UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

Curso de Graduação em Farmácia-Bioquímica

DENGUE: ALVOS MOLECULARES POTENCIAIS E NOVAS

PERSPECTIVAS TERAPÊUTICAS

Mariana Montemagni Pires

Trabalho de Conclusão do Curso de

Farmácia-Bioquímica da Faculdade de

Ciências Farmacêuticas da

Universidade de São Paulo.

Orientador(a):

Profa. Dra Jeanine Giarolla Vargas

São Paulo

2017

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SUMÁRIO

p.

Lista de Abreviaturas 3

Resumo 5

1. Introdução 7

2. Objetivos 13

3. Materiais e Métodos 14

4. Resultados e Discussão 15

4.1. Inibidores de Entrada 18

4.2. Inibidores de Replicação 24

5. Conclusão 31

6. Bibliografia 33

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LISTA DE ABREVIATURAS

ADE Dengue exacerbada dependente de anticorpo (antibody-dependent

enhancement)

AIDS Síndrome da Imunodeficiência Adquirida (Acquired Immunodeficiency

Syndrome)

ALT Alanina aminotransferase

ANVISA Agência Nacional de Vigilância Sanitária, Brasil

AST Aspartato aminotransferase

βOG N-octil-β-d-glicosídeo

CC50 Concentração do composto que provoca morte em 50% das células

CDC Centro de controle e prevenção da doença (Center for Disease

Control and Prevention)

CRDS Curdlan sulfate compound

DAA Agente antiviral direto (Direct Antiviral Agent)

DENV Vírus da dengue

DF Dengue febril (dengue fever)

DHF Febre hemorrágica (dengue hemorrhagic fever)

DSS Síndrome do choque (dengue shock syndrome)

DWS Dengue com sinais de alarme (dengue with warning signs)

DWWS Dengue sem sinais de alarme (dengue without warning signs)

EC50 Concentração do composto que induz metade do efeito máximo

FcR Receptor Fc (fragment, crystallizable)

GAG Glicosaminoglicano

HCV Vírus da hepatite C

IB Instituto Butantan

IL Interleucina

IMPα/β1 Importina

JAK Via de sinalização extracelular-núcleo (Janus kinase)

MS Ministério da Saúde, Brasil

MTase Metiltransferase

NES Sequência de exportação nuclear (nuclear export signal)

NI Inibidor análogo ao nucleotídeo (nucleotide analog inhibitor)

4 de 39

NHS Serviço Nacional de Saúde, Reino Unido (National Health Service)

NLS Sequência de importação nuclear (nuclear localization sequence)

NNI Inibidor não-nucleotídico (non-nucleotide inhibitor)

PNCD Plano Nacional de Controle de Dengue

PRR Receptor de reconhecimento padrão (Pattern Recognition Receptor)

RdRp RNA polimerase RNA-dependente

REA Relação Estrutura-Atividade

RMN Ressonância magnética nuclear

RNA Ácido ribonucleico (ribonucleic acid)

SD Dengue grave (severe dengue)

SNC Sistema Nervoso Central

STAT Via de sinalização extracelular-núcleo (Signal Transducer and

Activator of Transcription)

WHO Organização Mundial da Saúde (World Health Organization)

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RESUMO

MONTEMAGNI PIRES, M. Dengue: alvos moleculares potenciais e novas

perspectivas terapêuticas. 2017. Trabalho de Conclusão de Curso de

Farmácia-Bioquímica – Faculdade de Ciências Farmacêuticas – Universidade

de São Paulo, São Paulo, 2017.

Palavras-chave: Dengue, DENV, novos alvos, tratamento.

INTRODUÇÃO. Segundo a Organização Mundial de Saúde, a dengue é

classificada como doença tropical negligenciada, com alta incidência em países

em desenvolvimento. Não possui tratamento específico, o que contribui para os

elevados números de mortes e hospitalizações nas áreas atingidas. Dessa

forma, o planejamento de compostos específicos, seguros e eficazes para o

tratamento desta infecção é uma necessidade urgente. OBJETIVO. Face ao

exposto, o objetivo deste trabalho é apresentar um panorama geral sobre a

dengue, discutindo, principalmente, sobre alvos moleculares promissores, bem

como moléculas que podem ser úteis no tratamento da doença Pretende-se,

também, apresentar, quando possível, a relação estrutura-atividade destes

antivirais. MATERIAL E MÉTODOS. O trabalho foi realizado através de revisão

bibliográfica. Foram utilizados artigos científicos, em português e inglês,

acessados nas bases de dados Web of Science e PubMed. Alguns websites

também foram consultados. O primeiro passo foi a busca pelos artigos, seguido

pela seleção dos materiais. Prosseguiu-se, então, com uma leitura dinâmica e

com os artigos e publicações selecionados, realizou-se a leitura aprofundada e

as informações obtidas foram analisadas, interpretadas e discutidas.

RESULTADOS. O genoma do vírus da dengue é composto por RNA de fita

simples, senso positivo, que codifica proteínas estruturais, denominadas de

capsídeo (C), membrana (M) e envelope (E), fundamentais na ligação ao

receptor, fusão de membrana, indutor de resposta imune, hemaglutinação,

formação e maturação do vírion. Já as não-estruturais, NS1, NS2A, NS2B,

NS3, NS4A, NS4B e NS5, são responsáveis pelos processos de replicação,

montagem e evasão da resposta imune do hospedeiro. Algumas moléculas

estão em estudo por atuarem como inibidores destas proteínas. CONCLUSÃO.

6 de 39

Apresentaram-se 13 moléculas promissoras neste trabalho. Entre elas, quatro

apresentaram eficácia e segurança in vivo (7-DMA/MK-0608, ST-148, ST-610 e

composto 1/NITD008) e nove foram estudadas apenas em testes in vitro

(CRDS, SA-17, NITD448, DN59, 1OAN1, ARDP0006, ARDP0009, composto 32

e ivermectina). Entretanto, nenhuma delas foi estudada em ensaios clínicos,

até então. Já os compostos ST-148 e ST-610 precisam ter seus perfis

farmacocinéticos melhorados para administração oral (BYRD et al., 2013a;

BYRD et al., 2013b), enquanto o composto 1/NITD008 deve ser melhor

estudado em relação à sua toxicidade (YIN et al., 2009). O composto 7-

DMA/MK-0608, por fim, não apresentou nenhum obstáculo em seu estudo in

vivo (SCHUL et al., 2007), portanto ensaios clínicos podem ser realizados para

a molécula.

7 de 39

1. INTRODUÇÃO

O vírus da dengue (DENV) pertence à família Flaviviridae e gênero

Flavivirus, e possui quatro diferentes sorotipos: DENV-1, DENV-2, DENV-3,

DENV-4. Uma vez infectado por um determinado sorotipo, a imunidade a ele é

vitalícia, porém, em uma posterior infecção, com outro sorotipo, há

possibilidade de desenvolver formas graves da doença (MURRAY, QUAM,

WILDER-SMITH, 2013).

Apesar de a dengue causar grandes impactos econômicos e sociais,

ainda existe um descaso nas políticas públicas com campanhas de controle e

incentivo à pesquisa. Desta forma, a doença foi classificada como uma Doença

Tropical Negligenciada, e é considerada uma prioridade para a Organização

Mundial de Saúde (WHO, do inglês World Health Organization). Esta

Organização lançou o programa “Global Strategy for Dengue Prevention and

Control 2012-2020”, com o objetivo de reduzir a epidemia e seus impactos

(WHO, 2012). Denominam-se Doenças Tropicais Negligenciadas infecções

parasitárias, virais, bacterianas ou fúngicas, as quais afetam, principalmente,

populações carentes de países em desenvolvimento. Na América Latina,

estima-se que 40% da população, o que corresponde a 556 milhões de

pessoas, viva abaixo da linha da pobreza (HOTEZ et al., 2008).

A virose não possui tratamento específico, portanto seu controle

depende de políticas públicas de controle dos vetores (MURRAY, QUAM,

WILDER-SMITH, 2013). No Brasil, o Ministério da Saúde, com o objetivo de

controlar a epidemia de dengue após a detecção da cocirculação de três

sorotipos no país, implementou, em 2002, o Plano Nacional de Controle da

Dengue (PNCD). Este plano, no entanto, não atingiu suas metas e a doença

espalhou-se rapidamente por todo o país (PESSANHA et al., 2009).

O primeiro caso de dengue, atualmente conhecido, ocorreu durante a

Dinastia Chinesa, em que sintomas compatíveis com a doença e uma possível

relação com insetos voadores foram descritos em uma enciclopédia médica. O

vetor A. aegypti tem origem incerta, mas acredita-se que ele tenha se

espalhado a partir de navios saindo da África e Ásia entre os séculos XVIII e

XIX. Durante as guerras mundiais a doença expandiu-se rapidamente e, no fim

da Segunda Guerra Mundial, cocirculação de sorotipos e surgimento de formas

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graves da doença foram reportadas na Ásia (MURRAY, QUAM, WILDER-

SMITH, 2013).

Cerca de 3,9 bilhões de pessoas moram em regiões com alto risco de

infecção por dengue, que já atinge 128 países (WHO, 2017). Hales e

colaboradores (2002) acreditam que, até 2085, ao menos 50% da população

mundial estará vivendo em regiões endêmicas (HALES et al., 2002). De acordo

com a WHO, a incidência da doença é de 350 milhões de infecções por ano,

com 96 milhões de pessoas apresentando sintomas (WHO, 2017). Estima-se

que 70% das infecções ocorram na Ásia, 14% nas Américas e 16% na África

(EBI, NEALON, 2016). Entretanto, sabe-se que os números de casos

reportados de infecções, DHF/DSS (do inglês dengue hemorrhagic fever, DHF,

ou síndrome do choque, do inglês dengue shock syndrome, DSS) e morte não

condizem com a realidade.

No Brasil, DENV-1 foi identificado em 1846, DENV-2 em 1990, DENV-3

em 2001 e DENV-4 em 2010 (PASTRANA et al., 2014). Todos os quatro

sorotipos cocirculam no País. Em 2009, o Brasil apresentava o maior número

de casos de dengue no mundo (TEIXEIRA et al., 2009). Somente em 2010, 1

milhão de casos foram reportados no país, com uma taxa de infecção de

538/100.000 habitantes, levando a 94 mil hospitalizações e 678 mortes

(TEIXEIRA et al., 2013). Isso representa cerca de 60,4% de todos os casos

reportados no mundo (MACHADO et al., 2014).

Grandes epidemias de dengue são comuns no continente americano,

sobretudo em países do Caribe, Brasil, Colômbia, Equador, México e

Venezuela. Na América Latina, o número de infecções continua aumentando

de forma alarmante. Em 2011 foram relatados 652.212 casos, já em 2013 o

número subiu para 2.386.836. No mesmo período, o número de mortes

aumentou de 92 para 1.318 (SARTI et al., 2016). Esse perfil também pode ser

visto ao se comparar o número total de casos relatados na década de 80 com

os observados entre 2000 e 2007, que aumentou de 1.033.417 para 4.759.07.

A incidência de DHF/DSS também aumentou no continente, de 13.398, na

década de 80, para 111.724, entre 2000 e 2007, o que pode ser explicado pela

cocirculação dos 4 sorotipos do vírus (MARTÍN et al., 2010). O custo anual da

doença na América chega a US$ 2.1 bilhão, em que 60% corresponde à perda

de produtividade (SHEPARD et al., 2011).

9 de 39

Dentre os quatro sorotipos, DENV-2 é considerado o mais relevante

por apresentar a maior população efetiva, enquanto DENV-1 e 3 têm

apresentado alto crescimento (COSTA, VOLOCH, SCHRAGO, 2012). Em

relação aos vetores, Kraemer e colaboradores (2015) mapearam a distribuição

do A. Aegypti e A. Albopictus a partir de estudos publicados entre 1960 e 2014.

O A. Aegypti é encontrado, principalmente, em regiões tropicais e subtropicais,

concentrando-se no norte do Brasil e sul da Ásia. Já o A. Albopictus é visto em

regiões com temperaturas mais amenas, concentrando-se no sul da Europa e

do Brasil, além do norte da China, Estados Unidos e Japão (KRAEMER et al.,

2015). O crescente aumento da incidência da virose pode ser explicado pela

maior distribuição destes dois vetores, devido à ineficácia de programas de

controle dos vetores, urbanização, migrações e inundações (TORRES,

CASTRO, 2007).

O ciclo de vida do vírus inicia-se com a ingestão, pela fêmea do A.

Aegypti, de sangue ao picar um indivíduo com viremia. Com isso, ocorre

infecção das células epiteliais do intestino e, em seguida, da hemocele e, por

último, da glândula salivar. O período de incubação, necessário para o

mosquito ser transmissor da doença, é de 8 a 12 dias. Após este período, ao

picar um indivíduo, o mosquito transmite a doença por infectá-lo com o vírus

secretado na saliva. Além da transmissão ao ser humano, também ocorre

transmissão vertical, uma vez que o vírus é capaz de infectar o trato genital e

entrar nos ovos maduros durante a oviposição (POOJA, AMRITA, VINEY,

2014).

A dengue pode ser assintomática ou manifestar-se como dengue febril

(do inglês dengue fever, DF), febre hemorrágica (DHF) ou síndrome do choque

(DSS) (WHO, 2009). Estas denominações foram revisadas em 2009, a fim de

facilitar a identificação de pacientes com maiores riscos de desenvolver

complicações. Basearam-se, então, nos sintomas e sinais indicativos de

desfecho grave da doença (MACHADO et al., 2014). A nova classificação

compreende, atualmente, dois grandes grupos subdivididos em um total de

cinco classificações, de acordo com a gravidade dos sinais e sintomas:

Dengue:

o com sinais de alarme (do inglês dengue with warning signs, DWS):

indivíduo vive ou viajou para área endêmica e apresenta, além de febre, dois

10 de 39

dos seguintes critérios: náusea, vômito, rash, dores, leucopenia e teste positivo

para torniquete;

o sem sinais de alarme (do inglês dengue without warning signs, DWWS):

indivíduo apresenta dor abdominal, vômito persistente, acúmulo de fluídos,

sangramento de mucosa, letargia, inquietação, hepatomegalia maior que 2 cm,

aumento de hematócrito com rápida diminuição das plaquetas;

Dengue grave (do inglês severe dengue, SD):

o Grave extravasamento de plasma: acúmulo de fluido com dificuldade

respiratória; pode levar ao choque;

o Grave hemorragia: conforme avaliação médica;

o Grave disfunção orgânica: fígado com AST ou ALT abaixo de 1000,

sistema nervoso central (SNC) com consciência prejudicada, coração ou outros

órgãos (WHO, 2009).

Em 2014, o Brasil começou a utilizar a nova classificação como base e

estabeleceu, no guia do Ministério da Saúde, as seguintes denominações:

Fase Febril: febre com duração de 2 a 7 dias concomitante com cefaleia,

fraqueza muscular, mialgia, artralgia e dor retro-orbitária; pode haver

exantema, anorexia, náusea, vômito e diarreia;

Fase Crítica:

o Dengue com sinais de alarme: a diminuição da febre é acompanhada

por sinais de alarme como dor abdominal, vômitos persistentes, acúmulo de

fluídos, hipotensão postural, hepatomegalia maior que 2 cm, sangramento de

mucosa, letargia, inquietação, aumento de hematócrito;

o Dengue Grave: extravasamento de plasma com acúmulo de fluídos e

dificuldade respiratória, sangramento grave ou disfunção orgânica com

comprometimento do fígado, coração, SNC, pulmão e rins;

Choque: ocorre devido ao alto extravasamento de plasma durante

24-48 horas, e pode levar à morte em apenas 12 horas se não tratado

rapidamente; pode haver disfunção cardíaca grave, síndrome da angústia

respiratória e pneumonite;

Hemorragia grave: grande hemorragia sem choque prolongado;

Disfunção grave de órgãos: hepatites, encefalites, miocardites;

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Fase de Recuperação: reabsorção do fluido, normalização do débito

urinário; podem ocorrer bradicardia, rash e até infecções bacterianas (MS,

2016).

Atualmente não existe tratamento antiviral contra a dengue (CDC,

2016; NHS, 2016). Pacientes são tratados, basicamente, com terapia de

suporte e fluidos. Diagnóstico rápido e correto, no início da doença, é

importante para definir qual terapia será realizada, iniciá-la rapidamente e evitar

hospitalizações desnecessárias. Da mesma forma, o monitoramento contínuo,

em busca de sinais de alarme, é fundamental a fim de evitar a progressão da

infecção para a fase crítica, bem como para o choque. A terapia indicada pelo

Ministério da Saúde é definida conforme classificação A-D, baseada no

diagnóstico recebido:

Grupo A: pacientes diagnosticados com dengue em fase febril sem

sinais de alarme, comorbidades e risco social. Monitoramento em busca de

sinais de alarme deve ser realizado diariamente por um profissional da saúde.

A terapia é realizada em casa, com hidratação oral a base de soro, sucos e

outros líquidos que permitam a recuperação dos eletrólitos perdidos durante a

febre e vômitos. Paracetamol pode ser utilizado para febre. Anti-inflamatórios

não esteroides não devem ser administrados, pois podem agravar

sangramentos;

Grupo B: pacientes diagnosticados com dengue em fase febril sem

sinais de alarme, mas com comorbidades e/ou risco social e/ou condição

especial. Monitoramento constante da contagem de hematócritos e em busca

de sinais de alarme. O paciente é hospitalizado em leito de observação, mas a

terapia também se baseia em hidratação oral e paracetamol, se necessário;

Grupo C: pacientes diagnosticados com dengue com sinais de alarme,

mas sem sinais de gravidade. Contagem de hematócritos deve ser realizada

antes do início da terapia e monitorada continuamente ao longo do tratamento.

O paciente é hospitalizado em leito de internação e a terapia de hidratação é

intravenosa;

Grupo D: pacientes diagnosticados com dengue grave. Contagem de

hematócritos deve ser continuamente monitorada. O paciente é hospitalizado

em leito de emergência para terapia com fluido isotônico cristaloide

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intravenoso. Realiza-se transfusão de sangue naqueles com hemorragia grave

ou choque (MS, 2016; WHO, 2009).

A única vacina registrada no país, Dengvaxia®, foi desenvolvida pela

Sanofi-Aventis com vírus quimérico dos quatro sorotipos de DENV, obtidos por

tecnologia de DNA recombinante. Associou-se o vírus atenuado da febre

amarela e os sorotipos de DENV. O registro foi concedido pela Agência

Nacional de Vigilância Sanitária em 28/12/2015 e a vacina encontra-se

disponível somente em clínicas particulares (ANVISA, 2017b; G1, 2016; Sanofi

Pasteur, 2017). O Instituto Butantan também vem investindo em uma vacina

tetravalente com vírus atenuado, que se encontra em fase três da pesquisa

clínica (IB, 2017; Portal Brasil, 2016).

O desenvolvimento de uma vacina, no entanto, representa grandes

desafios, uma vez que ela deve imunizar o indivíduo, de forma vitalícia,

igualmente e simultaneamente, contra os quatro sorotipos. A vacina com vírus

atenuados, apesar de eficaz, apresenta algumas desvantagens como a

necessidade de doses de reforço, em intervalos de pelo menos seis meses. A

inoculação isolada não induz imunização à todos os sorotipos. Desta forma,

existe um risco de a resposta incompleta induzida pelas imunizações iniciais

exacerbar a resposta imunológica, caso o indivíduo se infecte pela doença

durante o período entre as doses (POOJA, AMRITA, VINEY, 2014).

Devido à inexistência de tratamentos específicos, ressalta-se a

importância do planejamento de antivirais seguros e eficazes potencialmente

ativos nesta enfermidade. As evoluções nos métodos de identificações de alvos

moleculares, tais como nas técnicas de raios-X e ressonância magnética

nuclear (RMN), permitiram grandes avanços no campo da química

farmacêutica medicinal (FERREIRA et al., 2015). Mais de 100.000 proteínas

tiveram suas estruturas reconhecidas, fornecendo informações cruciais no

design de um líder (BERMAN, 2000; FERREIRA et al., 2015). Assim, a

estratégia de Structure Based Drug Design tornou-se muito importante no

desenvolvimento de um fármaco (BLUNDELL, 1996; SALUM, POLIKARPOV,

ANDRICOPULO, 2008; MOITESSIER et al., 2016).

Alguns estudos mostraram que DENV-2 e 3 estão mais associados à

DHF, e que DENV-2 asiático é mais virulento que DENV-2 americano, já que o

último está mais associado à DF. Alterações de nucleotídeos foram

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identificadas nos genes de algumas proteínas, em especial no aminoácido de

posição 390 da glicoproteína E, sítio ligado à especificidade ao alvo e virulência

(RODENHUIS-ZYBERT, WILSCHUT, SMIT, 2010).

As proteínas, estruturais e não-estruturais, fundamentais para o ciclo

de infecção e replicação viral, constituem, portanto, importantes alvos

moleculares. Tais proteínas, assim como moléculas com potenciais ações

sobre elas e, assim, promissoras no tratamento da dengue, serão discutidas

adiante neste trabalho. Um tratamento ideal para a dengue deve apresentar as

seguintes características: (1) ser eficaz contra os quatro sorotipos do vírus,

com perfil de segurança bem tolerado em todas as faixas etárias; (2) ter baixa

toxicidade e interação com outros medicamentos; (3) apresentar rápida ação e

resolução dos sintomas, de preferência para administração oral, em dose única

diária, a fim de aumentar a aderência ao tratamento e diminuir os custos com

internações e (4) deve ser estável em temperatura ambiente, a fim de facilitar

sua distribuição para zonas rurais e de baixo custo. Ressalta-se que os países

mais afetados também estão entre os mais pobres (CHAN, OOI, 2015; LIM et

al., 2013). Um dos principais problemas em torno de terapias com agentes

antivirais diretos (DAA, do inglês direct antiviral agents) é a rápida queda na

viremia, que reduz em 10 vezes dentro de 24 horas e em 100 vezes dentro de

48 horas. Questiona-se, assim, se este tipo de abordagem é realmente útil para

o tratamento da dengue. Assim, o antiviral deve ter ação rápida e o diagnóstico

deve ser realizado o mais cedo possível, o que não é realidade para grande

parte da população em risco de infecção (LIM et al., 2013).

2. OBJETIVOS E JUSTIFICATIVAS

A dengue representa um problema de saúde pública em muitos países

e regiões. O esquema terapêutico constitui, basicamente, do controle dos

sinais e sintomas da doença. Assim, o planejamento de compostos específicos,

seguros e eficazes para o tratamento desta infecção é uma necessidade

urgente. Face ao exposto, o objetivo deste trabalho é apresentar um panorama

geral sobre a dengue, discutindo, principalmente, sobre alvos moleculares

promissores, bem como moléculas que podem ser úteis no tratamento da

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virose. Pretende-se apresentar, quando possível, a relação estrutura-atividade

destes antivirais.

3. MATERIAL E MÉTODOS

O trabalho foi realizado através de revisão bibliográfica. Utilizaram-se

artigos científicos, em português e inglês, acessados nas bases de dados Web

of Science e PubMed. Consultaram-se, também, alguns websites.

O primeiro passo foi a busca pelos artigos, entre 23 de Julho de 2016 e

20 de abril de 2017, realizada usando-se os seguintes descritores: dengue,

DENV, DHF, alvos moleculares, targets, doenças negligenciadas, neglected

tropical diseases, antiviral agents, tratamento, treatment, inhibitor. Devido à

grande quantidade de material relacionado à dengue, a coleta de artigos foi

restrita àqueles que apresentassem os descritores em seu título ou abstract.

Publicações em websites também foram pesquisadas usando-se as mesmas

palavras-chave no buscar do Google. Restringiu-se somente a materiais

publicados nos últimos 10 anos, ou anterior a isso, no caso de artigos com

grande número de citações.

Realizou-se a primeira seleção dos artigos e publicações através da

leitura do título e seu abstract, ou resumo, se aplicável. Em um segundo

momento, prosseguiu-se com uma leitura dinâmica, a fim de selecionar aqueles

materiais de interesse para o trabalho. Ao todo, selecionaram-se 60 artigos,

publicações e websites. Com os artigos e publicações escolhidos, prosseguiu-

se com a leitura aprofundada e registro das informações extraídas. Por fim, as

informações obtidas foram analisadas, interpretadas e discutidas através de

uma leitura analítica e readequação do texto.

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4. RESULTADOS E DISCUSSÃO

O genoma do vírus da dengue é composto por RNA de fita simples,

senso positivo, de aproximadamente 11 kb, que codifica proteínas estruturais e

não-estruturais (Figura 1). As proteínas estruturais são denominadas de

capsídeo (C), membrana (M) e envelope (E), já as não-estruturais são NS1,

NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B e NS5 (KAPTEIN, NEYTS, 2016).

Figura 1. Estruturas das proteínas e as regiões da fita de RNA onde elas

estão inseridas (adaptado de TOMLINSON, MALMSTROM, WATOWICH, 2009).

A proteína C, formada por quatro α-hélices (α1 – α4), é rearranjada em

dímeros para formar uma molécula côncava, com as hélices α4 - α4’

constituindo a base, responsável pela interação com o RNA. As hélices α2- α2’

e α1- α1’, no topo da estrutura, estão envolvidas com membranas (BYRD et al.,

2013a). A proteína M contém sete cadeias β antiparalelas, estabilizadas por

três ligações dissulfeto. Esta proteína pode ser encontrada nas células

infectadas como proteína pré-membrana (prM). Sua transformação, em

proteína de membrana, ocorre com a liberação do vírion no meio extracelular, e

é fundamental na formação e maturação do vírion. A glicoproteína E é

composta por três domínios: (1) domínio I, com localização central; (2) domínio

II contém uma alça interna e está envolvido na fusão e dimerização da proteína

E. Nele está, também, a maioria dos grupos e subgrupos de epítopos cross-

reativos e (3) domínio III é semelhante à imunoglobulina. Acredita-se interagir

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com o receptor, com funções de ligação ao alvo, fusão de membrana, induzir

resposta imune e provocar a hemaglutinação. Por esta razão, é considerado

um importante imunógeno (POOJA, AMRITA, VINEY, 2014). Ademais, sabe-se

que a glicoproteína E é o principal alvo de anticorpos neutralizantes durante a

infecção (YACOUB, MONGKOLSAPAYA, SCREATON, 2016).

As proteínas não-estruturais participam, principalmente, dos processos

de replicação, montagem e evasão da resposta imune do hospedeiro (LIM et al,

2013), são elas:

NS1 é uma glicoproteína de 50 kDa, secretada por células infectadas na

forma de hexâmero. A hipótese de sua ação está relacionada com o

mecanismo de patogênese da doença, uma vez que é detectada do início da

infecção até a recuperação, além de apresentar grandes quantidades nos

casos de choque (YACOUB, MONGKOLSAPAYA, SCREATON, 2016).

NS2A, NS4A, NS4B e NS5 estão envolvidas na inibição da resposta

inata mediada por IFN tipo 1, pois reduzem a ativação de STAT (RODENHUIS-

ZYBERT, WILSCHUT, SMIT, 2010). A proteína NS5, uma das mais estudadas,

contém um domínio metiltransferase (MTase) no N terminal, além de um

domínio RNA polimerase RNA-dependente (RdRp), no C terminal. Já a NS3

possui como domínio N terminal uma serina endoprotease e, como domínio C

terminal, RNA trifosfatase e helicase. Por fim, NS2A, NS2B, NS4A e NS4B

atuam na formação do complexo de replicação viral (LIM et al, 2013).

O ciclo de replicação do vírus da dengue inicia-se com a adsorção à

célula, promovida pela glicoproteína E, e endocitose mediada por clatrina

(Figura 2). Na vesícula, a acidez promove uma reorganização das proteínas E,

de dímeros para trímeros. Essa mudança expõe a alça do domínio II, que

promove a fusão do vírus com a membrana endossomal, liberando o

nucleocapsídeo viral no citoplasma da célula hospedeira. Na célula, ocorre o

desnudamento e o RNA é traduzido como uma única proteína. No retículo

endoplasmático, ocorre o processamento desta proteína por proteases, com a

separação entre as diversas proteínas estruturais e não-estruturais. As

proteínas não-estruturais iniciam a replicação do genoma viral e o novo RNA é,

então, envolto pela proteína C para formar o nucleocapsídeo. No retículo

também é sintetizada a bicamada lipídica que envolve o nucleocapsídeo. A

bicamada é formada por 180 cópias de glicoproteína E e proteína prM, que se

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associam em trímeros contendo três E e três prM cada. Nesta etapa, a prM

atua como chaperona, impedindo a fusão hidrofóbica entre a alça do domínio II

da E e as membranas da célula. O complexo prM-E é transformado ao longo

do complexo de Golgi, devido ao pH ácido. Ocorre a clivagem de prM pela

protease furina e rearranjo da proteína E em 90 dímeros. Após esta

transformação, o vírion é liberado para o meio extracelular. Essa estrutura,

composta por um envelope icosaédrico e nucleocapsídeo esférico, compõe um

vírion maduro, isolado inicialmente por Hotta e Sabin na década de 40

(LAUGHLIN et al., 2012; RODENHUIS-ZYBERT, WILSCHUT, SMIT, 2010;

YACOUB, MONGKOLSAPAYA, SCREATON, 2016).

Figura 2. Ciclo de replicação do vírus da dengue (adaptado de RODENHUIS-

ZYBERT, WILSCHUT, SMIT, 2010).

Ainda não se conhecem os alvos celulares do vírus da dengue, mas

estudos identificaram monócitos, macrófagos e células dendríticas como

possíveis locais de ação. Estes alvos, avaliados em humanos e ratos,

apresentam os receptores Fc (FcR) (LAUGHLIN et al., 2012; RODENHUIS-

ZYBERT, WILSCHUT, SMIT, 2010; YACOUB, MONGKOLSAPAYA,

SCREATON, 2016)

18 de 39

Na imunidade inata, células infectadas produzem IFNs do tipo 1 e 2,

após interação do vírus com receptores PRRs. Com isso, há ativação de

JAK/STAT e expressão de dezenas de proteínas efetoras, o que leva à

mudanças metabólicas e à resposta imune adaptativa, com maturação das

células dendríticas e ativação de linfócitos T e B. A imunidade humoral é

desenvolvida após seis dias da infecção, e anticorpos são direcionados

sobretudo às proteínas E, prM e NS1. Os anticorpos neutralizantes mais

potentes atuam principalmente no domínio III da glicoproteína E, impedindo a

ligação do DENV com os receptores celulares. Bloqueiam, desta forma, a

entrada do vírus na célula. No entanto, isso não neutraliza a infecção, já que

anticorpos não são capazes de atuar em vírus já internalizados por células

FcR. Este mecanismo é descrito como uma hipótese para o desenvolvimento

de ADE (do inglês, antibody-dependent enhancement), que ocorre quando um

indivíduo apresenta uma segunda infecção pelo vírus, mas de outro sorotipo,

com desenvolvimento de um quadro mais grave da doença. A infecção destas

células pelo vírus, além de suprimir a resposta imune inata, ativa as células T e

há, assim, grande liberação de citocinas, causando dano das células

endoteliais e, por fim, extravasamento de plasma (LAUGHLIN et al., 2012;

RODENHUIS-ZYBERT, WILSCHUT, SMIT, 2010; YACOUB,

MONGKOLSAPAYA, SCREATON, 2016).

4.1. Inibidores de entrada

A Tabela abaixo apresenta as estruturas químicas dos compostos

discutidos nesta seção (Tabela I).

19 de 39

Tabela I. Estruturas químicas dos Inibidores de entrada

CRDS (ICHIYAMA et al., 2013)

NITD448 (POH et al., 2009)

SA-17 (LIM et al., 2013)

Alguns compostos estão em estudo devido à capacidade de se ligarem

à proteína E, inibindo a adsorção e/ou fusão do vírus com a membrana

endossomal. Impedem, assim, sua entrada na célula (CHAN, OOI, 2015).

CRDS (do inglês, curdlan sulfate compound) é um grupo de moléculas

que possuem em sua estrutura química uma cadeia β-D-(1→3) glucano com

ácido piperidina-N-sulfônico, diferenciando-se pelo grau de sulfatação e massa

molecular (Tabela I). Este composto é estudado para o tratamento de HIV e

20 de 39

age impedindo a entrada do vírus na célula hospedeira, no início da doença.

Ichiyama e colaboradores (2013) comprovaram que CRDS interfere em

mecanismos de adesão e fusão do vírus DENV, previnindo, em pelo menos

60%, o desenvolvimento de ADE. Bloqueia, também, a formação de syncytia

(fusão de células infectadas). Adicionalmente, induz alterações estruturais nos

vírions, os quais formam agregados após o tratamento. Além disso, o estudo

mostrou eficácia in vitro contra os quatro sorotipos da dengue (EC50 = 0,262

mg/mL para DENV-1; EC50 = 0,007 mg/mL para DENV-2; EC50 = 0,01 mg/mL

para DENV-3; EC50 = 0,069 mg/mL para DENV-4). O mecanismo de ação

ainda não foi definido. Acredita-se que a molécula atue inibindo a internalização

do vírus por endocitose, além da fusão pH-dependente com a membrana

endossomal. Isso ocorre porque o CRDS se liga à proteína E no chamado βOG

binding pocket, cavidade hidrofóbica da proteína, contornada pela alça ‘kl’,

localizada entre dois monômeros nos domínios II e III-I, próximo à alça de

fusão (Figura 3). A cauda da molécula, por sua vez, interage com resíduos 100

a 108 do domínio II, vizinhos à alça de fusão. Esta alça ‘kl’ compreende os

peptídeos 268 a 280 e é de grande importância para a mudança de

conformação da proteína E, em trímero. Na ligação de CRDS ao βOG binding

pocket, há formação de ligação de hidrogênio com Gli 275 e interação

hidrofóbica com Asn 276, resíduos da alça ‘kl’. O efeito final observado é o

comprometimento da fusão do vírus com a membrana endossomal da célula

hospedeira. Há, então, a conversão da proteína E em trímero e, assim, as

exposições da alça do domínio II, estão impedidas. A presença da molécula

entre os monômeros causa, igualmente, impedimento estérico. A alça ‘kl’ não

consegue rotacionar os domínios II e III, movimento necessário para a

conversão. Dentre as interações de CRDS com a proteína, existem ligações de

hidrogênio com os resíduos His 244, Lis 310, Asn 153 e Lis 247 e interações

hidrofóbicas com Trp 101, Asn 103, His 244 e Gli 28. A ligação de hidrogênio

com Lis 310 é especialmente importante, pois, neste sítio, ocorre, também, a

ligação com o receptor GAG, mediador da adesão do vírus à célula hospedeira.

Além disso, a carga negativa dos grupos sulfato interage com a carga positiva

das glicoproteínas do vírus, causando alterações estruturais. Essas

modificações podem levar à agregação dos vírions, além da possível

modificação conformacional, responsável por impedir a adesão do agente

21 de 39

causador à célula hospedeira. Por fim, um estudo de relação estrutura-

atividade mostrou que, quanto maior a massa molecular, maior a eficácia da

molécula (ICHIYAMA et al., 2013).

Figura 3. Representação das interações entre CRDS e βOG binding pocket

(adaptado de ICHIYAMA et al., 2013).

Outro composto potencial é o SA-17, derivado da doxorubicina (Tabela

I). A doxorubicina é uma antraciclina utilizada como antibiótico antineoplásico.

É obtida a partir de Streptomyces peucetius, apresentnado atividade in vitro

contra alguns flavivirus, incluindo DENV-2 (EC50 = 0,67 ± 0,37 µg/mL).

Entretanto, possui alta citotoxicidade e atividade citostática (CC50 = 13 ± 0,7

22 de 39

µg/mL). SA-17, por sua vez, apresentou atividade in vitro contra DENV-1 e

DENV-3, e duas vezes maior contra o DENV-2 (EC50 = 0,34 ± 0,20 µg/mL), e

menor citotoxicidade (CC50 = 28 ± 2,7 µg/mL) (KAPTEIN et al., 2010). Em um

estudo, observou-se que o composto atua no início do ciclo de reprodução do

vírus, reduzindo adesão e fusão às células hospedeiras (KAPTEIN et al., 2010;

AYALA-NUÑEZ et al., 2013). Seu mecanismo e REA não foram totalmente

elucidados, mas estudos mostraram que SA-17 se liga diretamente ao vírion,

no βOG binding pocket da proteína E (Figura 4). Interage, igualmente, com os

resíduos Ala 50, Tyr 137 e Gln 200 através de ligações de hidrogênio, com os

resíduos Thr 48, Pro 53, Lis 128, Leu 135, Phe 193, Leu 198, Ala 205, Ile 270,

Gln 271, Thr 280 e Gli 281 por interações hidrofóbicas, sendo os resíduos Thr

48 e Ala 50 essenciais para a fusão do vírus à membrana endossomal (AYALA-

NUÑEZ et al., 2013; KAPTEIN et al., 2010).

Figura 4. Representação das interações entre SA-17 e βOG binding pocket

(KAPTEIN et al., 2010).

23 de 39

Poh e colaboradores (2009) estudaram a atividade in vitro do composto

NITD448 (Tabela I). Os experimentos comprovaram a capacidade de inibir a

infecção por dengue (EC50 = 9,8 µM), de suprimir a reprodução viral com 25

µM, além da citotoxicidade de CC50 = 49 µM. Acredita-se que o composto atue

inibindo a fusão do vírus à membrana endossomal, por interação do carboxilato

do anel cromenona com os resíduos Lis 128 e Gln 52 da proteína E. A ligação

do triflúor-fenil com βOG binding pocket também parece ser importante (Figura

5) (POH et al., 2009).

Em vermelho: ligações de hidrogênio

Em cinza: interações hidrofóbicas

Figura 5. Representação das interações entre NITD448 e βOG binding

pocket (POH et al., 2009).

Dois peptídeos foram estudados in vitro devido à capacidade de inibir

infecção por dengue e ADE. O alvo era a glicoproteína E. DN59

(MAILGDTAWDFGSLGGVFTSIGKALHQVFGAIY), EC50 de 6 µM, mimetiza a

haste pré-membrânica da proteína E (aminoácidos 412 a 444) e se liga à

proteína E trimérica, impedindo a fusão (LIM et al., 2013; NICHOLSON et al.,

2011). Adicionalmente, o peptídeo leva à liberação de RNA pelo vírus, através

da formação de poros em sua membrana de bicamada lipídica. Interage,

igualmente, com vesículas lipídicas em competição com a haste pré-

membrânica da proteína E, embora a concentração necessária para produzir

este efeito seja muito maior (EC50 = 17 µM) (LOK et al., 2012). Foi

24 de 39

demonstrado, ainda, que os aminoácidos 419 a 440 são responsáveis pela

afinidade do peptídeo à proteína E. Já os 441 a 444 estão envolvidos na

interação com a membrana do vírus. Portanto, substituições nos aminoácidos

419 a 440 levam à perda de atividade. Por outro lado, modificações em 441 a

444 modelam a eficácia do peptídeo: quanto mais hidrofóbica for esta região,

melhor é a atividade antiviral, já que aumenta a interação com a membrana da

bicamada lipídica viral (SCHMIDT, YANG, HARRISON, 2010). 1OAN1

(FWFTLIKTQAKQPARYRRFC), com EC50 de 3 µM, mimetiza a região

responsável pela conexão dos domínios I e II (aminoácidos 41 a 60) e interage

com proteínas E monoméricas. Altera, portanto, a estrutura da superfície dos

vírions e a simetria icosaédrica do vírus, bloqueando adesão e fusão (COSTIN

et al., 2010; NICHOLSON et al., 2011; LIM et al., 2013).

4.2. Inibidores de replicação

A Tabela II apresenta as estruturas químicas dos compostos discutidos

nesta seção.

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Tabela II. Estruturas químicas dos inibidores de replicação

ARDP0006 (LIM et al., 2013)

ARDP0009 (TOMLINSON et al., 2009)

7-DMA/ MK-0608 (CARROLL et al., 2009)

Composto 1/ NITD008 (CHEN et al., 2010)

Composto 32 (STEUER et al., 2011)

Ivermectina (LIM et al., 2013)

N S

NH2

O

HN

S

NN

ST-148 (SCATURRO et al., 2014)

ST-610 (BYRD et al., 2013a)

Byrd e colaboradores (2013) demonstraram que o composto ST-148

(Tabela II) é capaz de diminuir a replicação dos quatro sorotipos da dengue em

células hospedeiras. Os achados mostraram a diminuição da viremia em 52

vezes, se administrado por via intravenosa, ou em 3 vezes, se administrado via

oral, sem apresentar citotoxicidade. Reduziram, ainda, os níveis de citocinas

inflamatórias, em testes in vivo (BYRD et al., 2013a). ST-148 reduz a

quantidade de proteína C (capsídeo), disponível para a montagem dos vírions.

26 de 39

O composto compromete a redistribuição desta proteína do citosol para o

nucléolo, além da ligação às gotículas de lipídeo derivada do retículo

endoplasmático (BYRD et al., 2013a; SCATURRO et al., 2014). Além disso,

provoca estabilização da interação entre os dímeros de proteína C, formando

oligômeros, após o tratamento. O resultado final é a diminuição da replicação

viral e, portanto, da viremia. Esta estabilização afeta, também, a capacidade do

vírus em infectar uma célula após sua entrada, pois, uma vez no citosol, a

estabilização do capsídeo impede a liberação do RNA. A presença de ST-148

leva à alteração na posição das hélices α3 e α4. Por esta razão, ocorre a

abertura de uma fenda entre a hélice α1 de um dímero e as hélices α1’ e α3’ do

outro dímero, onde o composto se liga, estabilizando o tetrâmero (Figura 6). A

cadeia fenil do composto se liga à Phe 33, enquanto a fração tieno piridina

interage com a Ser 34 e Arg 68. Resíduos lipofílicos da fenda fortalecem a

ligação do ST-148, uma fez que o composto é altamente lipofílico. A ligação à

Ser 34 é fundamental. Demostraram-se que mutações neste aminoácido levam

à perda de atividade (SCATURRO et al., 2014). Ademais, ligação às hélices α1

prejudica a interação do capsídeo com membranas, afetando a montagem de

novos vírions (BYRD et al., 2013a).

Os tons em laranja representam um dímero, e os tons em azul, outro dímero; ST-148 é representado em verde; O aminoácido S34 é representado no modelo CPK.

Figura 6. Conformação do capsídeo tetrâmero antes (esquerda) e depois

(direita) da ligação de ST-148 ao aminoácido S34 (adaptado de SCATURRO et al.,

2014).

Estudaram-se ARDP0006 e ARDP0009 devido às eficácias em inibir

replicação em DENV-2, in vitro (Tabela II). Ambas as moléculas apresentaram

baixa toxicidade e boa seletividade para NS2B-NS3 protease: ARDP0006 EC50

= 4,2 ± 1,9 µM e CC50 = 69 ± 4 µM, e ARDP0009 EC50 = 35 ± 8 µM e CC50 ≥

27 de 39

300 µM. ARDP0006 interage com o sítio ativo desta enzima nos resíduos Gln

35, His 51 e Ser 135 e com o bolsão S1, nos resíduos Gli 151 e Gli 153.

ARDP0009 também interage com os mesmos resíduos, mas possui uma

interação extra com o resíduo Tyr 150 no bolsão P1 (Figura 7) (TOMLINSON et

al., 2009).

Em rosa: sítio ativo da protease

Em verde: bolsão S1 da protease

Figura 7. Interação dos compostos ARDP0006 (A) e ARDP0009 (B) com a NS2B-NS3

protease (TOMLINSON et al., 2009).

Estudo realizado por Steuer e colaboradores (2011) teve como objetivo

sintetizar possíveis inibidores da NS3 protease. Sabendo-se que a enzima

apresenta uma serina (Ser 135) em seu sítio ativo, pensou-se, primeiramente,

em aldeídos para a síntese. Este grupo funcional interage com a serina

nucleofílica, de forma covalente e reversível, formando hemicetais. Os

aldeídos, no entanto, foram substituídos por α-cetoamida, por serem mais

eletrofílicas. Tentativas de planejamento como: saturação e redução da cadeia,

substituição da insaturação por um ciclopropil, substituição da função α-ceto

por α-hidroxi e por α-epoxi, ou substituição da função cetoamida por amida

resultaram em compostos com baixa atividade. Já a metilação na posição β é

tolerada. Isso mostra que a função α-cetoamidas é fundamental para a

atividade do composto. A insaturação por sua vez, confere à molécula

28 de 39

conformação rígida e plana, necessária para a interação com a região 1 do sítio

ativo (S1), onde está a Ser 135. Acredita-se que a metilação tolerada na

posição β seja um indício de que a molécula pode ser substituída, nesta

posição, por cadeias que interajam com a segunda região do sítio ativo (S2).

Estabelecido como grupo farmacofórico a cadeia α-cetoamida β,γ-insaturada

(composto 1, Tabela II), prosseguiu-se com variações da cadeia aril, na

posição γ. Nesta etapa, observou-se que grupos doadores de elétrons

conferem atividade inibitória, enquanto grupos aceptores diminuíam esta

atividade. Grupo das posições 3 ou 4 do anel deve ser um doador de elétron

em S1, por ligação de hidrogênio, para Tyr150 e Asp129. Por fim, analisaram-

se as substituições no nitrogênio da α-cetoamida. Grupos alquil menores, como

o metil, e maiores, como o pentil, mantiveram a atividade. Por outro lado,

ciclohexano e o benzeno levaram à perda de atividade devido à alta

hidrofobicidade. Já os grupos com heteroátomos apresentaram bons

resultados. Estes grupos apresentam caráter hidrofílico, especialmente os

grupos contendo oxigênio. Selecionou-se o composto 32 (Tabela II) como

melhor opção de tratamento por, além de ter alta atividade inibitória, é seletivo

à protease, apresentando baixa interação com a trombina humana. Testes in

vitro comprovaram sua eficácia, ao diminuir em 1000 vezes a viremia. Não

mostrou citotoxicidade nas concentrações utilizadas (STEUER et al., 2011). A

Figura 8 mostra as interações da molécula com a protease, em comparação ao

grupo farmacofórico.

Figura 8. Representação das interações entre o sítio ativo da NS3 protease e os

compostos 1 (rosa) e 32 (verde) (adaptado de STEUER et al., 2011).

29 de 39

O composto ST-610 (Tabela II), por sua vez, foi identificado como

potente inibidor da helicase da proteína NS3, inibindo-a nos quatro sorotipos da

dengue. Alguns dos resultados em testes in vivo foram: (1) EC50 = 0,236 ± 0,06

µM para DENV-1, EC50 = 0,272 ± 0,05 µM para DENV-2, EC50 = 0,256 ± 0,17

µM para DENV-3, EC50 = 0,203 ± 0,09 µM para DENV-4 e (2) citotoxicidade de

CC50 ≥ 100 µM (BYRD et al., 2013b; CHAN, OOI, 2015). Acredita-se que ele

interaja com o resíduo Ala 263 da proteína, que, junto com outros aminoácidos,

como Thr 264, estabeleçam ligação de hidrogênio com a cadeia hidroxil-ribose

dos substratos do RNA. Desta forma, ST-610 pode interferir na ligação da

proteína com os substratos do ácido nucleico ou pode translocar a fita de RNA

pelo canal (BYRD et al., 2013b).

Ivermectina (Tabela II), atualmente utilizada como anti-helmintos,

demonstrou atividade anti-dengue, in vitro, para os quatro sorotipos, em dois

estudos. A molécula interage com IMPα/β1, inibindo o reconhecimento de NS5

por esta proteína (EC50 = 1,6 µM para DENV-1; EC50 = 1,4 µM para DENV-2;

EC50 = 1,2 µM para DENV-3; EC50 = 1,3 µM para DENV-4). Apesar de não

atuar sobre NS5, há indícios de que apresente atividade inibitória sobre NS3. A

proteína NS5, para desempenhar sua função como polimerase, contém, entre

os aminoácidos 320 e 405, a região NLS (do inglês, nuclear localization

sequence). Esta região é responsável pelo sinal de importação nuclear. Já a

denominada região NES (do inglês, nuclear export signal), é responsável pelo

sinal de exportação. Juntas, elas medeiam o transporte nucleocitoplasmático

de NS5. Neste sentido, NLS é reconhecida pela IMPα/β1 (importina), a qual faz

o transporte de proteínas para o núcleo celular. Portanto, uma vez bloqueada a

importina, o transporte de NS5 para o núcleo celular será interrompido. A

função nuclear desta proteína será inibida (WAGSTAFF et al., 2012; TAY et al.,

2013).

Inibidores de polimerase são classificados em duas categorias:

(1) Inibidores análogos ao nucleotídeo (NIs, do inglês nucleotide analog

inhibitors). Quando convertidos ao trifosfato correspondente, competem com os

substratos naturais (nucleotídeos) e são incorporados à cadeia de RNA. Como

resultado, levam ao término da elongação ou causam mutações nas próximas

sínteses de RNA. Esta categoria é a mais utilizada, porém apresenta maior

potencial para o desenvolvimento de resistência pela polimerase;

30 de 39

(2) Inibidores não-nucleotídicos (NNIs, do inglês non-nucleotide inhibitors)

ligam-se ao sítio alostérico, inativando a enzima ou impedindo alterações

conformacionais necessárias para a iniciação e elongação na síntese de RNA

(LIM et al., 2013).

Schul e colaboradores (2007) analisaram uma série de compostos e

identificaram, entre eles, o 7-DMA (7-deaza-2’-C-metiladenosina) (Tabela II)

(SCHUL et al., 2007). Esta molécula também foi estudada por Carroll e

colaboradores devido à sua eficácia contra HCV. Estes pesquisadores a

nomearam como MK-0608 (Tabela II) (CARROLL et al., 2009). O composto foi

capaz de reduzir a viremia de dengue em testes in vivo, atuando em NS5

polimerase (RdRp). Diminuiu, também, a resposta inflamatória aguda ao vírus,

já que os níveis de TNF-α, IL-6, IL-12, IFN-γ e MCP-1 abaixaram após o

tratamento (SCHUL et al., 2007). Baseado nisso, Chen e colaboradores (2007)

demonstraram que o composto 1 (Tabela II) também foi capaz de bloquear a

síntese de RNA viral, reduzindo, em 10 vezes a viremia. Após sua conversão

para a forma 5’-trifosfatada, o composto atua como um NI, competindo com os

substratos naturais a serem inseridos no RNA pela NS5 polimerase. A porção

3’-OH da ribose é fundamental para a ligação do composto ao RNA. Já a

porção 2’-C-acetileno, após inserida na cadeia, faz impedimento estérico e

bloqueia o elongamento da fita. O planejamento iniciou com alguns

substituintes na posição 2’-C em análogos de adenosina. Compostos com as

substituições metila e acetileno apresentaram os melhores resultados (EC50 =

1,12 µM e CC50 ≥ 50 µM para metila; EC50 = 1,41 µM e CC50 ≥ 40 µM para

acetileno), enquanto as substituições etila, vinila e propino resultaram em perda

de atividade (EC50 ≥ 50 µM). Prosseguiu-se, então, com a análise da atividade

de análogos 2’-C-acetileno ribose de outras bases, citocina e guanosina, porém

ambos os compostos apresentaram resultados insatisfatórios (EC50 ≥ 100 µM).

Sabendo-se que análogos de adenosina com substituição 2’-C-alquil na ribose

sofrem desaminação, pela adenosina desaminase intracelular, para derivados

de inosina, substituiu-se o nitrogênio da posição 7 por um carbono (composto

1) (tabela III). Esta alteração, por impedir a modificação intracelular do

composto, melhorou sua atividade (EC50 = 0,7 µM) e citotoxicidade (CC50 ≥ 100

µM). Algumas substituições no carbono 7 foram testadas, no entanto, todas

falharam (CHEN et al., 2010). Importante mencionar que este composto é um

31 de 39

pró-fármaco que depende de enzimas conversoras para que sua forma

trifosfatada seja obtida.

Tabela III. Análogo de adenosina vs Composto 1/ NITD008

Análogo de adenosina com substituição 2’-C-acetileno

(adaptado de CHEN et al., 2010)

Composto 1/ NITD008 (adaptado de CHEN et al., 2010)

5. CONCLUSÃO

Embora a dengue atinja milhões de pessoas anualmente (WHO, 2017;

BHATT et al., 2013), ainda não existe um tratamento capaz de curar a doença

(CDC, 2016; NHS, 2016). Seu controle, atualmente, é realizado apenas com

terapia de suporte (MS, 2016; WHO, 2009), prevenção por controle do vetor

(MURRAY, QUAM, WILDER-SMITH, 2013) e, mais recentemente, por vacina

(ANVISA, 2017b; G1, 2016; Sanofi Pasteur, 2017). Inúmeros são os compostos

estudados para o tratamento da dengue, obtidos por Structure Based Drug

Design no caso de novas moléculas, ou estudados contra alvos diferentes, no

caso de medicamentos já existentes para outras doenças. No entanto, poucos

são os compostos que seguem para estudos clínicos. Para isso, é necessário

entender-se as limitações e aplicar-lhes melhorias moleculares.

Neste trabalho foram apresentadas 13 moléculas promissoras. Entre

elas, três já haviam sido estudadas para outras doenças (CRDS, ivermectina,

7-DMA/MK-0608) e dez eram novos compostos (SA-17, NITD448, DN59,

1OAN1, ST-148, ARDP0006, ARDP0009, composto 32, ST-610 e composto

1/NITD008). Ainda, quatro apresentaram eficácia e segurança in vivo (7-

DMA/MK-0608, ST-148, ST-610 e composto 1/NITD008) e nove foram

estudadas apenas em testes in vitro (CRDS, SA-17, NITD448, DN59, 1OAN1,

ARDP0006, ARDP0009, composto 32 e ivermectina). Entretanto, nenhuma

delas foi avaliada em ensaios clínicos, até então. Para se prosseguir com

32 de 39

estudos clínicos é necessário que a molécula tenha demonstrado eficácia e

segurança em estudos in vivo (ANVISA, 2017a).

Entre os compostos, 7-DMA/MK-0608 e 1/NITD008, já avaliados em

animais, apresentaram bom perfil farmacocinético para administração oral, com

boa disponibilidade na administração de duas doses orais ao dia, por três dias

(SCHUL et al., 2007; YIN et al., 2009). Já o composto ST-148 apresentou

queda na viremia de três vezes no tratamento oral e de 52 vezes no tratamento

intravenoso (BYRD et al., 2013a). O ST-610 mostrou biodisponibilidade oral de

apenas 7% enquanto a biodisponibilidade intraperitoneal foi de 56% (BYRD et

al., 2013b). Ambos precisam, portanto, de modificações moleculares, as quais

possam melhorar seu perfil farmacocinético. O 1/NITD008 apresentou, no

entanto, efeitos adversos em tratamentos de duas semanas em ratos e

cachorros (YIN et al., 2009). Avaliações futuras devem ser feitas a fim de se

identificar as causas e contorná-las, para que o composto possa ser,

finalmente, testado em humanos. Já durante o estudo in vivo de 7-DMA/MK-

0608, nenhum obstáculo foi encontrado (SCHUL et al., 2007). Ensaios clínicos

podem ser realizados para a molécula.

33 de 39

6. BIBLIOGRAFIA

ANVISA. Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Considerações e

definições para pesquisa clínica. Disponível em: http://www.anvisa.gov.br/

medicamentos/pesquisa/def.htm. Acesso em: 13 Abril 2017 (a).

ANVISA. Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Consulta a

medicamentos registrados, Dengvaxia. Disponível em: http://consultas.

anvisa.gov.br/#/medicamentos/. Acesso em: 19 Fevereiro 2017 (b).

AYALA-NUÑES, N.V.; JARUPATHIRUN, P.; KAPTEIN, J.F.; NEYTS, J.;

SMIT, J.M. Antibody-dependent enhancement of dengue virus infection is

inhibited by SA-17, a doxorubicin derivative. Antiviral Research, v.100, p.238-

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