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julio, 2019 Departamento Agronomía Efecto alelopático de Terminalia catappa L. sobre Meloidogyne incognita en condiciones in vitro Autora: Daily Jauregui Rodriguez Tutor del trabajo: Dr.C. Ray Espinosa Ruiz
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julio, 2019
Departamento Agronomía
Efecto alelopático de Terminalia catappa L. sobre Meloidogyne
incognita en condiciones in vitro
Autora: Daily Jauregui Rodriguez
Tutor del trabajo: Dr.C. Ray Espinosa Ruiz
Department of Agronomy
Allelopathic effect of Terminalia catappa L. on
Meloidogyne incognita under in vitro conditions
Author: Daily Jauregui Rodriguez
Supervisor: Dr. C. Ray Espinosa Ruiz
julio, 2019
Este documento es Propiedad Patrimonial de la Universidad Central “Marta Abreu” de Las
Villas, y se encuentra depositado en los fondos de la Biblioteca Universitaria “Chiqui Gómez
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Dedicatoria
En especial a mi papá Dios por convertirme en quien soy hoy porque gracias a él hoy
puedo disfrutar este momento especial en compañía de las personas que más amo, mi
familia.
A mis padres en especial a mi mamá, por su Sacrificio Incondicional sin importarle aún
sus condiciones de salud lo dio todo por mí para que hoy fuera una persona de bien.
A mi Esposo Yoelvis Carrazana por todo su amor, comprensión, dedicación, paciencia
y apoyo absoluto en cada momento que lo necesité.
Con mucho amor a mi abuela Senén Castellón por todos sus consejos y porque
siempre me inspiró a que yo lo lograría.
A la familia de mi esposo por todo el cariño y apoyo.
A todas aquellas personas que me han apoyado en hacer posible este día.
Dedicados a todos aquellos
Nunca te arrepientas de dar todo por alguien aunque no lo valoren, mañana tú lo
olvidaras y volverás a darlo todo... sin embargo ese alguien te recordara cada vez que
le fallen.
Agradecimientos
Muchas gracias a Dios porque si no hubiese sido por él no hubiese llegado a
cumplir este sueño.
Gracias a la Dra. Lilian Morales (mami Lili) por todo el apoyo brindado,
dedicación constante y gran calidad humana.
Gracias al Ms. Vaniert Ventura Nematólogo del INIVIT por su apoyo durante la
etapa experimental de la Tesis y a todo el colectivo de la institución.
A cada docente que me apoyó durante estos cinco años y de manera especial a
mi tutor el Dr.C Ray Espinosa Ruíz tutor de la investigación, por su ayuda
incondicional por guiarme durante todo este período y principalmente en los
momentos más difíciles de la investigación y sus sabias contribuciones.
A la Dra. Mayrita Morales por ser una educadora brillante y haberme brindado
sus sabios consejos y todo el amor que debe caracterizar a un docente en la
etapa más difícil de mi tesis y de mi vida como estudiante.
A mis compañeros de la universidad, por la ayuda brindada y los momentos
especiales que pasamos juntos.
A Anisley del laboratorio de Fisiología Vegetal por su ayuda ofrecida.
A Yilian Carrazana (mi suegra) por su apoyo incondicional y su ayuda en la
investigación.
A mi familia en general.
A todos, Muchas Gracias
Resumen
Meloidogyne incognita es una de las especies de nematodos que afectan a la mayoría
de los cultivos. En nuestro país, ha tenido un gran impacto en la producción protegida y
semiprotegida. El uso de extractos vegetales con efecto alelopático sobre estos
agentes fitopatógenos puede contribuir a una estrategia de manejo integrado para
controlarlos eficazmente. El experimento se realizó en el período comprendido entre
septiembre del 2018 a mayo del 2019. Tuvo el objetivo de determinar las
concentraciones de fenoles, flavonoides y taninos presentes en hojas de Almendro de
la india de diferentes edades y colectadas en varios meses del año sobre la
sobrevivencia de M. incognita. Los resultados indican que existe una dependencia del
contenido de metabolitos secundarios en relación con el tipo de hoja. Según su edad
en las hojas jóvenes se presentan momentos de mayor riqueza de flavonoides mientras
que los taninos permanecen elevados en las adultas. Las condiciones climáticas
inciden en la producción de metabolitos secundarios. El contenido de fenoles no
presentó una relación clara con las variaciones ambientales. De forma similar se
evidenció en la cuantificación de flavonoides. Las concentraciones de taninos
presentaron cierta distribución en función de los meses de sequía y bajas
temperaturas. Entre los tres tipos de hojas no se presentaron diferencias respecto a la
mortalidad del nematodo. La mejor concentración fue la del 100% debido a que induce
la muerte de mayor cantidad de nematodos, el resto de las concentraciones lo hace en
el rango de 50% a 60%.
Summary
Meloidogyne incognita is one of the nematode species that affect most crops. In our
country, it has had a great impact on protected and semi-protected production.The use
of plant extracts with allelopathic effect on these phytopathogenic agents can contribute
to an integrated management strategy to control them effectively.The experiment was
carried out in the period from September 2018 to May 2019.It aimed to determine the
concentrations of phenols, flavonoids and tannins present in indian Almond leaves of
different ages and collected in several months of the year on the survival of M.
incognita.The results indicate that there is a dependence on the content of secondary
metabolites in relation to the type of leaf. According to their age in the young leaves
there are moments of greater richness of flavonoids while the tannins remain elevated
in the adults.Climatic conditions affect the production of secondary metabolites. The
content of phenols did not show a clear relationship with environmental variations.In a
similar way, it was evidenced in the quantification of flavonoids. The concentrations of
tannins showed some distribution depending on the months of drought and low
temperatures.Among the three leaf types, there were no differences with respect to
nematode mortality.The best concentration was 100% because it induces the death of
more nematodes, the rest of the concentrations do it in the range of 50% to 60%.
Índice
1. Introducción ........................................................................................................... 1
2. Revisión Bibliográfica ............................................................................................... 4
2.1Características generales de los nematodos .......................................................... 4
2.1.2 Los nematodos fitopatógenos ......................................................................... 5
2.2 La alelopatía .......................................................................................................... 8
2.2.1 Plantas alelopáticas con efectos nematicidas ............................................... 12
3. Materiales y Métodos .............................................................................................. 14
3.1 Cuantificación de fenoles, flavonoides y taninos presentes en hojas de Almendro
de la india .................................................................................................................. 14
3.2Aislamientoe identificación de nematodos del género Meloidogyne spp. ............. 17
3.3 Efecto alelopático de hojas de Almendro de la india sobre la sobrevivencia de
Meloidogyne spp........................................................................................................ 18
4. Resultados y Discusión .......................................................................................... 20
4.1 Cuantificación de fenoles, flavonoides y taninos presentes en hojas de Almendro
de la india .................................................................................................................. 20
4.2 Aislamiento e identificación de nematodos del género Meloidogyne spp. ........... 25
4.3 Efecto alelopático de hojas de Almendro de la india sobre la sobrevivencia de
Meloidogyne spp........................................................................................................ 28
5. Conclusiones ........................................................................................................... 32
6. Recomendaciones ................................................................................................... 33
7. Referencias Bibliográficas .................................................................................. 34
1
1. Introducción
Los nematodos son los organismos pluricelulares más numerosos en los
agroecosistemas; se conocen unas 20.000 especies y se pueden encontrar en
densidades de hasta 30 millones por metro cuadrado. Se alimentan de hongos,
bacterias, protozoarios u otros nematodos, o como parásitos de plantas y animales;
además, forman parte importante de las cadenas tróficas del suelo, poseyendo vida
libre (Piedra, 2008).
Pueden ser encontrados en casi todos los ambientes, desde el cálido trópico hasta el
helado ártico y antártico, muchos son parásitos patógenos de las plantas y animales;
incluyendo los humanos. Otros pueden cumplir funciones benéficas muy importantes
en los suelos de actividad agrícola, muchos y varios géneros de nematodos son
antagonistas y ayudan al control de organismos que causan importantes enfermedades
a las plantas (Agrios, 2005).
Los nematodos fitopatógenos se encuentran siempre presentes en el suelo. Están
asociados con el crecimiento de las plantas y la producción del cultivo. Ellos
constituyen una limitación significativa para la agricultura y pueden ser difíciles de
controlar. La determinación de la importancia de ciertas especies de nematodos
aislados no es una tarea simple, esta se agudiza cundo el cultivo es susceptible a
varios géneros que constituyen comunidades, o se combinan con otros problemas
sanitarios como el ataque de hongos y bacterias del suelo. Las condiciones
ambientales del clima tropical complejizan aún más dicha determinación (Talavera,
2003).
Existen tecnologías de cultivos donde estos organismos son altamente destructivos y
representan una causa importante de las bajas producciones. Tal es el caso de la
producción hortícola en invernaderos o casa de cultivo protegido (Staller, 2012).
Entre los nematodos de mayor importancia que afectan las plantas bajo esta forma
productiva, se encuentran aquellos “formadores de agallas en raíces” o especies del
género Meloidogyne. Las pérdidas han sido estimadas en torno al 12,0%, pero en el
caso de Meloidogyne spp. varían entre 15,0% y el 60% de la cosecha.
___________________________________________________________________Introducción
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Dentro de los invernaderos en América, el promedio de la superficie infestada por los
nematodos está sobre el 20% y las mermas de producción cercanas al 33% (Flor et al.,
2012). Esta estimación probablemente sería aún mayor si no se usaran medidas de
control nematológico.
En Cuba, el Programa de Defensa Fitosanitaria para Casas de Cultivo Protegido
editado por el Centro Nacional de Sanidad Vegetal (MINAG, 2002), y el Manual de
Producción de diferentes hortalizas de Casanova et al. (2006), indicaron un conjunto de
medidas de carácter obligatorio para evitar la introducción y diseminación de los
nematodos formadores de agallas. Sin embargo, en la mayoría de los casos, se
presentan problemas de plagas donde estos nematodos ocupan un lugar importante al
afectar la producción y calidad (Rodríguez et al., 2014).
En este sentido, se han estudiado y aplicado prácticas de manejo con vistas a lograr
disminuir las poblaciones por debajo del umbral de daño con resultados satisfactorios,
tanto para campo abierto como en la producción protegida de hortalizas (Casanova et
al., 2003). Entre estas tácticas se destacan: la aplicación de materia orgánica (Mcguire,
2004), la biofumigación (Gómez et al., 2006) y solarización del suelo, uso de rotaciones
de cultivos donde se introducen variedades no susceptibles, tolerantes y porta injertos
resistentes (Migue, 2004), aplicación de control biológico (Ferry, 2000) y cultivos de
ciclo corto, tales como el rabanito (Raphanus sativus L.) y lechuga (Lactuca sativa L.) y
plantas trampas (Cuadra et al., 2000), entre otras.
Sin embargo, en los sistemas de producción protegidas de hortalizas en el país,
prevalece el método químico para el control de las plagas (Casanova et al., 2003). El
Basamid es uno de los productos que se usa para el disminuir la afectación de plagas
edáficas, formulada y producida por la firma Bayer, a pesar de poseer una alta
efectividad encarece el costo de producción de las instalaciones, unido a su efecto
tóxico (Cuadra et al., 2000).
La utilización de plantas como alternativa para disminuir las poblaciones de nematodos
ha sido una de las prácticas que se suman en manejo integrado de estos organismos,
tanto en sistemas de producción de campo a cielo abierto como en cultivo protegido.
___________________________________________________________________Introducción
3
Esta posibilidad se basa en la producción de uno o más compuestos provenientes del
metabolismo secundario de las plantas que influyen en el crecimiento, supervivencia o
reproducción de otros organismos. Tal aspecto es conocido como “Alelopatía”.
Además, estos aleloquímicos pueden inducir efectos benéficos sobre la planta
(alelopatía positiva) o perjudiciales (alelopatía negativa). Este es el fenómeno que
implica la inhibición directa de una especie por otra ya sea vegetal o animal, usando
sustancias tóxicas o disuasivas (Espinosa, 2012).
Los compuestos fenólicos son altamente activos biológicamente, se destacan los
taninos y flavonoides por su acción en la “defensa” dela planta contra diferentes plagas.
Entre las plantas que se han estudiado con alta concentración de este tipo de
metabolitos se encuentra al Almendro de la india (Terminalia catappa L). Sus hojas
presentan altos contenidos de compuestos fenólicos, sin embargo, se desconoce la
variación de estos bajo las diferentes condiciones climáticas del año, así como su
efecto nematicidas en función de la edad de las hojas (jóvenes, adultas o senescentes).
Hipótesis
La supervivencia de M .incógnita en condiciones in vitro presenta variaciones debido a
las concentraciones de fenoles, flavonoides y taninos presentes en los extractos
acuosos de las hojas almendro de la india colectadas a diferentes edades y meses del
año.
Objetivo General
Determinar el efecto alelopático de hojas de Almendro de la india de diferentes edades
y colectadas en los diferentes meses del año sobre Meloidogyne incógnita.
Objetivos Específicos
1. Determinar las concentraciones de fenoles, flavonoides y taninos presentes en
hojas de Almendro de la india de diferentes edades y colectadas en varios
meses del año.
2. Evaluar, en condiciones in vitro, el efecto alelopático de hojas de Almendro de la
india con altas y bajas concentraciones de fenoles, flavonoides y taninos sobre
la sobrevivencia de Meloidogyne incognita.
___________________________________________________________Revisión Bibliográfica
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2. Revisión Bibliográfica
2.1Características generales de los nematodos
La clasificación taxonómica más aceptada de los nematodos es la propuesta por B. G.
Chitwood y M. B. Chitwood en 1950 (Agrios, 1996).
Reino: Metazoa
Sub reino: Eumetazoa
División: Bilateralia
Sub-división: Protostonia Super
Phylum: Pseudocelolates
Phylum: Nemata
Los nematodos son animales acuáticos muy delgados que viven en la película de agua
que rodea las partículas de suelo, también se encuentran en el estiércol, desechos
orgánicos y en sedimentos de estanques, ríos y océanos, aún a profundidades de 5000
metros en el Golfo de Biscaya y a una densidad de un millón de nematodos por metro
cuadrado. En pantanos de agua salada en los Países Bajos (Land van Saeftinghe) se
han encontrado hasta 50 millones de nematodos por metro cuadrado. Generalmente la
forma de su cuerpo es vermiforme (anguiliforme), y longitud promedio es 50 veces el
ancho del cuerpo con sus extremos casi redondeados hasta una proporción
longitud/ancho de 200 (Bongers, 2011).
Con sus cuerpos alongados nadan como una anguila o serpiente. Los ejemplares con
colas largas nadan bien, mientras que los nematodos que viven parcialmente en las
raíces de las plantas siempre tienen una cola corta (Bongers, 2011).
El propio autor refiere que las hembras de algunas especies comienzan a hincharse tan
pronto encuentran un lugar adecuado para alimentarse en la raíz de la planta,
perdiendo su movilidad. Sin embargo, los machos mantienen la forma delgada para
buscar activamente a las hembras inmóviles.
___________________________________________________________Revisión Bibliográfica
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El ciclo de vida de lo nematodos es simple y directo y se divide en seis estadios: huevo,
cuatro estadios larvarios y el adulto. La duración de cada uno de estos difiere para
cada especie y también depende de otros factores como la temperatura, humedad y la
planta huésped. El huevo algunas veces está formado por una capa gelatinosa,
generalmente es depositado, en distintas etapas de desarrollo, en el suelo o dentro de
la planta. Una vez fecundado sufre una serie de divisiones mientras pasa por las
etapas de blástula y gástrula hasta llegar al estadio juvenil (nematodo filiforme) (Coyne
et al, 2009).
Las larvas de los nematodos, morfológicamente parecidos a los adultos, sufren durante
su desarrollo cuatro mudas, una al final de cada etapa larvaria. La primera muda se
produce cuando aún se encuentra en el interior del huevo y la última es la que define el
sexo del adulto (machos, hembras, e individuos hermafroditas). La reproducción de
estos organismos generalmente es sexual, pero en casos especiales puede llevarse a
cabo de forma partenogenética (la hembra genera descendencia sin la intervención del
macho) o hermafrodita (con auto fecundación) (Roman et al., 2013).
2.1.2 Los nematodos fitopatógenos
Características generales del género
Los nematodos fitoparásitos, según el género, tienen en la región anterior (cabeza) un
estilete hueco (estomatoestilete u odontoestilete) también llamado “lanza”, pero hay
algunos con estilete sólido modificado (onquioestilete). El estilete es usado para
perforar o penetrar las células de las plantas y a través de él extraer los nutrientes,
causando enfermedades en diferentes cultivos (Perry et al., 2009).
Los adultos macho y hembra del género Meloidogyne, son fácilmente identificables
morfológicamente, los machos tienen una forma vermiforme y miden aproximadamente
de 1.2 a 1.5 mm de largo por 0.30 a 0.36 mm de ancho. Las hembras tienen forma de
pera y un tamaño aproximado de 0.40 a 1.30 mm de largo por un ancho de 0.27 a 0.75
mm. (Da Mata et al., 2016).
Según Agrios (2005), el daño mecánico directo causado por los nematodos mientras se
alimentan es muy leve. La mayoría de daños parece ser causados por la secreción de
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saliva introducida en los tejidos de las plantas durante el proceso de alimentación. Ellos
perforan la pared celular, introducen saliva dentro del citoplasma, extraen parte del
contenido celular, y se movilizan en unos pocos segundos.
El proceso de alimentación causa una reacción en las células de las plantas afectadas,
resultando la muerte o debilitamiento de los extremos de las raíces y yemas, formación
de lesiones, rompimiento de tejidos, abultamientos y agallas, arrugamiento y
deformación en tallos y hojas. Algunas de estas manifestaciones son causadas por la
descomposición del tejido afectado por las enzimas del nematodo, la cual, con o sin la
ayuda de metabolitos tóxicos, causa desintegración del tejido y muerte de las células
(Castillo et al., 2007).
Otros síntomas son causados por alargamiento anormal de la célula (hipertrofia), por
supresión de la división celular, o por la estimulación del proceso de división celular de
una manera descontrolada y que resulta en la formación de agallas (hiperplasia) o de
un gran número de raíces laterales en o cerca de los sitios de infección (Perry et al.,
2009).
El nivel de daño que causan los nematodos depende de una amplia gama de factores
tales como su densidad poblacional, la virulencia de las especies o aislados, y la
habilidad de la planta de reducir la población del nematodo (resistencia) o habilidad de
la planta de rendir una cosecha a pesar del ataque del nematodo (tolerancia). Otros
factores que también contribuyen, de una u otra manera, son el clima, disponibilidad de
agua, condiciones edáficas, fertilidad del suelo, y la presencia de otras enfermedades y
plagas. Sin embargo, aunque se tenga conocimiento de la relación nematodo-planta y
los factores que la influencian, este espacio es más complejo de lo que se puede
percibir (Talavera, 2003).
Debido a los síntomas inespecíficos que producen, suelen confundirse con desordenes
nutricionales, estrés hídrico, problemas de fertilidad del suelo, así como con otras
infecciones causadas por hongos y bacterias. No obstante, diversas fuentes han
estimado que los nematodos reducen entre un 12% y 20% la producción agrícola
mundial lo que representa aproximadamente unos 135.000 millones de euros anuales
(Hassan et al., 2013).
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Género Meloidogyne
Ubicación Taxonómica
El género Meloidogyne teniendo en cuenta a (Karssen, 2002; Siddiqi, 2000)
Orden: Tylenchida (Örley, 1880)
Superfamilia: Hoplolaimoidea (Paramonov, 1967)
Familia: Meloidogynidae (Skarbilovich, 1959 (Wouts, 1973)
Subfamilia:Meloidogyninae (Skarbilovich, 1959
Género: Meloidogyne (Goeldi, 1892)
M. incognita (Kofoid & White, 1919) Chitwood, 1949
M. javanica (Treud, 1885) Chitwood, 1949.
Meloidogyne es uno de los géneros más importantes el cual contiene alrededor de 80
especies, la mayoría restringidas a regiones cálidas. Las hembras se identifican
también por el patrón de marcas cuticulares alrededor de la abertura vulvar. Este
patrón de marcas se denomina diseño perineal y a diferencia de Globodera que tiene
una proyección en forma de cono, en el caso de Meloidogyne la abertura vulvar es
plana (Cantuña, 2013).
Los juveniles se encuentran en el suelo y pueden identificarse por la forma de la cola.
Recientemente se ha descubierto que uno puede identificar M. chitwoodi y M. hapla
mediante la parte interna de la punta de la cola. En el primero de estos la parte interna
termina abruptamente mientras que en M. chitwoodi es más difusa. Los machos de
Meloidogyne se pueden identificar por la longitud del estilete y la espícula. Las
especies de Meloidogyne son parásitos de gran importancia económica en los trópicos,
subtrópicos y en invernaderos en regiones templadas (Bongers, 2011).
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El nombre de nematodos noduladores de la raíz se refiere a los nódulos característicos
asociados con este tipo de nematodos. Este género es especialmente importante en la
agricultura tropical (Chávez et al., 2016). El primer estadio ocurre dentro del huevo (J1),
posteriormente los juveniles del segundo estadio (J2), eclosionan. Estos pueden vivir
durante un mes libre en el suelo, tienen energía suficiente para moverse hasta localizar
y penetrar la raíz, donde establecen su sitio de alimentación, usualmente dentro del
periciclo y el tejido vascular (Cruz, 2013).
Se reproducen y se alimentan de células vivas dentro de las raíces de las plantas en
los que inducen agallas pequeñas y grandes, o nudos en la raíz, cuya severidad varía
dependiendo del grado de infestación por el nematodo y de la variedad y especie de la
planta parasitada, los síntomas en los cultivos son típicamente producidos por la falta
de crecimiento, un pobre desarrollo de las plantas con las hojas amarillentas. También
se aprecia senescencia temprana, las hojas muestran colores anormales, reducción del
sistema radicular, raíces infladas y producción reducida de frutos (Cantuña, 2013)
2.2 La alelopatía
Alelopatía se refiere a cualquier proceso donde haya metabolitos secundarios
producidos por plantas, microorganismos, virus y hongos que influyen en el desarrollo
de la agricultura y los sistemas biológicos. Las estrategias alelopáticas apuntan a la
reducción de la contaminación ambiental y a mantener un balance ecológico en la flora
y la fauna, con la disminución en el uso de pesticidas (insecticidas, fungicidas,
nematicidas y herbicidas) sustituir estos por compuestos naturales (plantas y
microorganismos); los aleloquímicos y fotoquímicos están libres de todos estos
problemas asociados con la presencia de pesticidas (Narwal,2001).
Es un fenómeno biológico por el cual un organismo produce uno o más compuestos
que influyen en el crecimiento, supervivencia o reproducción de otros organismos.
Estos compuestos son conocidos como aleloquímicos y pueden conllevar a efectos
benéficos (alelopatía positiva) o efectos perjudiciales (alelopatía negativa) a los
organismos receptores (Sampietro, 2003).
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El empleo de plantas alelopáticas resulta ser una de las alternativas agroecológicas
para combatir las plagas, enfermedades y elevar el rendimiento de cultivos. Esta se
define como el efecto perjudicial o estimulatorio que pueden ejercer microorganismos y
plantas sobre otras, mediante la liberación al medio de sustancias químicas, llamadas
aleloquímicos (Razzaghi et al., 2013).
Estos no son más que compuestos derivados del metabolismo secundario sintetizados
por las plantas que cumplen funciones no esenciales en ellas, de forma que su
ausencia no es letal para el organismo, al contrario que los metabolitos primarios. Los
metabolitos secundarios intervienen en las interacciones ecológicas entre la planta y su
ambiente (Tharayil, 2009). Además participan en la defensa contra predadores y
patógenos, para atraer a los polinizadores o a los dispersores de las semillas (Lorenzo
et al., 2010). Poseen una distribución restringida en el reino de las plantas, y algunos
solo se encuentran en una especie o grupo, por lo que a menudo son útiles en la
Botánica Sistemática.
La familia Combretaceae es muy rica en productos metabólicos, la mayoría de estos
son producidos y almacenados en sistemas secretorios especiales. Entre estos se
encuentran, terpenos, diterpenos, triterpenos, sesquiterpenos, ácidos grasos,
aminoácidos, alcaloides, flavonoides, cumarinas, y otros (Danos, 1988).
Los metabolitos secundarios de las plantas pueden ser divididos en 3 grandes grupos,
con base en sus orígenes biosintéticos:
1. Terpenoides. Todos los terpenoides, tanto los que participan del metabolismo
primario como los más de 25.000 metabolitos secundarios, son derivados del
Isopentenil difosfato o 5-carbono isopentenil difosfato (IPP) que se forman en la vía del
ácido mevalónico. Es un grupo grande de metabolitos con actividad biológica
importante (Choling, 2006). Están distribuidos ampliamente en las plantas y muchos de
ellos tienen funciones fisiológicas primarias. Unos pocos, como los que forman los
aceites esenciales, están restringidos a solo algunas.
2. Compuestos fenólicos y sus derivados. Desde el punto de vista de la estructura
química, son un grupo muy diverso que comprende desde moléculas sencillas como los
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ácidos fenólicos hasta polímeros complejos como los taninos y la lignina. En el grupo
también se encuentran pigmentos y flavonoides. Muchos de estos productos están
implicados en las interacciones planta-herbívoro (Peñarrieta et al., 2014).
Los más de 8.000 compuestos fenólicos que se conocen están formados o por la vía
del ácido shikímico o por la vía del malonato/acetato. Entre ellos se encuentran gran
cantidad de compuestos alelopáticos. Los fenoles simples con el cumárico, caféico y
felúrico presentan diferentes acciones desde la inhibición de la germinación de semillas
(Hernández, 2015) hasta la mortalidad de nematodos (El-Rokiek et al., 2011).
Otros de mayor complejidad como los taninos y flavonoides se encuentran en gran
cantidad de plantas su efectos alelopáticos son muy variables, dependen de la
concentración y tolerancia del organismo receptor (Hassan et al., 2011; Reiner et al.,
2016)
La idea de los compuestos fenólicos como agentes en la defensa química del vegetal
puede estar sobrevalorada, y algunos autores consideran que la característica general
de los polifenoles tánicos de acomplejarse con las proteínas para formar mezclas
insolubles es la propiedad esencial en la defensa operativa del vegetal (Beart, 1985).
En el caso de la soja se ha demostrado que los flavonoides cumestrol, faseol y
afromosina tienen efectos antibióticos (Caballero, 1986), y daidzeína, gliceolina, sojalol
y cumestrol tiene efectos antipredatorios y antibióticos contra la oruga de la col
Trichoplusia ni (Sharma, 1991).
Uno de los efectos fisiológicos más relevantes de los fenoles es la astringencia, basada
en el hecho de su capacidad de formar complejos con proteínas y mucopolisacáridos
(Ozawa et al., 1987). Un vegetal que acumule fenoles en sus hojas producirá un efecto
desagradable en el herbívoro predador, pues no será palatable. Así, una población de
herbívoros puede ejercer una presión selectiva hacia los vegetales de su entorno,
según sugiere la teoría actual de la coevolución animal-vegetal.
Los taninos son compuestos fenólicos poliméricos que se unen a proteínas
desnaturalizándolas. El nombre de tanino procede de la antigua práctica de utilizar
extractos vegetales para convertir la piel animal en cuero (en el curtido, se unen al
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colágeno aumentando su resistencia al calor, al agua y a microorganismos) (Avalos et
al., 2009).
Los propios autores plantean que existen dos categorías: taninos condensados y
taninos hidrolizables. Los taninos condensados son polímeros de unidades de
flavonoides unidas por enlaces C-C, los cuales no pueden ser hidrolizados pero sí
oxidados por un ácido fuerte para rendir antocianidinas.
Los taninos hidrolizables son polímeros heterogéneos que contienen ácidos fenólicos,
sobre todo ácido gálico y azúcares simples; son más pequeños que los condensados y
se hidrolizan más fácilmente. Generalmente son toxinas debido a su capacidad de
unirse a proteínas. También actúan como repelentes alimenticios de muchos animales
que evitan, en el caso de los mamíferos, plantas o partes de plantas que contienen
altas concentraciones de taninos. Esto ocurre en los frutos inmaduros en los que se
concentran los taninos en la piel (Avalos et al., 2009).
3. Alcaloides y compuestos nitrogenados: Los alrededores de 12.000 alcaloides que
se conocen, que contienen uno o más átomos de nitrógeno, son biosintetizados
principalmente a partir de aminoácidos. Los alcaloides poseen una gran diversidad de
estructuras químicas (Espinosa, 2012).
Son fisiológicamente activos en los animales, aún en bajas concentraciones, por lo que
son muy usados en medicina. Ejemplos conocidos son la cocaína, la morfina, la
atropina, la colchicina, la quinina, y la estricnina. En un sin número de plantas se han
identificado muchos de estos metabolitos. Sus propiedades insecticidas, acaricidas y
nematicidas, las convierten en herramientas útiles para el manejo de plagas agrícolas
(Taiz et al., 2006).
La mejor forma de aprovechar estos compuestos es mediante su extracción con el uso
de diferentes solventes como agua, alcohol, éter etílico, aceites, cetonas y benceno. La
maceración y decocción de los tejidos vegetales son uno de los mejores métodos para
preparar los extractos (Arboleda et al., 2012).
Las investigaciones en alelopatía en algunos casos permiten plantear estrategias
orientadas a una mayor sustentabilidad de los sistemas de producción agrícola, con un
___________________________________________________________Revisión Bibliográfica
12
menor consumo en insumos contaminantes. Para lograr un mejor aprovechamiento de
los agentes alelopáticos es necesario ampliar el conocimiento de los mismos en
relación a la rotación de cultivos, manejo de residuos, prácticas de labranza y la
implementación de control biológico de malezas (Hernández, 2015).
2.2.1 Plantas alelopáticas con efectos nematicidas
Los efectos alelopáticos de las plantas han sido reportados por varios autores, sus
estudios demuestran que pueden ser una vía de disminución de las poblaciones de
nematodos en el suelo.
Algunas investigaciones realizadas en Venezuela con extractos acuosos y abono verde
de: Cyperus rotundus L. (cyperaceae), Calotropis procera (Ait.) R. Br. (apocinaceae) y
Leucaena leucocephala L. (fabaceae) señalan el efectivo control sobre M. incognita.
Para el caso de C. procera su efecto fue comparable con el control logrado con el
nematicida Carburan (ac), (González et al., 2015). El carácter nematicida del extracto
acuoso de las hojas de esta planta produjo una mortalidad de 97,5% en los juveniles de
segundo estadio (J2) de M. incognita y M. exigua; 87,5% en los J2 de Tylenchulus
semipenetrans Cobb y 57,5% en hembras jóvenes de Rotylenchulus reniformis (Reina
et al., 2002).
El método de tratamiento a las plantas susceptibles varía según las características de
los compuestos alelopáticos. Al tratar las raíces del pimentón (Capsicum annum L.) con
el aceite esencial de tártago (Ricinus communis L.) se reduce la incidencia de M.
incognita (Akhtar et al., 1996). De igual forma, las raíces de este cultivo, previo al
trasplante, sumergidas en la solución acuosa al 0,5% de las plantas Ocimun sanctus L.,
O. basilicum L., Cymbopogon winterianus Jowitt., Eucaliptus ssp., y Vitex negundo son
capaces de causar 100% de mortalidad en M. incognita (Gillet al., 2001).
El extracto de canela (Qanum) y extractos de ajo, chile, picante, canela
PROGRANIC®GAMMA ejercen una actividad nematástica sobre Meloidogyne incognita
(Ayvar-Serna et al., 2018).
Estudios recientes (Rodríguez et al., 2014) han arrojado una reducción significativa de
la población de M. incognita mediante la desinfección de suelo con diferentes dosis de
___________________________________________________________Revisión Bibliográfica
13
residuos vegetales de (Azadirachta indica A.Juss) conocido como árbol del nim.
Además reduce la formación de agallas y masas huevos en 70,3% y 59,3%,
respectivamente (Zareena et al., 2014).
Entre las sustancias alelopáticas con carácter nematicidas se pueden mencionar los
politienilos, glucosinolatos, glucósidos, alcaloides, lípidos, terpenoides, esteroides,
fenoles, triterpenoides a los cuales se les atribuyen propiedades (Bôhm et al., 2009,
Akhtar et al., 2015). Así, especies como Sesamun indicum L (ajonjolí), Origanum
vulgare L (orégano), Chrysanthemum morifoliumL (crisantemo), Raphanus sativus L
(rábano), Brassica oleracea var. Capitata (repollo), Tagetes sp.(Tagete), Brassica
napus (canola), y Brassica nigra (mostaza) secretan durante su desarrollo o en su
desintegración en el suelo algunas de estas sustancias. En este sentido, la presencia
de glucosinolatos, en algunas brasicaceaes, durante su descomposición produce
compuestos conocidos como isotiocianatos y nitrilos, los cuales suprimen las
poblaciones de nematodos (Ávila et al., 2008).
14
3. Materiales y Métodos
3.1 Cuantificación de fenoles, flavonoides y taninos presentes en hojas de
Almendro de la india
Colecta y secado del material vegetal y obtención de extractos
El material vegetal se colectó de plantas adultas de Almendro de la india la primera
semana de cada mes del año 2017. Cada colecta consistió en tomar de la planta hojas
jóvenes (hojas verde claro de las zonas apicales de las ramas laterales, primer y
segundo par de hojas), adultas (hojas verdes oscuro, entre el tercer y cuarto par de
hojas de las ramas laterales) y senescentes (hojas de color rojizo posteriores al cuarto
par de hojas). Se tomaron muestras de diferentes plantas ubicadas en la zona urbana y
rural del municipio de Santa Clara provincia de Villa Clara.
Las muestras de las diferentes plantas correspondientes a un mismo mes se unificaron
según el tipo de hojas a fin de conformar los lotes.
Además, se tomaron las variables climáticas precipitaciones y temperatura de cada
mes según los registros facilitados por el Centro Provincial de Meteorología. Ellas
permitieron la posterior comparación de su composición química en función de las
condiciones imperantes en el momento de colecta.
Una vez colectadas las plantas se procedió al secado. Este fue en condiciones
controladas (estufa a 45 °C con tiro de aire) bajo condiciones de oscuridad. Pasados
siete días se molinaron en un molino de cuchillas a un tamaño de partícula máximo de
0,5 cm.
La cuantificación de los metabolitos secundarios se basó en resultados de trabajos
anteriores que demostraron que las hojas de Almendro de la india presentan un
elevado contenido de compuestos fenólicos, flavonoides y taninos por encima de otros
como saponinas y coumarinas (Espinosa, 2012). Ello llevó a corroborarlos como
metabolitos mayoritarios en las hojas de la planta en estudio y por tanto son los de
interés en el presente trabajo.
___________________________________________________________Materiales y Métodos
15
Las cuantificaciones se realizaron en el laboratorio de espectroscopia del Centro de
Investigaciones Agropecuarias (CIAP) perteneciente a la Facultad de Ciencias
Agropecuarias de la Universidad Central “Marta Abreu” de Las Villas. Para ello se
emplearon diferentes metodologías en función del metabolito de interés. Los análisis se
realizaron por triplicado y las lecturas de cada muestra fueron en un espectrofotómetro
UV-VIS (Génesis 6, EUA).
Cuantificación de compuestos fenólicos
Para la extracción de compuestos fenólicos de las hojas de Almendro de la india se
realizó una Extracción Asistida por Ultrasonido (EAU) a 20KHz de frecuencia por 30
min. Se partió de 0,1 g del material vegetal en 40 mL de agua destilada. Pasado este
tiempo se filtró el extracto obtenido y se realizó una dilución 1/30 (v/v) de la cual se
tomó una alícuota de un mililitro para su análisis. La metodología empleada para ello
fue el método colorimétrico con el reactivo de Folin-Ciocalteu propuesto por Gutiérrez
et al. (2008).
A un mililitro de cada extracto vegetal se adicionó 80 μL de Folin-Ciocalteu (1N), se
dejó reposar durante 5 min y se adicionaron 800 μL de carbonato de sodio (20 % p/v),
se llevó a un volumen final de 2 ml con agua destilada y se dejó reposar la mezcla por
90 minutos a una temperatura de 25±1°C. Finalmente se realizó la lectura a 750 nm en
el espectrofotómetro.
También se preparó una muestra “blanco” y un patrón. En la primera se sustituyó el
extracto por agua destilada y en la segunda por una disolución de ácido gálico de
concentración conocida (15 mg/L).
El contenido de fenoles totales de cada extracto se calculó partir de la fórmula que se
muestra a continuación:
Donde:
C (%) = Concentración porcentual de fenoles totales en base a ácido gálico contenidos
en un gramo de material vegetal.
𝐶(%) = 𝐴𝑏𝑠𝑀 ∗ 𝐶(𝑃) ∗ 8
𝐴𝑏𝑠𝑃 ∗ 𝑃𝑚𝑠
___________________________________________________________Materiales y Métodos
16
AbsM= Absorbancia de la muestra.
C (P)= Concentración del patrón (mg L-1)
AbsP= Absorbancia del patrón.
Pms = Peso de la muestra seca (mg).
Cuantificación de Flavonoides
La cuantificación de estos metabolitos se realizó por espectrofotometría UV-Vis
mediante el método del AlCl3 según describe Liu et al. (2008).
El procedimiento consistió en tomar 0,5 g del material vegetal y someterlo a EAU bajo
las mismas condiciones descritas anteriormente. En este caso el medio de extracción
fue etanol al 95%. Posteriormente, se tomó una alícuota de 1 mL a la cual se le
agregaron 60 μL de una disolución de NaNO2 (5% p/v), se mezcló con vórtex durante 5
min; seguidamente se añadieron 60 μL de AlCl3 (5% p/v) y se dejó reposar durante 6
min. A continuación, se adicionaron 400 μL de NaOH (1 M).Se dejó en reposo durante
10 min. La lectura de la absorbancia fue a 415 nm antes de 30 min. La determinación
del contenido de flavonoides en el material vegetal se realizó por triplicado y se expresó
en porcentaje de flavonoides (quercetina) a través de la fórmula:
Donde:
C (%) = Concentración porcentual de flavonoides totales en base a quercetina
contenidos en un gramo de material vegetal.
AbsM= Absorbancia de la muestra.
C (P)= Concentración del patrón (mg L-1)
AbsP= Absorbancia del patrón.
Pms = Peso de la muestra seca (g).
𝐶(%) = 𝐴𝑏𝑠𝑀 ∗ 𝐶(𝑃) ∗ 4
𝐴𝑏𝑠𝑃 ∗ 𝑃𝑚𝑠
___________________________________________________________Materiales y Métodos
17
Para determinar el factor Pms se tomaron varias muestras de 1g del material vegetal y
se secaron en estufa a 105 ºC, se dejó enfriar en una desecadora y se pesó. La
diferencia representa la humedad presente en la muestra (Vásquez et al., 1982).
Cuantificación de taninos totales
Los taninos totales se cuantificaron mediante el método de separación con
Polivinilpolipirrolidona (PVPP) (Makkar, 2003). Este método permite extraer los
compuestos tánicos del extracto tomando como base la capacidad astringente de los
taninos y por tanto su precipitación. Es necesario realizar una cuantificación de
compuestos fenólicos mediante el reactivo de Folin-Ciocalteu antes y después del
tratamiento con la PVPP. De esta forma se obtiene por diferencia el contenido de
taninos precipitado. La cuantificación de fenoles se realizará como se describió
anteriormente.
El tratamiento con PVPP consistió en tomar 1 mL del mismo extracto empleado para la
cuantificación de compuestos fenólicos y adicionarle 100 mg de PVPP. Se dejó reposar
por 10 min en baño de hielo a 4°C. Posteriormente se centrifugo a 3000 rpm por 15
min. Se colectó el sobrenadante y se realizó el desarrollo de color mediante el reactivo
de Folin-Ciocalteu.
3.2Aislamientoe identificación de nematodos del género Meloidogyne spp.
Los nematodos se obtuvieron a partir de plantas de pimientos con síntomas de su
infección (agallas o nodulaciones características). Una vez en el laboratorio (INIVIT) las
muestras se lavaron sucesivamente con agua destilada para eliminar restos de suelo y
materiales indeseables adheridos a estas.
Las raíces, una vez limpias, se colocaron en una cápsula de petri con 5 ml de agua.
Con ayuda de pinzas y agujas de disección bajo estereoscopio se separó la corteza de
las zonas dañadas, se colectaron las hembras adultas y se pasaron a otra capsula de
Petri con 5 mL de agua destilada para su incubación
Pasadas 72 horas se corroboró la eclosión de la masa de huevecillo adherida a las
hembras colectadas. Dada la alta concentración de individuos se realizó una dilución
___________________________________________________________Materiales y Métodos
18
1/10 (v/v) a fin de poder contarlos y establecer un estándar de 21 nematodos por
mililitro.
Identificación de nematodos
Para la identificación de nematodos se tomaron 20 hembras de las placas de cultivos
de los nematodos. Estas se seleccionaron bajo estéreo con ayuda de una micropipeta y
luego se colocaron en portaobjeto debidamente identificadas. Para esta selección se
tomaron zonas de alta concentración de nematodos a fin de encontrar una posible
elevada diversidad del parásito.
Posteriormente, con ayuda de pinzas y bisturí se cortaron los tejidos de las zonas
perianales de cada uno de los individuos y se hicieron las observaciones en
microscopio óptico a 40X y 100X.
La identificación se realizó con ayuda de claves taxonómicas y manuales de
identificación de nematología vegetal (Bongers, 2011).
3.3 Efecto alelopático de hojas de Almendro de la india sobre la sobrevivencia de
Meloidogyne spp.
Para determinar el efecto alelopático de las hojas de Almendro de la india se tomaron
los meses de mayor y menor cuantía de los metabolitos analizados. Se prepararon
cuatro concentraciones (25%, 50%, 75% Y 100%) en función del Total de Sólidos
Disueltos medidos posterior a la EAU empleando un Electrodo (InoLab) acoplado a un
phmetro (Hanna).
Se emplearon placas de 10 cm de diámetro en las cuales se depositaron los
nematodos contenidos en un mililitro del cultivo y el volumen de extracto
correspondiente según la concentración para un volumen final de 10mL (Tabla 1)
Tabla 1. Composición de los tratamientos ensayados
Conc
(%TDS)
VExt.
(ml)
Vaguadest
(ml)
Vnemat
(ml)
25 2,50 6,50 1
50 5.0 4.0 1
___________________________________________________________Materiales y Métodos
19
75 7.5 1.5 1
100 0,00 -
Para el caso de las concentraciones del 100% no se agregaron los nematodos
contenidos en un mililitro de la dilución sino se tomarán directamente y se colocaron en
la capsula de petri correspondiente.
Las placas se mantuvieron en oscuridad a 27 ±1 °C por 72h. Cada 24h se realizaron
observaciones en el estereoscopio para contar la cantidad de nematodos muertos. Se
tomó como evidencia de muerte aquellos nematodos que se mantenían inmóviles
cuando se les estimuló la región cefálica (Gamboa et al., 2016). Para el conteo se
dividió la cápsula de Petri en cuatro secciones y se realizó el recuento de cada una por
separado. A partir de los resultados obtenidos se determinó el porcentaje de mortalidad
de cada concentración según meses de colecta y edad de las hojas.
El análisis estadístico se realizó con el paquete InfoStat 2018. Para verificar
homogeneidad de varianza de realizó la prueba levinnet. A partir de este resultado se
corroboró que no existió distribución normal por lo cual se transformaron los datos
correspondientes al tipo raíz cuadrada Arcosen.
20
4. Resultados y Discusión
4.1 Cuantificación de fenoles, flavonoides y taninos presentes en hojas de
Almendro de la india
En la figura 1, 2 y 3 respectivamente se pueden apreciar los resultados de la
cuantificación de fenoles, flavonoides y taninos en los diferentes tipos de hojas acorde
con su edad en la planta.
De forma general el análisis reveló diferencias sustanciales en cuanto a los contenidos
de metabolitos en los diferentes meses del año. Los fenoles fueron los de mayor
cuantía, los cuales se encontraron en un rango entre 6 % y 10,5 % de un gramo de
material vegetal. Estos están seguidos por los taninos y los flavonoides en orden
descendente. Este efecto se debe a la propia cuantificación de los compuestos fenoles
mediante el desarrollo del color con el reactivo Folin Ciocalteau (Muñoz-Bernal et al.,
2017).
Los extractos de productos vegetales, ya sean acuosos u orgánicos, contienen una
gran cantidad de biomoléculas. Se ha estudiado que algunas de estas moléculas de
características no polifenólicas pueden interaccionar con el reactivo, lo que puede
repercutir en una sobreestimación. Algunos de los principales compuestos que pueden
interferir son: azúcares reductores como fructosa y glucosa, aminoácidos y ácido
ascórbico (Granato et al., 2016). Bajo este efecto no solamente reaccionan compuestos
fenólicos simples sino también aquellos polifenoles como taninos y flavonoides que se
cuantificaron con posterioridad de forma específica.
Al analizar de forma individual, se constató que para el caso de los fenoles (Figura 1)
contenidos en las hojas jóvenes se presentaron picos máximos en los meses de julio y
octubre y un mínimo en abril con un 7,6 %. Para las adultas las concentraciones no
variaron bruscamente como en las jóvenes. Sus concentraciones aumentaron
paulatinamente en un rango desde 6% y 10.1%.
_______________________________________________________Resultados y
Discusión
21
En las hojas senescentes experimentaron una tendencia a su disminución en
función del paso de los meses desde enero a diciembre. Sin embargo, se
presentaron puntos de inflexión a partir del mes de abril y se restablece de julio en
lo adelante.
Figura 1. Cuantificación de fenoles
Por su lado, los flavonoides (Figura 2) fueron los que se encontraron en menores
concentraciones. En las hojas jóvenes, los valores más elevados correspondieron
a los meses de abril y julio con 1,58 y 1,61 respectivamente. El valor más bajo en
estas hojas se encontró en el mes de noviembre correspondiente con un 0,7%.
Las hojas adultas y senescentes presentaron un pico máximo similar de
flavonoides en el mes de marzo (1,22% y 1,29% respectivamente).
Figura 2.Cuantificación de Flavonoides
0,00
0,20
0,40
0,60
0,80
1,00
1,20
1,40
1,60
1,80
Ene Feb Mar Abr May Jun Jul Ago Sep Oct Nov Dic
Fla
vo
no
ides
po
r g
ram
o d
e
ma
teria
l v
eget
al
(%)
Meses de colectaH. Jóvenes H. Adultas H. Senescentes
0,00
2,00
4,00
6,00
8,00
10,00
12,00
14,00
16,00
Ene Feb Mar Abr May Jun Jul Ago Sep Oct Nov Dic
Po
rcen
taje
de f
en
ole
s p
or
gra
mo
de m
ate
rial
veg
eta
l (%
)
Meses de colecta
H. Jóvenes H. Adultas H. Senescentes
_______________________________________________________Resultados y
Discusión
22
Adicionalmente las hojas adultas tuvieron un descenso de la concentración de
flavonoides en el mes de abril y esta ascendió paulatinamente hasta el mes de
julio con un valor similar al de marzo. Posteriormente ocurrió su descenso hasta su
estabilidad a partir del mes de octubre.
Por otro lado, las hojas senescentes presentaron en el mes de febrero los valores
más bajos de flavonoides entre todos los cuantificado (0,5 %). Después del mes
de abril los porcentajes se presentaron relativamente estables con el transcurso
del tiempo.
Las cuantificaciones de los taninos (Figura 3) presentaron un comportamiento
peculiar, ya que las hojas adultas tuvieron concentraciones altas respecto a las
jóvenes y senescentes, con excepción del primer trimestre para las senescentes
donde se elevó el contenido de taninos.
Figura 3. Cuantificación de taninos
En este primer trimestre del año tanto jóvenes como adultas presentaron valores
similares. En estas últimas, a partir del mes de abril los valores de compuestos
tánicos ascendieron hasta alcanzar valores de7, 8 % y 8,1% en los meses de junio
y septiembre respectivamente, con un leve descenso en julio. Posteriormente su
concentración disminuye hasta el final del año. Aunque en las jóvenes ocurrió el
ascenso de las concentraciones de taninos, no es comparable con los valores
alcanzados por las hojas adultas. Solamente en los meses de noviembre y
diciembre sus valores se igualan. En las hojas senescentes no se apreciaron
0,00
1,00
2,00
3,00
4,00
5,00
6,00
7,00
8,00
9,00
Ene Feb Mar Abr May Jun Jul Ago Sep Oct Nov Dic
Po
rcen
taje
de
tan
ino
s p
or
gra
mo
de
ma
teria
l v
eget
al
(%)
Meses de colecta
Hojas Jóvenes Hojas Adultas Hojas senescentes
_______________________________________________________Resultados y
Discusión
23
variaciones significativas, solamente se destaca el mes de abril con los
porcentajes bajos de este metabolito.
Según los resultados anteriores existe una dependencia del contenido de
metabolitos secundarios en relación con el tipo de hoja. Según su edad, en las
hojas jóvenes se presentan momentos de mayor riqueza de flavonoides mientras
que los taninos permanecen elevados en las adultas.
Las condiciones climáticas es otro factor que incide en la producción de
metabolitos secundarios. En el año de colecta se presentaron meses bien
diferenciados con respecto a las precipitaciones (figura 4). En el primer trimestre,
así como en los dos últimos meses del año las condiciones de sequía fueron
marcadas, en estos momentos las concentraciones de fenoles fueron bajas para
las hojas jóvenes y adultas
Figura 4. Climograma del período de colecta
La época lluviosa comienza a ser intensa para este año a partir de mayo con 256
mm presenta un pico en junio y comienza a descender desde julio hasta agosto.
En noviembre comienza nuevamente la sequía en el municipio de Santa Clara.
El contenido de fenoles no presentó una relación clara con las variaciones
ambientales. En las hojas jóvenes se presentaron, de forma indiferente, picos
tanto en meses lluviosos o secos con altas y bajas temperaturas respectivamente.
0
5
10
15
20
25
30
35
0
50
100
150
200
250
300
350
Tem
pe
ratu
ra m
ed
ia (
ºC)
Pre
cip
itac
ion
es
(mm
)
Precipitaciones Temperatura media
_______________________________________________________Resultados y
Discusión
24
Por su parte las adultas incrementaron paulatinamente el contenido de este
metabolito desde enero a diciembre, mientras que en las senescentes se mantuvo
relativamente constante con excepción del período abril-julio donde se observaron
fluctuaciones. Están no relacionadas con el aumento o disminución de la
temperatura o precipitaciones. De forma similar se evidenciaron los resultados de
las cuantificaciones de flavonoides. Los picos máximos y mínimos no
corresponden con momentos de variaciones de los datos climáticos analizados.
Por el contrario, las concentraciones de taninos presentaron cierta distribución en
función de los meses de sequía y bajas temperatura. Entre enero y marzo los tres
tipos de hojas presentaron la menor cantidad de compuestos tánicos. Igualmente,
tanto en hojas jóvenes, adultas como senescentes se encontraron valores
elevados del metabolito en la época lluviosa.
Se han realizado varios estudios fotoquímicos teniendo en cuenta la variabilidad
estacional del contenido de metabolitos secundarios (Valares, 2011, Ziyad et al.,
2017; Fuente, 2018). Ellos han tenido como objetivo determinar el momento
óptimo de colecta de la planta, a fin de obtener máximos rendimientos en
compuestos de interés. Además, se han buscado las coincidencias con
variaciones climáticas con el objetivo de predecir un momento de colecta
adecuado. Sin embargo, estos han arrojado una diversidad de situaciones para
estos mismos metabolitos en diferentes plantas.
Los resultados de Zarate (2012) indican las variaciones estacionales en la
concentración de compuestos fenólicos del látex de árboles de Sangre de drago
(Crotóndra covar. Draco Schltdl & Cham), euphorbiaceae que crece en Islas
Canarias. Como resultado se obtuvo un período (septiembre-noviembre) con
elevados contenidos de estos metabolitos y escaso en aquellos de verano e
invierno. Así mismo Avalos (2017) informa que estos compuestos no presentan
correlación con las condiciones climáticas en Eugenia clarensis Britton & P.
Wilson.
Estas contradicciones se han encontrado en varios trabajos científicos
consultados. Ello conlleva a inferir que la concentración de algunos metabolitos,
_______________________________________________________Resultados y
Discusión
25
como los fenoles y flavonoides, no dependen totalmente de las condiciones
climáticas sino del fotoperíodo que trae consigo niveles de radiación solar y
duración de los días y las noches características para cada uno (Gourine et al.,
2010; Yang et al., 2013).
En la planta de Almendro de la india se ha estudiado que está fuertemente influida
por este fenómeno. Es un árbol caducifolio, que pierde sus hojas a finales del año.
Después del mes de septiembre se hace lenta la producción de hojas jóvenes,
poco a poco las hojas se tornan rojizas lo cual evidencia su período de
senescencia. Entre los meses de diciembre y febrero las plantas pierden las hojas
y comienza sobre el mes de marzo una brotación acelerada. Es importante referir
que este fenómeno no ocurre de forma radical, sino que en una misma planta
convergen los tres tipos de hojas con prevalencia de unas u otras en dependencia
del cambio que experimenten (Espinosa 2012).
4.2 Aislamiento e identificación de nematodos del género Meloidogyne spp.
Las plantas colectadas presentaron síntomas
evidentes de la presencia de nematodos formadores
de agallas del genero Meloidogyne. Los estudios de
Perichi et al. (2019) sobre los cambios morfológicos
de las raíces de pimentón cv Río Tocuyo afectadas
por la especie M. incognita reveló que el nematodo es
capaz de inducir la formación de células gigantes
multinucleadas en el sitio de alimentación, ubicado
entre los haces del xilema y alrededor de la parte
cefálica de la hembra.
Las células del xilema próximas a la células gigantes
estaban comprimidas, destruidas y/o en posiciones atípicas
alterando notablemente la continuidad vascular.
Sin embargo, en su investigación este mismo autor concuerda con otros como
Vovlas et al. (2008) y Crozzoli et al. (2015) que indican que este síntoma no es
definitorio para discernir entre las diferentes especies del género Meloidogyne.
_______________________________________________________Resultados y
Discusión
26
Estas afectaciones se presentan como características esenciales ante la presencia
deotros integrantes del género. Dada la problemática se hace indispensable un
análisis específico del organismo causal.
Una observación minuciosa, a nivel microscópico (figura 5), de la zona vulvar de
las hembras adultas permitió discernir entre los patrones perienales de las cuatro
especies de Meloidogyne (Figura 6) de mayor incidencia en la zona tropical: M.
arenaria, M. hapla, M. incognita y M. javanica (Sasser, 1979).
Figura 6. Patrones perineales de nematodos del género
Meloidogyne:A – M. arenaria, B– M. hapla, C – M.
incognita y D – M. javanica. Fuente: Solano-Gonzales et
al. 2015
Las observaciones microscópicas revelaron que el 91% delos individuos
evaluados presentó forma elongada con arco dorsal elevado y cuadrado, campo
lateral ausente, señalado por estrías lisas a onduladas con algunas bifurcaciones
B
D C
Figura 5. Patrones perineales
de nematodos de muestras en
estudio observados al
microscopio (100X)
A
_______________________________________________________Resultados y
Discusión
27
en las líneas laterales, estrías en la cola más onduladas que en la región de la
vulva y a veces en forma de zig-zag, y con estrías gruesas. Estas características
coinciden con las de Meloidogyne incognita descritas en las claves taxonómicas
revisadas (Bongers, 2011). El 9% restante de las observaciones presentaron
patrones confusos que no brindaron claramente un valor de identificación.
M. incognita presenta una tasa de reproducción exponencial. Cada hembra puede
depositar más de 500 huevecillos, sin embargo, solo el 5% sobrevive y se
reproduce. A pesar de este bajo porcentaje la cifra de individuos después de la
cuarta generación puede estar cercana a 15 625 individuos (Frápolli, 2000). Este
hecho es indicativo de una alta tasa de reproducción y por ende crecimiento
poblacional.
Otro factor decisivo en la persistencia del organismo en el suelo es la competencia
interespecífica por el espacio vital dentro de las raíces de la planta hospedante
(Jaramillo et al., 2012), la susceptibilidad del cultivar ante el parásito (Cardona et
al., 2016) y la forma intensiva bajo régimen de monocultivo que se emplean en
estas casas de cultivo protegido.
Estas razones corroboran que la severidad del nematodo nodulador se ve
favorecida y por tanto se eleva la probabilidad de que M. incognita se encuentre
en altas concentraciones en un área determinada bajo las condiciones antes
mencionadas.
Esta especie es de alta importancia, puede causar hasta un 90% pérdidas en el
tomate (Agrios, 2005). Adicionalmente, se ha reportado que es el principal
nematodo fitoparásito asociado a este cultivo durante sus diferentes etapas
fenológicas. Su importancia se basa en la capacidad para dañar las raíces
secundarias; se reduce así su capacidad de alimentación y desarrollo (Karssen et
al., 2013).
_______________________________________________________Resultados y
Discusión
28
4.3 Efecto alelopático de hojas de Almendro de la india sobre la
sobrevivencia de Meloidogyne spp.
El efecto alelopático producido por las hojas con diferentes edades según sus
concentraciones se determinó a partir de aquellos meses donde se encontraron
los picos máximos y mínimos del total de sólidos disueltos. Ello permitió descartar
los momentos de colecta con resultados medios. En la Figura 7 se relacionan los
resultados de las mediciones de los TDS de los extractos acuosos de las
diferentes hojas
Figura 7. Total de Sólidos disueltos por meses de colecta
Para el caso de las hojas jóvenes se encontraron valores bajos respecto a las
adultas. Estas últimas presentaron los valores más elevados. Estos dos tipos de
hojas presentaron un comportamiento similar. A inicios del año sus valores fueron
bajos, pero fueron incrementándose hasta evidenciarse un pico en los meses de
julio y octubre. Sobre finales del año vuelven a obtenerse valores de menor
cuantía. Para el caso de las senescentes, se observó un decrecimiento del TDS
desde enero hasta mayo; mes en el cual sus valores fueron mínimos. Por otro
lado, se observaron los picos máximos en agosto y octubre.
El TDS está íntimamente relacionado con las características fenológicas de las
plantas. Como se explicó anteriormente al analizar la cuantificación de los
0
100
200
300
400
500
600
700
800
Ene Feb Mar Abr May Jun Jul Ago Sep Oct Nov Dic
TDS
(mg/
L)
Meses de colecta
Jóvenes
Adultas
Senecentes
_______________________________________________________Resultados y
Discusión
29
metabolitos secundarios en estudio las condiciones climáticas inciden
directamente en la producción de sustancias que compone tal parámetro.
En función de estos resultados se determinó trabajar con los meses que, de forma
general, presentaron los máximos valores en función del TDS: julio y octubre. Así
mismo con aquellos donde se observaron picos mínimos: enero y noviembre. De
esta forma se hace más factible la presentación de los resultados que permitan
llegar a conclusiones de una forma directa.
De forma general los resultados del efecto de los extractos acuosos de las hojas
de Almendro de la india según su edad develaron que no existen diferencias
significativas entre ellas (Tabla 2)
Tabla 2. Porcentaje de mortalidad de M. incognita según la edad de la hoja de
Almendro de la india
Edad de las hojas Mortalidad (%) EE
Jóvenes 62.86 1,31
Adultas 60.63 1.31
Senescentes 58.78 1.31
Medias con una letra común no son significativamente diferentes según prueba de Tukey(p > 0.05)
A pesar de tener edades diferentes las hojas presentaron efectos alelopáticos
similares, ello es indicativo de la presencia de metabolitos secundarios capaces de
limitar la sobrevivencia de los nematodos en estudio. Sin embargo, según el
alcance de la investigación es imposible definir si existe un mismo compuesto
químico presente en los tres tipos hojas con dicha acción o se debe a varias
sustancias que varían en función de la edad de la hoja con igual efecto alelopático.
Es preciso referir que, como se demostró anteriormente, las concentraciones de
los compuestos fenólicos varían en función de la edad de las hojas. De esta forma
los fenoles simples son más abundantes en las hojas senescentes y jóvenes. En
estas últimas, conjuntamente con las adultas, se encuentran valores elevados de
_______________________________________________________Resultados y
Discusión
30
flavonoides mientras que los taninos se presentan en mayor cuantía en las
adultas.
Lo anterior conlleva a inferir que cada uno de los metabolitos puede tener una
acción preponderante en la acción alelopática. Sin embargo, se desprende la
necesidad de profundizar el estudio con el aislamiento de estas sustancias según
la edad de las hojas para corroborar dicho planteamiento.
En los meses de menor concentración de sólidos disueltos (enero y noviembre) se
presentaron resultados similares a los de julio y octubre. En estos últimos el valor
de los TDS fue máximo (Figura 8). Ello indica que la toxicidad de los metabolitos
que se presentan en el extracto es suficientemente elevada para M. incognita
como para ejercer acción alelopática negativa aun cuando se encuentre en bajas
concentraciones.
Medias con una letra común no son significativamente diferentes (p > 0.05)
Figura 8. Porcentaje de mortalidad de los nematodos según la concentración del
extracto en los meses de colecta
De esta forma se aprecia que en todos los meses la concentración del 100%
indujo los valores más elevados de mortalidad, diferenciándose del resto de las
cbc
bc
a
bc
c
bc
a
b bcb
a
bcc c
a
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
25 50 75 100 25 50 75 100 25 50 75 100 25 50 75 100
Enero Julio Octubre Noviembre
Porc
enta
je d
e m
ort
alid
ad
Dosis por meses de colecta
_______________________________________________________Resultados y
Discusión
31
concentraciones, pero con efectos biológicos similares entre sí. Para el 25%, 50%,
y 75% del TDS los porcentajes de mortalidad fueron muy parecidos, aunque se
apreciaron diferencias estadísticas entre algunas de estas en función de los
meses en estudio
Se evidencia la dependencia del efecto biológico con la concentración del extracto
probado. A medida que se fue aumentando la cantidad de sólidos disueltos por
unidad de volumen los valores de mortalidad fueron similares (para las
concentraciones del 25% al 75%) o mayores. En tal sentido varios autores
evidencian dicha relación Tharayil, 2009; Álvarez et al., 2016; Cepeda et al.,
2018).
Estos resultados son similares a los reportados por Garrido et al. (2014), quienes
evaluaron bajo condiciones de laboratorio el control de M. incognita con extractos
de nogal pecanero. En su composición química esta planta presenta elevadas
concentraciones de compuestos fenólicos al igual que el Almendro de la india. En
su caso se reportó la mayor actividad nematicida con el 89% de mortalidad.
Por otro lado, Vinueza et al. (2006) reportaron la efectividad de extractos acuosos
de distintas plantas sobre juveniles de Meloidogyne spp. Además, indican su
eficiencia sobre otros concentrados con diferentes medios de extracción
Arias et al. (2018) demostró que la infestación de la planta de frijol común con
nematodos del género Meloidogyne induce la activación de diferentes rutas
metabólicas encaminadas a la producción de metabolitos secundarios con acción
defensiva para la planta. Una de estas es la de la producción de fenilpropanoides.
A partir de la medición de la concentración de la enzima Fenilalanina amonioliasa
se evidenció que la producción de compuestos fenólicos es una de las claves para
la resistencia del frijol común ante M. incognita. De este resultado se infiere que
los compuestos fenólicos juegan un papel importante en la protección de la planta
contra el nematodo agallero.
32
5. Conclusiones
1. La edad de las hojas del Almendo de la india, así como los meses del año
inducen variaciones en la concentración de fenoles, flavonoides y taninos.
2. La máxima concentración de sólidos disueltos se presentaron en los meses
de julio y octubre mientras que sus mínimos en los de enero y noviembre.
3. Las hojas jóvenes, adultas y senescentes indujeron valores de mortalidad
semejantes (62.86%, 60.63% y 58.78 respectivamente) sin diferencia
significativas entre ellos.
4. La concentración del 100% de los extractos de hojas colectados en los
meses de enero, julio, octubre y noviembre presentaron porcentajes de
mortalidad semejantes (79,18%, 83,92%, 84,92% y 77,32%
respectivamente) con diferencias significativas con el resto de las
concentraciones.
5. Las concentraciones del 25%, 50% y 75% de los extractos de los meses en
estudio indujeron porcentajes de mortalidad en el rango del 50% al 60% con
diferencias poco apreciables entre sí.
33
6. Recomendaciones
1. Extender los resultados obtenidos a condiciones semicontrolas y de campo.
2. Profundizar en la identificación del tipo o conjunto de metabolito secundario
que posee la acción nematicida en los diferentes tipos de hojas según los
meses de colecta.
34
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