, donde
procesa la proteína del centrosoma pericentrina, así como tiene funciones de
señalización nuclear regulando la transcripción de PI3K 169,170.
30
Por otro lado, se ha descrito la presencia de MT1-MMP proteolíticamente inactiva en
las uniones celulares en microdominios de tetraspaninas (Tspan) asociada a la
integrina α3β1 y Tspan CD151 171,172. Finalmente, MT1-MMP ha sido identificada en
vesículas extracelulares y exosomas en células endoteliales y tumorales 173,174.
4. Internalización. La vía de caveolina es la principal vía de internalización de MT1-
MMP en células endoteliales 163.
5. Dimerización. La unión de MT1-MMP en dímeros a través del residuo Cys564 del
dominio hemopexina y del dominio transmembrana incrementa la capacidad
proteolítica de la proteína 30,175–177.
6. Flujo sanguíneo. Recientemente se ha analizado el efecto del flujo sanguíneo sobre la
expresión y actividad de MT1-MMP. Se han realizado ensayos sometiendo células
endoteliales a flujo mediante un agitador circular. Se detectó un descenso en la
expresión de MT1-MMP por unión a su promotor de Sp1, desplazando EGR-1 vía
activación de PKCζ 153,178. Sin embargo el laboratorio de la Dra. Bayless ha reportado
el incremento de actividad de MT1-MMP y su polarización hacia la membrana basal
en respuesta a flujo laminar, en un efecto sinérgico con el estímulo angiogénico S1P
179,180.
3.3 Función de MT1-MMP en células endoteliales
MT1-MMP es considerada, debido a su función proteolítica, el mayor modificador
del ambiente pericelular en células endoteliales, pero además ha sido implicada en
distintas vías de señalización independientemente de su función catalítica.
3.3.1 Actividad Catalítica
La actividad proteolítica de MT1-MMP es altamente selectiva, reconociendo una
secuencia Arg-noPro-Xpolar-XHy 181. Su gran repertorio de sustratos incluye proteínas de
matriz extracelular (triple hélice de colágeno I, II y III, laminina, nidógeno,
trombospondina y Cyr61) 146,148,182,183, otras proteasas (Pro-MMP2, pro-MMP8, pro-
MMP13, ADAM9) 145,184–186, citoquinas y quimioquinas (pro-TGFβ, pro-TNFα, SDF1,
CCL7, IL8) 187–190, receptores y proteínas transmembrana (E- y N-cadherina, EMMPRIN,
CD44, integrina αv) 191–196, y proteínas intracelulares (Pericentrina) 169. Durante la
angiogenesis el procesamiento por parte de MT1-MMP de proteínas de la matriz
extracelular y ancladas a la membrana plasmática puede modificar su actividad de
señalización, como en el caso del corte de trombospondina, decorina, endoglina,
31
semaphorina-4D, pro-TNFα o pro-TGFβ. Además, puede liberar factores
proangiogénicos anclados a la matriz extracelular 197. Por otro lado, MT1-MMP puede
modular la señalización de la vía de VEGF a través del corte proteolítico de VEGFR1 191.
Nuestro laboratorio ha identificado una colección de sustratos de MT1-MMP
mediante el análisis del degradoma de células endoteliales pulmonares de ratones de
fenotipo salvaje y deficientes para la expresión de MT1-MMP, estimuladas con TNFα.
El estudio demostró la capacidad de MT1-MMP de desarrollar un programa proteolítico
específico de angiogénesis, modificando mediante el la proteólisis de moléculas como
TSP1 o CYR61 procesos de adhesión y migración celular 148.
3.3.2 Funciones independientes de la actividad catalítica
MT1-MMP está implicada en procesos de señalización en células endoteliales. Se
ha descrito la interacción con receptores transmembrana y GTPasas, participando de la
señalización intracelular en respuesta a estímulos como ox-LDL, TNFα o trombina 198–
201. Así, MT1-MMP es capaz de modificar la expresión de algunos genes implicados en
angiogénesis como VEGF a través de dos vías descritas. Por un lado, MT1-MMP forma
un complejo con VEGFR2 y Src que mantiene VEGFR2 en la membrana plasmática y
activa su cascada de señalización 202,203. Por otro lado, se ha descrito en macrófagos la
asociación de MT1-MMP con el factor de inhibición de HIF1 (FIH-1) y Mint3 en la
membrana del trans-Golgi, inactivando FIH-1 y estabilizando el factor inducido por
hipoxia 1α (HIF-1α), que regula la transcripción de genes angiogénicos 204–206. Además,
nuestro laboratorio ha descrito en macrófagos la unión de MT1-MMP a la proteína
adaptadora p130cas por medio del residuo Tyr563, que permite la regulación de la
GTPasa Rac1. La interacción entre MT1-MMP y Rac1 fue confirmada en la membrana
plasmática de células endoteliales. Así, MT1-MMP puede modular la organización del
citoesqueleto y la migración 170,207.
3.4 MT1-MMP en angiogénesis por brote capilar e intususcepción
Ratones deficientes para la expresión MT1-MMP desarrollan, entre otros
defectos, procesos angiogénicos aberrantes tras el nacimiento. Estos animales mueren en
las primeras semanas de vida, lo que dificulta el estudio de la función de MT1-MMP en
angiogénesis 208–210. Sin embargo, la reciente aparición de animales con deficiencia
inducible de MT1-MMP en tejidos específicos es una nueva herramienta de gran utilidad
32
para identificar la función de MT1-MMP en distintos tipos celulares durante la
angiogénesis 211.
Se ha identificado la expresión mayoritaria de MT1-MMP en la célula líder
durante la angiogénesis por brote capilar, aunque se desconoce si tiene algún papel
durante la especificación en células líder y tallo. Se ha demostrado su participación en
diferentes etapas del proceso angiogénico por brote capilar 212.
1. Migración. MT1-MMP es necesaria para la migración del brote capilar a través de la
matriz extracelular. Así, se han descrito defectos en migración tanto en ensayos de
angiogénesis ex vivo usando anillos aórticos de ratón deficientes para la expresión de
MT1-MMP en matrices 3D, como en células endoteliales murinas y humanas en
matrices en 2D 171,213,214. Además, MT1-MMP puede afectar a la migración celular a
través de la modulación de la actividad de las GTPasas Rho por la interacción con su
cola citosólica 148,207.
2. Invasión. La actividad proteolítica de MT1-MMP es necesaria para la degradación de
la lámina basal, permitiendo la invasión endotelial. Explantes de anillos aórticos de
ratón deficientes para la expresión de MT1-MMP presentan defectos en la invasión
de geles de colágeno y fibrina. Se ha observado el enriquecimiento de MT1-MMP en
zonas de la membrana plasmática de células endoteliales en contacto con la lámina
basal, formando estructuras llamadas podosomas encargadas de la degradación 1,146.
3. Tubulogénesis. MT1-MMP es necesaria para la formación del lumen vascular. A
través de la formación de túneles de guía vascular crea el espacio a través del cual
migran las células endoteliales y forman el nuevo vaso 215.
4. Reclutamiento de células perivasculares. Se ha descrito la interacción entre MT1-
MMP y PDGFRβ regulando la migración de proliferación de las células
perivasculares y por tanto la estabilización del vaso 216.
5. Regresión. MT1-MMP también ha sido implicada en procesos de regresión vascular
en modelos angiogénicos usando anillos aórticos ex vivo 217.
En cuanto a la función de MT1-MMP durante la angiogénesis por intususcepción,
si bien no ha sido estudiada hasta el momento, se han observado importantes defectos
durante el aumento de la superficie vascular pulmonar tras el nacimiento en animales
deficientes para la expresión de MT1-MMP. Este proceso se produce mayoritariamente a
través de angiogénesis por intususcepción, constituyendo un indicio de la posible función
de MT1-MMP como nuevo actor en este tipo de angiogénesis 76,214.
33
Objetivos
34
35
La angiogénesis, por brote capilar o intususcepción, se ha considerado una posible diana
terapéutica en patologías como el cáncer o la enfermedad inflamatoria intestinal, pero su
inhibición no ha obtenido los efectos terapéuticos esperados, lo que indica que es
necesario profundizar en los mecanismos moleculares subyacentes. Dado los
antecedentes sobre el papel de las oscilaciones de Ca2+ en regulación de patrones
dinámicos de expresión génica y sobre las acciones de la proteasa MT1-MMP en células
endoteliales, hipotetizamos que caracterizar las oscilaciones de calcio y la función de
MT1-MMP en los distintos modos de angiogénesis avanzará nuestro conocimiento sobre
este proceso y su posible inhibición en patología. Para ello, en este trabajo nosotros
proponemos los siguientes objetivos:
1. Caracterizar el patrón, regulación y señalización de las oscilaciones de Ca2+ en células
endoteliales en condiciones de especificación de células líder y tallo.
2. Analizar el posible papel de la proteasa MT1-MMP durante la angiogénesis por
intususcepción en el contexto inflamatorio:
2.1. Caracterizar el impacto de la deleción de MT1-MMP en células endoteliales
sobre la angiogénesis por intususcepción.
2.2. Investigar el impacto de la deleción de MT1-MMP en células endoteliales
sobre la patogénesis de la colitis experimental.
2.3. Explorar el mecanismo molecular implicado en la inducción de la
angiogénesis por intususcepción.
2.4. Evaluar la posible aplicación de MT1-MMP como diana terapéutica en colitis.
36
37
Materiales y métodos
38
39
Reactivos Compañía 4-Hidroxitamoxifeno Sygma-Aldrich
Acetilcolina Sigma-Aldrich
Agujas BD-Biosciences
APS Sygma-Aldrich
ARNs interferencia Thermo Fisher
BCA Thermo Fisher
Bis-acrilamida Biorad
BSA Sygma-Aldrich
β-mercaptoetanol Sigma-Aldrich
Colagenasa tipo I GIBCO
Colagenasa tipo I Worthington
DAPT Sigma-Aldrich
DEANO Sigma-Aldrich
DSS MP Biomedicals
Elastasa Worthington
Estreptomicina Lonza
Eosina Sigma-Aldrich
FluoromontG SouthernBiotech
Gelatina Sygma-Aldrich
Glicerol Merk-Millipore
Glutamina Lonza
Hematoxilina Sigma-Aldrich
Hemocult Colon Screen
Hepes Lonza
HUVECs Lonza
Inhibidores de fosfatasas Roche
Inhibidores de proteasas Roche
Jeringuillas BD-Biosciences
Lipofectamina RNAimax Thermo Fisher
Medio 199 Lonza
Medio DMEN F12 Lonza
Medio EGM2 Promocell
Medio Optimem Lonza
Membrana de nitrocelulosa Biorad
NaCl Sygma-Aldrich
Paraformaldehído Merk-Millipore
Penicilina Lonza
Placas de cultivo Falcon
SDS Sigma-Aldrich
Suero bovino fetal Gibco
Suero de burro Jackson
Suero de cabra Jackson
Suero de Pollo Jackson
Synta 66 Aobious Inc
Temed Sigma-Aldrich
Tabla 1
40
TNFα PeproTech
Triton X-100 Sigma-Aldrich
TSP1 Athensresearch
VEGF PeproTech
Equipo Compañía Bioflux Fluxion Biosciences
BioRad-CFX-384 BioRad
Imaris Bitplane AG
LAS4000 Gelifesciences
Leica DM6000-FS Leica
Lupa Nikon
Material de disección Fine scientific tools
Microscopio de campo claro Nikon
Placa de neubauer Marienfeld
Western blot kit Biorad
Zeiss LSM 700 Carl Zeiss
Zeiss LSM 780 Carl Zeiss
Anticuerpo/fluoróforo WB IF Referencia
Actina 1:5000 Sigma-Aldrich
A5441
Anti-mouse IgG 1:500 Jackson
Anti-rabbit IgG 1:500 Jackson
Anti-rat IgG 1:500 Jackson
Β-galactosidasa 1:100 Abcam ab476120
CD11b 1:100 Ebiosciences 51-
0112-82
CD31 1:100 Millipore
MAB1398Z
CD31 1:100 Dianova DIA310
CD34 1:100 Dako M7165
DAF-FM 2,5 µM Thermo Fisher
eNOS 1:1000 BD-Biosciences
610297
ERG-647 1:100 Abcam ab196149
Fluo-4 1 µM Thermo Fisher
Faloidina FITC 1:200 Life Technologies
GAPDH 1:10000 Sigma G9545
GFP 1:1000 Abcam ab13970
Hoechst 1:5000 Invitrogen H1399
HRP goat-anti-mouse 1:10000 Jackson
HRP goat anti rabbit 1:5000 Jackson
ICAM2 1:100 Bd pharmingen
553325
Isolectina B4 1:100 Vector: B-1205
Tabla 3
Tabla 2
41
MT1-MMP (LEM-2/15) 1:5 1:1 Galvez et al;
2001
MT1-MMP HR 1.100 Abcam ab38971
P-PLCγ 1:1000 Cell Signaling
2821
PLCγ 1:1000 Cell Signaling
5690
TSP1 1:100
Cedido por el
laboratorio de Mª
Luisa Iruela
Arispe
TSP1 1:100 Thermo Fisher
MA5-13398
Tubulina 1:5000 Sigma T6074
1 Cultivos celulares y técnicas in vitro
1.1 Cultivo de HUVECs
Las células endoteliales vasculares humanas de cordón umbilical (HUVECs)
fueron provistas por la casa comercial Lonza obtenidas de diferentes donantes. Las
HUVECs fueron cultivadas sobre una matriz de gelatina 0.5% (Sigma) en medio 199
(Lonza) suplementado con 20% de suero fetal bovino (SFB, Gibco), 100U/ml penicilina
(Lonza), 100 mg/ml estreptomicina (Lonza), 2mM L-Glutamina (Lonza), 10mM hepes
(Lonza), y factores de crecimiento endoteliales suplementados con heparina (Promocell).
Las células fueron utilizadas entre el tercer y quinto pase.
1.2 Aislamiento y cultivo de MAEC
Las células endoteliales de aorta de ratón (MAEC) fueron aisladas tras la disección
de 10 aortas procedentes de ratones de 4 semanas. En primer lugar, se retiró el tejido graso
de las aortas y fueron incubadas durante 5 minutos en una solución de colagenasa tipo I
a una concentración de 3.33 mg/ml (Worthington). Tras la digestión, se retiro la
adventicia de las aortas y fueron cortadas en pequeños fragmentos incubados durante 45
minutos en una dilución en medio comercial DMEM/F12 de colagenasa tipo I (6mg/ml)
y elastasa (2,5 mg/ml) (Worthington). Finalmente, el medio obtenido fue plaqueado sobre
una matriz de gelatina 0.2% en medio DMEM/F12 suplementado con 20% SFB, 2 mM
L-glutamina, 50 U/ml penicilina, 50 μg/ml estreptomicina, 10 U/ml heparina (Chiesi), y
factores de crecimiento endoteliales. Con el objetivo de descartar células musculares de
42
la vasculatura, las MAEC fueron seleccionadas positivamente dos veces con el anticuerpo
anti-ICAM2 (BD Biosciences) unido a bolas magnéticas.
1.3 Estimulación de células endoteliales
Para la estimulación de células endoteliales se usó el factor de crecimiento
endotelial vascular (VEGF) o el factor de Necrosis tumoral (TNFα), provistos por
Peprotech a una concentración de 1 o 20 ng/ml. Las células fueron cultivadas previamente
al experimento en ausencia de ECGS y manteniendo la concentración de SFB al 1%.
Durante el tiempo de tratamiento se mantuvieron las mismas condiciones de cultivo.
Las HUVECs fueron tratadas con DAPT (5µM) para la inhibición de la γ-
secretasa, y Synta 66 (5µM, Aobious Inc) para la inhibición del canal de Ca2+ ORAI1.
1.4 Silenciamiento de la expresión de proteínas mediante ARN de interferencia.
Las HUVECs fueron silenciadas para la expresión de MT1-MMP a nivel de ARN
mediante la transfección con ARN de interferencia (ARNi) formando liposomas con
lipofectamina RNAimax (ThermoFisher). Previamente a la transfección, las células se
encontraban entre 70-80% de confluencia, cultivadas en medio sin antibiótico. Las células
se incubaron en medio Optimen (Lonza) sin suplementar durante 2 horas, y se añadió el
ARNi, a una concentración final de 10 nM, a un ratio ARNi-lipofectamina de 6 pmoles/µl.
Las células se incubaron con ARNi-lipofectamina durante 6 horas tras las cuales se añadió
medio con 20% SFB. Este proceso se llevó a cabo dos días consecutivos. El medio se
retiró al día siguiente siendo sustituido por medio 199 completo durante al menos 24 horas
antes de realizar los ensayos in vitro.
Los ARNi para el silenciamiento de MT1-MMP y control utilizados fueron
proporcionados por Ambion, Thermo Fisher Scientific (MT1-ARNi#1, 8877 (4390824)
MT1-ARNi#2 8879 (4390824) y Control No. 1 (4390843)). Fueron producidas por
Thermo Fisher Scientific.
1.5 Exposición de células endoteliales a flujo laminar
Las HUVECs fueron plaqueadas en microcanales de flujo de placas de 48 pocillos Bioflux
(Fluxion Bioscience) sobre una matriz de fibrinógeno (100ng/ml). Se cultivaron durante
36 horas en medio DMEN 199 suplementado. Posteriormente, las células fueron
sometidas a flujo laminar a 37ºC durante 12 horas produciendo un “estrés de cizalla” de
43
12 dynas/cm2 usando el sistema Bioflux (Fluxion Bioscience). Finalmente, las células
fueron teñidas por inmunofluorescencia siguiendo el protocolo detallado más adelante.
2 Modelos animales y experimentos in vivo
2.1 Líneas experimentales de ratón
Los ratones fueron mantenidos en instalaciones libres de patógenos en el
animalario del Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares (CNIC), mantenidos
a una temperatura constante y sometidos a ciclos de luz oscuridad de 12 horas. Los ratones
fueron alimentados con pellets comerciales y agua disponibles ad libitum.
La línea MT1-MMP (Mmp14)loxP/loxP VE-cadherin (Cdh5)-CreERT2 fue generada
por el cruce de la línea MT1-MMP (Mmp14)loxP/loxP cedida por el laboratorio del Dr Lopez
Otin 211, con la línea VE-cadherin (Cdh5)-CreERT2 cedida por el laboratorio del Dr Adams.
La deleción de Mmp14 fue inducida por la inyección durante 5 días consecutivos de 200μl
de 4-hidroxitamoxifeno a una concentración de 5mg/ml (Sigma Aldrich). Además, se
utilizaron ratones reporteros MT1-MMP (Mmp14)lacz/+ cedidos por el laboratorio del Dr.
Seiki212, que expresan β-galactosidasa bajo el promotor del gen Mmp14.
El genotipado fue realizado para confirmar la presencia de los alelos flox, cre y
Lac Z por PCR de ADN genómico procedente de la cola de los animales. Además, se
confirmó por PCR la recombinación del alelo MT1-MMP en ADN genómico procedente
de la cola o pulmones de los animales. Las secuencias de los cebadores utilizados se
muestran en la Tabla 4. Fueron producidos por Sigma Aldrich.
Todo protocolo que incluye animales ha sido aprobado por PROEX 34113.
Genotipado Cebadores
Flox 5´-CCCTGGGTCAACTACAGCA-3´
5´-TTTGTGGGTGACCCTGACTTG-3´
LacZ 5´-ATCGTGCGGTGGTTGAA-3´
5´-TGCTGACGGTTAACGCCTCG-3´
Cre 5´-AGGTGTAGAGAAGGCACTTAGC-3´
5´-CTAATCGCCATCTTCCAGCAGG-3´
Tabla 4
44
2.2 Inducción química de colitis en ratones y medición del índice de colitis.
La colitis fue inducida en ratones de 8 a 18 semanas de edad por la administración
de sulfato sódico de dextrano (DSS) 1% (m:v) en el agua de bebida ad libitum durante 3
o 7 días. El índice de colitis de los animales fue evaluado diariamente, los ratones fueron
pesados, se analizó la consistencia de las heces y la presencia de sangre oculta en las
mismas. A día 0 se le asignó un índice de colitis 0, el resto de días fue calculado de la
siguiente forma: el porcentaje de pérdida de peso con respecto al día 0 se puntuó con un
0 para aquellos ratones que mantuvieron o ganaron peso, un 1 para una pérdida de entre
el 1 y el 5% del peso corporal, 2 para una pérdida del 5 al 10%, 3 del 10 al 20% y 4 para
aquellos ratones que perdieron más del 20% de su peso. Para la consistencia de las heces
se puntuó como 0 las heces bien formadas de tamaño y forma de pellet normal, como 2
aquellos ratones de pellets blandos, y como 4 aquellos ratones de heces líquidas. En
cuanto al sangrado rectal, se puntuó con un 0 la ausencia de sangre en heces, con un 2 la
aparición de sangre oculta en heces positiva por hemocult (Colon Screen), y 4 la aparición
de sangre abundante visible en las heces y el ano.
2.3 Inyección de lentivirus in vivo
Ratones de 8 a 18 semanas fueron inyectados con lentivirus que expresan la
secuencia completa de la proteína MT1-MMP, con la mutación Y573F, o E240K bajo el
promotor SFFV. Se inyectaron 200 µl de lentivirus por ratón a una concentración 2x107
PV/ml a través de la vena yugular en ratones previamente anestesiados.
Se comprobó la eficiencia de transducción y expresión por Western blot de la
proteína verde fluorescente (GFP), expresada en el vector viral bajo el mismo promotor
que nuestra proteína de interés.
2.4 Ensayo de perfusión
Para analizar la funcionalidad de los vasos sanguíneos del plexo mucoso se realizó
un ensayo de perfusión. Los ratones se perfundieron vía intravenosa 20 minutos antes de
ser eutanasiados con 100 μl de isolectina B4 biotinilada o fluoresceinada (Vector labs) y
fueron perfundidos con PBS. El porcentaje de vasculatura perfundido por IB4 fue
analizado mediante el software Imaris (version 7.7.2; Bitplane AG).
45
3 Técnicas de imagen
3.1 Tinciones de inmunofluorescencia en células.
Las células fueron plaqueadas sobre cristal cubierto de gelatina al 1% y fijadas
con paraformaldehído (PFA) al 4% durante 8 minutos a temperatura ambiente. La
reactividad inespecífica de los anticuerpos fue bloqueada durante 30 minutos a
temperatura ambiente, con BSA 5% en PBS, suplementado con el 5% de sueros
procedentes de la especie animal en la que hubieran sido producidos los anticuerpos
secundarios que iban a ser utilizados. Las células fueron permeabilizadas en los casos que
fue necesario con Triton X-100 0.1% disuelto en PBS durante 15 minutos a temperatura
ambiente. Se incubaron con los anticuerpos primarios en solución de bloqueo durante una
noche a 4ºC y se lavaron 3 veces durante 15 minutos con PBS. Tras ello, las células fueron
incubadas con los anticuerpos secundarios unidos a fluoróforos durante 45 minutos a
37ºC y se lavaron 3 veces durante 10 minutos con PBS. Finalmente, las muestras fueron
observadas y fotografiadas con un microscopio confocal Zeiss LSM700 (Plan-
Apochromat 63x1.4 o 40x1.3 Oil DIC M27).
3.2 Determinación relativa de la concentración de óxido nítrico
La determinación de la concentración relativa de óxido nítrico en HUVECs fue
realizada mediante la sonda DAF-FM diacetato (ThermoFisher). Las células fueron
incubadas a una concentración de 2.5 μM de la sonda disuelta en Optimen en ausencia de
rojo fenol durante 30 minutos a 37ºC. A continuación, se lavaron abundantemente con
PBS y se fijaron con PFA 4% durante 8 minutos. Las células fueron observadas usando
un microscopio confocal Zeiss LSM700 (Plan-Apochromat 40x1.3 Oil DIC M27). Se
cuantificó la intensidad de fluorescencia media (IFM) a nivel de célula única usando el
software ImageJ.
3.3 Determinación relativa de la concentración de Ca2+ y análisis de oscilaciones
La determinación de la concentración relativa de Ca2+ en HUVECs fue realizada
mediante la sonda fluorescente de Ca2+ Fluo4-AM (ThermoFisher). Las células fueron
incubadas con la sonda a una concentración de 1µM disuelta en HBSS con ácido
plurónico (0.002%) durante 30 minutos a temperatura ambiente. A continuación, las
células fueron lavadas y se analizó la variación de Ca2+ intracelular a lo largo del tiempo
en situación control o bajo el efecto de los estímulos angiogénicos VEGF o TNFα,
mediante un microscopio confocal Zeiss LSM700 (Plan-Apochromat 40x1.3 Oil DIC
46
M27). Se cuantificó la intensidad de fluorescencia media a nivel de célula única por
fotograma usando el software ImageJ y se normalizó respecto al valor del primer
fotograma de cada célula.
Las frecuencias de oscilación de cada célula se obtuvieron mediante la
transformada rápida de Fourier usando el protocolo adaptado desarrollado por Uhlén para
el software Matlab (MathWorks) 218.
3.4 Tinción de tejido in toto
Se realizaron tinciones de inmunofluorescencia de tejido in toto en tejido de colon
procedente de ratón o de biopsias humanas, así como de aortas y músculo cremáster de
ratón.
Los fragmentos distales del colon de los animales y los músculos cremáster fueron
abiertos y fijados durante una noche con PFA al 4% en PBS a 4ºC. Las muestras fijadas
fueron incubadas durante una hora en solución de bloqueo, 5% BSA, 0.3% Triton X-100,
y 5% de sueros provenientes de la especie animal en la que hubieran sido producidos los
anticuerpos secundarios que se iban a utilizar. A continuación, las muestras se incubaron
a 4ºC durante una noche en agitación suave, con los anticuerpos primarios en solución de
bloqueo y se lavaron con PBS 0.1% Triton X-100 al menos 3 veces. Finalmente, las
muestras fueron incubadas con los anticuerpos secundarios unidos a fluoróforos durante
una noche a 4ºC y se lavaron con la misma solución de lavado que anteriormente. Las
muestras fueron observadas y fotografiadas con un microscopio confocal Zeiss LSM700
(Plan-Apochromat, 25X0.8 or 63x glycerol DIC M27). La reconstrucción de la
vasculatura del colon en 3 dimensiones, y la cuantificación de la misma fueron realizadas
por medio del software Imaris (version 7.7.2; Bitplane AG).
Las aortas fueron extraídas de los animales tras ser perfundidos con PFA al 4% en
PBS, limpiadas, abiertas y postfijadas durante una hora con PFA al 4% en PBS. Se tiñeron
y analizaron las aortas mediante el mismo protocolo seguido en el caso de las muestras
de colon y músculo cremáster.
El análisis de la polarización de las células endoteliales de la aorta se llevó a cabo
mediante la medición del ángulo formado por el vector entre el núcleo y el aparato de
Golgi, y el vector del flujo sanguíneo usando el software ImageJ. Se realizó un histograma
de su distribución usando el software R-estudio.
47
3.5 Tinciones de tejido parafinado
Fragmentos de colon de los ratones tratados con DSS o control fueron fijados con
4% de PFA a 4ºC durante 12 horas, embebidos en parafina y cortados en secciones de 5
µm. Las secciones fueron desparafinadas e hidratadas en una cadena xilol-etanol, y se
tiñeron con hematoxilina/eosina para el análisis histológico de las muestras o fueron
desenmascaradas con tampón Tris-EDTA pH 9 durante 20 minutos a 95ºC para ser
teñidas por inmunofluorescencia.
Las muestras desenmascaradas para tinción de inmunoflurescencia fueron
bloqueadas durante una hora a temperatura ambiente con PBS 0.3% Tx100, 5% BSA, 5%
suero de cabra y anti-CD16/CD32 a una concentración de 1:100. Posteriormente, se
incubaron con anticuerpos primarios durante una noche y se lavaron las muestras con
PSB 0.1% Tx100. Las muestras fueron incubadas con anticuerpos secundarios
conjugados con diferentes fluorocromos durante 2 horas a temperatura ambiente y se
lavaron con PSB 0.1% Tx100. Finalmente, se montaron en Fluoromont con Hoechst
33342 para la visualización de los núcleos y se observaron utilizando un microscopio
confocal Zeiss LSM700 (Plan-Apochromat 25x Oil DIC M27).
3.6 Microscopía intravital de músculo cremáster de ratón
La microscopía intravital en el músculo cremáster se realizó de acuerdo a lo
descrito previamente 219. El músculo cremáster de ratones anestesiados fue cortado
longitudinalmente y expuesto al microscopio intravital Leica DM6000-FS ajustado a una
cámara DFC350-FX con un objetivo de inmersión en agua Apo 40x NA 1.0. El músculo
fue perfundido continuamente con buffer Tyrode. Los animales fueron tratados por vía
intravenosa con 100µl de Acetilcolina 100µM (ACh), y 100 µl de DEANO 10-4 M. Se
analizó la vasodilatación arterial mediante el programa LAS-AF.
4 Procedimientos experimentales
4.1 Western Blotting
Las células fueron lisadas en buffer RIPA (Tris 50mM, NaCl 150 mM, SDS 0.1
%, Na-deoxicolato 0.5 %, NP40 1%) a 4ºC con inhibidores de proteasas y fosfatasas
(Roche). La concentración de proteínas de los lisados fue determinada por colorimetría
usando ácido bicinconínico (BCA) (ThermoFisher). Las proteínas desnaturalizadas en
48
tampón Laemmli con 4% β-mercaptoetanol se cargaron en geles de acrilamida del 8 al
12% (SDS-PAGE) y se realizaron electroforesis en condiciones desnaturalizantes. Se
utilizó el marcador de pesos moleculares Secblue plus presteined (ThermoFisher).
Tras la electroforesis, las proteínas fueron transferidas a una membrana de
nitrocelulosa (Biorad). Se bloquearon los sitios de unión no específica con BSA 5% en
TBS durante una hora a temperatura ambiente y las membranas fueron incubadas con los
anticuerpos primarios durante una noche a 4ºC. Al día siguiente, se incubaron durante 45
minutos a temperatura ambiente con anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa
de rábano. La señal producida al suministrar sobre la membrana luminol (Merk Milipore),
sustrato de la peroxidasa, fue detectada por quimioluminiscencia mediante el equipo LAS
4000.
Los resultados fueron cuantificados por densitometría usando el software ImageJ
y normalizados respecto al control de carga, GAPDH, actina o tubulina. Los anticuerpos
usados y la concentración de uso se muestran en la tabla 3.
4.2 Retro-PCR cuantitativa (qPCR)
El ARN de tejidos y células fue extraído utilizando el kit comercial RNeasy Plus micro
kit (Qiagen) y cuantificado usando el espectofotómetro Nanodrop ND-100 (Thermo
Fisher Scientific). Se sintetizó 1 μg de ADNc usando el kit de transcripción reversa de
alta capacidad (Applied Biosystems). A continuación, se realizó una PCR cuantitativa por
triplicado para cada uno de los ARNm mediante el sistema SYBR Green (Applied
Biosystems). La fluorescencia del agente intercalante fluorescente SYBR Green fue
detectada por el termociclador CFX-384 (Biorad)
Los cebadores fueron diseñados usando la librería online primerBank. Las secuencias de
los cebadores se muestran en la Tabla 5, para los genes humanos y en la Tabla 6, para los
genes de ratón. Todos ellos fueron sintetizados por Sigma Aldrich. Los datos fueron
analizados usando el software qBASE.
Gen Cebadores
DLL4 5´-GTCTCCACGCCGGTATTGG-3´
5´-CAGGTGAAATTGAAGGGCAGT-3´
CD34 5´-CTACAACACCTAGTACCCTTGGA-3´
5´-GGTGAACACTGTGCTGATTACA-3
Tabla 5
49
ESM1 5´-CAGGGGGACGGGAAAATGC-3´
5´-CAGATGCCATGTCATGCTCC-3´
CXCL12 5´-ATTCTCAACACTCCAAACTGTGC-3´
5´-ACTTTAGCTTCGGGTCAATGC-3´
VEGFR2 5´-GGCCCAATAATCAGAGTGGCA-3´
5´-CCAGTGTCATTTCCGATCACTTT-3´
PCDH10 5´-TGGATGGTGGAAGGAGTCTTT-3´
5´-TTCAGCGATATTCCCCACGAA-3´
PAK1 5´-AGGGGAGTTTACGGGAATGC-3´
5´-TCTTCTGCTCCGACTTAGTGATA-3´
SFRP 5´-ACGTGGGCTACAAGAAGATGG-3´
5´-CAGCGACACGGGTAGATGG-3´
STAT1 5´-ATCAGGCTCAGTCGGGGAATA-3´
5´-TGGTCTCGTGTTCTCTGTTCT-3´
RCAN1.4 5´-CTCACTAGGGGCTTGACTGC-3´
5´-CAGGCAATCAGGGAGCTAA-3´
ICAM1 5´-ATGCCCAGACATCTGTGTCC-3´
5´-GGGGTCTCTATGCCCAACAA-3
VCAM1 5´-GGGAAGATGGTCGTGATCCTT-3´
5´-TCTGGGGTGGTCTCGATTTTA-3´
MMP14 5´-GGCTACAGCAATATGGCTACC-3´
5´-GATGGCCGCTGAGAGTGAC-3´
NOS3 5´-GGCTGGGTTTAGGGCTGTG-3´
5´-TGAGGGTGTCGTAGGTGATG-3´
GAPDH 5´-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3´
5´-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3´
HPRT 5´-CCTGGCGTCGTGATTAGTGAT-3´
5´-AGACGTTCAGTCCTGTCCATAA-3
YWHAB 5´-CCTGCATGAAGTCTGTAACTGAG-3´
5´-GACCTACGGGCTCCTACAACA-3´
Gen Cebadores
Mmp14 5´- CAGTATGGCTACCTACCTCCAG-3´
5´- GCCTTGCCTGTCACTTGTAAA-3´
Cdh5 5´-AAAGAACTGGACAGAGAAA-3´
5´-GGTTGTCATTCTCATCCAAG-3´
Tbp 5´- GCTCTGGAATTGTACCGCAG-3´
5´- CTGGCTCATAGCTCTTGGCTC-3´
Gapdh 5´- AATGCATCCTGCACCACCAA-3´
5´- GTGGCAGTGATGGCATGGAC-3´
4.3 Citometría de flujo preparativa
Pulmones procedentes de ratones recién eutanasiados por dislocación cervical fueron
digeridos en colagenasa tipo I a una concentración de 0.2% (GIBCO) durante una hora a
Tabla 6
50
37ºC. Las células extraídas de los pulmones fueron incubadas durante 5 minutos en
tampón ACK (150mM NH4Cl, 0.1mM Na2EDTA, 10mM KHCO3, pH=7.4) para
eliminar los eritrocitos, y resuspendidas en buffer de citometría de flujo preparativa (PBS
+ 1% FBS + 10mM HEPES). Posteriormente, se bloquearon los receptores Fcγ, que se
unen a inmunoglobulinas, con anti-CD16/CD32 (Pharmingen) durante 10 minutos a 4ºC.
Las muestras fueron teñidas con anti-CD31 (Mec13.3) conjugado con el fluorocromo
Alexa Fluor 488 y anti- CD45.1 conjugado con el fluorocromo V405 (BD Bioscience,
Pharmingen). Finalmente, las muestras fueron analizadas por Synergy 4L Cell Sorter
(Sony Biotechnology Inc.) y la población endotelial definida como CD31+/CD45- fue
aislada para su análisis por qPCR.
5 Análisis estadístico
Todos los resultados fueron analizados y representados en gráficas usando el software
GraphPad Prism 4.0 (GraphPad Software, La Jolla, USA). Para comparar dos grupos
muestrales de igual varianza se utilizó el método de la t de Student de dos colas. Cuando
las varianzas eran significativamente diferentes, se aplicó el método de Welch. En los
casos en que se comparó más de dos grupos muestrales se utilizó ANOVA de una cola o
dos colas combinado con el método de comparación múltiple Benjamini–Hochberg en
los casos en los que las muestras se ajustaron a una distribución paramétrica, y el método
de Kruskal-Wallis combinado con el método de comparación múltiple de Dunn cuando
no se ajustaron. En aquellos casos donde las muestras control se normalizaron a uno se
usó el método de la t de Student de un grupo para su análisis estadístico. Finalmente, en
el caso de datos procedentes del mismo individuo o célula, se realizó un análisis de la t
de Student pareada.
En todos los casos se representó la media ± el error estándar de la media (EEM) y se
consideraron diferencias significativas cuando el valor p del correspondiente análisis
estadístico era inferior a 0.05. Se representó el grado de significación con uno, dos, tres o
cuatro asteriscos, siendo: * p<0.05, ** p< 0.01, *** p< 0.001, **** p< 0,0001.
51
Resultados
52
53
1 Papel de las oscilaciones de Ca2+ en la especificación de células endoteliales en
células líder y tallo durante la angiogénesis por brote capilar
Diferentes estímulos mecánicos y químicos producen la activación de las células
endoteliales, dando lugar a angiogénesis por brote capilar por la especificación de las
células endoteliales quiescentes en células líder y tallo. Para que la angiogénesis por brote
capilar se produzca correctamente es necesaria una respuesta celular heterogénea ante un
estímulo angiogénico. VEGF A, que nosotros denominaremos a partir de este momento
como VEGF, y TNFα son dos de los estímulos mejor caracterizados en la bibliografía
como inductores de la angiogénesis por brote capilar13,29.
Sin embargo, se desconoce cómo se produce la señalización celular ante un
estímulo para producir una respuesta heterogénea con dos fenotipos endoteliales bien
diferenciados, las célula líder y tallo. En este trabajo, nosotros proponemos la señalización
por Ca2+ como posible eje para la divergencia en células líder y tallo, durante la
especificación celular ante estímulos angiogénicos como VEGF y TNFα.
1. 1 Análisis de las oscilaciones de Ca2+ en respuesta a estímulos angiogénicos
1.1.1 VEGF y TNFα aumentan la concentración de Ca2+ intracelular en células
endoteliales
En primer lugar, se comprobó si VEGF y TNFα modificaban las oscilaciones de
Ca2+ durante su transducción de señales. Se trataron HUVECs en monocapa confluente,
marcadas con la sonda de Ca2+ fluorescente Fluo 4, con VEGF o TNFα en ausencia de
Ca2+ extracelular durante 10 minutos. Se observó una respuesta moderada en cuanto a las
oscilaciones de Ca2+ en las células endoteliales. Transcurridos 10 minutos se restituyó el
Ca2+ extracelular a una concentración de 5 mM, observando un rápido y significativo
ascenso del Ca2+ intracelular a nivel poblacional y de célula única en HUVECs tratadas
con ambos estímulos (Figura 7). Estos resultados indicaron que VEGF y TNFα utilizan
el Ca2+ intracelular como molécula señalizadora durante la transducción de señales e
implicaron al Ca2+ extracelular y los canales de Ca2+ de la membrana plasmática en las
oscilaciones producidas por ambos estímulos.
54
Figura 7. La estimulación con VEGF y TNFα produce el aumento de la concentración de Ca2+
citoplasmático en células endoteliales. A. Evolución de la concentración intracelular de Ca2+ a nivel
poblacional en HUVECs estimuladas con VEGF (20 ng/ml) en ausencia de Ca2+ durante 10 minutos,
y tras la adición de Ca2+ en el medio extracelular (5 mM). B. Cuantificación de la intensidad de
fluorescencia media de Fluo4 a nivel de célula única en ausencia de Ca2+ extracelular y a una
concentración de 5mM de células estimuladas con VEGF. n=3 experimentos C. Evolución de la
concentración intracelular de Ca2+ a nivel poblacional en células estimuladas con TNFα (20 ng/ml) en
ausencia de Ca2+ durante 10 minutos, y tras la adición de Ca2+ en el medio extracelular (5mM). D.
Cuantificación de la intensidad de fluorescencia media de Fluo4 a nivel de célula única en ausencia
de Ca2+ extracelular y a una concentración de 5mM en células estimuladas con TNFα. n=3. En B y D
se realizaron los análisis estadísticos con el método de la t de Student pareada. *** p< 0,001, ****
p<0,0001.
1.1.2 Análisis de las oscilaciones de Ca2+ en respuesta a VEGF y TNFα a nivel de
célula única
A continuación, se analizó de qué forma son capaces VEGF y TNFα de modificar
las oscilaciones de Ca2+ en HUVECs. Para ello, se estimularon HUVECs con 20ng/ml de
VEGF o TNFα y se midió la concentración relativa de Ca2+ cada 1,52 segundos a nivel
de célula única durante 47 minutos de estimulación. De esta forma, se analizó la respuesta
celular independiente frente a ambos estímulos y se comparó con las oscilaciones de Ca2+
en células control sin estimulación.
55
Figura 8. La estimulación con VEGF y TNFα modifica los patrones de las oscilaciones de Ca2+
en células endoteliales. A. B. Evolución de la concentración de Ca2+ intracelular durante 1800
fotogramas (47 minutos) a nivel de célula única en 4 células representativas (A) y a nivel poblacional
(B) en HUVECs sin estímulos angiogénicos externos. C. D. Evolución de la concentración intracelular
de Ca2+ durante 1800 fotogramas (47 minutos) a nivel de célula única en 5 células representativas (C)
y a nivel poblacional (D) en HUVECs estimuladas con 20ng/ml de TNFα. E. F. Evolución de la
concentración intracelular de Ca2+ durante 1800 fotogramas (47 minutos) a nivel de célula única en 5
células representativas (E) y a nivel poblacional (F) en HUVECs estimuladas con 20ng/ml de VEGF.
G. H. Cuantificación del porcentaje de HUVECs tratadas con VEGF (G) o TNFα (H) que presentan
oscilaciones de Ca2+ con periodos clasificados en intervalos de 10 segundos (blanco) comparados con
los de células control (negro) sin estímulos angiogénicos externos. n=3 experimentos. En B, D y F se
representó la media experimental en azul, y en gris cada una de las células del experimento. En G y H
se realizaron los análisis estadísticos con el método ANOVA de dos colas con post-test de Benjamini-
Hochberg. * p<0,05, ** p< 0,01.
56
En células control, no estimuladas con ningún factor angiogénico, no se
observaron variaciones en las oscilaciones de Ca2+, tan solo una pequeña proporción de
células presentó picos de Ca2+ espontáneos (Figura 8A,B). Las células estimuladas con
20ng/ml de TNFα presentaron dos subpoblaciones celulares en cuanto a su respuesta de
oscilaciones de Ca2+. Aquellas células que no respondieron a la estimulación mediante
oscilaciones de Ca2+, y las que respondieron con numerosos picos de Ca2+ cortos y de
frecuencia aproximadamente estable, los cuales no eran visibles a nivel poblacional pero
sí a nivel de célula única (Figura 8C,D).
En el caso de las células estimuladas con 20ng/ml de VEGF se observaron
diferentes comportamientos celulares en cuanto a las oscilaciones de Ca2+ en respuesta al
estímulo. Por una parte, la mayoría de células incrementaron rápidamente su
concentración de Ca2+, con una oscilación visible a nivel poblacional de gran amplitud,
seguida de rápidas y amplias oscilaciones o descenso y estabilización del Ca2+
intracelular. Otras células, por el contrario, presentaron numerosas oscilaciones de Ca2+
con un patrón similar al mayoritario en células estimuladas con TNFα, por otro lado una
minoría de células no respondieron a la estimulación con VEGF (Figura 8E,F).
1.1.3 Análisis de las frecuencias de las oscilaciones de Ca2+ en respuesta a VEGF y
TNFα
Para analizar las diferencias en las oscilaciones de Ca2+ entre las células
estimuladas con VEGF o TNFα y las células control, se extrajeron las frecuencias de las
oscilaciones de Ca2+ a nivel de célula única usando la transformada rápida de Fourier. Se
cuantificó el porcentaje de células con periodos de oscilación (el inverso de la frecuencia)
clasificados en intervalos de 10 segundos. Las oscilaciones de Ca2+ de las células
endoteliales son oscilaciones complejas que presentan numerosas frecuencias dentro de
una misma onda. Los porcentajes de células con oscilaciones en los distintos intervalos
de periodos fueron comparadas usando ANOVA de dos colas y post test de Benjamini y
Hochberg.
Tanto la estimulación con VEGF como con TNFα, produjo unos porcentajes de
células distribuidas en los intervalos de periodos estadísticamente diferente a la de las
células control. En el caso de VEGF los porcentajes de células con oscilaciones con
periodos menores a 20 segundos fueron significativamente mayores que en el control,
57
mientras que en las células estimuladas con TNFα hallamos diferencia significativa en el
porcentaje de células con periodos menores de 30 segundos. Por tanto se concluyó que
las HUVECs estimuladas con VEGF o TNFα presentan mayor número de células con
oscilaciones de alta frecuencia (Figura 8G,H).
Estos datos en conjunto indican que tanto VEGF como TNFα utilizan las
oscilaciones de Ca2+ intracelulares como método de transducción de señales por medio
del incremento de la concentración intracelular del catión y de la generación de
oscilaciones de alta frecuencia.
1.2 Análisis de la heterogeneidad de las oscilaciones de Ca2+ en respuesta a VEGF
Dado que la estimulación con VEGF produjo en HUVECs una respuesta celular
más heterogénea, con diferentes tipos de oscilaciones de Ca2+, y que de acuerdo con
nuestra hipótesis dicha heterogeneidad es necesaria para iniciar la especificación de las
células endoteliales en los dos fenotipos celulares implicados en la angiogénesis por brote
capilar, se decidió profundizar en su señalización a través de oscilaciones de Ca2+,
excluyendo a partir de entonces la estimulación con TNFα de nuestro estudio.
Con el objetivo de esclarecer cómo las células endoteliales son capaces de
responder de forma diferente ante un mismo estímulo, se estudió a nivel de célula única
la función de algunos componentes de la ruta de señalización responsable las oscilaciones
de Ca2+ en células endoteliales.
1.2.1 Papel del canal ORAI1 en las oscilaciones de Ca2+ en respuesta a VEGF
Conociendo la importancia del Ca2+ extracelular en la respuesta a la estimulación
con VEGF, se decidió comprobar la implicación del principal canal de Ca2+ de la
membrana plasmática, ORAI1, en las oscilaciones de Ca2+. Para ello, se preincubaron
HUVECs en confluencia con el inhibidor químico específico de ORAI1 (Synta 66) y se
estimularon con 20ng/ml de VEGF. No se observó en ninguna célula el pico de Ca2+ de
gran amplitud característico de la mayoría de células tratadas con VEGF. Sólo en torno a
un 13% de las células respondieron a VEGF con múltiples picos de Ca2+ de duración
breve (Figura 9).
Estos datos indicaron que las diferentes oscilaciones de Ca2+ en respuesta a un
mismo estímulo no son dependientes de los mismos canales de Ca2+ de la membrana
plasmática.
58
Figura 9. La actividad del canal de Ca2+ ORAI1 es necesaria para la respuesta mayoritaria a
VEGF por oscilaciones de Ca2+ en HUVECs. A. B. Evolución de la concentración intracelular de
Ca2+ en HUVECs bajo el efecto de la droga inhibidora del canal de Ca2+ ORAI1, Synta 66 (S66),
estimuladas con VEGF (20ng/ml) a nivel poblacional (A) y de célula única (B). Un 12.83% ± 8.74 de
las células respondieron con múltiples picos de Ca2+. En A se representó la media experimental en
azul, y en gris cada una de las células del experimento. Experimento representativo de 3 experimentos
independientes.
1.2.2 VEGF produce diferentes respuestas de oscilaciones de Ca2+ dependientes de
dosis
Se ha descrito que el aumento de la migración celular, característica de células
líder, en células endoteliales estimuladas con VEGF es dependiente de dosis. Por ello, se
decidió comprobar si diferentes concentraciones de VEGF (1ng/ml y 20ng/ml) podían
producir diferentes patrones de oscilaciones Ca2+ cambiando la heterogeneidad de la
respuesta celular.
Las células analizadas se clasificaron en tres grupos según el tipo de oscilaciones
de Ca2+ que presentaron en respuesta a VEGF: i) las que presentaron una oscilación
principal de gran amplitud al inicio de la estimulación como oscilación principal (OP), ii)
las que presentaron repetidas oscilaciones de frecuencia aproximadamente estable como
oscilaciones repetidas (OR) y iii) aquellas que no responden como no respondedoras (NR)
(Figura 10A).
Las células tratadas con 20ng/ml de VEGF presentaron un porcentaje
aproximadamente del 88% de células OP, un 10% de OR y tan solo un 2% de células NR
(Figura 10B) (Video 1). Las células que fueron tratadas con la dosis más baja de VEGF,
1ng/ml, presentaron sin embargo un bajo porcentaje de células OP, elevado de células
OR, y en torno a un 20% de células NR (Figura 10C) (Video 2).
59
Figura 10. VEGF produce diferentes patrones de oscilaciones de Ca2+ dependientes de dosis. A.
Clasificación de los patrones de oscilaciones de Ca2+ en respuesta a la estimulación con VEGF en
HUVECs: presencia una oscilación principal de gran amplitud al inicio de la estimulación (OP)
(arriba), presencia de oscilaciones repetidas (OR) (centro) y a aquellas que no responden (NR) (abajo).
B. Porcentaje de células que presentaron cada una de las respuestas clasificadas en A tras la
estimulación con 20 ng/ml de VEGF. n=4. C. Porcentaje de células que presentaron cada una de las
respuestas clasificadas en A tras la estimulación con 1 ng/ml de VEGF. n=3.
En resumen, estos datos indican que las HUVECs sometidas a elevadas dosis de
VEGF presentan mayoritariamente una respuesta de una oscilación principal mientras
que aquellas sometidas a dosis más bajas responden mayoritariamente con oscilaciones
repetidas.
1.2.3 VEGF produce dinámicas de fosforilación de PLCγ1 dependientes de dosis
Como se ha explicado en la introducción de este trabajo, las oscilaciones de Ca2+
se producen por una vía de señalización en la que las fosfolipasas son pieza esencial. Por
esto, y con objetivo de comprender cómo la misma ruta de señalización puede producir
dos tipos de oscilaciones de Ca2+ diferentes, se decidió analizar la dinámica de
fosforilación de la fosfolipasa mayoritaria en el endotelio, la fosfolipasa gamma 1
(PLCγ1).
HUVECs cultivadas en monocapa confluente fueron estimuladas con 1 y 20 ng/ml
VEGF durante diferentes tiempos y se analizó por Western blot la fosforilación activadora
en la tirosina 783 (Tyr783) de la PLCγ1.
60
Se observó una rápida fosforilación de la proteína en las células tratadas con dosis
elevadas de VEGF que decreció con el tiempo de estimulación, mientras esta fosforilación
es menor pero sostenida en el tiempo en las células estimuladas con 1ng/ml de VEGF.
Estos resultados correlacionaron con las oscilaciones de Ca2+en respuesta a estímulo
mayoritarias en cada tratamiento (Figura 11A,B).
Figura 11. VEGF produce dinámicas de fosforilación de PLCγ1 dependientes de dosis. A. Western
blot representativo de p-PLCγ1, PLCγ1 total y tubulina de HUVECs tratadas con 20ng/ml de VEGF
a diferentes tiempos de estimulación y su cuantificación. n=3. B. Western blot representativo de p-
PLCγ1, PLCγ1 total y tubulina de HUVECs tratadas con 1ng/ml de VEGF a diferentes tiempos de
estimulación y su cuantificación. n=3. Se realizaron los análisis estadísticos con el método de la t de
Student para una muestra. * p<0,05.
1.2.3 Análisis de la regulación de las oscilaciones de Ca2+ por la ruta Dll4/Notch
La vía de inhibición lateral Dll4/Notch es considerada como el principal eje en la
especificación de células líder y tallo, por ello se decidió analizar el efecto de esta vía
sobre las oscilaciones de Ca2+ en respuesta al estímulo angiogénico VEGF.
Se trataron HUVECs en monocapa confluente con un inhibidor de la γ-secretasa
(DAPT), encargada del corte del fragmento intracelular de NOTCH (NICD) responsable
de su señalización, y se estimularon con 1 o 20 ng/ml de VEGF. Se observaron, al igual
que en experimentos anteriores, las oscilaciones de Ca2+ a nivel de célula única en
respuesta a VEGF durante 47 minutos. Finalmente, se cuantificó el porcentaje de células
61
que presentaron cada uno de los diferentes tipos de oscilaciones de Ca2+ en respuesta a
VEGF y se comparó con los de las células no tratadas con DAPT.
Las células tratadas con DAPT y estimuladas con 20 ng/ml de VEGF, no
presentaron oscilaciones de Ca2+ de tipo OP mientras que en las células control, tratadas
solo con VEGF, fue el comportamiento mayoritario. Además, se incrementó un 55% las
células con fenotipo OR (Figura 12A).
Figura 12. El patrón de oscilaciones de Ca2+ de las células endoteliales en respuesta a VEGF es
dependiente del corte intracelular de Notch. A. Porcentaje de células que presentaron cada una de
las respuestas clasificadas en la figura 34 A tras la estimulación con 20 ng/ml de VEGF tratadas o no
con el inhibidor de la γ-secretasa DAPT. n=3 experimentos independientes. B. Porcentaje de células
que presentaron cada uno de las respuestas clasificadas en la figura 10 tras la estimulación con 1 ng/ml
de VEGF tratadas o no con el inhibidor de la γ-secretasa DAPT. n=3 experimentos independientes. Se
realizaron los análisis estadísticos con el método la t de Student. ** p< 0,01, *** p< 0,001, **** p<
0,0001. OP= Oscilación Principal, OR= Oscilaciones Repetidas y NR= No Respondedoras.
En cuanto a las estimuladas con 1ng/ml de VEGF, aquellas células con
oscilaciones de tipo OR disminuyeron un 57% tras el tratamiento con DAPT respecto al
control, y se incrementaron las células que no respondieron mediante oscilaciones de Ca2+
a la estimulación con 1ng/ml de VEGF (Figura 12B). Por tanto, estos datos indicaron
que el bloqueo in vitro del sistema de inhibición lateral desregula los porcentajes de
células que presentan cada tipo de oscilaciones.
Estos datos en conjunto, sugieren que el sistema Dll4/Notch modula la respuesta
a VEGF a través de las oscilaciones de Ca2+ de células endoteliales, y con ello su
especificación en células líder y tallo.
62
1.3 Impacto de las oscilaciones de Ca2+ en la transcripción génica
1.3.1 Regulación génica de marcadores de célula líder o tallo en respuesta a
diferentes dosis de VEGF
Para comprobar si las diferentes oscilaciones de Ca2+ estaban implicadas en la
especificación celular de los dos fenotipos de célula endotelial, se estimularon HUVECs
con 1 y 20ng/ml de VEGF durante 2 y 24 horas y se analizaron los niveles de marcadores
endoteliales de células líder y tallo a nivel de ARNm por qPCR cuantitativa. La búsqueda
de candidatos se realizó de acuerdo a la bibliografía previa 53,220.
Marcadores de células líder como ESM1, CD34, CXCL12, VEGFR2 o DLL4
aumentaron a nivel de ARNm en células HUVECs tratadas con 20ng/ml durante 2 o 24
horas (Figura 13A). Sin embargo, en la mayoría de los marcadores de células tallo como
PAK7, SFRP o PCDH10 no se observó una regulación génica tan clara tras el tratamiento
con diferentes concentraciones de VEGF (Figura 13 B).
Las oscilaciones de Ca2+ pueden activar la transcripción génica en células
endoteliales a través de diferentes factores de la transcripción como NFAT y NFκB. Por
ésto, se analizó la expresión de RCAN1.4 como diana clásica del factor transcripcional
NFAT. RCAN1.4 ha sido caracterizado como marcador de células líder por su
importancia en la migración celular mediada por VEGFR2 221. Como dianas
transcripcionales de NFκB se analizó la expresión de VCAM1 e ICAM1 222. En el caso
de RCAN1.4 observamos el aumento del ARNm en las células tratadas con 20ng/ml de
VEGF. Por el contrario, los niveles del mensajero de ICAM1 y VCAM1 aumentaron en
células endoteliales tratadas tanto con 1 como con 20ng/ml de VEGF durante 24 horas
(Figura 13 C).
63
Figura 13. Diferentes dosis de VEGF regulan la trasncripción génica de marcadores de célula
líder o tallo. A. qPCR en HUVECs estimuladas con 1 o 20 ng/ml VEGF durante 2 o 24 horas de los
marcadores de célula líder (A) DLL4, CD34, ESM1, CXCL12, VEGFR2, de células tallo (B)
PCDH10, PAK7, SFRP, STAT1, y los marcadores de trancripción dependiente de NFAT, RCAN1.4,
y de NFκB: ICAM1 y VCAM (C). . Se realizaron los análisis estadísticos con el método de la t de
Student para una muestra. * p<0,05.
64
Dado que RCAN1.4 apareció sobreexpresado en células líder siendo un gen diana
de NFAT, factor transcripcional asociado previamente a la diferenciación de células tallo,
se comparó la expresión de los marcadores en células estimuladas con VEGF tratadas o
no con el inhibidor de la ruta de NFAT, ciclosporina (CSA). Se observó que el aumento
de la expresión de la mayoría de los genes marcadores de célula líder ESM1, CD34,
CXCL12, y DLL4 son independientes de la activación de NFAT y no se observaron
cambios en genes marcadores de células tallo como PAK7, Col8a, PCDH10, o SFRP. Sin
embargo, el tratamiento con CSA inhibió el incremento de la expresión de RCAN1.4 en
células estimuladas con 20ng/ml de VEGF y atenuó los cambios en los niveles del
mensajero de ICAM y VCAM en células estimuladas con ambas concentraciones de
VEGF (Figura 14 C).
Figura 14. Papel de NFAT en la regulación de la transcripción de genes marcadores de célula
líder y tallo. A.B.C. qPCR cuantitativa de RCAN1.4 (A), ICAM1 (B) y VCAM (C) en HUVECs
control y tratadas con el inhibidor de NFAT ciclosporina (CSA), estimuladas con 1 o 20 ng/ml VEGF
durante 2 o 24 horas. Se realizaron los análisis estadísticos con el método de la t de Student para una
muestra. * p<0,05.
Estos datos demuestran el aumento en la expresión de los marcadores de célula
líder bajo altas concentraciones de VEGF. El aumento de la transcripción de RCAN1.4
en un contexto que estimula la transcripción de marcadores de célula líder, sugiere la
participación de la vía de NAFT en la especificación de este fenotipo líder.
65
2 MT1-MMP, nuevo actor en angiogénesis por intususcepción en contexto
inflamatorio: papel del flujo y del óxido nítrico
2.1 Estudio de la angiogénesis por intususcepción en un modelo de colitis
experimental inducida por DSS
2.1.1 Visualización de la vasculatura intestinal y sistemas indirectos de
cuantificación de angiogénesis por intususcepción
Desde la caracterización de la angiogénesis por intususcepción en EII, esta ha sido
estudiada usando como herramienta la técnica de molde de corrosión combinada con
microscopía electrónica de barrido. Esta técnica, si bien ha supuesto un gran avance para
la caracterización morfológica de este tipo de angiogénesis, presenta numerosos
problemas derivados de su complejidad técnica y de la dificultad de analizar un número
elevado de individuos. En este trabajo hemos desarrollado un sistema de cuantificación
de angiogénesis por intususcepción a través de microscopía confocal en tinciones de
tejido de intestino in toto y la reconstrucción informática en 3 dimensiones del plexo
capilar de la mucosa.
Así, en primer lugar se optimizó la técnica de tinción por inmunofluorescencia de
tejido in toto, que nos permitió visualizar y caracterizar la vasculatura intestinal. En la
Figura 15 se puede observar la reconstrucción tridimensional de la vasculatura desde el
plexo mucoso, de arquitectura poligonal en torno a las criptas de Lieberkuhn, a las arterias
y venas de mayor calibre presentes en la submucosa y serosa que irrigan la
microvasculatura intestinal.
66
Figura 15. Visualización de la vasculatura intestinal. A. Imagen representativa de la vasculatura
intestinal de colon de ratón, teñida por inmunofluorescencia in toto para CD31 en vista ortogonal. La
barra de escala equivale a 40 µm B. Imágenes representativas de la vasculatura de la mucosa
(izquierda), submucosa (centro) y serosa (derecha) teñidas por inmunofluorescencia in toto para
CD31. La barra de escala equivale a 60 µm.
Seguidamente, con el objetivo de analizar la angiogénesis por intususcepción en
tinciones de colon in toto se implementó un sistema de cuantificación de los eventos
marcadores de angiogénesis por intususcepción presentes en el plexo mucoso, ya
caracterizados por la técnica de molde de corrosión. El primer evento caracterizado son
los pilares intraluminales, formados por la migración de las células endoteliales a través
del lumen del vaso sanguíneo. Estos pilares tienen un diámetro de entre 1 y 5 µm (Figura
16A izquierda). La formación de los pilares tiene lugar en regiones donde el flujo
sanguíneo genera turbulencias o disminuye su velocidad. En el caso de la vasculatura del
plexo mucoso intestinal se forman en torno a los tricórneres, punto en el que confluyen
tres o más capilares. Los pilares formados en los tricórneres aumentan su tamaño y se
fusionan con otros formando un asa (Figura 16A centro). Finalmente, estas asas crecen
hasta convertirse en dos vasos sanguíneos que discurren en paralelo formando las
denominadas duplicaciones (Figura 16A derecha).
67
Por otro lado, la medida de los ángulos formados entre los vasos de cada tricorner
también puede ser usada para cuantificar de forma indirecta la angiogénesis por
intususcepción 111. La media de estos ángulos en un animal sano es de aproximadamente
120º, y decrece con la duplicación de los vasos por intususcepción (Figura 16B).
Figura 16. Sistema de cuantificación de angiogénesis por intususcepción en la vasculatura del
plexo mucoso intestinal. A. Imágenes de la vasculatura del colon teñida para CD31, representativas
de los principales eventos de angiogénesis por intususcepción, pilar (izquierda), asa (centro) y
duplicación (derecha) en los paneles superiores, y sus reconstrucciones en 3 dimensiones usando el
software Imaris (paneles inferiores). Las barras de escala equivalen a 10 µm. B. Medida de los ángulos
formados entre los vasos de un tricorner de la vasculatura del plexo mucoso intestinal.
2.1.2 Cuantificación de la angiogénesis por intususcepción en colitis inducida por
DSS
La presencia de la angiogénesis por intususcepción en el colon durante el
desarrollo de colitis está bien descrita en la bibliografía 82, pero poco se conoce acerca de
los mecanismos moleculares propios de este tipo de angiogénesis. Durante este trabajo
nosotros hemos propuesto a la metaloproteinasa de matriz MT1-MMP, con un papel bien
descrito durante la angiogénesis por brote capilar, como un nuevo actor en la angiogénesis
68
por intususcepción. Para la caracterización de la función de MT1-MMP durante la
angiogénesis por intususcepción en contexto inflamatorio se decidió utilizar un modelo
animal de colitis inducida por DSS administrado en el agua de bebida ad libitum a una
concentración del 1% m:v durante 7 días. Los animales desarrollan bajo este porcentaje
del químico una colitis moderada que permite visualizar los eventos angiogénicos
presentes en la vasculatura, ocultos tras el daño en tratamientos con porcentajes mayores
del químico.
Para comprobar la inducción de angiogénesis por intususcepción en nuestro
modelo se realizó un primer experimento usando ratones C57BL/6 de genotipo salvaje, y
se analizó la estructura de la vasculatura intestinal, así como el número de eventos
marcadores de angiogénesis por intususcepción mediante inmunofluorescencia de tejido
in toto (Figura 17A). Se observó un aumento estadísticamente significativo de los
eventos marcadores de angiogénesis por intususcepción en los animales tratados con 1%
de DSS durante 7 días (Figura 17B).
Figura 17. La inducción de colitis con 1% DSS causa angiogénesis por intususcepción en el plexo
mucoso de ratones. A. Proyecciones máximas de imágenes de microscopía confocal representativas
de la vasculatura del plexo mucoso, procedentes de ratones de fenotipo salvaje tratados durante 7 días
con 1% DSS y su control basal teñidos para CD31. La barra de escala equivale a 20 µm. B.
Cuantificación de los eventos de angiogénesis por intususcepción de los ratones de A. n=3 por
condición. Se realizó el análisis estadístico con el método de la t de Student. **p< 0.01.
2.2 Análisis del papel de MT1-MMP en angiogénesis por intususcepción
2.2.1 Caracterización de la expresión endotelial de MT1-MMP durante angiogénesis
por intususcepción en el colon de ratón
Resultados previos de nuestro laboratorio demostraron por Western blot el
incremento de la expresión de la proteína MT1-MMP en lisado total de colon, durante el
69
desarrollo de colitis inducida por administración de DSS al 1% m:v en agua de bebida a
ratones de genotipo salvaje.
Figura 18. MT1-MMP se expresa en las células endoteliales de arteriolas y capilares del
colon durante el desarrollo de colitis experimental. Proyecciones máximas de imágenes de
microscopía confocal representativas de la vasculatura intestinal de ratones reporteros MT1-MMP
(Mmp14) lacz/+ tratados durante 3 o 7 días con 1% DSS y su control basal, teñidos para ICAM2 (verde),
β-galactosidasa (rojo) y ERG (blanco). Se muestran en detalle zonas con una arteriola (recuadro
naranja) y zonas del plexo capilar (recuadro verde). Las flechas amarillas indican células endoteliales
positivas para β-galactosidasa. La barra de escala equivale a 50 µm (panel superior) y 25 µm (vistas
en detalle).
Para comprobar si el aumento de la expresión de MT1-MMP durante la progresión
de la enfermedad tiene lugar en células endoteliales, se utilizaron animales MT1-MMP
(Mmp14)lacz/+, reporteros de la actividad del promotor del gen Mmp14 212. Los animales
fueron tratados durante 3 y 7 días con 1% DSS. Se analizó la vasculatura del plexo
mucoso y las arteriolas que lo irrigan por inmunofluorescencia en cortes de parafina y de
tejido in toto. Las muestras se tiñeron con anticuerpos contra β-galactosidasa, para
analizar la actividad del promotor de Mmp14, y los marcadores de células endoteliales
ERG (nuclear) e ICAM2 (membrana). Se decidió en este punto la inclusión de un estadio
70
intermedio de la enfermedad a 3 días para visualizar los eventos tempranos de
intususcepción.
Se observó la continua de MT1-MMP en el endotelio de las arteriolas durante el
tratamiento con DSS. En cuanto a las células endoteliales de los capilares del plexo
mucoso, se observó un aumento del número de células con actividad en el promotor de
MT1-MMP en paralelo a los días de tratamiento (Figura 18). Además, se observó, en
colon de ratones tratados durante 7 días y teñidos por inmunofluorescencia in toto, un
mayor número de células positivas para la expresión de MT1-MMP localizadas en torno
a los tricórneres, donde se inicia la angiogénesis por intususcepción (Figura 19).
Figura 19. MT1-MMP se expresa en células endoteliales cercanas a tricórneres y eventos de
angiogénesis por intususcepción. Proyecciones máximas de una imagen de microscopía confocal
representativas de la vasculatura intestinal de ratones reporteros MT1-MMP (Mmp14) lacz/+ tratados
con 1% DSS durante 7 días teñida para ICAM2 (verde), β-galactosidasa (rojo) y ERG (blanco). Las
flechas blancas indican células endoteliales positivas para β-galactosidasa junto a un evento de
angiogénesis por intususcepción. La barra de escala equivale a 20 µm.
2.2.2 Deleción endotelial de MT1-MMP
Con el objetivo de caracterizar el impacto funcional de la proteasa endotelial
MT1-MMP durante la angiogénesis por intususcepción en un contexto inflamatorio, se
usaron ratones de la línea MT1-MMP (Mmp14)f/f VE-cadherin (Cdh5)-CreERT2/+. En estos
ratones se indujo la deleción de los exones 4 y 5 de Mmp14, flanqueados por dos
secuencias loxP, mediante la inyección intraperitoneal de 4-hidroxitamoxifeno (4-OHT)
durante 5 días consecutivos (MT1iΔEC). Como animales control se usaron ratones de la
misma línea negativos para la expresión de la recombinasa cre (MT1f/f) (Figura 20A).
71
La deleción de los exones 4 y 5 de Mmp14 fue testada mediante la PCR de ADN
genómico extraído del pulmón de los animales MT1iΔEC y MT1f/f (Figura 20B). Además,
se testó la eficiencia de la deleción a nivel de ARNm por qPCR cuantitativa de células
endoteliales de pulmón aisladas mediante citometría de flujo preparativa. Los animales
MT1iΔEC presentaron una expresión del mensajero de MT1-MMP un 88% menor que los
MT1f/f, mientras que no se hallaron diferencias en la expresión del marcador endotelial
Cdh5 (Figura 20C). Por otro lado, se comprobó la deleción de MT1-MMP a nivel de
proteína en la vasculatura del intestino por inmunofluorescencia de cortes de parafina. En
el panel D de la figura 20 se muestran imágenes representativas en las que se observa la
disminución de la proteína MT1-MMP en células endoteliales de ratones MT1iΔEC.
Figura 20. Validación de la deleción endotelial de MT1-MMP. A. Esquema de la obtención de la
línea MT1-MMP(Mmp14)f/f VE-Cadherina(Cdh5)CreERT2/+. B. PCR de ADN genómico de pulmón
mostrando la banda indicativa de la deleción de MT1-MMP en los ratones MT1 iΔEC y ausencia de
banda en los ratones MT1f/f. La posición de los cebadores usados se indica mediante cuadrados rojos
en el esquema del panel A C. qPCR cuantitativa de VE-cadherina (Cdh5) y MT1-MMP (Mmp14) en
células endoteliales de pulmón de ratones MT1f/f y MT1iΔEC aisladas por citometría de flujo
preparativa. D. Proyecciones máximas de imágenes de microscopía confocal representativas de
secciones transversales del colon de ratones MT1f/f y MT1iΔEC teñidas para MT1-MMP (rojo) y CD31
(verde).
72
2.2.3 La deleción endotelial de MT1-MMP disminuye la angiogénesis por
intususcepción durante la colitis experimental inducida por DSS
Con el objetivo de caracterizar el papel MT1-MMP durante la angiogénesis por
intususcepción se trataron animales MT1iΔEC y MT1f/f con 1% DSS en el agua de bebida
ad libitum siguiendo el diseño experimental descrito en el panel A de la Figura 21, y se
analizó el efecto de la deleción endotelial de MT1-MMP sobre la angiogénesis por
intususcepción en el plexo mucoso del colon de estos ratones.
Se cuantificaron los eventos marcadores de angiogénesis por intususcepción en la
vasculatura del colon. Para ello, la región distal del colon de los ratones MT1iΔEC y MT1f/f
fue teñida por inmunofluorescencia in toto para CD31. Se detectó un incremento
estadísticamente significativo de los eventos de intususcepción durante la progresión de
la enfermedad a 3 y 7 días en los ratones MT1f/f, pero no así en los ratones MT1iΔEC.
Además, se observó una diferencia estadísticamente significativa en el porcentaje de
vasos sanguíneos con eventos entre los ratones MT1iΔEC y MT1f/f a 3 y 7 días de
tratamiento (Figura 21B,C).
Por otro lado, se cuantificaron los ángulos formados por los capilares en los
tricórneres del plexo mucoso. Se observó una disminución del ángulo intervascular de los
tricórneres tras 3 días de tratamiento con DSS al 1% en ratones MT1f/f, ausente en los
ratones MT1iΔEC, indicando una menor angiogénesis por intususcepción en estos animales
(Figura 21D). Finalmente, se cuantificó el volumen vascular de los plexos mucosos de
estos animales. Se observó un aumento del volumen vascular en los animales MT1f/f
tratados con DSS durante 7 días, mientras que el volumen vascular en los animales
MT1iΔEC permaneció sin cambios significativos durante el transcurso de la enfermedad
(Figura 21E).
Estos datos señalan a MT1-MMP como un actor necesario para la inducción de la
angiogénesis por intususcepción durante la patogénesis de la colitis.
73
74
Figura 21. La deleción endotelial de MT1-MMP disminuye la angiogénesis por intususcepción
durante la colitis inducida por DSS. A. Diseño experimental de la deleción de MT1-MMP mediante
inyección de 4-Hidroxitamoxifeno (4-OHT) intraperitoneal e inducción de colitis con 1% DSS ad
libitum en el agua de bebida durante 3 o 7 días. B. Proyecciones máximas de imágenes representativas
de la vasculatura del plexo mucoso, procedentes de ratones MT1f/f y MT1iΔEC tratados durante 3 y 7
días con 1% DSS y sus controles basales teñidos con CD31. La barra de escala equivale a 40µm. C.
Cuantificación de los eventos de angiogénesis por intususcepción en ratones MT1f/f y MT1iΔEC
mostrados en B. n=9-15 animales por condición y genotipo de 5 experimentos independientes. D.
Cuantificación de los ángulos formados por los vasos sanguíneos del plexo mucoso en los tricórneres
en ratones MT1f/f y MT1iΔEC tratados durante 3 días con DSS al 1% y sus controles basales. n=6 ratones
por condición y genotipo de 2 experimentos independientes. E. Cuantificación del volumen vascular
en ratones MT1f/f y MT1iΔEC mostrados en B. n=9-11 animales por condición y genotipo de 5
experimentos independientes. En C, D y E se realizó el análisis estadístico con el método de ANOVA
de una cola con post-test de Benjamini-Hochberg. * p<0,05, ** p< 0,01.
2.2.4 Efecto de la deleción endotelial de MT1-MMP sobre la función vascular del
plexo intestinal
Se evaluó la funcionalidad de la vasculatura del plexo mucoso del intestino
mediante un ensayo de perfusión. Animales MT1iΔEC y MT1f/f tratados con 1% DSS
durante 3 y 7 días fueron perfundidos con isolectina b4 (IB4) directamente marcada,
posteriormente se realizaron inmunofluorescencias de tejido del colon in toto contra la
proteína endotelial CD31 para visualizar la vasculatura total (Figura 22A). Se cuantificó
el porcentaje de volumen ocupado por la tinción de isolectina dentro de los vasos
marcados con CD31 mediante el software Imaris.
Los animales sanos de ambos genotipos mostraron una perfusión similar. Sin
embargo, los animales MT1iΔEC tratados con DSS durante 7 días mostraron una perfusión
significativamente mayor que los ratones MT1f/f (Figura 22B).
75
Figura 22. La deleción endotelial de MT1-MMP disminuye la perfusión de la vasculatura
intestinal durante la colitis inducida por DSS. A. Proyecciones máximas de imágenes
representativas de la perfusión de la vasculatura del plexo mucoso de ratones MT1f/f y MT1iΔEC
tratados durante 3 y 7 días con 1% DSS y sus controles basales, teñidos para CD31 (verde) e IB4
(rojo). La barra de escala equivale a 40 µm. B. Cuantificación del porcentaje de disminución del
volumen vascular perfundido por IB4 en plexo mucoso de ratones MT1f/f y MT1iΔEC mostrados en A.
n=8-12 animales por condición y genotipo en 5 experimentos independientes. Se realizó el análisis
estadístico con el método de ANOVA de una cola con post-test de Benjamini-Hochberg. ** p< 0,01.
2.2.5 Efecto de la deleción endotelial de MT1-MMP sobre el reclutamiento de células
inflamatorias
Se ha descrito el reclutamiento de diferentes células inflamatorias a la zona dañada
durante el desarrollo de las primeras etapas de las EII 223. Por esta razón, se analizó el
76
número de células inflamatorias CD11b+ que incluye neutrófilos y monocitos, presentes
en la mucosa intestinal por inmunofluorescencia en cortes transversales de muestras de
colon parafinados, procedentes de ratones sanos y tratados con DSS durante 3 y 7 días,
de genotipos MT1iΔEC y MT1f/f. Se observó que el número de células CD11b+ en la
mucosa del colon aumenta a lo largo de los días de tratamiento con DSS, hasta ser
significativo a día 7 en ratones MT1f/f pero no en MT1iΔEC (Figura 23A,B). Estos datos
demuestran que la ausencia de MT1-MMP endotelial disminuye la presencia de células
inflamatorias en el colon durante el desarrollo de colitis inducida por DSS.
77
Figura 23. La deleción endotelial de MT1-MMP disminuye la presencia de células inflamatorias.
A. Proyecciones máximas de imágenes representativas de cortes transversales de colon de ratones
MT1f/f y MT1iΔEC tratados durante 3 y 7 días con 1% DSS y sus controles basales, teñidos para CD11b
(rojo) y Hoechst (azul). La barra de escala equivale a 50 µm. B. Cuantificación del número de células
positivas para la expresión de CD11b en la mucosa de ratones MT1f/f y MT1iΔEC mostrado en A. n=4-
5 animales por condición y genotipo. Se realizó el análisis estadístico con el método de ANOVA de
una cola con post-test de Benjamini-Hochberg. * p<0,05, **** p<0,0001.
2.2.6 Impacto funcional de la deleción de MT1-MMP endotelial sobre la progresión
clínica de la colitis
Con el objetivo de analizar el efecto de la deleción endotelial de MT1-MMP en la
progresión de la enfermedad, se analizó la integridad estructural del tejido intestinal
mediante tinciones de hematoxilina/eosina en cortes transversales de intestino. Tras 7 días
de tratamiento con 1% DSS los animales MT1iΔEC presentaron una mayor preservación
de la estructura epitelial, se observó una menor área intestinal con criptas epiteliales
dañadas que en los animales MT1f/f (Figura 24A). La técnica de microscopía generación
de segunda armónica nos permitió visualizar la estructura de las fibras de colágeno en
tejido fresco. Los animales sanos de ambos genotipos presentaron un bajo número de
fibras de colágeno organizadas alrededor de las criptas intestinales, formando una
estructura en panel de abeja. Sin embargo, en los ratones MT1f/f se observó un mayor
número de fibras de colágeno tras 3 días de tratamiento con DSS, que aumentaron hasta
día 7, donde se observó la pérdida de la estructura en panel de abeja. Por el contrario, los
ratones MT1iΔEC tratados con DSS mantuvieron la estructura de fibras de colágeno en
torno a las criptas intestinales (Figura 24B).
Por otro lado, se caracterizó el efecto de la deleción de MT1-MMP sobre la
progresión de la enfermedad, cuantificando a diario la pérdida de peso, el sangrado rectal
y la consistencia de las heces, como parámetros característicos de las EIIs. Estos
parámetros fueron integrados en un índice de gravedad de la enfermedad, el índice de
colitis. Se observó un índice significativamente menor en ratones MT1iΔEC a partir del
sexto día de tratamiento con 1% DSS (Figura 24C). Sin embargo no se observaron
cambios significativos en otros marcadores usados como indicadores de la progresión de
la enfermedad, como la disminución del peso corporal o la longitud del colon tras 7 días
de tratamiento con 1% DSS.
78
Nuestros datos indican que la deleción de MT1-MMP endotelial preserva las
estructuras intestinales y mejora la progresión de los animales durante el desarrollo de
colitis inducida por DSS.
Figura 24. La deleción endotelial de MT1-MMP mejora la progresión clínica en colitis inducida
por DSS. A. Imágenes representativas de tinciones de hematoxilina/eosina del colon de ratones MT1f/f
y MT1iΔEC tratados durante 3 y 7 días con DSS al 1% y sus controles basales. La barra de escala
equivale a 50 µm. B. Proyecciones máximas de imágenes representativas de microscopía de
generación de segunda armónica donde se observa el colágeno fibrilar del plexo mucoso de ratones
MT1f/f y MT1iΔEC tratados durante 3 y 7 días con DSS al 1% y sus controles basales. La barra de escala
equivale a 40 µm. C. Evolución diaria del índice de colitis en animales MT1f/f y MT1iΔEC tratados con
1% DSS en el agua de bebida durante 7 días. n=19-24 por condición y genotipo en 4 experimentos
independientes.
79
2.2.7 MT1-MMP como diana terapéutica para el tratamiento de EII
Como se ha descrito, la deleción endotelial profiláctica de la proteína MT1-MMP
produjo una disminución del índice colitis, y otros marcadores de la enfermedad en
animales tratados durante 7 días con 1% DSS. Por esta razón, se decidió analizar el papel
de MT1-MMP como posible diana terapéutica en EII. Para testar esta hipótesis, se
delecionó MT1-MMP en ratones de la línea MT1-MMP (Mmp14)f/f VE-cadherin (Cdh5)-
CreERT2/+ una vez comenzada la inducción de la enfermedad, tras cuatro días de
tratamiento con 1% DSS en el agua de bebida. Se mantuvo a los ratones bajo tratamiento
con DSS durante un total de 15 días, siguiendo el diseño experimental mostrado en el
panel A de la Figura 25.
Durante los 15 días de tratamiento se analizó a diario la pérdida de peso y el índice
de colitis de los animales. Ambos marcadores fueron significativamente menores en los
animales MT1iΔEC a partir del día 12 de tratamiento indicando una mejor progresión de
los animales durante la enfermedad (Figura 25B,C). Además, tras 15 días de tratamiento,
los ratones fueron sacrificados y se cuantificó el número de eventos marcadores de
angiogénesis por intususcepción en el plexo mucoso. No se observaron diferencias
significativas en el número de estos eventos entre ambos genotipos (Figura 25D,E).
80
Figura 25. La deleción endotelial de MT1-MMP durante el desarrollo de colitis mejora la
progresión de los animales enfermos. A. Diseño experimental terapéutico incluyendo 15 días de
tratamiento con 1% DSS y la deleción de MT1-MMP por 5 inyecciones de 4-Hidroxitamoxifeno a
días 4-8 del transcurso de la enfermedad. B. Evolución diaria del peso corporal en animales MT1f/f y
MT1iΔEC durante el desarrollo de la enfermedad. n=12-13 animales por condición y genotipo de 3
experimentos independientes. C. Evolución diaria del índice de colitis en animales MT1f/f y MT1iΔEC
durante 15 días de enfermedad. n=12-13 animales por condición y genotipo de 3 experimentos
independientes. D. Proyecciones máximas de imágenes representativas de la vasculatura del plexo
mucoso, procedentes de ratones MT1f/f y MT1iΔEC tratados durante 15 días con 1% DSS teñidos para
CD31. La barra de escala equivale a 40 µm. E. Cuantificación de los eventos de angiogénesis por
intususcepción en ratones MT1f/f y MT1iΔEC mostrados en D. n=10-11 animales por genotipo. En B y
C se realizó el análisis estadístico con el método de ANOVA de dos colas con post-test de Benjamini-
Hochberg y en E se realizó t de Student. * p<0,05, ** p< 0,01, **** p<0,0001.
81
2.3 Papel de MT1-MMP endotelial durante la transducción de estímulos mecánicos
Se ha estudiado en numerosos trabajos la importancia de las señales mecánicas,
especialmente los cambios del flujo sanguíneo, durante la angiogénesis por
intususcepción 75. Dado que nuestros datos indican que MT1-MMP endotelial es un actor
necesario durante la inducción de angiogénesis por intususcepción y que ha sido
implicada en la respuesta de células endoteliales a flujo durante angiogénesis por brote
capilar 179, decidimos testar la posible función de la proteína MT1-MMP en la recepción
y transducción de estímulos mecánicos. MT1-MMP puede estar implicada tanto
formando parte del sistema de mecanorrecepción como en transmisión de señales
intracelulares y la posterior respuesta celular efectora a los estímulos producidos por los
cambios del flujo sanguíneo.
2.3.1 Efecto de la deleción de MT1-MMP en la recepción y transducción de señales
de flujo in vitro
En primer lugar, se analizó in vitro la implicación de MT1-MMP en la recepción
de señales producidas por cambios en el flujo sanguíneo. Para ello se utilizaron células
HUVECs tratadas con un ARN corto de interferencia (ARNi) para silenciar la expresión
de MT1-MMP o con un ARNi control (Ctrl-ARNi). Se testaron dos ARNi (MT1-ARNi#1
y MT1-ARNi#2) para el silenciamiento de la proteína MT1-MMP en células humanas, y
se analizó la eficiencia de ambos por qPCR a nivel de ARNm y Western blot a nivel de
proteína. El MT1-ARNi#2 mostró una eficiencia de deleción mayor en ambos análisis
por lo que decidimos realizar los experimentos de respuesta a flujo con este ANRi
(Figura 26).
82
Figura 26. Eficiencia del silenciamiento de MT1-MMP por ARNi en HUVECs. A. Western blot
representativo del silenciamiento de MT1-MMP en HUVECs por dos ARNi MT1-ARNi#1 y MT1-
ARNi#2 y su cuantificación. n=5. B. qPCR cuantitativa de la eficiencia de interferencia de MT1-MMP
por ambos ARNi en HUVECs. n=4. Se realizó el análisis estadístico con el método de la t de Student
para una muestra. *** p< 0,001, **** p<0,0001.
Las HUVECs interferidas para la expresión de MT1-MMP y control fueron
sometidas a un flujo laminar de 12 dynas/cm2 durante 12 horas usando el sistema Bioflux.
Se analizaron patrones de respuesta a flujo de células endoteliales como polarización
celular. Para esto, se usó la posición relativa del aparato de Golgi con respecto al núcleo
celular, pues se ha descrito que durante la migración este orgánulo se posiciona en la
región anterior al núcleo 224. Así, se tiñó por inmunofluorescencia el aparato de Golgi
usando el marcador GLG1 y se midió la dirección y sentido del vector que toma su origen
en el centro del núcleo y su extremo en el aparato de Golgi (Figura 27A). Las células
fueron clasificadas como polarizadas a favor de flujo, en contra o sin dirección, según lo
indicado en el esquema del panel B de la figura 27. No se obtuvieron diferencias
significativas en el porcentaje de células orientadas en cada una de las direcciones
(Figura 27C).
83
Figura 27. La ausencia de MT1-MMP en células endoteliales in vitro no altera su polarización en
respuesta a flujo laminar. A. Proyecciones máximas de imágenes representativas de HUVECs
control y silenciadas para la expresión de MT1-MMP sometidas a flujo laminar (12dynas/cm2) durante
12 horas, teñidas para Hoechst (azul), MT1-MMP (blanco) y GLG1 (rojo). La barra de escala equivale
a 20µm B. Esquema de la orientación mayoritaria del aparato de Golgi respecto la posición del núcleo
C. Cuantificación de la orientación del Aparato de Golgi con respecto del núcleo de células interferidas
para MT1-MMP y control, siguiendo el esquema de B para clasificarlas en contra, a favor del sentido
del flujo o sin dirección. n=3 experimentos de dos viales de HUVECs independientes. Se realizó el
análisis estadístico con el método de la ANOVA de dos colas con post-test de Benjamini-Hochberg.
2.3.2 Efecto de la deleción de MT1-MMP en la recepción y transducción de señales
de flujo in vivo
Seguidamente, se decidió testar el efecto de la deleción de MT1-MMP sobre la
recepción de los estímulos mecánicos en células endoteliales in vivo, usando como
modelo las células endoteliales de la aorta, que presenta flujo turbulento en la curvatura
menor del cayado aórtico y flujo laminar en la aorta torácica descendente (Figura 28A).
Primero, se analizó la expresión de MT1-MMP en las células endoteliales de estas
dos regiones de la aorta con diferentes flujos. Se utilizó la línea reportera de la actividad
del promotor de Mmp14 (descrito anteriormente). Se cuantificó por inmunofluorescencia
de tejido in toto el número de células con actividad del promotor de Mmp14 en ambas
zonas de la aorta, obteniendo una media de 35.25% células positivas en la zona sometida
84
a flujo turbulento y un 22.85% en aquellas zonas bajo flujo laminar (Figura 28B). Al
realizar la tinción de inmunofluorescencia para la proteína MT1-MMP, ésta apareció
expresada en la mayoría de las células, inclusive en aquellas sin actividad del promotor.
Estos resultados podrían indicar la activación fluctuante de la expresión de MT1-MMP
(Figura 28C).
Figura 28. Efecto del flujo turbulento y laminar sobre la expresión de MT1-MMP in vivo. A.
Esquema de la aorta, indicando el flujo turbulento en la curvatura menor y bifurcaciones y laminar en
la aorta torácica descendente. B. Proyecciones máximas de imágenes representativas de la monocapa
endotelial en la curvatura menor y la región torácica descendente de aortas de ratones MT1-
MMP(Mmp14)lacz/+ teñidas in toto para CD31 (blanco) y β-galactosidasa (rojo). La barra de escala
equivale a 20 µm. C. Cuantificación del porcentaje de células positivas para β-galactosidasa en las
diferentes regiones de la aorta de B. n=5 ratones de 2 experimentos independientes. Se realizó el
análisis estadístico con el método de la t de Student pareada. D. Proyección máxima de una imagen
representativa de la capa endotelial de la aorta torácica descendente de un ratón MT1-
MMP(Mmp14)lacz/+ representativo teñida in toto para Hoechst (azul), β-galactosidasa (rojo), MT1-
MMP (verde) y CD31 (blanco).
85
A continuación, se decidió analizar el efecto de la deleción de MT1-MMP
endotelial bajo flujo laminar. Para ello se analizaron por inmunofluorescencia de tejido
in toto las aortas torácicas descendentes procedentes de animales de MT1iΔEC y MT1f/f,
tras dos semanas de la deleción de MT1-MMP por la inyección intraperitoneal de 4-
hidroxitamoxifeno durante 5 días (Figura 29A). Se comprobó por tinción para MT1-
MMP la eficacia de la deleción en este contexto (Figura 29B), y se analizó la
polarización, tamaño y elongación celular como marcadores de respuestas endoteliales a
flujo laminar.
Figura 29. Eficiencia de la deleción de MT1-MMP en el endotelio aórtico. A. Esquema del diseño
experimental de la deleción de MT1-MMP en el endotelio aórtico por la inyección de 4-
hidroxitamoxifeno (4-OHT). B. Proyecciones máximas de imágenes representativas de la monocapa
endotelial de aortas torácicas descendientes procedentes de ratones MT1f/f y MT1iΔEC dos semanas
después de la deleción de MT1-MMP, teñidas para MT1-MMP (rojo) y CD31 (blanco). La barra de
escala equivale a 20 µm.
Para el análisis de la morfología celular en respuesta a flujo, se cuantificó el área
y el factor elíptico de las células endoteliales de las aortas de animales MT1iΔEC y MT1f/f,
teñidas para el marcador de uniones endoteliales CD31 (Figura 30A). Si bien no se
86
obtuvieron diferencias significativas en el área celular (Figura 30B), sí fueron observadas
en la elongación celular. El factor elíptico (calculado como eje celular menor partido eje
mayor) de las células de la aorta de ratones MT1f/f era significativamente menor,
indicando que estas células eran más alargadas que las procedentes de la aorta de ratones
MT1iΔEC (Figura 30C).
Figura 30. La deleción de MT1-MMP endotelial afecta a la elongación de las células endoteliales
aórticas sometidas a flujo laminar. A. Proyecciones máximas de imágenes representativas de la
monocapa endotelial de aortas torácicas descendientes procedentes de ratones MT1f/f y MT1iΔEC 2
semanas después de la deleción de MT1-MMP, teñidas para CD31 (blanco). La barra de escala
equivale a 50 µm. B. C. Cuantificaciones del factor elíptico (B) y el área (C) de las células endoteliales
de las aortas mostradas en A. n=7 animales por genotipo. Se realizó el análisis estadístico con el
método de la t de Student. ** p< 0,01.
Finalmente, se analizó la polaridad celular utilizando el método ya descrito
anteriormente para células in vitro. Obtuvimos histogramas radiales de la dirección de
polarización celular similares en ambos genotipos (Figura 31A). Además, se clasificaron
las células en tres posibles orientaciones, en contra, a favor de flujo o sin dirección, sin
hallar ninguna diferencia significativa en cuanto a los porcentajes de células en cada una
de estas direcciones (Figura 31B).
87
En conclusión, nuestros datos indican que MT1-MMP está implicada en la
respuesta durante la adaptación celular a flujo sanguíneo regulando la elongación celular
pero no la polarización.
Figura 31. La deleción de MT1-MMP endotelial no afecta a la polarización de células endoteliales
aórticas sometidas a flujo laminar. A. Proyecciones máximas de imágenes representativas de la capa
endotelial de aortas torácicas descendientes procedentes de ratones MT1f/f y MT1iΔEC dos semanas
después de la deleción de MT1-MMP, teñidas con CD31 (verde), Hoechst (blanco) y GLG1 (ROJO).
La barra de escala equivale a 20 µm. B. Histogramas radiales de los ángulos de orientación relativa
del aparato de Golgi con respecto del núcleo celular en A. C. Cuantificación de la orientación del
Aparato de Golgi con respecto del núcleo en A, clasificadas en contra, a favor de flujo o sin dirección
según el esquema de la figura 12B. n=5 ratones por genotipo de 2 experimentos independientes. Se
realizó el análisis estadístico con el método de ANOVA de dos colas con post-test de Benjamini-
Hochberg.
2.4 Efecto de la deleción endotelial de MT1-MMP sobre la vasodilatación
Está bien caracterizada la importancia de la vasodilatación causada por el aumento
del flujo sanguíneo durante la angiogénesis por intususcepción, por ello decidimos
analizar la posible función de la proteína MT1-MMP en vasodilatación, bien por formar
parte de la maquinaria de transducción de señales mecánicas como el flujo, o bien por ser
parte efectora en la propia dilatación vascular.
88
2.4.1 Efecto de la deleción endotelial de MT1-MMP sobre la vasodilatación en
músculo cremáster
Con el objetivo de analizar el efecto de la deleción de MT1-MMP sobre la
vasodilatación in vivo se usó como modelo el músculo cremáster de ratones MT1iΔEC y
MT1f/f estimulados con un potente vasodilatador, acetilcolina (ACh). La acetilcolina
aumenta el diámetro de los vasos sanguíneos actuando, al igual que el flujo, a través de
la producción de óxido nítrico. Este modelo nos permitió analizar por una parte la
vasodilatación de las arteriolas in vivo usando microscopía intravital, y por otra la
vasodilatación del plexo capilar por tinción de tejido in toto con el marcador endotelial
CD31.
Se midió el diámetro de las arteriolas antes de la estimulación con acetilcolina vía
intravenosa y en el punto máximo de vasodilatación (Figura 32A). No se observó
diferencia significativa en los diámetros iniciales de las arteriolas de los ratones MT1iΔEC
y MT1f/f (Figura 32B). Sin embargo, tras la administración de acetilcolina se observó
una vasodilatación significativamente mayor en las arteriolas de los ratones MT1f/f que
en los MT1iΔEC, los cuales presentaron una escasa respuesta a la estimulación con
acetilcolina, indicando un posible defecto en la producción de óxido nítrico o en proceso
efector de la vasodilatación (Figura 32C) (Videos 3 y 4).
89
Figura 32. La deleción endotelial de MT1-MMP disminuye la vasodilatación de arteriolas in vivo.
A. Imágenes representativas de microscopía intravital de la vasculatura del músculo cremáster de
ratones MT1f/f y MT1iΔEC previas y tras el tratamiento con acetilcolina (ACh). A indica arteriola y V
indica vénula. Las flechas amarillas indican el diámetro arteriolar. La barra de escala equivale a 30
µm. B. Cuantificación del diámetro de las arteriolas del músculo cremáster mostradas en A, antes del
tratamiento con ACh. C. Cuantificación del incremento del diámetro de las arteriolas del músculo
cremáster mostradas en A. n=5-6 ratones por genotipo. Se realizó el análisis estadístico con el método
de la t de Student. ** p< 0,01.
Por otro lado, se cuantificó la vasodilatación del plexo capilar del músculo
cremáster. Se tiñeron por inmunofluorescencia de tejido in toto los músculos cremáster
de ratones de ambos genotipos, basales y tratados con acetilcolina durante 15 minutos. Se
observó una vasodilatación significativamente mayor en los capilares de ratones MT1f/f
tratados con acetilcolina que en aquellos MT1iΔEC con el mismo tratamiento (Figura
33A,B).
Para comprobar si MT1-MMP está implicada en la producción de óxido nítrico o
es parte de la maquinaria efectora de la vasodilatación, se decidió analizar la
vasodilatación del plexo capilar por la administración del donador de óxido nítrico,
DEANO. Se inyectó DEANO vía intravenosa 10 minutos después de estimulación con
acetilcolina, y se diseccionaron los músculos cremáster tras 15 minutos. Los músculos
fueron teñidos siguiendo el mismo protocolo que los animales tratados con acetilcolina y
se observó un aumento estadísticamente significativo en la vasodilatación de ambos
genotipos (Figura 33A,B).
Estos resultados indicaron que MT1-MMP es requerida para la vasodilatación de
capilares y arteriolas, implicándola en el proceso de producción de óxido nítrico.
90
Figura 33. La deleción endotelial de MT1-MMP disminuye la vasodilatación de capilares
dependiente de óxido nítrico in vivo. A. Proyecciones máximas de imágenes representativas de la
vasculatura capilar de músculos cremásteres procedentes de ratones MT1f/f y MT1iΔEC basales y
tratados con el vasodilatador ACh durante 15 minutos o con ACh (10 minutos) y el donador de NO,
DEANO (15 minutos) teñidos por inmunofluorescencia in toto para CD31 (blanco). B. Cuantificación
del diámetro de los capilares del músculo cremáster mostrados en A. La barra de escala equivale a 25
µm. n=5-8 ratones por condición y genotipo en 4 experimentos independientes. Se realizó el análisis
estadístico con el método de la ANOVA de una cola con post-test de Benjamini-Hochberg. * p<0,05,
** p< 0,01, *** p< 0,001, **** p<0,0001.
2.4.2 Función de MT1-MMP durante la producción de óxido nítrico in vitro
Con el objetivo de confirmar el efecto de la deleción de MT1-MMP sobre la
producción de óxido nítrico, se analizó su producción en células endoteliales de aorta de
ratón (MAEC) procedentes de animales MT1iΔEC y MT1f/f, usando la sonda fluorescente
DAF-FM. Se observó a nivel de célula única la disminución de la producción de óxido
nítrico en MAECs procedentes de ratones MT1iΔEC respecto a las procedentes de animales
MT1f/f (Figura 34A). Se testó usando el mismo método la producción de óxido nítrico en
91
HUVECs interferidas para la expresión de MT1-MMP mediante el MT1-ARNi#2 o Ctrl-
ARNi. Al igual que en el caso de las MAEC, las HUVECs silenciadas para la expresión
de MT1-MMP mostraron una menor producción de óxido nítrico que aquellas interferidas
con el ARNi control (Figura 34B).
Decidimos continuar usando el modelo de HUVECs interferidas para la expresión
de MT1-MMP para el estudio de la participación de MT1-MMP en la producción de
óxido nítrico en células endoteliales. Se analizaron por Western blot la expresión de MT1-
MMP y eNOS, principal proteína productora de óxido nítrico en células endoteliales. Se
observó una disminución de la expresión de eNOS a nivel de proteína en las células
interferidas para MT1-MMP con dos ARNi diferentes (Figura 34C). Además, se
comprobó la bajada de expresión de eNOS (NOS3) a nivel de ARNm por qPCR, en las
células tratadas con ambos ARNi.
Estos datos en conjunto indican que la deleción de la expresión de MT1-MMP en
células endoteliales disminuye la producción de óxido nítrico a través de la menor
expresión de eNOS.
92
Figura 34. La deleción de MT1-MMP en células endoteliales disminuye la producción de óxido
nítrico y la expresión de eNOS. A. Imágenes representativas de microscopía de MAECs teñidas para
la producción de óxido nítrico por la sonda fluorescente DAF-FM (pseudocolor, panel izquierdo) y la
cuantificación de su intensidad de fluorescencia media (IFM) a nivel de célula única (panel derecho).
n=263-266 células en 3 experimentos independientes. La barra de escala equivale a 25 µm B. Imágenes
representativas de microscopía de HUVECs control (Ctrl-ARNi) y silenciadas para MT1-MMP (MT1-
ARNi#2) teñidas para la producción de óxido nítrico por la sonda fluorescente DAF-FM (pseudocolor,
panel izquierdo) y la cuantificación de su IFM a nivel de célula única (panel derecho). n= 637-879 en
3 experimentos independientes. La barra de escala equivale a 50 µm C. Western blot representativo
de la expresión de la proteína eNOS en HUVECs control (Ctrl-ARNi) y silenciadas para MT1-MMP
(MT1-ARNi#1 y MT1-ARNi#2) y su cuantificación. n=5. D. qPCR cuantitativa de la expresión del
ARNm de NOS3 (eNOS) en HUVECs control (Ctrl-ARNi) y silenciadas para MT1-MMP (MT1-
ARNi#1 y MT1-ARNi#2). n=4. En A y B se realizó el análisis estadístico con el método de Mann-
Whitney, en C y D se realizó con el método de la t de Student para una muestra. *** p< 0,001, ****
p<0,0001.
93
2.5 Función de los dominios catalítico y citoplasmático de MT1-MMP durante la
angiogénesis por intususcepción y la producción de óxido nítrico
2.5.1 Función de los dominios catalítico y citoplasmático durante la angiogénesis por
intususcepción in vivo
Como ya se ha descrito en la introducción, la región extracelular de MT1-MMP
ha sido caracterizada por su poder proteolítico con numerosas dianas entre proteínas de
la matriz extracelular y proteínas de membrana, mientras que la región citosólica de MT1-
MMP, especialmente la tirosina 573, ha sido implicada en procesos de señalización
celular 148,170.
Con el fin de determinar qué dominio de la proteína MT1-MMP está implicado
en el proceso de angiogénesis por intususcepción y por tanto en la progresión de la colitis
se utilizaron tres construcciones lentivirales que expresan bajo el promotor SFFV
distintas formas de MT1-MMP: la secuencia completa de la proteína MT1-MMP (SC),
con una mutación en la región extracelular de la proteína que impide su función catalítica
(E240A), o con una mutación en la región citosólica (Y573F), la tirosina implicada en las
diferentes rutas de señalización intracelular 167. Además, bajo control de este mismo
promotor se expresa la proteína GFP, que fue usada como control de la eficiencia de
transducción (Figura 35A).
Se inyectaron 200 µl de los lentivirus descritos a una concentración de 1x107
colonias lentivirales por ml a ratones MT1iΔEC a través de la vena yugular. Tres días
después de la inyección de los lentivirus se inició el protocolo de deleción endotelial de
MT1-MMP a través de la inyección intraperitoneal diaria de 4-hidroxitamoxifeno durante
5 días, y se comenzó la inducción de colitis con la administración de 1% DSS en el agua
de bebida según el esquema mostrado en el panel B de la figura 35. Además, ratones
MT1iΔEC y MT1f/f fueron transducidos siguiendo el mismo protocolo con lentivirus
control (Mock) sin ninguna de las secuencias de MT1-MMP, como control de que la
transducción lentiviral no modificaba la angiogénesis por intususcepción o la progresión
de la enfermedad.
Tras 3 días de exposición al químico, los animales fueron sacrificados y se
realizaron tinciones por inmunofluorescencia de tejido in toto del colon. Se comprobó la
eficiencia de transducción por Western blot de GFP de lisado total de un fragmento de
94
intestino, y aquellos animales que no expresaban GFP en el intestino fueron excluidos de
los análisis finales (Figura 35C).
La cuantificación de los eventos marcadores de angiogénesis por intususcepción
en la vasculatura del plexo mucoso de ratones transducidos con los lentivirus de las tres
secuencias de MT1-MMP, mostró un aumento de la angiogénesis por intususcepción en
los ratones transducidos con la secuencia completa de MT1-MMP y la mutación
citosólica Y573F. Sin embargo, aquellos ratones transducidos con el lentivirus de la
mutación E240A, inhibidora de la actividad catalítica, no mostraron un aumento
significativo de los marcadores de angiogénesis por intususcepción (Figura 36A,B).
Figura 35. Estrategia de transducción lentiviral in
vivo. A. Esquema de la construcción lentiviral usada
para la expresión de MT1-MMP y la proteína verde
fluorescente (GFP) bajo el promotor SFFV. Se expresó
la secuencia completa MT1-MMP (SC), y sus
mutaciones E240A (catalítica) e Y573F (citosólico). B.
Diseño experimental para la transducción lentiviral de
animales MT1f/f y MT1iΔEC y la inducción de colitis con
1% DSS ad libitum en el agua de bebida durante 3 días.
C. Western blot representativo de la eficiencia de
transducción de los lentivirus mostrados en A en
extractos de colon de ratones MT1iΔE.
95
96
Figura 36. La función catalítica de la proteína MT1-MMP es esencial para la producción de
angiogénesis por intususcepción. A. Proyecciones máximas de imágenes representativas de la
vasculatura del plexo mucoso, procedentes de ratones MT1f/f y MT1iΔEC transducidos con el virus
control (Mock) tratados durante 3 días con 1% DSS y sus controles basales teñidos con CD31 (blanco).
La barra de escala equivale a 40 µm. B. Proyecciones máximas de imágenes representativas de la
vasculatura del plexo mucoso, procedentes de ratones MT1iΔEC tratados durante 3 días con 1% DSS y
transducidos con lentivirus para la expresión de MT1-MMP total, MT1-MMP E240A o MT1-MMP
Y573F. C. Cuantificación de los eventos de angiogénesis por intususcepción en ratones MT1f/f y
MT1iΔEC mostrados en A y B. n=5-8 ratones por condición y genotipo en 2 experimentos
independientes. Se realizó el análisis estadístico con el método de ANOVA de una cola con post-test
de Benjamini-Hochberg. * p<0,05, ** p< 0,01, *** p< 0,001.
2.5.2 Función del dominio catalítico de MT1-MMP durante la producción de óxido
nítrico in vitro.
A continuación, se decidió analizar la implicación del dominio catalítico de MT1-
MMP en la producción directa de óxido nítrico en células in vitro. Con este objetivo se
analizó la producción de óxido nítrico en HUVECs tratadas con el anticuerpo inhibidor
de la actividad de MT1-MMP, LEM-2/15 171. Como control, se usaron células HUVECs
interferidas para la expresión de MT1-MMP mediante el MT1-ARNi#2 previamente
testado. Se observó una disminución significativa de la producción de óxido nítrico en las
HUVECs tratadas con el anticuerpo inhibidor respecto a las células control y a aquellas
células tratadas con un anticuerpo control del mismo isotipo. Mientras que el anticuerpo
LEM-2/15 no tuvo ningún efecto sobre la producción de óxido nítrico de las células
interferidas para la expresión de MT1-MMP (Figura 37).
Figura 37. La función catalítica de MT1-MMP es requerida para la producción de óxido nítrico
en células endoteliales in vitro. Cuantificación de la producción de óxido nítrico, a través de la IFM
de la sonda DAF-FM a nivel de célula única, en HUVECs control y silenciadas para MT1-MMP
tratadas con el anticuerpo inhibidor de la actividad catalítica de MT1-MMP, LEM-2/15 o su IgG1
control (IgG). n=128-360 células por condición en 3 experimentos independientes. Se realizó el
análisis estadístico con el método de Mann-Whitney. **** p<0,0001. Los * representan diferencias
significativas con el control no tratado. Las # representan diferencias significativas con el control de
isotipo.
97
Nuestros resultados demuestran que la actividad proteolítica de MT1-MMP
endotelial es requerida para la inducción de angiogénesis por intususcepción durante la
colitis inducida por DSS in vivo y para la producción de óxido nítrico por células
endoteliales in vitro.
2.6 Caracterización de trombospondina 1 como sustrato de MT1-MMP
A la luz de estos resultados, decidimos analizar la implicación de los sustratos de
MT1-MMP en la producción de óxido nítrico y angiogénesis por intususcepción. La
proteína trombospondina 1 (TSP1) ha sido descrita previamente como sustrato de MT1-
MMP e implicada en la regulación de la producción de óxido nítrico en diferentes
contextos a través de la unión con sus receptores de membrana. Además, ha sido
propuesta como posible regulador de la angiogénesis por intususcepción. Datos previos
de nuestro laboratorio mostraron a MT1-MMP implicada en el corte de la proteína TSP1
en células endoteliales estimuladas con TNFα 148, contexto inflamatorio comparable al de
las EII. Por todo ello, se decidió estudiar la función de TSP1 como sustrato de MT1-MMP
durante la producción de óxido nítrico y angiogénesis por intususcepción.
TSP1 es una proteína capaz de formar trímeros presente en la matriz extracelular,
con efectos pleiotrópicos sobre la angiogénesis, si bien es habitualmente considerada una
molécula anti-angiogénica. Se ha descrito TSP1 como ligando de diferentes receptores de
membrana expresados en células endoteliales como CD36 y CD47/IAP e integrinas como
β1 y αvβ3 225 (Figura 38A).
2.6.1 Modelado in silico del corte de TSP1 por MT1-MMP
Aunque TSP1 ha sido reconocida anteriormente como sustrato de MT1-MMP, su
sitio de corte continúa siendo desconocido. Con el objetivo de identificar los posibles
sitios de corte para MT1-MMP en la proteína TSP1 se utilizó el software online
Cleavpredict (http://cleavpredict.sanfordburnham.org). Las predicciones de este software
fueron analizadas por modelado de proteína in silico hallando tan solo dos posiciones
probables para el corte de TSP1 por parte de MT1-MMP, H441W y/o P467Q. Ambas
posiciones, muy cercanas entre ellas, obtuvieron además una puntuación para P1’P1 de
4/1 y 8/6 respectivamente de acuerdo con la matriz proteolítica para MT1-MMP en la
base de datos online MEROPS (Figura 38B). Las posibles secuencias de corte de TSP1
aparecen resumidas en la tabla 7.
98
P1
posici
ón
Residuos
PWM
Puntu
ación
Sec Struct pred Dominio
Transmemb N-masa C-masa
6 GLAWG-
LGVLF 3.71 ____HHHEEE
OOOOOO
OOOO 633.28 128683.54
11 LGVLF-
LMHVC 5.27 HHEEEEEEE_
OOOOOO
OOOO 1162.60 128154.22
93 LLLAS-
LRQMK 6.64 HHHHHHHHHH
OOOOOO
OOOO 9933.05 119383.77
193 RDLAS-
IARLR 1.17 HHHHHHHHHH
OOOOOO
OOOO 21025.78 108291.04
225 TTPED-
ILRNK 3.00 _____EE___
OOOOOO
OOOO 24538.63 104778.19
253 GSSPA-
IRTNY 0.54 _____EEEE_
OOOOOO
OOOO 27366.04 101950.78
286 LELRG-
LRTIV 7.90 HHHH___EEE
OOOOOO
OOOO 31010.84 98305.98
440 GGWSH-
WSPWS 1.33 __________
OOOOOO
OOOO 48377.51 80939.31
467 NSPSP-
QMNGK 1.11 __________
OOOOOO
OOOO 51266.82 78050.00
578 ACPPG-
YSGNG 0.89 __________
OOOOOO
OOOO 62958.91 66357.91
668 NYLGH-
YSDPM 1.56 __________
OOOOOO
OOOO 72791.09 56525.73
1024 DDYAG-
FVFGY 0.75 ____EEEEEE
OOOOOO
OOOO 112343.48 16973.34
1060 QGYSG-
LSVKV 4.42 _____EEEEE
OOOOOO
OOOO 116595.46 12721.36
1075 GPGEH-
LRNAL 1.85 _____EEEEE
OOOOOO
OOOO 118101.23 11215.59
1092 GQVRT-
LWHDP 1.76 _EEEEEE___
OOOOOO
OOOO 120003.22 9313.60
1099 HDPRH-
IGWKD 5.66 _________H
OOOOOO
OOOO 120944.68 8372.14
Tabla 7. Lista de potenciales secuencias de corte de MT1-MMP en TSP1. Se muestran las
secuencias de TSP1 acompañadas de su puntuación de corte por la acción de MT1-MMP.
99
Figura 38. Caracterización in silico del corte de TSP1 por MT1-MMP. A. Esquema de la estructura
de la proteína TSP1 y sus secuencias de unión a receptores de membrana presentes en células
endoteliales. La flecha roja indica los posibles sitios de corte por MT1-MMP. B. Modelado in silico
del corte de TSP1 por parte de MT1-MMP en las posiciones H441W y P477Q. En azul y naranja se
muestran los monómeros de MT1-MMP, con el sitio catalítico en amarillo, en verde se muestra TSP1,
con la posición de corte en rojo.
2.6.2 Caracterización del corte de TSP1 por MT1-MMP in vivo durante colitis
inducida por DSS
Con el objetivo de analizar el corte de TSP1 por parte de MT1-MMP in vivo, se
analizó la acumulación de TPS1 en torno a los vasos sanguíneos en ratones MT1iΔEC y
MT1f/f tratados durante 3 días con 1% DSS. Se tiñeron cortes trasversales de colon
procedentes de ratones MT1iΔEC y MT1f/f por inmunofluorescencia usando un anticuerpo
que reconoce específicamente la región amino terminal, con respecto a las probables
posiciones catalíticas de MT1-MMP, de la proteína TSP1 (Figura 38A). Se ha descrito
en el caso del corte de TSP1 por ADAMTS1 que este dominio amino terminal de TSP1
es degradado en el tejido mientras la región carboxilo terminal de la proteína es liberada
226. Se observó una acumulación significativamente mayor de TSP1 en torno a los vasos
sanguíneos del colon de ratones MT1iΔEC con respecto a los ratones control MT1f/f
(Figura 39 A,B).
100
Figura 39. La deleción endotelial de MT1-MMP induce la acumulación perivascular de TSP1
durante la colitis. A. Proyecciones máximas de imágenes representativas de microscopía confocal de
cortes transversales de intestino procedentes de ratones MT1f/f y MT1iΔEC tratados durante 3 días con
1% DSS, teñidos para CD31 (verde) y TSP1 (rojo). Imagen de la pared intestinal (paneles izquierdos)
y vista en detalle de un vaso sanguíneo (paneles centrales y derechos). La barra de escala indica 100
µm en la imagen general y 10 µm en el detalle. B. Cuantificación de la Intensidad de fluorescencia
media (IFM) de TSP1 alrededor de los vasos sanguíneo en A. n=4 individuos por genotipo. Se realizó
el análisis estadístico con el método de la t de Student. * p<0,05.
2.6.3 Caracterización in vitro del corte de TSP1 por MT1-MMP
Resultados previos del laboratorio demostraron la acumulación de TSP1 en
células endoteliales silenciadas para la expresión de MT1-MMP estimuladas con TNFα
148. Se analizó este evento bajo las condiciones en que hemos observado la bajada en la
producción de óxido nítrico. Así, cultivamos HUVECs silenciadas para la expresión de
MT1-MMP y control durante 36 horas en el medio comercial EGM2 y se realizaron
tinciones de inmunoflorescencia para TSP1. Se observó una acumulación de TPS1 en las
células silenciadas para MT1-MMP con respecto a las células control (Figura 40).
101
En resumen, nuestros resultados combinando experimentos in vivo, in vitro e in
silico sugieren el corte proteolítico de TSP1 por parte de MT1-MMP.
Figura 40. El silenciamiento de la expresión de MT1-MMP produce una acumulación de TSP1
en HUVECs in vitro. Proyecciones máximas de imágenes representativas de HUVECs control (Ctrl-
ARNi) y silenciadas para MT1-MMP (MT1-ARNi#2) cultivadas durante 24 horas y teñidas para MT1-
MMP (blanco), TSP1 (rojo), faloidina (verde) y Hoechst (azul).
2.7 Función de MT1-MMP/TSP1 durante la producción de óxido nítrico in vitro
1.7.1 Efecto de TSP1 sobre la producción de óxido nítrico in vitro
Analizamos el efecto de TSP1 sobre la producción de óxido nítrico en presencia
o ausencia de MT1-MMP. Se cuantificó la producción de óxido nítrico en HUVECs
control e interferidas para la expresión de MT1-MMP cultivadas sobre una matriz de
gelatina enriquecida con TSP1 (200 ng/ml). Observamos un fuerte aumento en la
producción de óxido nítrico en las HUVECs control. Las células interferidas para la
expresión de MT1-MMMP también aumentaron significativamente la producción de
óxido nítrico, aunque en menor proporción que las células control (Figura 41A). Estos
datos indican que TSP1 puede incrementar la producción de óxido nítrico en células que
expresan MT1-MMP.
102
2.7.2 Caracterización de la función de los receptores de TSP1 durante la producción
de óxido nítrico
Posteriormente se analizó la función de los receptores de TSP1 en la producción
de óxido nítrico. Se ha descrito la interacción de TSP1 con receptores capaces de
modificar la vía de producción de óxido nítrico, como CD36, CD47/IAP y la integrina
αvβ3 250,251. La participación de CD36 fue descartada debido a que la secuencia de unión
a este receptor en TSP1 está localizada cercana al corte de MT1-MMP, quedando a priori
inhabilitada tras el corte. Por ello se decidió estudiar el papel de CD47/IAP y la integrina
αvβ3.
Para abordar este objetivo se utilizaron HUVECs interferidas para la expresión de
MT1-MMP con el MT1-ARNi#2 o el Ctrl-ARNi y se analizó la producción de óxido
nítrico a nivel de célula única bajo el efecto de diferentes inhibidores mediante la sonda
fluorescente de óxido nítrico DAF-FM. En primer lugar, se inhibió la unión de TSP1 a
CD47 o αvβ3 con dos anticuerpos bloqueantes de dicha unión, y se utilizó la IgG del
mismo isotipo como control. Se observó una bajada estadísticamente significativa de la
producción de óxido nítrico en HUVECs control con ambos tratamientos. Por el contrario,
la producción de óxido nítrico en células interferidas para MT1-MMP permaneció
constante tras el tratamiento con ambos anticuerpos (Figura 42A).
Ante estos resultados se decidió continuar caracterizando la función de la integrina
αvβ3 en la producción de óxido nítrico. Para ello, se bloqueó la unión de TSP1 a la
integrina con los péptidos RGDS y cilengitide, (basado en el péptido cíclico cyclo-
RGDfV) que se unen a αvβ3 desplazando la unión de la integrina con sus sustratos. Estos
dos péptidos han sido descritos como inhibidores de la acción de la integrina αvβ3 durante
Figura 41. TSP1 incrementa la producción de
óxido nítrico en células endoteliales in vitro. A.
Cuantificación de la producción de óxido nítrico, a
través de la IFM de la sonda DAF-FM a nivel de
célula única, en HUVECs control (Ctrl-ARNi) y
silenciadas para MT1-MMP (MT1-ARNi#2)
cultivadas sobre gelatina suplementada con TSP1
(200 ng/ml) o únicamente sobre gelatina. n=78-
184 células por condición de 3 experimentos
independientes. Se realizó el análisis estadístico
con el método de Mann-Whitney. ** p<0,01, ****
p<0,0001.
103
la angiogénesis a elevadas concentraciones pero también como activadores a bajas, por
ello se decidió usar ambos rangos de concentración 227.
Figura 42. El bloqueo del receptor de membrana CD47/IAP y de la integrina αvβ3 disminuye la
producción de óxido nítrico en células endoteliales in vitro. A. Cuantificación de la producción de
óxido nítrico, a través de la IFM de la sonda DAF-FM a nivel de célula única, en HUVECs control
(Ctrl-ARNi) y silenciadas para MT1-MMP (MT1-ARNi#2) tratadas con anticuerpos bloqueantes de
CD47 y αvβ3 a la unión de TSP1 (1µg/ml y 10 µg/ml respectivamente durante 24 h) o sus controles
de isotipo (IgG). n=78-184 células por condición de 3 experimentos independientes. B. C.
Cuantificación de la producción de óxido nítrico, a través de la IFM de la sonda DAF-FM a nivel de
célula única, en HUVECs control (Ctrl-ARNi) y silenciadas para MT1-MMP (MT1-ARNi#2) tratadas
con el péptido inhibidor de αvβ3 (RGDS) y su control (RADS) (B) o el péptido cíclico inhibidor de
αvβ3 cilengitide (C). n=100-385 células por condición de 3 experimentos independientes. Se realizó
el análisis estadístico con el método de Mann-Whitney. **** p<0,0001. Los * representan diferencias
significativas con el control de células no tratado. Las # representan diferencias significativas con el
control de isotipo o péptido control correspondiente a la muestra.
104
Ambos péptidos inhibieron significativamente a las dos concentraciones usadas la
producción de óxido nítrico en HUVECs control en comparación con las células no
tratadas y las tratadas con el péptido control RDAS. Sin embargo, no causaron cambios
en la producción de óxido nítrico de HUVECs interferidas para la expresión de MT1-
MMP (Figura 42B,C).
Con el objetivo de analizar el efecto específico de la unión de TSP1 a αvβ3 sobre
la producción de óxido nítrico, se sintetizó la secuencia de unión de TSP1 a la integrina,
el nonámero GDGRGDACK, y un nonámero control GDGRADACK. Se analizó su
efecto a dos rangos de concentraciones sobre la producción de óxido nítrico en HUVECs
control e interferidas para la expresión de MT1-MMP.
El nonámero procedente de la secuencia de TSP1, pero no el control, inhibió a
ambas concentraciones la producción de óxido nítrico en células control, sin efecto en
células interferidas para la expresión de MT1-MMP (Figura 43B).
Estos resultados en conjunto indicaron que el fragmento liberado por MT1-MMP
a través del corte proteolítico de TSP1 activa la producción de óxido nítrico a través de
CD47(IAP)/integrina αvβ3.
Figura 43. El nonámero basado en la secuencia de unión de TSP1 a la integrina αvβ3 disminuye
la producción de óxido nítrico en células endoteliales in vitro. A. Cuantificación de la producción
de óxido nítrico, a través de la IFM de la sonda DAF-FM a nivel de célula única, en HUVECs control
(Ctrl-ARNi) y silenciadas para MT1-MMP (MT1-ARNi#2) tratadas con el péptido GDGRGDACK
procedente de la secuencia de unión de TSP1 a αvβ3 o el péptido control GDGRADACK. n=149-337
células por condición de 3 experimentos independientes. Se realizó el análisis estadístico con el
método de Mann-Whitney. **** p<0,0001. Los * representan diferencias significativas con el control
de células no tratado. Las # representan diferencias significativas con el péptido control
correspondiente a la muestra.
105
2.8 Impacto funcional de la inhibición de la unión de TSP1 a la integrina αvβ3 sobre
la angiogénesis por intususcepción
El siguiente objetivo fue analizar el impacto funcional de la señalización de TSP1
a través de la integrina αvβ3 en angiogénesis por intususcepción en el contexto de colitis.
Para ello, se indujo colitis moderada en ratones MT1f/f por administración de 1% DSS en
el agua de bebida ad libitum durante 3 días. Estos animales fueron tratados con el
nonámero GDGRGDACK o su control, GDGRADACK durante los 3 días de inducción
de la enfermedad mediante el injerto subcutáneo de bombas osmóticas que administraron
100mg/kg de nonámero al día de manera continua.
Tras tres días de tratamiento los ratones fueron sacrificados y se analizó la
estructura del plexo mucoso del colon por inmunofluorescencia de tejido in toto de CD31,
cuantificando el número de eventos de angiogénesis por intususcepción. Los animales
tratados con el nonámero presentaron significativamente un menor número de eventos
que los tratados con el nonámero control (Figura 44A).
Además, se caracterizó la conservación del plexo por el análisis de las fibras de
colágeno a través de microscopía de generación de segunda armónica. Se observó el
aumento de las fibras de colágeno en los animales tratados con el péptido control.
106
Figura 44. El bloqueo de la unión de TSP1 a la integrina αvβ3 disminuye la angiogénesis por
intususcepción in vivo. A. Proyecciones máximas de imágenes representativas de la vasculatura del
plexo mucoso, procedentes de ratones MT1f/f tratados durante 3 días con 1% DSS en el agua de bebida
y 100mg/kg/día del péptido GDGRGDACK o su control GDGRADACK a través de una bomba
osmótica subcutánea, teñidos con CD31. B. Cuantificación de los eventos de angiogénesis por
intususcepción en los ratones MT1f/f mostrados en A. n=5-6 animales por condición y genotipo de 2
experimentos independientes. C. Proyecciones máximas de imágenes representativas de generación
de segunda armónica donde puede observarse el colágeno fibrilar del plexo mucoso de ratones MT1f/f
tratados durante 3 días con 1% DSS en agua de bebida y el péptido GDGRGDACK o su control
GDGRADACK a través de una bomba osmótica. La barra de escala equivale a 40 µm. Se realizó el
análisis estadístico con el método de la t de Student. **p< 0,05.
2.9 Implicación de MT1-MMP durante la patogénesis de EII Humanas
Nuestro modelo ha tratado de mimetizar el efecto de las EII crónicas humanas (EC
y CU) en ratones tratados con DSS. Por ello, el siguiente paso fue analizar la presencia
de MT1-MMP en estas enfermedades comprobando el aumento de la expresión de MT1-
MMP endotelial en biopsias de pacientes con EII por inmunofluorescencia de tejido in
toto (Figura 45A). Además, se analizó la expresión de MT1-MMP a nivel de ARNm por
qPCR cuantitativa observando un aumento de la expresión en biopsias de regiones
intestinales afectadas por la enfermedad con respecto a biopsias de regiones control
107
(Figura 45B). Tinciones de TSP1 en secciones de biopsias de pacientes con EII
mostraron un aumento de la expresión de TSP1 en áreas afectadas por la enfermedad
(Figura 45C).
108
Figura 45. Caracterización de la expresión de MT1-MMP durante EII humana. A. Proyecciones
máximas de imágenes representativas de biopsias intestinales humanas procedentes de pacientes con
EII en regiones afectadas y no afectadas del colon, teñidas in toto para MT1-MMP (rojo), CD34
(verde) y Hoechst (azul). La barra de escala equivale a 50 µm. B. qPCR cuantitativa de la expresión
de MT1-MMP (MMP14) en biopsias intestinales humanas procedentes de pacientes con EII C.
Proyecciones máximas de imágenes de microscopía confocal representativas de áreas afectadas y no
afectadas de cortes de biopsias intestinales humanas procedentes de pacientes con EII, teñidas para
TSP1 (rojo), CD31 (blanco) y Hoechst (azul). La barra de escala equivale a 100 µm D. Proyecciones
máximas de imágenes representativas de microscopía de generación de segunda armónica en las que
se observa el colágeno fibrilar del plexo mucoso de biopsias intestinales humanas procedentes de
pacientes con EII.
Por otro lado, se caracterizó la conservación de la estructura del plexo mucoso en
biopsias de CU y sanas usando la técnica de generación de segunda armónica. Se observó
un aumento del número de fibras de colágeno en los individuos enfermos, similar al de
modelos animales de colitis como el usado por nosotros (Figura 45C).
Estos datos indicaron la regulación de MT1-MMP y TSP1 endotelial en el
transcurso de EII humanas.
109
Discusión
110
111
1 Papel de las oscilaciones de Ca2+ en la especificación de células endoteliales en
células líder y tallo durante angiogénesis por brote capilar
1.1 Inducción de oscilaciones de Ca2+ en células líder y tallo
Durante el primer capítulo del presente trabajo hemos analizado la respuesta de
las células endoteliales a los estímulos angiogénicos VEGF y TNFα a través de la
modificación de la frecuencia y amplitud de las oscilaciones de Ca2+. Hemos identificado
dos tipos de oscilaciones de Ca2+ en respuesta a VEGF. El primer tipo de respuesta, un
gran pico de Ca2+ al inicio de la estimulación con VEGF, es mayoritaria a elevadas dosis
de VEGF, que incrementan la expresión de marcadores génicos de células líder. Además,
Noren y colaboradores han asociado estas oscilaciones de Ca2+ a la activación de MLCK
y migración celular características de la célula líder 70. El segundo tipo de respuesta en el
que las células presentan numerosas oscilaciones de Ca2+, es mayoritario a bajas dosis de
VEGF. Si bien nosotros no hemos observado regulación génica de marcadores de célula
tallo en este tratamiento, Noren y colaboradores lo asociaron a la activación de NFAT y
la proliferación celular, características de la célula tallo 70.
Por tanto, altas dosis de VEGF inducen la especificación de las células
endoteliales en células líder a la que se asocia una respuesta de Ca2+ determinada,
mientras que dosis más bajas inducen la especificación en células tallo asociadas a
oscilaciones de Ca2+ diferentes. Este resultado concuerda con lo observado en situaciones
fisiológicas, donde un brote capilar está sometido a un gradiente de concentración de
VEGF, la célula líder del brote capilar es estimulada a una mayor concentración de VEGF
que las tallo. Sin embargo, el comportamiento de las células endoteliales no es totalmente
binario. Presentan también oscilaciones de Ca2+ intermedias entre ambos tipos de
oscilación, que pueden indicar fenotipos celulares intermedios, como los de la primera
célula tallo de un brote capilar que compite por la posición de célula líder 50.
La estimulación con TNFα induce oscilaciones de Ca2+ de alta frecuencia
similares a las causadas por bajas concentraciones de VEGF, pero más rápidas. Estas
oscilaciones son comparables a las descritas por Yokota y colaboradores en la célula líder
de los brotes capilares de la aorta dorsal de pez cebra durante el desarrollo de la
vasculatura, donde células líder y tallo presentan oscilaciones de Ca2+ similares pero de
mayor frecuencia en las células líder 70,73.
112
La producción de dos respuestas diferentes por oscilaciones de Ca2+ a un estímulo
requiere la participación de distintas rutas de señalización y canales de Ca2+. Hemos
observado que si bien la entrada de Ca2+ extracelular es necesaria para ambos fenotipos,
la participación de ORAI1 sólo es requerida por parte de la respuesta propia de células
líder. Estudios anteriores han observado cómo el silenciamiento de la expresión de
ORAI1 en HUVECs inhibe la entrada de Ca2+ por la estimulación de altas dosis de VEGF
a nivel poblacional, disminuyendo la migración y proliferación en células endoteliales y
la angiogénesis in vitro e in vivo 65,228. Sin embargo, el bloqueo de otros canales de Ca2+
de la membrana plasmática como los canales iónicos receptores de potencial transitorio
1 y 6 (TRPC1 y 6), no inhibió dicha entrada de Ca2+. Nosotros proponemos que los dos
tipos de oscilaciones de Ca2+ están guiados por diferentes canales de Ca2+, ORAI1 es el
principal canal en oscilaciones de células líder, pero las oscilaciones de Ca2+ en células
tallo podrían ser dirigidas mayoritariamente por otros canales presentes en las células
endoteliales como TRPCs y TRPVs. El silenciamiento de la expresión de TRPC6 o la
transfección con su dominante negativo ha demostrado el papel de este canal en células
endoteliales durante la división celular y la angiogénesis 229. Además, de acuerdo con
nuestra hipótesis se ha observado que la sobreexpresión de TRPC6 promueve la
angiogénesis sin necesidad de VEGF externo, respondiendo a bajas concentraciones del
factor de crecimiento 229. En esta misma línea, estudios en células humanas embrionarias
de riñón combinando experimentos in vitro e in silico han propuesto que variaciones
estocásticas de los niveles de expresión de los canales de Ca2+, a nivel de célula única son
capaces de producir respuestas celulares diferentes ante un mismo estímulo. 230,231
En cuanto al papel de las PLCs, nuestros resultados demuestran que las diferentes
dosis de VEGF utilizadas generan diferentes dinámicas de activación por fosforilación de
la PLCγ1 en línea con los resultados obtenidos por Fearnley y colaboradores al tratar
células endoteliales con las distintas concentraciones de las isoformas de VEGF 165 y
121 61. Estos datos correlacionan con el tipo de oscilación de Ca2+ mayoritario en ambos
tratamientos. Estudios futuros son necesarios para el análisis en profundidad del papel de
la PLCβ3 sobre estas oscilaciones de Ca2+, cuya fosforilación ha sido asociada in vitro a
la disminución de la migración y aumento de la proliferación, proponiéndola como
posible marcador de células líder 63.
113
1.2 Papel de la vía Dll4/Notch durante las oscilaciones de Ca2+ inducidas por VEGF
Nuestros resultados indican un efecto regulador de la vía Dll4/Notch sobre las
oscilaciones de Ca2+ producidas en respuesta a VEGF. La incubación de nuestras células
con DAPT disminuyó el número de células con oscilaciones de Ca2+ características de
célula líder y aumentó las de tallo, en células tratadas con altas dosis de VEGF. Dicha
inhibición a su vez disminuyó el número de células tipo tallo sustituyéndolas por células
no respondedoras a bajas concentraciones de VEGF.
Estos resultados son contradictorios con lo descrito en trabajos previos. La
inhibición de la vía Dll4/Notch aumentó el número de células líder con oscilaciones de
Ca2+ de alta frecuencia in vivo en la aorta dorsal de peces cebra 70,73. Un estudio reciente
ha caracterizado el aumento de la expresión de genes implicados en las oscilaciones de
Ca2+ en células endoteliales aórticas humanas interferidas para la expresión de Notch1
232. Por el contrario, se ha observado la disminución de las oscilaciones de Ca2+ in vitro
en células de músculo liso tratadas con DAPT por disminución de la expresión de canales
de la maquinaria SOCE 233,234.
Los diferentes resultados obtenidos pueden deberse a la mayor complejidad de los
anteriores ensayos realizados in vivo con una mezcla de señales angiogénicas y anti-
angiogénicas. Así, los cambios observados en las oscilaciones de Ca2+ durante la
inhibición de la vía de Notch pueden deberse a cambios en la expresión de la maquinaria
de oscilaciones de Ca2+ en respuesta específicamente a VEGF.
1.3 Cambios de la expresión de marcadores génicos de células líder y tallo en
respuesta a VEGF
Nuestros datos indican que la estimulación de células endoteliales con distintas
concentraciones de VEGF correlaciona con la activación de diferentes programas
génicos. Las células estimuladas con altas dosis de VEGF aumentan la expresión de los
marcadores génicos de célula líder. El incremento de la transcripción del gen Dll4 indica
que el tratamiento con altas dosis de VEGF produce la salida de las oscilaciones
transcripcionales descritas para este gen iniciando la especificación en célula líder 56,58.
Por su parte, la falta de regulación génica observada en los marcadores de célula
tallo a bajas concentraciones de VEGF, puede deberse al cultivo celular en dos
dimensiones, a diferencia de los experimentos de identificación de estos marcadores
realizados en contextos de tres dimensiones que permiten la migración celular y la
114
creación del brote capilar 53,54. Nuevos análisis usando modelos angiogénicos
tridimensionales como la formación de estructuras tipo capilares con esferoides podrían
aportar nuevos datos.
Además, hemos analizado la participación del factor de transcripción NFAT,
implicado previamente en la proliferación de células tallo, en la transcripción de estos
genes. Se ha observado la regulación parcial a través de esta vía de genes como VCAM1
e ICAM1 que aparecían sobreexpresados en los tratamientos de ambas concentraciones
de VEGF durante 24 horas. Es interesante señalar que si bien tal como se esperaba, la
expresión de la mayoría de los marcadores descritos como propios de célula líder no son
regulados por la inhibición de la ruta de NFAT, sí lo es la expresión de su gen diana
RCAN1.4. Ya se ha demostrado previamente la regulación de RCAN1.4 por parte de
NFAT y su papel como inhibidor de la calcineurina y por tanto de la vía de NFAT 235.
RCAN1.4 es además un marcador de células líder implicado en la polarización y
migración celular a través de la regulación de la endocitosis de VEGFR2 221,236. De esta
forma el pico inicial de Ca2+ presente en las células líder podría activar de forma rápida y
transitoria la ruta de NFAT incrementando la expresión de RCAN1.4 que favorecería el
fenotipo líder e inhibiría la posterior activación de la vía de NFAT estabilizando este
fenotipo 70. Nuevos análisis son necesarios para la comprensión de la decodificación de
las oscilaciones de Ca2+ para la activación de los factores de transcripción NFAT y NFκB
en las células endoteliales líder y tallo.
En conjunto nuestros datos y los procedentes de otros estudios similares
demuestran que las células endoteliales responden a VEGF mediante diferentes
oscilaciones de Ca2+ que se correlacionan con su especificación en células líder y tallo
durante la angiogénesis por brote capilar (Figura 46).
115
Figura 46. Esquema representativo de la participación de las oscilaciones de Ca2+ en la especificación
de células líder y tallo durante angiogénesis por brote capilar.
2. MT1-MMP, nuevo actor en angiogénesis por intususcepción en contexto
inflamatorio: papel del flujo y el óxido nítrico
En este trabajo hemos descrito a MT1-MMP como un nuevo actor en la
angiogénesis por intususcepción durante la patogénesis de EII. Además, hemos propuesto
la producción de óxido nítrico por la vía MT1-MMP/TSP1/integrina αvβ3/eNOS, como
mecanismo dependiente de la actividad catalítica de MT1-MMP, responsable de la
inducción de este tipo de angiogénesis.
2.1 Sistema de visualización de angiogénesis por intususcepción en el plexo mucoso
Hemos desarrollado un nuevo método de visualización y cuantificación de la
angiogénesis por intususcepción, mediante microscopía confocal y reconstrucción en tres
dimensiones mediante el software Imaris. Hasta la fecha, la mayoría de los estudios
cuantitativos de angiogénesis por intususcepción se han realizado usando microscopía
electrónica de barrido en muestras obtenidas por la técnica de molde de corrosión 82,110.
Esta técnica permite la visualización de alta resolución de los eventos distintivos de
angiogénesis por intususcepción, pilares, asas y duplicaciones, pero su complejidad a
nivel técnico dificulta el uso de un número de sujetos experimentales suficiente. Algunos
estudios recientes han analizado la angiogénesis por intususcepción, producida en vasos
sanguíneos tumorales, usando cortes de tejido teñidos por inmunofluorescencia. El
principal problema de esta técnica es que el escaso grosor de las muestras impide la
cuantificación de pilares, asas y duplicaciones obligando a usar los diámetros de los vasos
116
sanguíneos como medida indirecta de la angiogénesis por intususcepción 107,109. Nuestro
método resuelve algunos de estos problemas. Al realizar la tinción en tejido intestinal in
toto podemos analizar toda la vasculatura del intestino, y mediante la reconstrucción en
tres dimensiones podemos cuantificar los eventos de angiogénesis por intususcepción.
Queda pendiente la visualización del proceso de formación de los pilares, mediante
tinciones de microfilamentos de actina y microscopía confocal de alta resolución.
Creemos que esta técnica permitirá observar las protrusiones endoteliales migrando en
dirección al lumen capilar y el puente endotelial completo, de una forma similar a lo
observado previamente en tumores 85. Además, este sistema de visualización de la
angiogénesis combinado con el uso de líneas de ratón con reporteros fluorescentes
permitirá en el futuro el estudio de nuevos actores moleculares durante la angiogénesis
por intususcepción, y el análisis del papel de otros tipos celulares como los pericitos y
fibroblastos que han sido descritos introduciéndose en el pilar intraluminal 237.
2.2 Papel de MT1-MMP endotelial durante la patogénesis de colitis experimental
En este proyecto, hemos analizado el papel de MT1-MMP endotelial en
angiogénesis por intususcepción durante colitis experimental en ratones tratados con 1%
DSS en el agua de bebida. Este porcentaje más bajo que el usado en trabajos similares,
nos ha permitido una visualización más limpia de la vasculatura por inmunofluorescencia,
debido al menor daño epitelial y la presencia de un menor número de células
inflamatorias. Hemos demostrado que la deleción endotelial de MT1-MMP disminuye la
angiogénesis por intususcepción, mejora la funcionalidad de los vasos y la evolución de
la enfermedad. Sin embargo la deleción de MT1-MMP no tiene efecto en la progresión
de ratones tratados con mayores porcentajes de DSS (4%). Esto indica que la función de
MT1-MMP es importante en contextos donde la angiogénesis influye más en la
progresión de la enfermedad como durante su inicio y en presencia de respuesta
inflamatoria moderada.
Al igual que trabajos previos, nuestros resultados demuestran la participación de
la angiogénesis por intususcepción durante la patogénesis de colitis en ratones 82,121.
Además, hemos observado angiogénesis por intususcepción al tercer día de tratamiento
con 1% DSS sin que sea necesario un gran incremento de células inflamatorias en tejido,
en contra de lo considerado hasta ahora en el campo 223. Es importante destacar que la
mayor parte de estos estudios previos sobre la participación de la angiogénesis en la
etiología de la colitis, no tienen en cuenta el mecanismo angiogénico por el que ésta tiene
117
lugar en dicho contexto, dificultando el estudio de los mecanismos moleculares que
participan en la angiogénesis durante la enfermedad.
Aunque MT1-MMP desempeña también un papel en linfoangiogénesis 238, en este
estudio no hemos abordado su posible función en este proceso, para el que se ha descrito
un papel protector durante el desarrollo de la colitis experimental. Así, Alessio y
colaboradores observaron una mejor evolución de animales tratados con DSS por la
sobreexpresión de VEGF-C, factor promotor de linfoangiogénesis 239.
2.3 Papel de MT1-MMP durante la respuesta endotelial a flujo sanguíneo
Nuestros resultados in vivo han mostrado la expresión de MT1-MMP a nivel de
proteína en células endoteliales bajo elevado flujo laminar en la aorta torácica
descendiente. Sin embargo, la actividad del promotor de MT1-MMP solo está activo en
la quinta parte de las células, indicando una expresión fluctuante de MT1-MMP en estas
condiciones. En cuanto al efecto del flujo turbulento, se observó un número mayor de
células endoteliales con actividad del promotor de MT1-MMP en la curvatura menor de
la aorta, y en las células endoteliales de los tricórneres de animales enfermos. Si bien
estudios previos in vitro usando un agitador circular para simular el flujo sanguíneo sobre
células endoteliales habían descrito una bajada de la expresión de MT1-MMP 153,178,
nuestros resultados in vivo sugieren que la expresión de MT1-MMP está regulada por
flujo, aumentando en zonas de alto flujo laminar y zonas donde existen gradientes de flujo
o disminución del estrés de cizalla como los tricórneres.
Nuestra combinación de experimentos in vivo e in vitro ha demostrado que la
deleción de MT1-MMP endotelial disminuye la elongación celular pero no modifica su
polarización en respuesta a flujo. Estos resultados indicarían la participación de MT1-
MMP en la mecanorrecepción del flujo sanguíneo o la adaptación celular a éste. MT1-
MMP podría formar parte o modificar el mecanosensor endotelial, por ejemplo través del
corte de VE-cadherina al igual que en el caso de las proteínas de la misma familia N-
cadherina y E-cadherina 192. Por otro lado, MT1-MMP podría participar de la elongación
celular, reorganización del citoesqueleto y migración en respuesta a flujo por la activación
de GTPasas, o modulando la actividad de integrinas y eNOS 170.
La menor elongación celular en respuesta a flujo en células deficientes para MT1-
MMP no pudo ser reproducida in vitro, probablemente debido a la limitación temporal,
ya que las células solo pudieron ser sometidas a flujo durante 12 horas. Estudios previos
118
han mostrado un cambio en la morfología celular tras 24 horas de flujo laminar a 35
dyn/cm2 en células endoteliales de arteria coronaria humana (HCAECs) y tras 18 o 48
horas a diferentes flujos (0,5-37dyn/cm2) en HUVECs 240,241.
2.4 Función de MT1-MMP durante la vasodilatación y producción de óxido nítrico
En este trabajo hemos mostrado la menor capacidad de vasodilatación de
arteriolas y capilares del músculo cremáster de ratones MT1iΔEC en respuesta a ACh. La
ACh produce vasodilatación a través de dos mecanismos, la producción de óxido nítrico
y de prostanglandinas 242. En nuestro modelo, la vasodilatación del plexo capilar del
cremáster en ratones MT1iΔEC fue rescatada mediante un donador de óxido nítrico,
indicando la prevalencia de esta vía en este contexto. Además, hemos correlacionado este
defecto en la vasodilatación de los animales MT1iΔEC con la disminución de la producción
de óxido nítrico y la expresión de eNOS en células endoteliales in vitro en ausencia de
MT1-MMP.
MT1-MMP puede desempeñar una doble función a través de la producción de
óxido nítrico durante la inducción y desarrollo de la angiogénesis por intususcepción. Por
una parte, la vasodilatación de la arteriola producida por óxido nítrico incrementa el flujo
sanguíneo en el plexo capilar induciendo, como ya se ha descrito anteriormente,
angiogénesis por división de los capilares 99,243. Por otra parte, el incremento de flujo
inducirá una mayor producción de óxido nítrico local en el plexo capilar que ha sido
propuesto como inductor de la migración de células endoteliales para formar el pilar
intraluminal. De esta forma el óxido nítrico producido en las regiones del plexo con flujo
laminar puede inducir la expresión de VEGFR2 y la migración celular necesaria para la
formación de los pilares intraluminales en la región de menor estrés de cizalla del plexo,
los tricórneres. Futuros estudios son necesarios para la comprensión de los procesos por
los que eNOS puede inducir la formación de pilares en los tricórneres del plexo mucoso
y el papel de la vía de VEGF y sus receptores durante el proceso vascular.
2.5 Señalización del fragmento carboxilo terminal de TSP1 a través de la integrina
αvβ3
Hemos identificado un nuevo mecanismo molecular por el que MT1-MMP es
capaz de incrementar la producción de óxido nítrico y la expresión de eNOS a través del
corte proteolítico de TSP-1 durante el desarrollo de colitis experimental.
119
TSP1 es una glicoproteína secretada a la matriz extracelular, capaz de señalizar
por diferentes vías. Ha sido detectada a bajas concentraciones en contextos fisiológicos
que aumentan rápidamente durante la inflamación en enfermedades crónicas como las
EII. TSP1 interacciona con el receptor CD36 a través de su secuencia repetida I y con
CD47 por su dominio carboxilo terminal; también cuenta con secuencias de interacción
con las integrinas αvβ3 y β1 y otras proteínas de la matriz extracelular 225. La actividad
anti-angiogénica de TSP1 se ha estudiado en profundidad. TSP1 se une a CD36
inhibiendo migración y tubulogénesis e induciendo apoptosis en el endotelio 244–246 e
interacciona con la vía de VEGF/VEGFR2, secuestrando moléculas de VEGF y
bloqueando la fosforilación de VEGFR2 a través de la unión a CD36 y CD47 247–249.
Además, la señalización de TSP1 a través de CD36 y CD47 disminuye la producción de
óxido nítrico por inhibición de la fosforilación de eNOS 250,251.
Sin embargo, TSP1 es una proteína pleiotrópica a la que se le han atribuido
también efectos proangiogénicos en modelos in vitro a través de la inducción de actividad
inflamatoria en células de músculo liso 252, y en ensayos in vivo durante la angiogénesis
en la córnea de conejos 253. Aunque TSP1 puede ser procesada tanto por MT1-MMP como
por otras proteasas, la mayor parte de los ensayos para analizar su potencial anti-
angiogénico se han realizado usando la proteína completa. Nosotros proponemos un
comportamiento pleiotrópico de TSP1 inducido por su corte proteolítico 254. En esta
misma dirección, se ha observado la función proangiogénica del fragmento amino
terminal de TSP1 255. Aunque el papel de TSP1 durante la angiogénesis por
intususcepción es aún desconocido, su expresión ha sido observada en contextos donde
este mecanismo angiogénico está presente, como la expansión del plexo vascular de la
membrana corioalantoidea y la colitis 256.
Durante este trabajo, hemos observado la acumulación de la proteína TSP1 en las
arteriolas del colon de animales MT1iΔEC y en HUVECs silenciadas para la expresión de
MT1-MMP, indicando junto al modelo desarrollado in silico el corte proteolítico de TSP1
por parte de MT1-MMP. El procesamiento de TSP1 por MT1-MMP ya ha sido descrito
anteriormente en otros contextos 148,257. En el caso del corte de TSP1 por ADAMTS1 se
ha descrito la liberación de la matriz del fragmento carboxilo terminal de TSP1 mientras
que el fragmento amino terminal es degradado 226. En nuestro modelo, datos previos del
laboratorio han mostrado el incremento de la proteína TSP1 en el suero de ratones tratados
con 1% DSS, que fue inhibido por el anticuerpo bloqueante de la actividad catalítica de
120
MT1-MMP (LEM-2/15). Además describieron el aumento de la concentración de TSP1
en sueros de pacientes de CU y EC de baja actividad, mimetizado por nuestro modelo
experimental. Nuestros datos indican que el fragmento carboxilo terminal de TSP1
liberado por MT1-MMP señaliza a través del complejo CD47/integrina αvβ3
disminuyendo la producción de óxido nítrico. El complejo CD47/ integrina αvβ3 ha sido
descrito previamente como receptor de TSP1 en diferentes tipos celulares e identificado
como receptor de vitronectina en la membrana apical pero no basal de células adherentes
258–260. En cuanto a la degradación del fragmento amino terminal de TSP1 puede ser
parcialmente responsable del incremento de la producción de óxido nítrico y aumento de
la angiogénesis al suprimir el sitio de unión de TSP1 a CD36, cuya señalización favorece
la apoptosis de células endoteliales e inhibe la producción de óxido nítrico y migración
celular 261. Por otro lado, no debemos descartar la posible participación en el fenotipo del
procesado de la integrina pro-αv en su forma madura 262.
2.6 La vía MT1-MMP/TSP1/integrina αvβ3/eNOS como diana terapéutica
Hemos demostrado que la unión del fragmento carboxilo terminal de TSP1 a la
integrina αvβ3 induce angiogénesis por intususcepción favoreciendo la evolución de la
colitis en ratones tratados con 1% DSS. Así la angiogénesis por intususcepción disminuyó
al bloquear la interacción TSP1/integrina αvβ3 con el nonapéptido de TSP1
GDGRGDACK. Danese y colaboradores ya analizaron por inmunohistoquímica el efecto
del bloqueo de las integrinas αvβ3 y α5β1 mediante el péptido ATN-161 sobre la
angiogénesis durante la colitis experimental en ratones IL10-/-. Sin embargo, a diferencia
de nuestro trabajo, no se analizó el efecto específico sobre la angiogénesis por
intususcepción ni se identificó el ligando responsable de la angiogénesis 263. Si bien el
nonapéptido GDGRGDACK inhibió la angiogénesis por intususcepción, queda por
determinar si el bloqueo de la integrina puede mejorar la evolución de la enfermedad en
ratones tratados con 1% DSS durante periodos más largos o con porcentajes más elevados
de DSS. Por otra parte, otros dos péptidos basados en la secuencia de TSP1 han sido
usados durante el tratamiento de colitis. Los péptidos ABT-510 y ABT-898 basados en
las secuencias que se unen específicamente a CD36 y CD47 respectivamente inhibieron
parcialmente la angiogénesis durante la colitis experimental en ratones tratados con DSS
y mejoraron la evolución de la enfermedad, aunque no se analizó el efecto en marcadores
de angiogénesis por intususcepción 141,143.
121
En cuanto a la función de MT1-MMP durante la patogénesis de la enfermedad en
humanos, hemos descrito el incremento de MT1-MMP en el endotelio del plexo mucoso
de intestinos procedentes de pacientes de EIIs, indicando un posible uso terapéutico de la
vía descrita.
En resumen y a la luz de nuestros resultados proponemos un modelo en el que la
angiogénesis por intususcepción en un contexto de colitis moderada es estimulada por el
procesado de TSP1 por parte de MT1-MMP. Esto bloquea la inhibición de la producción
de óxido nítrico producida a través de la interacción de TSP1 con el receptor CD36. El
fragmento carboxilo terminal de TSP1 señaliza a través del complejo apical
CD47/integrina αvβ3 estimulando la producción de óxido nítrico y la angiogénesis por
intususcepción (Figura 47).
Figura 47. Esquema de la vía MT1-MMP/TSP1/integrina αvβ3-CD47/eNOS/óxido nítrico en
inducción de angiogénesis por intususcepción durante la patogénesis de colitis. CE célula endotelial,
PR pericito, FB fibroblasto, Col colágeno.
122
En conclusión nuestros datos señalan a MT1-MMP endotelial como un regulador
esencial de la angiogénesis por intususcepción durante la colitis, sugiriendo el posible uso
de la metaloproteasa y de la vía MT1-MMP/TSP1/integrinaαvβ3-CD47/eNOS/óxido
nítrico como diana terapéutica para el tratamiento de las EII humanas y otras
enfermedades donde la angiogénesis por intususcepción aparece implicada como la
displasia broncoalveolar y el cáncer, en los que TSP1 ya ha sido propuesto como diana
terapéutica 264–267.
123
Conclusiones
124
125
1. Las células endoteliales responden a VEGF y TNFα mediante cambios en la amplitud
y frecuencia de las oscilaciones de Ca2+ intracelular, que requieren la participación del
Ca2+ extracelular. Las células endoteliales tratadas con VEGF presentan oscilaciones de
Ca2+ heterogéneas.
2. El comportamiento de oscilaciones de Ca2+ en células endoteliales en respuesta a
VEGF es dependiente de la dosis del mismo. Células tratadas con altas dosis de VEGF
presentan un pico de Ca2+ al inicio de la estimulación asociado a la especificación de
células líder. Mientras que células tratadas con dosis bajas de VEGF presentan numerosas
oscilaciones de Ca2+ durante la estimulación, asociadas a la especificación de células
tallo.
3. Las oscilaciones de Ca2+ en respuesta a elevadas dosis de VEGF requieren la
participación del canal de Ca2+ ORAI1 y correlacionan con la rápida activación por
fosforilación de la PLCγ1. Altas dosis de VEGF aumentan la transcripción de genes
marcadores de células líder así como la transcripción del inhibidor de calcineurina
RCAN1.4 dependiente de NFAT.
4. El uso combinado de microscopía confocal y reconstrucción tridimensional del plexo
vascular mucoso intestinal, aporta resolución suficiente para el análisis y cuantificación
de eventos vasculares característicos de la angiogénesis por intususcepción.
5. La deleción endotelial de MT1-MMP reduce la angiogénesis por intususcepción y
mejora la función vascular de la vasculatura intestinal del plexo mucoso durante la
patogénesis de colitis experimental en ratón, reduciendo la progresión de la enfermedad.
5. La ausencia de MT1-MMP en el endotelio reduce la vasodilatación de arteriolas y
capilares dependiente de óxido nítrico.
6. La actividad catalítica de MT1-MMP endotelial es necesaria para la inducción de
angiogénesis por intususcepción durante la patogénesis de colitis experimental en ratón.
126
7. La liberación de TSP1 por parte de MT1-MMP aumenta la producción de óxido nítrico
a través del complejo CD47-integrina αvβ3.
8. El bloqueo de la interacción TSP1/integrina αvβ3 reduce la angiogénesis por
intususcepción durante la colitis experimental en ratón.
9. Los niveles de la proteína MT1-MMP aumentan en el endotelio intestinal humano
durante las enfermedades inflamatorias intestinales, por lo que se propone MT1-MMP y
la vía TSP1/integrina αvβ3/ óxido nítrico como posibles nuevas dianas terapéuticas.
127
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128
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155
156
“Somos los mismos que cuando empezamos
¡Cuidado!”