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Organo ufficiale della Divisione SSOG di InnovhubStazioni Sperimentali per l’IndustriaAzienda Speciale della Camera di Commercio di Milano

LUGLIO/SETTEMBRE 2012ISSN 0035-6808 RISGARD 89 (3) 141-212 (2012) - Poste Italiane S.p.a.Spedizione in Abbonamento Postale -70%Finito di stampare nel mese di Settembre 2012

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Jatropha curcas seed oil:detoxification in view of biodiesel production.Determinazione diretta del fosforo negli oli e grassi vegetali ed animalimediante assorbimento atomico con fornetto di grafite (GF-AAS).Glass bottles of different sizes for the packaging of virgin oliveoil: influence on shelf life.Indagine conoscitiva sull’efficacia di differenti parametri per lavalutazione del contenuto di burro in prodotti misti.

Composition en stérols des huiles extraites d’olives de cultivarsde la province de Reggio Calabria (Sud d’Italie).Application of High Performance LiquidChromatography/Evaporative Light Scattering Detector (HPLC/ELSD)for the study and the fractionation of milk fat triacylglycerols.Variability in trans fatty acid content of selected local andimported foods in Jordan.CongressiLibri

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LUGLIO/SET TEMBRE 2012 – ANNO LXXXIX

Sommario

P. Bondioli, P. Rovellini, L. Della Bella, G. Rivolta D. Baglio, L. Folegatti

P. Masella, A. Parenti, P. Spugnoli

G. Contarini, M. Povolo, L. Folegatti, E. Forte, M. Fusari, A. Gasparoli, M. Mandrioli,M. Molinari, G. De FeliciA.M. Giuffrè, L. Louadj, M. Poiana, A. MacarioM. Povolo, G. Contarini

R. Mashal, K. Al-Ismail, H. Al-Domi, T. Al-MousaNotiziario

ORGANO UFFICIALE DELLA DIVISIONE SSOG DI INNOVHUB STAZIONI SPERIMENTALI PER L’INDUSTRIA

AZIENDA SPECIALE DELLA CAMERA DI COMMERCIO DI MILANO

A. FABERI: Ministero delle Politiche Agricole Alimentari e Forestali – Roma

La RIVISTA ITALIANA DELLE SOSTANZE GRASSE è l’organo ufficiale della Divisione SSOG di Innovhub

Stazioni Sperimentali per l’Industria Azienda Speciale della

Camera di Commercio di Milano. Ha periodicità trimestrale e la scientificità dei contenuti è garantita

da un Comitato Internazionale di Referee.Pubblica lavori originali e sperimentali di autori

italiani ed esteri riguardanti la chimica, la biochimica, l’analisi e la tecnologia nei settori:

sostanze grasse e loro derivati, tensioattivi, detersivi, cosmetici, oli minerali.

Include metodi di analisi in inchiesta pubblica relativi ai settori di competenza, il Notiziario con

informazioni su congressi, notizie in breve e libri.La Rivista viene consultata in Italia dalle industrieproduttrici di oli e grassi alimentari ed industriali,

dalle industrie chimiche, da laboratori di enti statali,da istituti di ricerca e facoltà universitarie. E’ inoltre

distribuita all’estero in vari Paesi come Spagna,Grecia, Francia, Germania, Tunisia, Nigeria, Congo, Polonia, Romania, Bulgaria, Russia,

Stati Uniti, Brasile, Cina, Giappone, presso industrie produttrici ed esportatrici, enti pubblici e università,

da dove provengono diversi lavori scientifici.

Five kg of Jatropha curcas whole seed were crushed using a screw press. The extractionyield was higher than 85% of the total crude oil. After an evaluation of the total deoxy-hydroxy-phorbol esters content the oil was degummed and bleached with activated silica.After each treatment the deoxy-hydroxy-phorbol esters content decreased from an initialcontent of 2.32 % down to 2.16% and 1.69% respectively. The purified oil was physical-ly neutralised in different temperature/time conditions, while residual pressure was main-tained at 1 mbar. Several samples were taken during the experiments and it was possibleto demonstrate that at temperatures higher than 230°C it is possible to contemporarilyremove both fatty acids and deoxy-hydroxy-phorbol esters from oil. A single HPLCmethod suitable for the evaluation of all classes of obtained products during biodiesel pro-duction was developed. Some hypotheses about the fate and transformation of the deoxy-hydroxy-phorbol esters are discussed and their degradation products evidenced. Finallyfour differently purified J. curcas oil samples were transformed into biodiesel. The resultsof deoxy-hydroxy-phorbol esters contents for both biodiesel and glycerol are reported. Keywords: biodiesel production, Jatropha curcas, deoxy-hydroxy-phorbol esters, deto-xification, transesterification

Olio di semi di Jatropha curcas: prove di detossificazione in funzione dellaproduzione di biodiesel.

Cinque kg di seme di Jatropha curcas sono stati sottoposti a spremitura mediante pressaa coclea. Con questo procedimento è stato possibile estrarre più dell’85% della sostanzagrassa presente. Dopo valutazione del contenuto totale di deossi-idrossi-forbol esteril’olio è stato degommato e trattato con silici attive. Dopo ogni singolo trattamento il con-tenuto in composti tossici diminuiva da una concentrazione iniziale di 2.32% fino a 2.16%e 1.69% rispettivamente. L’olio cosi purificato era quindi sottoposto a raffinazione fisica adifferenti temperature, in corrente di vapore alla pressione residua di 1 mbar. In questomodo è stato possibile dimostrare, mediante campionamenti ed analisi mirate, che ope-rando a temperature superiori ai 230°C era possibile ottenere la contemporanea rimozio-ne dall’olio degli acidi grassi e dei deossi-idrossi-forbol esteri. Per la valutazione analiti-ca dei forbol esteri è stato messo a punto un metodo HPLC, che può essere utilizzato sututte le matrici che appartengono alla filiera biodiesel. Vengono discusse alcune ipotesirelative al destino ad alla trasformazione dei deossi-idrossi-forbol esteri, per i quali ven-gono evidenziati alcuni possibili prodotti di degradazione. Quattro differenti campioni diolio di J. curcas sono stati trasformati in biodiesel. Si riportano i valori ottenuti per i deos-si-idrossi-forbol esteri nel biodiesel e nel glicerolo ottenuto quale sottoprodotto.Parole chiave: produzione di biodiesel, Jatropa curcas, deossi-idrossi-forbol esteri,detossificazione, transesterificazione.

Jatropha curcas seed oil: detoxification in view

of biodiesel production

P. Bondioli*P. Rovellini

L. Della BellaG. Rivolta

Divisione SSOG diINNOVHUB - Stazioni

Sperimentali per l’Industria -Azienda Speciale della Camera

di Commercio di Milano

*CORRESPONDENCE:Dr. Paolo Bondioli

Head of Technology UnitDivisione SSOG

Via Giuseppe Colombo 7920133 Milano, Italy

e-mail: [email protected]: + 39 02 2363 953

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LA R IV ISTA ITAL IANA DELLE SOSTANZE GRASSE - VOL. LXXX IX - LUGL IO/SETTEMBRE 2012

INTRODUCTION

Biodiesel is an alternative fuel prepared from veg-etable oils by means of the transformation of natu-ral triglyceride molecule into the correspondingfatty acid methyl ester, generally indicated asFAME. Contrary to natural oils FAME have viscosityand distillation properties similar (but not equal) todiesel fuel and for this reason they have been inuse as renewable diesel fuel substitutes since theearly 90s.An important biodiesel development took placeworldwide starting from the new century andEurope leaded the way in this development.Biodiesel is one of the fuels considered to reducecarbon dioxide emissions and useful to meet theKyoto protocol requirements. The importantbiodiesel development was slowed down becauseof two important barriers that appeared on the hori-zon. The first is represented by the availability ofnatural oil. At the moment the maximum develop-ment of world biodiesel production has reachedthe amount of 15 millions MT per year, representinga requirement of the same natural oil amount for theproduction and generating 1,5 million MT per yearof the by-product glycerol. As demonstrated byGunstone [1] the oils and fats sector positivelyreacted to the increased demand by easilyincreasing production. As a side effect a strongprice tension derived from the increased demandfor oil and sugar crops for biofuel production andaffected prices in part as a consequence of thedemand but mainly because of international spec-ulation [2]. The second and most critical barrierwas represented by ethical issues. It is generalopinion that under the ethical standpoint using edi-ble oils and fats for energy production in rich Coun-tries cannot be a politically correct decision. As aconsequence of this scenario biodiesel research inthe last ten years was oriented toward non edibleoils and fats sources, such as used frying oils, nonedible animal and vegetable oils and fats, algaland bacterial oils and, last in time order, insect oils[3]. Among the category of non edible vegetableoils and fats we can include the oil produced fromJatropha curcas crop. Jatropha curcas, native fromCentral and South America, belongs to the Euphor-biaceae family, well known for the biosynthesis oftoxic products. J. curcas can be cultivated in trop-ical areas in marginal fields using a low impactinput and it has strong drought and salinity resist-ant properties [4]. Due to its toxic products it doesnot represent an alternative for food production.Apart from a Mexican low diffusion, non toxic vari-ety all available J. curcas seeds contain a numberof toxic molecules representing a limit for food orfeed use of seed, oil and cake. The literature con-tains a number of interesting pieces of information

about the content of toxic compounds in Jatrophaseeds [5-7]. In extreme synthesis J. curcas seedscontain several toxic and antinutritional com-pounds, such as trypsin inhibitors, lectins,saponins, phytates and the protein curcin. In addi-tion to the presence of these substances that canbe found also in a number of different crops, Jat-ropha seeds contain the chemical group of thedeoxy-hydroxy-phorbol esters (DHPEs) represent-ing a real danger for human and animal health. Thebiological effects related to the ingestion of DHPEsinclude tumor promotion, lymphocite mitogenesis,cell proliferation, activation of blood platelets,inflammation, prostaglandin production and stimu-lation of degranuluaton in neutrophils as reportedby Aitken [8] and cited by Haas and Mittelbach [9]in the first paper published about the production ofbiodiesel from Jatropha after oil detoxification.The family of DHPEs chemically contains the struc-ture of tigliane, a tetracyclic diterpenic compound.DHPEs represent pentaxydroxy tigliane deriva-tives, in which the –OH moieties located in carbonatoms 12 and 13 are esterified with different fattyacids. The spatial placement of free –OH groups inphorbol and DHPEs makes the difference betweentoxic (β isomer) and non-toxic (α isomer) mole-cules. The most known and studied DHPEs is the 4β -12 O-tetradecanoylphorbol-13-acetate (TPA) thatis normally available for analytical purposes oftenin use in HPLC as an external standard for totalDHPEs’ measurement: TPA is not present in J. curcas seed oil, but other seven diester deriva-tives of 12 deoxy-16 hydroxy phorbol (DHPEs),have been found in the oils [10, 14]. Some DHPEs’structures are reported in Figure 1. A completepaper about DHPEs’ structure, biological activityand toxicity was published a few years ago byGoel et al. [11]. DHPEs are usually recovered intothe oil after oil extraction using both solvents ormechanical crushing. As DHPEs are polar sub-stances they can be easily isolated from oil sam-ples by means of methanol extraction. This opera-tion represents the first step of analytical methodsbased on HPLC-UV in use for DHPEs’ content eval-uation [15]. Notwithstanding the suggested use forenergy production of oil as it is or after transesteri-fication for biodiesel production, the toxicity issuecannot be neglected because of the protection ofworkers and the environment as well as the possi-bility of contamination of some side streams, suchas the one represented by glycerol. For these rea-sons during the last ten years some research wasdone in order to investigate the different possibilitiesto remove DHPEs from oil using simple unit opera-tions. Probably the best way for J. curcas oil detox-ification is methanol extraction, already in use foranalytical applications and allowing the isolation ofan unmodified pool of different DHPEs. This solution

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represents an extra unit operation to be added tothe oil/biodiesel processing chain however it can-not be suggested at the moment because of itsenergy requirements necessary for the evapora-tion/distillation of huge amounts of methanol. Onthe other hand some research is in progress [7] tobetter understand the biological activity of DHPEs.If this research has positive results, with the evi-dence that unmodified or modified DHPEs can beused for therapy, all the economical balances willbe able to be reviewed and perhaps methanol pre-treatment could be feasible. Several Authors studied the fate of DHPEs duringseed crushing, oil refining and biodiesel produc-tion. In the already mentioned paper published byHaas and Mittelbach [9] a complete study onDHPEs disappearance during the classic chemicaloil refining process is reported. The two Authorsdemonstrated that by means of a complete chemi-cal refining the DHPEs’ content can be reduceddown to approx. 30% of the original oil content.Haas and Mittelbach [9] reported that during thisprocess the most important reduction in DHPEs’content takes place during bleaching. TheseAuthors published a very complete list of a numberof bleaching tests, carried out using differentagents, such as activated bleaching clays, activat-ed carbon and amorphous silica. In some experi-ments the treatment with bleaching agents wasrepeated up to four times in sequence.During these experiments the deodorisation stepwas carried out under incorrect experimental con-ditions, because of the lack of a suitable laborato-ry deodorisation unit. In this case the impact ofdeodorisation operation on DHPEs’ concentrationwas reported as negligible.In a more recent paper Makkar et al. [12] describethe procedures and the obtained results for a phys-ical refining of a J. curcas oil sample. In this case

the impact of bleaching treatment with silica wassimilar to the one described by Haas and Mittel-bach [9], but the effect of physical neutralisationcarried out using a proper apparatus in correctexperimental conditions (260°C, 1 hour treatment,3 mbar residual pressure) on DHPEs’ concentra-tion leaded to the complete disappearance ofDHPEs in the refined oil. As a consequence of thistreatment no DHPEs were detected in biodieseland glycerol prepared from this refined oil. NoDHPEs were detected in fatty acid distillate too:this remark could indicate that DHPEs are notphysically removed but thermally degraded duringthe physical neutralisation step.DHPEs’ content in Jatropha seed oil varies accord-ing to the growing district, ranging from 870 mg/kgto 3320 mg/kg of kernel except for non toxic vari-eties (Mexico, Papantla) [5].More information and more analytical details wereprovided by Ichihashi et al. [4] who studied theDHPEs’ fate during a complete press extraction/par-tial refining/transesterification/ biodiesel vacuum dis-tillation process chain carried out on two different J. curcas seed samples. During this exercise theDHPEs’ content decreased from 2800 mg/kg incrude oil down to 1900 mg/kg in partly refined oil(acid degummed, treated with filter aid, then acidi-ty was removed by methanol esterification using anacidic resin as a catalyst), to 30 mg/kg in biodieseland finally made zero in distilled biodiesel. SomeDHPEs were detected in the distillation residue.This paper contains a detailed study about the dif-ferent structures of DHPEs, carried out by means ofHPLC-MS/MS equipment.Starting from the described experiences a lack ofknowledge was evident in the kinetic of degrada-tion/removal/transformation of DHPEs during thephysical neutralisation step and this paper isfinalised to fill this gap. Moreover we have focal-

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Figure 1 - Chemical structures of tigliane (A), general deoxy-hydroxy-phorbol (B) and TPA 4β-12 O-tetradecanoyl phorbol-13-acetate (C)

ized our attention to develop a single HPLC-UVmethod able to quantify the DHPEs’ content in allproducts obtained during the different technologi-cal steps, from raw oil to biodiesel production, evi-dencing the degradation and/or transformationproducts in the chromatogram profile. New com-pounds hypothesized to be “triester derivatives”,in particular in the biodiesel samples, have beenpointed out.

EXPERIMENTAL

MATERIALSFive kg of Jatropha curcas seeds with hulls, com-ing from Ecuador were used. Oil content and mois-ture were 32,2% and 6,5% respectively.All reagents used in this work were analytical gradefor volumetric and gravimetric analysis, HPLCgrade for HPLC analysis. Trisyl was kindly providedby Grace Italiana (Passirana di Rho, IT)

METHODS Seed crushing-mechanical pressing: a continuousscrew press (mod. Komet CA 54G, IBG Monforts,Moenchengladbach, DE) was used. The wholeseed was previously preheated for 30 min in an airoven thermostated at 80°C. The head of the screwpress was maintained at approx. 100°C by meansof an electric heating ring, the screw rotation speedwas 50 rpm and the seed feeding rate was 3 kg/h.Finally the outlet hole was 6 mm in diameter. Imme-diately after pressing the oil was filtered on paperand dried under vacuum .Oil degumming: 1 kg of the obtained crude J. cur-cas oil was heated under stirring at the tempera-ture of 80°C. 1 ml of 85% H3PO4 and 2 ml of dis-tilled water was contemporarily added understrong agitation. After a contact of 30 min the tem-perature was reduced down to 60°C and NaOH14% (w/v) solution was added in an amount calcu-lated for the complete neutralisation of H3PO4. Stir-ring was continued for 15 more minutes. After thiscontact time 30 ml of water was added and after acontact under stirring for 15 minutes the samplewas centrifuged to remove the formed solids andthe added water. A washing step of oil, carried outat 60°C by adding 30 ml of water, stirring and cen-trifugation was finally carried out to obtain thedegummed oil (OD1).Silica treatment: the degummed oil was heated at80°C under stirring in a 3 litre flask. Following theprocedure published by Makkar et al. [12] 10 ml ofa 10% (w/v) solution of citric acid was added to theoil under strong stirring. The treatment was contin-ued for 15 min, then 0,3% (w/w) Trisyl was addedas a slurry in the oil. Simultaneously 0,5% w/wwater was added to the mixture. After 30 min reac-tion at 80°C and atmospheric pressure, the tem-

perature was increased to 95°C and the pressurereduced to 50 mbar in order to remove water fromthe mixture. After 30 min vacuum drying the oil wasfiltered on paper. The obtained oil represents theSilica treated sample (O1).

PHYSICAL NEUTRALISATIONSamples of silica treated oil (200 g) wereprocessed in a physical neutralisation glass unit,designed as described by Bogdanor et al. [13]and consisting of a 500 ml reaction vesselequipped with a bubbling pipe for nitrogen/steamdistribution, vapours collection pipe connected totwo sequential cold traps for fatty acids condensa-tion and recovery loaded with ice. Steam was pro-vided by a vacuum evaporation unit where distilledwater was dispensed and measured by means of aburette. Heating was ensured by an electric heat-ing device and vacuum was obtained thanks to a8 m3/h rotary vacuum pump mod. RV8 (Edwards,Crawley, Sussex – UK). Heating and cooling of thesample to and from the operating temperaturewere carried out under nitrogen stream, withoutsteam injection. The experimental test conditionswere: temperature of 200, 230 and 260°C, residualpressure 1 mbar, steam injection 2 g water/(100 goil x hour). Samples were taken after 30, 60 and120 min for analysis; sampling was carried outwithout cooling and by compensating the vacuumdrop by means of nitrogen, until the ambient pres-sure was reached. The inert atmosphere was main-tained into the reactor until the vacuum wasrestored. At the end of the two hours processing foreach operating temperature of the fatty acid distil-late was recovered from cold traps using acetone.Acetone was removed at 40°C under a residualpressure of 40 mbar before sample analysis.

BIODIESEL PREPARATIONA sample (100 g) of refined J. curcas oil was trans-ferred in a 250 ml flask along with 21.7 g ofmethanol. A water condenser was connected bythe flask. The flask, containing a magnetic stirrerwas installed in a glycerol bath thermostated at60°C (± 2°C). When the reaction mixture reachedthe glycerol bath temperature the catalyst, sodiummethoxyde 30% (m/m) solution in methanol (BASF- Ludwigshafen, DE), was added. The amount ofadded catalyst was calculated as 0.54% (w/w) ofdry sodium methoxyde (fixed amount) with respectto the oil. A further variable catalyst amount wasadded for the neutralisation of the free fatty acidcontent of different samples. Heating and stirring were maintained for a periodof 2 hours. At the end of the reaction time glacialacetic acid was added, in a quantity sufficient toinactivate all the catalyst with a 10% in excess.Stirring was continued for 10 min, then the neu-

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tralised sample was transferred to a vacuum rotat-ing evaporator set at 60°C, where the methanolexcess was removed (residual pressure 40 mbar).After methanol removal the reaction mixture, stillhot, was transferred in a separator funnel and leftat ambient temperature overnight. The next daybiodiesel and glycerol phases were separately col-lected and analysed. Biodiesel was also filteredthrough paper to remove the dispersed glycerol.No washing steps were used, in order to avoidDHPEs’ losses. This simple biodiesel productionprocess was in use in Italy, even at industrial level,until the beginning of this century and it allows theproduction of EN 14214 [14] complying biodiesel,with the only exception of free glycerol, alkali andalkali earth metals concentration, that might bearranged in specification by means of water wash-ing and successive vacuum drying.

ANALYTICAL METHODSOilseed/defatted meal analysis: EN ISO 662:2001and EN ISO 659:2009 standards were used for mois-ture and total oil content evaluation respectivelyOil acidity: EN 660:2009 standard was usedFatty acids composition: ISO 5508:1990 standardwas used on biodiesel sample as prepared withthe described procedure.

EXTRACTION OF DHPEs2.5 g of sample (oil, biodiesel or glycerol) wereweighed in a 10 ml screw test tube. 2.5 ml ofmethanol was added and mixed in a Vortex for 1minute. The solution was extracted for 10 minutesin a ultrasonic bath at room temperature and cen-trifuged at 5000 rpm for 10 minutes. The upperlayer was transferred in a 25 ml flask. The extrac-tion was repeated 3 times in the same mode.The extracted phases were brought to volume withmethanol (HPLC grade – Sigma Aldrich – USA). 1ml was filtered on PVDF syringe filter (13 mm, 0.45µm). The same extraction procedure was appliedto glycerine and biodiesel products, paying atten-tion to the preliminary separation of the oil phasepresent at dispersion, utilizing a centrifuge at 5000rpm. Each sample was analyzed in duplicate.

HPLC-UV ANALYSIS OF DHPEsThe HPLC analysis was carried out with a Ther-moFinnigan instrument (San Josè – CA), equippedwith a quaternary pump P4000, vacuum degasser,autosampler AS3000 and photodiode array detec-tor UV6000. The chromatograms were recorded at280 nm. The reversed phase chromatography col-umn RP 18 was purchased from Dr. Maisch (GmbH– Germany): 250 x 4 mm, particle size 5 µm. Theanalysis was carried out at room temperature. Amixture of methanol and water in a linear gradientwas used starting from a ratio 80/20 (v/v) at a flow

rate of 1ml/min and reaching in 30 minutes thecomposition of 100% of methanol, holding thiscomposition for 10 minutes. The injection volumewas 20 µl. The external calibration was implemented using 4α-phorbol, 12 myristate-13 acetate (TPA), solution(0.5 mg/ml).

RESULTS AND DISCUSSION

Jatropha curcas seed can be easily processedwith a common screw press with good crushingyields. In our case, working under the experimentalconditions previously described, it was possible torecover 84.5% of the existing oil, calculated bymeans of a mass balance that takes into accountoil and water content of the whole seed (32.20%and 6.51% respectively), of the resulting partlydefatted meal (7.42% and 4.95% respectively), ofthe weight of the inlet seed and of the weight ofproduced meal. Crushing the whole seed with hullgreatly improves the operability of the machine andthe yield of the operation. The presence of animportant amount of inert fibre allows the oil drain-ing through the press and provides the possibilityto increase the operating pressure during process-ing, avoiding oil discharge holes occlusion. Theobtained oil was dark in colour and turbid becauseof the presence of a huge amount of drag on thesolids. Solids represented approx. 7% of theobtained oil fraction. After paper filtration the oil islight yellow and clear and, after vacuum drying(100 mbar at 80°C), it remains limpid even aftercooling at room temperature. The fatty acids com-position of the obtained oil/biodiesel is reported inTable I. Just after drying the oil had an acidity of1.38 (as oleic acid %).

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Table I - Fatty acids composition of Jatropha curcas oil and corre-sponding biodiesel

In Figure 2 a typical chromatogram recorded at280 nm relative to J. curcas. raw press oil methano-lic extract is reported.Seven DHPEs‘compounds eluting between 15 and25 minutes have been characterized and namedDHPE1-7 as already identified by other authors [9].It was also possible to detect a peak eluting at27.55 minutes (tocopherol derivative), with maxi-mum UV absorption at 294 nm typical of toco-pherols class, but not corresponding to any α, β, γ,δ, tocopherol or tocol standards injected in thesame experimental conditions. α -tocopherol is thepeak eluted at 32.55 minutes (Peak 11).Other substances may be detected in the moreapolar eluting zone (29 – 40 minutes). The maxi-

mum UV absorption is similar to the DHPEs’ andwe have hypothesized to be triester of deoxy-hydroxy-phorbol (Tab. IV).In Figure 3 as an example a chromatogramobtained for Biodiesel methanolic extract (B7) isreported. The DHPEs are present in lower concentration,while the tocopherol derivative and the hypothe-sized triester are in higher concentration. It is rea-sonable that during methylester synthesis, some ofthe fatty acids in triglyceride might react with theOH groups of phorbols leading to an esterificationderivative. We reserve in the future to confirm thishypothesis by means of the HPLC-MS technique.Moreover in this matrix, such as distillate matrix, we

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Figure 2 - Crude Jatropha curcas oil – HPLC-UV at 280 nm of methanolic extract – Peak identification as in Table IV

Table IV - UV spectra data obtained for the principal compounds detected in the methanolic extract

found a compound named degrad. DHPEs, notpresent in the original raw oil, probably a degrada-tion product of DHPEs (Peak 11).The quantitative data at the moment consider onlythe DHPEs’ content: DHPEs measured on crude oilwas 2.32% (OG1), while the oil obtained from thesame seed by means of hexane extraction duringthe analytical work had a DHPEs’ content of 1.65%.The difference between the two results depends onthe extraction yield: in the case of screw pressingthere is nearly an equivalent amount of DHPEs con-centrated in a minor amount of oil. The same effectwas already described by other Authors [4, 12]. Onthe contrary the J. curcas oil in our hands containsa very important amount of DHPEs. In the alreadymentioned paper Haas and Mittelbach [9] report aconcentration on crude oil of 0.31%, while Makkaret al. [12] report a concentration of 0.31 and 0.37%for oils extracted with solvent and by screw pressrespectively. In a paper published by Ahmed andSalimon [15] DHPEs’ concentration of J. curcas oilsof different origin are reported. Results indicate aDHPEs’ concentration of 1.58%, 0.58% and 0.23%for samples obtained from Indonesia, India andMalaysia respectively.Also the degumming/silica filtration treatment canbe easily carried out. The purified oil obtained atthe end of this operation showed a small increasein acidity (1.79, as oleic acid %), probably becauseof the contact with water and mineral acids.DHPEs’ content decreased down to 2,16% and1,69% after degumming (OD1) and silica treatment

(O1) respectively. This feedstock represented thestarting material for physical neutralisation/DHPEs’removal tests.Different amounts of this oil sample wereprocessed in a high vacuum glass physical neu-tralisation apparatus under different temperatureconditions. Samples taken at different processingtimes allowed to draw a kinetic of acidity andDHPEs’ removal during physical refining. In Table IIthe obtained results are summarised. As we can

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Figure 3 - Biodiesel from Jatropha curcas oil – HPLC-UV at 280 nm of methanolic extract – Peak identification as in Table IV

Table II - Physical refining of J. curcas oil. Removal of free fatty acidsand DHPEs in different experimental conditions

see the contemporary deacidification and detoxifi-cation of J. curcas oil is feasible and by increasingthe temperature the DHPEs’ removal is much moreefficient. The temperature of 260°C appears toensure the complete DHPEs’ removal in the refinedoil. As a side effect also the contemporary free fattyacid removal can be achieved. Using our appara-tus suitable results can be obtained at a tempera-ture of almost 230°C, under a residual pressure of1 mbar, as measured after the cold traps. Animportant question concerning the fate of removedDHPEs still remained. For this reason the fatty aciddistillate condensed in the cold traps were recov-ered using acetone as a solvent and, after solventremoval, analysed for DHPEs’ content. No DHPEswere detected in distillates obtained from physicalrefining under all explored experimental condi-tions. This is an important fact demonstrating thatDHPEs are not removed from the oil as they are,but transformed or degraded because of thermaleffects. Some different peaks in important amountswere detected in the HPLC chromatogram profile(Fig. 3) showing a maximum UV absorption at 276nm. These products belonging to the DHPEs’ family arecurrently under study and will represent the subjectfor a future paper. After oil refining four differentbiodiesel samples from O1, O4, O7 and O10 oilswere prepared. The samples were analysed forDHPEs’ content and results are summarised inTable III, along with the DHPEs’ concentration ofcorresponding oil. Looking at the data it is clearthat the higher the DHPEs’ starting concentrationthe higher the DHPEs’ removal. A particular case is represented by sample B10,showing a weak concentration of DHPEs but com-ing from an oil DHPEs free after refining. Thisremark could be justified by taking into account ofthe presence of “hidden” DHPEs, in other wordsthe presence of molecules (not yet identified) thatcould act as a DHPEs’ precursor and generatingDHPEs under specific experimental conditions. No

DHPEs were recovered in all glycerol samples.This fact could be regarded as doubtful at firstsight and taking into account the solubility ofDHPEs in methanol. We must remember that theparticular biodiesel production technique used,requiring catalyst inactivation and biodiesel/glyc-erol separation only after methanol removal, surelyaffected this result.

CONCLUSIONS

With our research it was possible to demonstrateonce again the feasibility of J. curcas oil detoxifica-tion (or better, DHPEs’ removal) by means of asequence of well known physical refining unit oper-ations. The study allowed us to understand thekinetics of DHPEs’ removal/thermal degradation interms of a temperature/time scheme. In fact pro-cessing temperatures higher than 230°C allow thecontemporary removal of both free fatty acids andDHPEs. For the time being no answer can be pro-vided about the fate of disappeared DHPEs. NoDHPEs were detected in fatty acid distillates andglycerol. At the moment it is doubtful whetherdetoxification is the right word to be used. Weunderstood that DHPEs are not detectable in oil orby-products, but nothing is known neither aboutthe structure of neo-formed substances nor abouttheir toxicity. Further studies are therefore neces-sary at first to understand the chemical nature ofDHPEs’ derivatives as well as to investigate aboutthe possible presence of DHPEs’ precursors, thatcan generate DHPEs under specific experimentalconditions. During the analytical part of thisresearch the HPLC investigation provided us sev-eral suggestions that we are going to develop indetail in the future.

CONFLICT OF INTEREST

The authors have declared no conflict of interest.

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Table III - DHPEs content in oil/biodiesel obtained from different J. Curcas oils

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La determinazione del fosforo negli oli e grassi vegetali ed animali ad uso alimentare edindustriale è condotta mediante la tecnica di assorbimento atomico con fornetto di grafi-te. Il campione è analizzato direttamente senza previa mineralizzazione, con notevoli van-taggi in termini di tempo e di materiali utilizzati. Il metodo di analisi è stato sviluppato peradattarlo alla tipologia dei campioni in esame, selezionando il migliore modificante dimatrice (soluzione di nichel in cicloesano alla concentrazione di 0,2%) e le migliori con-dizioni strumentali di temperatura per il processo di pirolisi e di atomizzazione. La metodologia è stata successivamente validata determinando la linearità in un interval-lo compreso tra 1 e 60 mg/kg di fosforo in olio, la precisione in termini di ripetibilità eprecisione intermedia, l’accuratezza e la sensibilità in termini di limite di rilevabilità e diquantificazione. I risultati ottenuti sono stati confrontati con il metodo di riferimento ISO 10540-2:2003,con ottima corrispondenza tra loro. E’ stato inoltre effettuato uno studio sul possibile effet-to matrice nella determinazione diretta del fosforo nei campioni, paragonando i risultaticon quelli ottenuti previa mineralizzazione del campione stesso ed analisi in fase acquo-sa, attestando l’assenza di effetto matrice su tutte le tipologie di matrici.Infine, la metodologia è stata applicata a differenti campioni, tra cui oli vegetali ad uso ali-mentare grezzi e raffinati, oli ad uso industriale, biodiesel e grassi animali senza apporta-re nessuna modifica ed ottenendo risultati affidabili.

Direct determination of phosphorus in animal and vegetable oils and fats bygraphite furnace atomic absorption spectrometry (GF-AAS)The determination of phosphorus in animal and vegetable oils and fats has been carriedout with a graphite furnace atomic absorption spectrometer. The sample was analyzeddirectly without prior mineralization, with significant advantages in terms of time andmaterials used. The analytical method was developed to fit the type of test samples, select-ing the best matrix modifier (solution of nickel in cyclohexane at a concentration of 0.2%)and instrumental conditions for the temperature of pyrolysis and atomization. The method-ology was subsequently validated by assessing the linearity in a range between 1 and 60mg/kg of phosphorus in oil, the precision in terms of repeatability and intermediate pre-cision, accuracy and sensitivity in terms of the limit of detection and quantification. Theresults obtained were compared with the reference method ISO 10540-2:2003, with goodagreement between them.There was also carried out a study on the possible matrix effectin the direct determination of phosphorus in the samples by comparing the results withthose obtained after wet digestion of the sample and analysis in the aqueous phase attest-ing to the absence of the matrix effect on all types of matrices. Finally, the methodologywas applied to different samples, including crude and refined edible vegetable oils, oils forindustrial use, biodiesel and animal fats without making any changes and obtaining reli-able results.

Determinazione diretta del fosforonegli oli e grassi vegetali edanimali mediante assorbimentoatomico con fornetto di grafite(GF-AAS)

D. BaglioL. Folegatti*

Divisione SSOG di INNOVHUB - StazioniSperimentali per l’Industria -Azienda Speciale della Cameradi Commercio di Milano

*CORRESPONDENCEDr.ssa L. FolegattiDivisione SSOG Via Giuseppe Colombo, 7920133 Milano e-mail: [email protected]

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1. INTRODUZIONE

Il fosforo è presente negli oli vegetali principalmen-te come fosfolipide, un lipide complesso di struttu-ra simile al trigliceride dove il glicerolo è esterifica-to con due molecole di acidi grassi e un gruppofosfato che conferisce una carica negativa, e quin-di polarità, alla molecola.La quantità dei fosfolipidi negli oli vegetali è unparametro importante da monitorare durante il pro-cesso di raffinazione e la loro rimozione rappresen-ta una delle problematiche principali da affrontare.Infatti i fosfolipidi tendono a formare emulsioni cheprovocano problemi agli impianti sia durante le fasidi neutralizzazione, con perdita di olio, sia nelle fasidi stoccaggio dell’olio stesso con formazione digomme insolubili nei serbatoi, nelle tubazioni e neifiltri.I fosfolipidi sono tradizionalmente rimossi median-te il processo di degommaggio. Tale trattamento sirende necessario soprattutto negli oli (ad esempiooli di soia) che presentano substrati ricchi in fosfa-tidi (lecitine, recuperabili e riutilizzabili in varie pre-parazioni alimentari come emulsionanti). Il degommaggio con sola acqua calda permettel’allontanamento dei fosfolipidi idratabili, cheessendo solubili in acqua sono separati dall’oliomediante centrifugazione.La parte non-idratabile dei fosfolipidi, presentecome complesso con vari cationi tra cui calcio,magnesio e ferro, deve essere rimossa per tratta-mento acido o mediante raffinazione ad alcali. Neldegommaggio acido i fosfolipidi non-idratabilisono convertiti nelle forme idratate mediante l’azio-ne degli acidi (principalmente acido fosforico ocitrico) che agiscono da agenti sequestranti rom-pendo il complesso catione – fosfolipide. Il risulta-to di tale reazione è la formazione di sali e di fosfo-lipidi idratabili, insolubili in olio, che sono poi allon-tanati mediante centrifugazione.Gli oli degommati hanno solitamente un contenutodi fosfolipidi di circa 25 mg/kg misurato comefosforo. Una ulteriore riduzione avviene mediantetrattamento con alcali per eliminare l’eccesso diacido e allontanare le ultime gomme. Il risultato èun olio avente un contenuto di fosfolipidi inferiore a10 mg/kg, pronto per i successivi trattamenti di raf-finazione.La determinazione del contenuto totale di fosforo èun indicatore dell’entità della rimozione dei fosfoli-pidi ed è importante sia negli oli vegetali alimenta-ri che negli oli destinati all’uso industriale. Adesempio nei biocarburanti la presenza di fosfatidicausa un aumento dell’indice carbonioso “Conrad-son”, determinando deposizioni nella camera dicombustione. La determinazione del fosforo negli oli è tradizio-nalmente effettuata mediante analisi spettrofoto-

metrica nel visibile [1]. Questa procedura lunga elaboriosa, che include la formazione di un com-plesso fosfo-vanadio-molibdato la cui assorbanzaviene letta a 650 nm, non trova ampia applicazionenell’industria come metodo di routine. Tecnichealternative, più veloci e con minor dispendio dimateriali e campione, sono normalmente impiega-te, tra cui l’analisi con emissione atomica con pla-sma (ICP-AES), oggetto anche di metodi di riferi-mento [2, 6], e con assorbimento atomico confiamma e fornetto di grafite (AAS).L’analisi del fosforo mediante assorbimento atomi-co ha creato nel passato diversi problemi legatialla posizione delle linee di risonanza di questoelemento, situate nel lontano ultravioletto. Infatti, laprima linea di risonanza del fosforo (la più sensibi-le) è nella regione UV a 177.50, 178.29 e 178.77nm. Analisi effettuate a queste lunghezze d’ondarichiedono configurazioni strumentali molto parti-colari, non disponibili per gli strumenti normalmen-te in commercio. Recentemente, l’avvento dellelampade a scarica senza elettrodi (EDL), aventiuna maggiore intensità luminosa rispetto alle clas-siche lampade a catodo cavo, ha permesso l’ana-lisi di questo elemento in modo routinario utilizzan-do la seconda linea di risonanza del fosforo(213.62 e 213.55 nm). A differenza del sistema a fiamma, la determinazio-ne del fosforo con assorbimento atomico e fornettodi grafite richiede la presenza di un modificante dimatrice, sia che si operi direttamente sul campionein fase organica, sia che si proceda alla sua mine-ralizzazione e analisi in fase acquosa [7,8]. Il presente studio ha lo scopo di sviluppare e vali-dare un metodo per l’analisi diretta del fosforo neglioli e grassi vegetali, sia ad uso alimentare cheindustriale e nei grassi animali, mediante l’utilizzodi uno spettrofotometro ad assorbimento atomicocon fornetto di grafite. Le caratteristiche dellametodica analitica sono poi confrontate con ilmetodo di riferimento ISO 10540-2 (2003) [8] e conil metodo in fase acquosa dopo mineralizzazionedel campione per la valutazione dell’effetto matri-ce.

2. PARTE SPERIMENTALE

2.1. MATERIALI E REAGENTITutti i reagenti impiegati sono di grado ultra-puro. Per le analisi condotte in fase organica: il cicloesa-no è fornito dalla Carlo Erba (Milano, IT) ed è digrado per spettroscopia, le soluzioni standard difosforo e di nichel in olio (concentrazione di 5000mg/kg), e l’olio bianco diluente sono forniti dallaConostan (Nova Chimica, Milano, IT).Per le analisi in fase acquosa: l’acido nitrico con-centrato (69%) è di grado superpuro per assorbi-mento atomico (Panreac, Milano, IT), l’acqua è

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bidistillata (Carlo Erba, Milano, IT). La soluzionestandard concentrata di fosforo in acqua (concen-trazione 1000 mg/L) e i modificanti di matricePd(NO3)2 in 15% HNO3 (10000 mg/L di Pd) eMg(NO3)2 in acqua (10000 mg/L di Mg) sono forni-ti dalla Perkin Elmer (Monza, IT).I campioni di oli e grassi vegetali analizzati com-prendevano oli vegetali grezzi (soia, girasole, mais,palma e palmisto etc.), oli vegetali raffinati per usoalimentare, oli vegetali ad uso industriale e biodie-sel. Inoltre si sono analizzati anche grassi di origi-ne animale.

2.2. STRUMENTAZIONELe analisi sono state condotte impiegando unospettrofotometro ad assorbimento atomico modelloAAnalyst 600 della Perkin-Elmer dotato di fornettodi grafite con correzione del rumore di fondomediante effetto Zeeman longitudinale. La lampada impiegata è a scarica senza elettrodi(EDL) e le misure di assorbanza sono state effet-tuate a 213.6 nm con uno slit di 0.7 nm.Il fornetto di grafite montava tubi di grafite piroliticariscaldati trasversalmente con piattaforma integra-ta (THGA end-caps). Il programma di temperatura utilizzato per le anali-si in fase organica è riportato in Tabella I, mentre ilprogramma di temperatura per le analisi in faseacquosa è riportato in Tabella II. L’introduzione del campione è stata effettuata conun autocampionatore modello AS 800 della Perkin-Elmer e il volume iniettato era di 10 μl per la faseorganica e di 20 μl per le analisi in fase acquosa aduna temperatura iniziale del fornetto di 50°C.L’acquisizione e l’elaborazione dei dati è stata ese-guita con software WinLab 32.Per la mineralizzazione del campione è stato utiliz-zato un mineralizzatore Discover SP-D con auto-campionatore Explorer della CEM (Bergamo, IT). Il

programma di mineralizzazione impiegato preve-deva il raggiungimento della temperatura di 210°Cin 5 minuti con una pressione massima ammissibi-le di 400 psi, e il mantenimento di tale temperaturaper 3 minuti.

2.3. PREPARAZIONE DEL MODIFICANTE DI MATRICEPer l’analisi dei campioni in fase organica, comemodificante di matrice è stata utilizzata una solu-zione di nichel in cicloesano avente una concentra-zione di 0.2% (m/v), preparata diluendo la soluzio-ne standard di nichel in olio bianco della Conostan(concentrazione 5000 mg/kg) con cicloesano. Perlo sviluppo del metodo è stato impiegato anche unmodificante di matrice costituito da una soluzionedi lantanio in cicloesano avente una concentrazio-ne di 0.2% (m/v), partendo da una soluzione di lan-tanio organico (Riedel-deHaën, Milano, IT).Per l’analisi dei campioni di fase acquosa, il modi-ficante di matrice impiegato era composto da0.020 mg Pd + 0.005 mg di Mg(NO3)2. Il volume dimodificante aggiunto è stato di 5 μl.

2.4. PREPARAZIONE DELLE SOLUZIONI DI CALIBRAZIONEE DEI CAMPIONIPer le analisi in fase organica: le soluzioni di cali-brazione sono state preparate partendo da unasoluzione standard di fosforo in olio bianco dellaConostan (concentrazione 5000 mg/kg). In detta-glio, si è preparata una soluzione diluita di fosforoin olio bianco avente una concentrazione di 200mg/kg. Si è poi proceduto alla preparazione disoluzioni standard di calibrazione aventi le con-centrazioni di 5, 10, 20, 30 e 40 mg/kg di fosforo,diluendo opportunamente la soluzione standard a200 mg/kg con olio bianco e con modificante dimatrice in modo da mantenere un rapporto 1:1(m/m) tra olio e modificante di matrice.Per i campioni di olio liquidi a temperatura ambien-

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Tabella I - Programma di temperatura del fornetto di grafite per la fase organica

Tabella II - Programma di temperatura del fornetto di grafite per la fase acquosa

te sono stati pesati 1.000 g in un vial da 15 ml eaggiunti di 1.000 g di modificante di matrice (dilui-zione 1:1, m/m), omogeneizzati ed analizzati diret-tamente. Nel caso di concentrazioni di fosforo noncomprese nell’intervallo di calibrazione, i campionisono stati diluiti con olio bianco e successivamen-te addizionati di modificante di matrice, mantenen-do sempre un rapporto 1:1 (m/m) tra olio e modifi-cante di matrice.I campioni solidi a temperatura ambiente eranodisciolti in stufa ad una temperatura superiore di10°C rispetto al loro punto di fusione, rispettandoperò una temperatura massima di 60-80°C finoall’ottenimento di campioni liquidi e limpidi. Essierano poi trattati come precedentemente descrittoper i campioni liquidi.Per le analisi in fase acquosa: le soluzioni di cali-brazione sono state preparate partendo da unasoluzione standard di fosforo in acqua avente unaconcentrazione di 1000 mg/L. Si è poi proceduto apreparare le soluzioni standard diluite di fosforo insoluzione di acido nitrico 0.3% aventi le concentra-zioni di 5, 10 e 25 mg/L.I campioni di olio sono stati preventivamente mine-ralizzati pesando 0.300 g di campione in contenito-re idoneo alla mineralizzazione e addizionati di 5ml di acido nitrico concentrato. Alla fine del pro-cesso i campioni sono stati portati al volume di 10ml con acqua bidistillata. Si è poi proceduto adeffettuare ulteriori diluizioni del campione conacqua in modo da ottenere soluzioni aventi unaconcentrazione di acido nitrico il più possibile vici-no allo 0.3%.

2.5. ESPRESSIONE DEI RISULTATIIl fosforo contenuto nel campione è stato quantifi-cato mediante calibrazione con standard esterni.Le soluzioni standard di fosforo sono state analiz-zate giornalmente e impiegate per la costruzionedella retta di calibrazione, riportando in ascisse ilvalore di concentrazione di fosforo in mg/kg ed inordinate l’area del picco transiente sottratta per ilvalore del bianco.La concentrazione di fosforo nel campione è statapoi calcolata considerando gli eventuali fattori didiluizione ed esprimendo il risultato finale comemedia di due determinazione effettuate sullo stes-so campione.

3. RISULTATI E DISCUSSIONE

3.1. SCELTA DEL MODIFICANTE DI MATRICE E OTTIMIZ-ZAZIONE DELLE CONDIZIONI STRUMENTALILa determinazione del fosforo mediante assorbi-mento atomico con fornetto di grafite è stata ogget-to di studio da parte di numerosi ricercatori [9-12].In particolare A. J. Curtius e collaboratori hannoinvestigato l’analisi di tale elemento senza l’impie-

go di modificanti di matrice concludendo che il tipodi grafite (pirolitica o elettrografite), il valore dellatemperatura di pirolisi e le condizioni di atomizza-zione condizionavano fortemente la sensibilità delmetodo, la quale poteva variare di più di un ordinedi grandezza [9]. Tuttavia, anche ponendosi nellemigliori condizioni strumentali possibili, parte delfosforo veniva perso sotto forma di molecole gas-sose prima dell’atomizzazione, rendendo necessa-rio l’impiego di un modificante di matrice. Inoltre iltipo di tubo di grafite (con piattaforma integrata osenza piattaforma) condizionava l’analisi e i risulta-ti migliori, in termini di sensibilità, erano ottenuticon un tubo con piattaforma integrata. Infatti, ladeterminazione del fosforo alle lunghezze d’onda213.5-213.6 nm necessita dell’atomizzazione esuccessiva eccitazione degli atomi e la presenzadella piattaforma offre le condizioni favorevoli perottenere una più elevata concentrazione di atomiallo stato eccitato rispetto all’atomizzazione suparete.Gli stessi autori hanno poi studiato differenti modi-ficanti di matrice (tra cui lantanio, ittrio, nichel, pal-ladio) al fine di scegliere il più adatto all’analisi,considerando la temperatura di pirolisi, il valoredella massa caratteristica e la loro influenza sulladurata del tubo di grafite e sulla riproducibilità delsegnale [10].Il modificante di matrice più diffuso per questo tipodi analisi è il lantanio e P. W. Hendrikse e collabo-ratori hanno pubblicato un metodo IUPAC cheimpiega questo modificante per la determinazionediretta del fosforo negli oli e grassi [7]; lo stessometodo è stato poi recepito dalla ISO per la deter-minazione del fosforo negli oli e grassi vegetali edanimali [8]. Applicando tale metodologia abbiamo riscontratoseri problemi analitici. In particolare, il metodo pro-poneva la diluizione del campione di olio o grassocon una soluzione allo 0.2% di lantanio in cicloesa-no, in proporzione 1:1. Le analisi da noi condotteimpiegando queste condizioni analitiche avevanouna scarsa riproducibilità del segnale del fosforo,un forte effetto memoria anche impiegando eleva-te temperature di pulizia del tubo di grafite (fino a2550°C, la massima ammissibile dallo strumento) euna forte usura del tubo stesso. Tutti questi proble-mi derivavano dal fatto che il lantanio reagisce conil fosforo formando dei composti che coinvolgonoanche il carbonio del tubo di grafite, producendoun forte effetto memoria ed usurando fortemente iltubo stesso. Inoltre la stabilità del segnale delfosforo era raggiunta solo dopo diverse iniezionidel campione, degradando poi per l’effetto memo-ria e di usura dovuto al lantanio stesso [12].Un altro inconveniente era rappresentato dalle ele-vate temperature di atomizzazione e di puliziarichieste dal metodo di analisi (2600-2700°C). Con

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lo strumento da noi usato non era possibile impo-stare valori così elevati in quanto la massima tem-peratura ammissibile è di 2550°C. Tutto questo ciha portato a valutare e selezionare un altro modifi-cante di matrice per l’analisi del fosforo negli oli. Quando il campione di analisi è in soluzioneacquosa, il modificante più diffuso è una soluzionecostituita da palladio in miscela con piccole quan-tità di calcio o magnesio. Questo modificante per-mette l’impiego di elevate temperature di pirolisisenza la perdita del fosforo in quanto si forma uncomposto chimico, di natura non ancora ben iden-tificata, che stabilizza il fosforo stesso. Inoltre il pal-ladio non provoca effetto memoria, non usura iltubo di grafite e permette l’ottenimento di elevatesensibilità già dalle prime iniezioni del campione.Gli stessi vantaggi dell’impiego del palladio sonoriportati per il nichel, anche se esso provoca unamaggiore usura del tubo di grafite quando è addi-zionato ad elevate concentrazioni.Il modificante da noi impiegato è stato una soluzio-ne di nichel in cicloesano, composto di più facilereperibilità in fase organica rispetto al palladio, allaconcentrazione di 0.2% (m/v), identica a quellaindicata per il lantanio [7].L’analisi di un elemento mediante assorbimentoatomico con fornetto di grafite necessita della defi-nizione di un programma di temperatura appro-priato da applicare al fornetto stesso, che include iseguenti processi: essiccamento del campioneeffettuato a temperature tali da eliminare la mag-gior parte del solvente (sia esso acqua o miscelaorganica); incenerimento o pirolisi del campione incui si ha la disgregazione della matrice e l’allonta-namento delle impurezze. La temperatura di que-sto processo è caratteristica per ogni elemento edeve evitare la perdita dell’elemento stesso. Infine,l’atomizzazione del campione, che avviene a tem-perature comprese tra 2000-2500°C, caratteristicheper ogni elemento, in cui si ha la disgregazione del-l’elemento e la formazione del vapore atomico.Come fase preliminare dello sviluppo del metododi analisi, si è proceduto all’ottimizzazione delletemperature per il processo di pirolisi e di atomiz-zazione impiegando direttamente un campione diolio vegetale addizionato con 20 mg/kg di fosforo.

I risultati sono riportati in Figura 1 per le tempera-ture di pirolisi e per l’atomizzazione.Come si può notare dalla Figura 1, la migliore tem-peratura di pirolisi è stata di 1100°C. Essa garanti-sce l’eliminazione della maggior parte della matri-ce organica senza perdita del fosforo. Per quantoriguarda il processo di atomizzazione, la tempera-tura selezionata è stata di 2500°C, la massimaammissibile con lo strumento da noi utilizzato e chefornisce un buon segnale di assorbanza. La valutazione della sensibilità raggiunta applican-do queste condizioni strumentali è stata eseguitasulla base del valore della massa caratteristica peril fosforo. La massa caratteristica è un parametrostrumentale tipico dell’assorbimento atomico confornetto di grafite ed è definita come la massa del-l’analita in picogrammi necessaria per produrre unpicco avente un’assorbanza di 0.0044 unità oun’area di 0.0044 Assorbanza × secondo. Essa èquindi funzione delle condizioni strumentali sele-zionate ed è un indicatore delle performance dellostrumento stesso. Nelle condizioni da noi adottate il valore dellamassa caratteristica è stato di 23000 pg/0.0044 A× s, valore paragonabile come ordine di grandez-za a quello riportato dal costruttore per lo stessoelemento in matrici acquose (12000 pg/0.0044 A × s).

3.2. VALIDAZIONE DEL METODO DI ANALISIIl metodo di analisi è stato poi validato internamen-te mediante la definizione dei seguenti parametristatistici: linearità, espressa in termini di intervallodi linearità della risposta del fosforo in soluzionistandard preparate in olio; precisione, espressa intermini di deviazione standard della ripetibilità edella precisione intermedia; accuratezza, calcolatamediante analisi di campioni a concentrazioninote; sensibilità espressa in termini di limite di rile-vabilità (LOD) e limite di quantificazione (LOQ)[13].

3.2.1. LinearitàLa linearità del metodo è stata valutata mediantel’analisi di soluzioni standard di fosforo preparatedirettamente in olio bianco e diluendole con modi-ficante di matrice in proporzione 1:1 (m/m). L’inter-vallo di concentrazioni analizzato è stato da 10 - 40mg/kg di olio. Tale intervallo è stato successivamente ampliatofino 100 mg/kg, ma a tale concentrazione si notavauna curvatura della risposta, comportamento tipicodelle analisi che seguono la legge di Lambert-Beer. La linearità è mantenuta fino alla concentra-zione di 60 mg/kg. Il valore delle rette di calibrazio-ne ottenute e i relativi r2 sono riportati in Tabella IIIper i due intervalli di concentrazione analizzati.Come si nota dai valori delle rette di calibrazione

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Figura 1 - Variazione della risposta del Fosforo a diverse temperatu-re di pirolisi e di atomizzazione

riportati in Tabella III, le pendenze e le intercettesono molto simili per entrambi gli intervalli di con-centrazione. Ciò ci ha portato a selezionare unampio intervallo di calibrazione, da 10 a 60 mg/kg,permettendo così l’analisi di campioni aventi diffe-renti quantità di fosforo senza operare successivediluizioni.

3.2.2. Precisione La precisione del metodo è stata determinata effet-tuando 8 analisi su un campione di olio vegetaleaddizionato a tre diverse concentrazioni di fosforo,in condizioni di ripetibilità, in cui cioè le determina-zioni sono state effettuate nello stesso giorno, dallostesso operatore e impiegando il medesimo stru-mento, e in condizioni di precisione intermedia,analizzando lo stesso campione in giorni diversi.I risultati ottenuti sono stati sottoposti ad analisidella varianza (ANOVA) per calcolare la ripetibilitàe la precisione intermedia.In aggiunta, i dati di precisione sono stati compa-rati con il valore calcolato applicando l’equazionedi Horwitz, una relazione empirica che fornisce laprecisione accettabile ad un determinato livello diconcentrazione dell’analita. Il rapporto tra la devia-zione standard relativa percentuale (RSD%) in con-

dizioni di precisione intermedia e il valore di RSD%fornito dall’equazione di Horwitz è noto come valo-re HORRAT ed è un indicatore della precisione del-l’analisi. Solitamente, valori inferiori a 1 indicanouna buona precisione analitica, valori compresi tra1 e 1.5 sono risultati accettabili, mentre valori supe-riori a 2 indicano la presenza di problemi analiticiche compromettono la precisione dell’analisi.I risultati degli studi di ripetibilità sono riportati inTabella IV.Come si può notare dai dati riportati in Tabella IV, laprecisione è buona in tutto l’intervallo di concentra-zioni analizzate, con un valore di RSD% di ripetibi-lità 3.6% per la concentrazione di 28 mg/kg, di2.7% a 47 mg/kg e di 1.8% per la concentrazionedi 62 mg/kg e un RSD% di precisione intermedia di3.9% per la concentrazione di 19 mg/kg, 6.9% perla concentrazione di 39 mg/kg e di 5.0% per laconcentrazione di 57 mg/kg. Anche i valori di HOR-RAT sono molto buoni, tutti inferiori a 1.

3.2.3. AccuratezzaL’accuratezza del metodo è stata determinata ana-lizzando campioni di oli vegetali aventi una con-centrazione di fosforo certificata. Data la difficoltànel reperire un materiale di riferimento a concentra-

157


Tabella III -Retta di calibrazione del Fosforo in soluzioni standard di olio

Tabella IV - Risultati dello studio di precisione per l’analisi del fosforo.

Tabella V - Risultati dello studio di accuratezza per l’analisi del fosforo.

zione certificata di fosforo in olio, i campioni analiz-zati appartenevano ad un circuito di correlazione ela concentrazione di fosforo in tali campioni derivadal trattamento statistico dei risultati delle proveinterlaboratorio. Il circuito interlaboratorio selezio-nato era organizzato dalla UNICHIM (Milano) nel2010 e la matrice analizzata era composta da oliomotore [14].In Tabella V sono riportati i risultati delle analisieffettuate su due campioni. La concentrazionemisurata è la media di 3 analisi ripetute sullo stes-so campione.Dai risultati riportati si nota come il metodo di ana-lisi proposto ha una buona accuratezza, attestatadai valori di recupero % dei due campioni pari a 97e 103%.

3.2.4. Limite di rilevabilità (LOD) e di quantificazio-ne (LOQ)Il limite di rilevabilità rappresenta il minimo segna-le rilevabile con un errore accettabile, solitamentedefinito come il rapporto tra segnale e rumoreuguale a 3. Il limite di quantificazione è definitocome il rapporto tra segnale e rumore uguale a 10.Per il calcolo del LOD e LOQ è stato analizzato 8volte un campione di olio bianco. Si è poi calcola-ta la deviazione standard delle 8 prove e i corri-spondenti valori di LOD e LOQ come 3 volte e 10volte la deviazione standard. I risultati sono riporta-ti in Tabella VI.

Come si può notare, i valori dei limiti di rilevabilitàe di quantificazione sono comparabili a quelli ripor-tati nel metodo ISO 10540-2:2003 [8] che stabilisceun LOD di 1 mg/kg di fosforo nel campione.Tali limiti possono essere ulteriormente abbassati,aumentando la quantità di campione iniettato nellafornace. Al momento il volume di iniezione impie-gato è di 10 μl, il quale può essere aumentato fino

a 40 μl. La scelta di mantenere una quantità iniet-tata non troppo elevata è frutto di una valutazionedei costi/benefici in termini di pulizia ed usura deltubo di grafite. Inoltre tali limiti sono adeguati per leanalisi del fosforo nelle matrici di nostro interesse.

3.3. CONFRONTO DEL METODO DI ANALISI CON ILMETODO DI RIFERIMENTO ISO 10540-2:2003Il metodo ISO 10540-2:2003 prevede l’analisi delfosforo negli oli e grassi vegetali ed animalimediante assorbimento atomico con fornetto digrafite. La metodica analitica prevede l’impiego diuna soluzione di lantanio in cicloesano al 0.2%come modificante di matrice e riporta i dati di pre-cisione, ottenuti dalle prove di analisi di due circui-ti interlaboratorio organizzati nel 1989 e 1999. Inol-tre riporta i limiti sul valore di ripetibilità e riproduci-bilità dell’analisi. In Tabella VII sono riportati i dati diconfronto tra il metodo qui proposto ed il metodoISO. I valori limite di ripetibilità e riproducibilità delmetodo ISO sono stati calcolati dalla interpolazionelineare dei valori riportati nella Tabella II della meto-dica ISO, come specificato dalla norma stessa.Come si può notare dai dati riportati in Tabella VII,il metodo proposto soddisfa tutti i requisiti riportatinel metodo ISO 10540-2:2003, sia in termini diintervallo di linearità, di precisione del metodo(espresso come ripetibilità e riproducibilità) e dilimite di rilevabilità.

3.4. ANALISI DELL’EFFETTO MATRICE SULLA DETERMI-NAZIONE DEL FOSFOROIl metodo di analisi sviluppato prevede comecampo di applicazione oli e grassi di origine ani-male e vegetale, sia per uso alimentare che indu-striale, includendo quindi una vasta gamma dimatrici.La tecnica di analisi mediante assorbimento atomi-co con fornetto di grafite offre notevoli vantaggi intermini di sensibilità analitiche, ma è soggetta aforti effetti matrice per campioni complessi.Al fine di verificare l’assenza di effetto matrice sulladeterminazione diretta del fosforo nel campione siè proceduto ad analizzare un set di campioni pre-via mineralizzazione e successiva analisi del fosfo-ro in fase acquosa.Il metodo di analisi impiegato per la determinazio-

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Tabella VI - Limite di rilevabilità (LOD) e di quantificazione (LOQ) perl’analisi del Fosforo

Tabella VII - Risultati dello studio di comparazione dei metodi per l’analisi del fosforo

ne del fosforo in fase acquosa era fornito dalla dittacostruttrice dello strumento (Perkin Elmer), ed èstato applicato senza alcuna modifica.In Tabella VIII sono riassunte le performance delmetodo di analisi in fase acquosa e la comparazio-ne con le stesse ottenute per il metodo diretto infase organica.Come si può notare dai dati riportati in Tabella VIIIl’analisi del fosforo in fase acquosa risulta avereuna sensibilità superiore rispetto a quella in faseorganica, indicata dalla massa caratteristica, laquale ha un valore doppio in fase acquosa. Per quanto riguarda la precisione dell’analisi, in ter-mini di ripetibilità e riproducibilità intermedia,entrambi i metodi hanno fornito risultati paragona-bili e buoni come valori numerici (sempre inferiorial 5% come deviazione standard relativa su tuttol’intervallo di concentrazione).Una nota particolare deve essere segnalata perquanto riguarda i limiti di rilevabilità e di quantifica-zione. Essi risultano più bassi per le analisi effet-tuate in fase acquosa, calcolati sui campioni diluitiprima dell’iniezione in fornetto di grafite. I campio-ni devono però subire la mineralizzazione e laquantità massima pesata è di circa 0.3 g; inoltrel’entità della diluizione del campione deve esseredi almeno un fattore 20 per avere una percentualedi acido nitrico nella soluzione da iniettare in fornet-to di grafite inferiore al 5%.La quantità di acido nitrico influenza fortementel’analisi del fosforo in soluzioni acquose e in parti-colare passando da una concentrazione di 2% auna di 20% si nota una riduzione del segnale delpicco transiente del fosforo del 30%. Questo fattodetermina il valore del limite di rilevabilità, per cuianche se l’analisi in fase acquosa è più sensibilerispetto a quella in fase organica, l’entità della dilui-zione che subisce il campione provoca un notevo-le innalzamento di LOD e conseguentemente diLOQ.Questo problema di eccessiva diluizione non sus-siste per le analisi in fase organica, le quali hanno

una diluizione minima di 2, aumentando notevol-mente la sensibilità dell’analisi.Tenendo conto di questi fattori, la valutazione del-l’effetto matrice è stata effettuata su campioniaventi concentrazioni di fosforo superiori a 200mg/kg. Sono stati analizzati oli vegetali grezzidestinati alla successiva raffinazione per renderliad uso alimentare, oli vegetali per uso industriale egrassi animali, per un totale di 10 campioni.I risultati ottenuti applicando entrambi i metodi dianalisi sono risultati paragonabili, indicando l’as-senza di un effetto matrice lavorando direttamentein fase organica senza previa mineralizzazione delcampione. Lo scarto tra i risultati è inferiore al 15%,valore accettabile considerando l’impiego di duetecniche analitiche differenti.

4. CONCLUSIONI

In questo studio si è sviluppato e validato un meto-do per l’analisi diretta del fosforo in oli e grassi diorigine vegetale ed animale ad uso alimentare edindustriale mediante assorbimento atomico confornetto di grafite. A tale scopo sono stati valutatidifferenti modificanti di matrice e il nichel è risulta-to essere il più adatto fornendo una buona sensibi-lità analitica e provocando la minore usura del tubodi grafite e uno scarso effetto memoria.Il metodo di analisi è stato poi validato internamen-te mediante la definizione dell’intervallo di linearità,della precisione (in termini di ripetibilità e di preci-sione intermedia), dell’accuratezza analizzandomateriali a concentrazione nota di fosforo e dellasensibilità, espressa dal valore del limite di rileva-bilità e di quantificazione. Inoltre è stato confronta-to con la norma ISO 10540-2:2003, avente il mede-simo campo di applicazione e tecnica analitica,fornendo ottimi risultati.Il metodo di analisi sviluppato prevede un ampiocampo di applicazione includendo matrici moltodiverse tra loro. A tal fine è stato effettuato uno stu-dio del possibile effetto matrice sulla determinazio-

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Tabella VIII - Comparazione dei metodi per l’analisi del fosforo in fase acquosa ed organica

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ne diretta del fosforo nei campioni paragonando irisultati con quelli ottenuti previa mineralizzazionedel campione stesso ed analisi in fase acquosa.L’assenza di effetto matrice è stata verificata sututte le tipologie di matrici, siano essi oli vegetaligrezzi destinati alla successiva raffinazione perrenderli ad uso alimentare, oli vegetali per usoindustriale e grassi animali. Il limite analitico all’impiego del presente metodoper l’analisi del fosforo in fase organica è rappre-sentato dalla solubilità del campione in cicloesano.Infatti alcuni grassi vegetali idrogenati sono difficil-mente solubili in solventi organici a temperaturaambiente o a temperature inferiori a 80°C. In que-sti casi si rende necessaria la mineralizzazione delcampione e l’analisi in fase acquosa. Per tutti glialtri campioni analizzati il metodo in fase organicasi è dimostrato più semplice, veloce e affidabile.

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The influence of bottle sizes on extra virgin olive oil quality decay during storage in differ-ent conditions, i.e. dark and light, was investigated for a period of about 8 months. Threeclear glass bottles with different volumetric capacity, i.e. 0.125 L, 0.250 L, and 0.500 Lwere used. Marked differences were recorded among samples as related to the light expo-sure, i.e. more advanced quality decay under light conditions as compared to dark condi-tions. PCA analysis showed a clear sample separation as related to the exposure condi-tions and storage time, whereas only under light exposure the bottles size become a rele-vant parameter to determine more advanced quality decay probably as a consequence ofthe highest ratio between the exposed oil surface and the oil mass volume into the bottle.This result was confirmed by LDA that clearly evidenced a group separation of the oil sam-ples stored in 0.125 L volume bottles.Keywords: virgin olive oil; glass bottles; shelf life

Bottiglie di vetro di diverse dimensioni per il confezionamento di olio d’oli-va vergine: influenza sulla shelf lifeE’ stata indagata l’influenza delle dimensioni delle bottiglie sul decadimento qualitativo diun olio extra vergine di oliva durante un periodo di conservazione di circa 8 mesi, sia incondizioni di esposizione alla luce che al buio. Sono state utilizzate bottiglie con tre diver-se capacità, 0.125 L, 0.250 L e 0.500 L. Differenze marcate sono state riscontrate nei cam-pioni in funzione dell’esposizione alla luce e del tempo di conservazione, ovvero è statoosservato uno stato di degradazione più avanzato per i campioni conservati alla lucerispetto a quelli conservati al buio. L’analisi PCA ha evidenziato una chiara separazione deicampioni in funzione delle condizioni di esposizione e del tempo di esposizione. La diver-sa capacità delle bottiglie è risultata un parametro rilevante nel determinare la degradazio-ne in particolare dell’olio sottoposto a conservazione alla luce, probabilmente a causadella maggiore superficie di olio esposta per unità di volume di olio all’interno della bot-tiglia. Questo risultato è stato confermato dall’analisi LDA che ha evidenziato una nettaseparazione dell’insieme dei campioni di olio conservati alla luce in bottiglie da 0.125 L.Parole chiave: olio vergine di oliva; bottiglie di vetro; shelf life

Glass bottles of different sizes forthe packaging of virgin olive oil:

influence on shelf life

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LA RIV ISTA ITAL IANA DELLE SOSTANZE GRASSE - VOL. LXXX IX - LUGLIO/SETTEMBRE 2012

P. Masella1*A. Parenti2

P. Spugnoli2

1Istituto di Biologia eBiotecnologia Agraria (IBBA)

Consiglio Nazionale delleRicerche (CNR) - Milano

2Dipartimento di Economia,Ingegneria, Scienze e

Tecnologie Agrarie e Forestali(DEISTAF),

Facoltà di Agraria,Università degli Studi, Firenze

*CORRISPONDENZA AUTOREDr. Piernicola Masella

Via E. Bassini 1520133 Milano

phone: +39 02 23699433fax: +39 02 23699411

e-mail: [email protected]

INTRODUCTION

Olive oil generally has a relatively long shelf life asmost producers consider 12-18 months as themaximum storage period from bottling to con-sumption. In any case, olive oil produced in a cropseason is usually consumed before the next cropseason, i.e. 10-12 months. Olive oil is consideredto be resistant to oxidation because of its low con-tent of polyunsaturated fatty acids and of the pres-ence of natural antioxidants such as phenoliccompounds. However, like other vegetable oils, itis susceptible to quality decay during storage as aconsequence of lipolysis and oxidation, the mainprocesses leading to the most serious deteriora-tion of olive oil. Lipolysis generally starts earlywhen the oil is in the fruit, while the oxidationbegins at the processing stage and continues dur-ing storage [1-3]. Further, oxidation which affectsboth the oil organoleptic properties and its nutri-tional and commercial value, can take place eitherin the presence of light (photoxidation) or in thedark (autoxidation) [4-6]. The rate of oxidationdepends upon various parameters such as thestorage conditions (temperature and light) as wellas on the availability of soluble oxygen into the oilmass and the kind (material) and color of packag-ing. In the last few years these parameters werestudied in a lot of different storage arrangementsand the effects on the olive oil quality decay werewell evidenced [7-17] but information about theinfluence of containers (bottles) size on olive oilstability during storage are lacking. The aim of thiswork was to ascertain the influence of bottle sizes,in terms of bottle surface-oil volume ratio, on thequality decay of olive oil stored in different condi-tions, i.e. dark and light, during a period of about8 months.

MATERIALS AND METHODS

EXPERIMENTAL PROCEDUREA shelf life test was performed using three clearglass bottles of equal shape (pseudo-cylindrical)but with different volumetric capacity, i.e. formally0.125 L, 0.250 L and 0.500 L. The different volu-metric capacity corresponds to three differentratios between the bottle surface, i.e. the exposedoil surface, and the bottle volume, i.e. the oil massvolume into the bottle. This last ratio, namelySoil/Voil (cm-1), was used in the following as the cri-terion for the comparison of the different bottles.Extra virgin olive oil produced from a blend of fran-toio, moraiolo and leccino cultivar, by means of 2-phases continuous extraction plant placed nearFlorence (Italy), was used for the experimental test.The total amount of olive oil was emptied into a

recipient for homogenization and then transferredto the containers. Each different bottle was filled upleaving a headspace proportional to the oil volume(3%) so that the ratio between the headspace vol-ume and oil volume was the same in all the bottles.Then, the bottles were sealed and divided in twoseries; the first one was stored in the dark, the sec-ond one in the light. In both cases the bottles wereplaced and evenly spaced on a shelf so as to sim-ulate the conditions of a supermarket (at room tem-perature, 20-22°C). Each of the two series consistsof three sub-series corresponding every one to abottle with different volumetric capacity, i.e. Soil/Voil

of 1.21 cm-1, 0.95 cm-1 and 0.73 cm-1 for bottles of125 cm3, 250 cm3 and 500 cm3 respectively. Theanalyses times were the following: initially (0 days)and 29, 50, 71, 99, 113, 134, 162, 197, 210 and230 days after bottling and storage (the series ofbottles were stored without opening for thesetimes). The quality evolution of the olive oil sam-ples during the storage period was evaluated bymeans of some chemical analyses, such as freeacidity (FA), peroxide value (PV), UV absorption(K232, K270, and ΔK), total chlorophyll (Chlo) andcarotens (Caro) concentration, total hydrophilicphenols concentration (colorimetric method, HP),differential pulse voltammetry (DPV) determinationof phenolic fractions.

CHEMICAL ANALYSIS Free acidity, PV and UV absorption were carriedout according to the European Official Method ofAnalysis [18]. Total Chlo and Caro concentrationswere determined at 670 and 472 nm respectively,in cyclohexane, using specific extinction values,by the method of Minguez-Mosquera et al. 1990[19]. Total hydrophilic phenols were extracted byliquid-liquid partition with an 80:20 methanol/watersolution. The total phenols content of the extractwas determined by the Folin-Ciocalteau spec-trophotometric method at 765 nm, using gallic acidas the calibration standard [20].Differential pulse voltammetry (DPV) determinationof the phenolic fraction was performed followingthe methodologies proposed by Capannesi et al.2000. DPV conditions were: potential range100±700 mV vs. screen-printed reference elec-trode; pulse amplitude 50 mV; scan rate 50 mV/s;pulse width 60 ms. Sample extraction and calibra-tion curve (oleuropein) for quantitative analysis asreported by Capannesi et al. 2000 [20]. Concen-trations were expressed as mg*kg-1. All determina-tions were performed in duplicate.

DATA ANALYSISData were analyzed by means of principal compo-nents analysis (PCA) and linear discriminant analy-sis (LDA) by using Systat Software (Inc. 2007).

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RESULTS AND DISCUSSION

The initial composition of the olive oil used for theexperiment was reported in Table I; the oil met theEuropean Union requirements [18] for the maxi-mum extra virgin category as regards the values ofFA, PV, K232 and K270. These parameters werewell below the upper legal limit values for extra vir-gin olive oil, which also showed a high phenolicconcentration, i.e. a good initial condition for thesuccessive study of quality decay. During the stor-age a general quality decay occurs on all the oil

samples in terms of oxidative indexes increase andminor compounds concentration decrease as stat-ed by the continuous decrement with time of bothDPV values and pigment concentration (Tab. II). Bycontrast, as discussed hereafter, an increment ofHP was recorded for all the samples. In order todisplay the structure of the data recorded duringthe storage period (230 days, ten points of analy-sis), a matrix with 60 rows (oil samples at differentstorage time in different conditions) and 9 columns(variables) was built. Initially the data matrix wasanalyzed by means of a principal componentanalysis (PCA). The first three principal compo-nents were enough to display the data structure, asthey explained about 80% of the total variance afterthe rotation (varimax method). As reported in (Fig.1) the score plot defined by the first two principalcomponents showed a clear separation of the oilsamples as related to the exposure conditions, i.e.positive values for storage in the light and negativevalues for storage in the dark on component 1. Thesecond component allows differentiating the sam-ples by storage time. In fact as a general trend thesamples at storage time less than about 100 daysshowed negative values on PC2. When the thirdprincipal component was considered (Fig. 1), it

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Table I - Initial composition of olive oil used for the shelf life test

Table II - Final stage composition of olive oil sample

Figure 1 - Scores plots of the first three principal components

was possible to differentiate the samples stored inthe 0.125 L bottles under light conditions, whichshowed the highest scores on the component,whereas the other samples were randomly over-lapped in the middle area of the plot. The analysisof the variables’ (chemical-analysis) loadings wasuseful to show which variables influenced thegroups separation (Tab. III). The K270 and ΔK(Tab. III) oxidation indexes have the highest posi-tive loading on the first component, whereas theconcentration in pigments such as Chlo and Carohave the highest negative load. These latter vari-ables were relevant in the sample separation asrelated to the different light exposure. Free acidityand HP (colorimetric method) showed high positiveloading values on the second component so as toallow differentiating among the sample groups as afunction of storage time. By contrast, DPV showeda high negative load in accord with its continuousdecrement with time. In agreement with Capannesiet al. (2000) [20], the general increase in the totalphenolic fraction recorded in all the samples (lightand dark storing) during the examined time couldbe explained considering that the Folin-Ciocalteaureagent, although widely used, is not specific anddetects all phenolic groups. Thus the increase inthe phenolic fraction of the examined samples isprobably due to the fact that during the storagetime degradation reactions occur, with the fraction-

ation of larger phenolic molecules and the forma-tion of smaller compounds that can react with theFolin-Ciocalteau reagent. For the third componenthigh positive loads were obtained for PV and K232,so that these two variables seem to be useful to dif-ferentiate the samples in relation to the bottles sizeunder light conditions probably as a consequenceof the highest light-exposed surface per oil unit vol-ume.To confirm the separation of the sample classes, i.e.oil in bottles of different sizes under light and darkconditions, data were analyzed by means of LDAanalysis and the classification model was validatedusing a leave-one-out cross-validation. The plot ofthe discriminant scores confirms the marked distinc-tion between dark and light storing conditions asstated by the corresponding two clusters of samplesin the first and fourth quadrant respectively (Fig. 2).Furthermore, a marked group separation wasrecorded for 0.125 L volume bottles (1.21 cm-1)stored under light which lie in the third plot quadrant.The cross validation gave for these latter samplesclass a 100% correct classification (Tab. IV).

CONCLUSIONS

The results of the shelf life test show the influenceof bottle size during the light storage on olive oilquality. The ratio between the exposed oil surfaceand the oil mass volume into the bottle, is a rele-

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Table III - Variables loadings values on principal components

Table IV - Cross validation of LDA classification model

Figure 2 - Discriminant functions scores plot from LDA

vant parameter to determine the extent and thedegree of quality decay mainly in terms of oxidativedegradation. Since extra-virgin olive oil is consid-ered to be the best olive oil for its organolepticcharacteristics, its stability and its chemical com-position, it is important to preserve its qualitativeattributes. Recently, due to gastronomic and mar-keting aspects the diffusion of glass bottles ofsmall dimensions, frequently of clear glass as theconsumers appreciate to see the oil color, isincreasing. A better understanding of the influenceof bottles sizes on the oil quality decay during stor-age could be very useful to ensure extra-virginolive oil stability, especially during commercialactivities up to the use by end consumers, whenthe product can be subjected to uncontrollablenegative factors such as long time and high tem-perature of storage and exposure to light. There-fore, the evidence of this research could supplyuseful information for a correct choice of the stor-age containers and/or the exposure to light condi-tions.

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Received February 11, 2011Accepted April 13, 2011

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Per ottenere il contenuto di materia grassa del latte in un mélange, la legislazione Europea pre-vede la determinazione del tenore di acido butirrico, come butirrato di metile, moltiplicato per ilfattore 25. Tuttavia proprio il riferimento ad un contenuto fisso di acido butirrico del grasso dilatte, rappresenta una delle problematiche legate al calcolo del contenuto di materia grassa lat-tiera in un prodotto misto. La Sottocommissione Grassi Vegetali ed Animali ha deciso di effet-tuare uno studio sulle caratteristiche compositive dei grassi misti allo scopo di verificare l’effi-cacia di altri parametri, oltre all’acido butirrico, nella caratterizzazione dei mélanges.Sono state preparate miscele a composizione variabile dal 2 al 20% di grasso di latte utilizzan-do 2 matrici vegetali differenti. Su tutti i campioni sono stati determinati: il contenuto in acidobutirrico, espresso come butirrato di metile, la composizione in acidi grassi, la composizione intrigliceridi e in steroli. L’efficacia dei diversi parametri studiati è stata valutata soprattutto in ter-mini predittivi, considerando cioè la loro precisione nella comune pratica di un laboratorio dicontrollo che non abbia a disposizione le materie prime utilizzate per produrre il mélange, masolo il prodotto finito. Dall’analisi dei dati ottenuti, è emerso che il calcolo della percentuale diburro secondo le indicazioni del Regolamento EU, porta ad un errore di valutazione superiore al12%, anche in prodotti in cui il burro è presente in quantità maggiori del 10%. Risultati menosoddisfacenti sono stati ottenuti utilizzando la composizione in trigliceridi ed il colesterolo acausa della notevole variabilità naturale di questi costituenti nelle matrici vegetali (trigliceridi) enel grasso di latte (colesterolo) Un errore di quantificazione più contenuto (10% circa), in misce-le con burro maggiore o uguale al 5%, è stato ottenuto quando, oltre all’acido butirrico, sonostati considerati altri acidi grassi (C10:1, C14:1, C15iso, C15anteiso, C17iso, e C17anteiso)parimenti caratteristici della matrice latte e assenti, invece, nei grassi di origine vegetale.

Study oon tthe eeffectiveness oof ddifferent pparameters oon tthe eevaluation oof bbutter ccontent oofmixtures.To evaluate the milk fat content of a blend, the EU legislation indicates that the butyric acid con-tent, expressed as methyl butyrate, should be multiplied by a factor of 25. The need to refer to afixed content of butyric acid of milk fat in order to define the composition of the mélange, is oneof the problems involved in calculating the milk fat content of a mixed product. In order to veri-fy the effectiveness of butyric acid, as well as other parameters, in the characterization ofmélanges, the Subcommittee on Vegetable and Animal Fat decided to carry out a characteriza-tion study on several blends. Mixtures were prepared (2-20% of milk fat) with 2 different veg-etable matrices, and butyric acid content (expressed as methyl butyrate), fatty acid, triglycerideand sterol composition were determined in all samples. The effectiveness of the different param-eters was evaluated in predictive terms, considering that usually, the testing laboratory receivesonly the blend, for the analysis, but not the raw materials that were used for its production.The calculation of the percentage of milk fat by applying the EU Regulation indications, led to anassessment error higher than 12%, even in samples containing more than 10% of milk fat. Less satisfactory results were obtained using triglycerides and cholesterol, due to the high nat-ural variability of these constituents in vegetable (triglycerides) and milk fat (cholesterol) matri-ces. A lowest quantification error (10%) was obtained for mixtures containing 5% of milk fat ormore, when, together with butyric acid, other fatty acids (C10:1, C14:1, C15iso, C15anteiso,C17iso and C17anteiso) that are also characteristic of the milk matrix and are therefore absentin the fat of vegetable origin, were taken into account.

Indagine conoscitiva sull’efficaciadi differenti parametri per lavalutazione del contenuto di burroin prodotti misti

G. Contarini1*M. Povolo1

L. Folegatti2

E. Forte3

M. Fusari4

A. Gasparoli2

M. Mandrioli5

M. Molinari6

G. De Felici7

1 CRA-FLC - Lodi2 Divisione SSOG di Innovhub -Stazioni Sperimentali perl’Industria - Azienda Specialedella Camera di Commercio -Milano3 Soremartec ITALIA S.r.l. Alba (CN)4 Unigrà Spa Conselice (RA)5 Dipartimento di Scienze degliAlimenti, Alma Mater Studiorum-Università di Bologna6 Olfood S.r.l. - Orzinuovi (BS)7 Agenzia delle Dogane - Roma

*CORRESPONDING AUTHOR:Dr.ssa Giovanna ContariniCRA-FLC Via A. Lombardo 1126900 Lodie-mail: [email protected]

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INTRODUZIONE

Il Regolamento CE n. 2991/94 [1] stabilisce ledenominazioni e le caratteristiche per i grassi daspalmare, intendendosi con questa definizione ilburro, la margarina ed i mélanges, ovvero lemiscele di margarina e burro.In particolare nell’allegato del citato regolamentovengono definiti, al punto B, i vari tipi di margarina,in base al contenuto in grasso e umidità (margari-na, margarina tre quarti, metà, grasso da spalma-re x%) e, al punto C, i vari tipi di grassi composti daprodotti vegetali e/o animali, con un tenore di gras-si lattieri compreso tra il 10 e il 90% (mèlanges).Nel caso dei prodotti definiti al punto B, l’eventua-le presenza di grassi lattieri deve essere limitata adun massimo del 3%.Poiché la presenza di grassi lattieri in questi pro-dotti rappresenta l’elemento qualificante che con-tribuisce in maniera determinante a definirne ilprezzo, è assolutamente necessario avere a dispo-sizione un metodo analitico, il più possibile precisoed affidabile, che consenta di valutarne la quanti-tà. Allo stesso tempo l’esatta determinazione delcontenuto di materia grassa derivante dal latte,cioè di burro, anche in altri prodotti compositi, è dinotevole importanza per gli organismi di controlloper poter stabilire sia i tassi di importazione [2] chele restituzioni all’esportazione [3].La legislazione in vigore è quella indicata nell’Art. 2Par. 3 del Regolamento CE 904/2008 [4] che pre-vede di determinare il contenuto di acido butirricodella frazione lipidica del prodotto, esprimerlocome butirrato di metile e moltiplicarlo per il fattore25, per ottenere il contenuto di materia grassa lat-tiera anidra, rispetto alla materia grassa totale delprodotto. Il fattore 25 deriva dall’assunto che il con-tenuto medio dell’acido butirrico nel grasso di latteanidro, espresso come butirrato di metile, sia parial 4%. Nel caso il prodotto analizzato non sia inte-ramente costituito da grassi anidri, il valore ottenu-to andrà ulteriormente moltiplicato per la percen-tuale di grasso totale per esprimere l’effettivo con-tenuto di materia grassa lattiera rispetto a 100 g diprodotto e non solo quindi rispetto al grasso totale. L’acido butirrico è senza dubbio l’elemento carat-terizzante ed esclusivo del grasso di latte, ma pur-troppo il suo utilizzo quale parametro di quantifica-zione del reale contenuto di materia grassa lattierain un prodotto misto non è privo di problematichesia di tipo analitico, soprattutto a causa della suaelevata volatilità, che di tipo applicativo.Il problema è stato più volte affrontato in ambitocomunitario attraverso la verifica delle perfoman-ces dei metodi di determinazione del contenuto diacido butirrico. Nel Regolamento CE n.4056/87,attualmente abrogato, in relazione alle analisi daapplicare alle merci soggette alla restituzione per

l’esportazione, veniva indicato il metodo basatosulla cromatografia in fase gassosa (GC) degliesteri metilici degli acidi grassi, per determinare ilcontenuto in acido butirrico e 23 era il fattore dautilizzare per ottenere il contenuto in materia gras-sa lattiera anidra. Quasi contemporaneamente, nelRegolamento CE n.4154/87, anch’esso attualmen-te abrogato, veniva indicato il metodo IUPAC [5]che prevedeva la determinazione GC dell’acidobutirrico come acido libero, previa quindi saponifi-cazione. Inoltre tale metodo prevedeva la quantifi-cazione del solo acido butirrico, per mezzo dell’ag-giunta dell’acido valerico come standard interno.Nel medesimo regolamento veniva inoltre indicatoil numero 27 quale fattore da usare per ottenere ilcontenuto di materia grassa lattiera anidra. Lamodifica del fattore da 23 a 27 si rendeva neces-saria per tener conto della differenza di peso mole-colare da metilbutirrato ad acido butirrico.Nei due Regolamenti n. 202 e n. 203 del 1998, chesostituivano i precedenti, veniva riproposta ladeterminazione dell’acido butirrico come metile-stere, senza precisare metodi analitici, e venivaindicato 25 come il fattore da utilizzare. Si ritieneche il ritorno alla valutazione dell’acido butirricocome butirrato di metile, invece che come acidolibero, sia derivante dalla pubblicazione, nel 1997,di un articolo [6] in cui l’autore, dopo aver messo aconfronto i diversi metodi di analisi, concludevache il metodo basato sull’analisi GC dei metilesterie la quantificazione mediante valerato di metilecome standard interno, forniva i risultati più affida-bili. Anche nel caso della modifica del fattore diconversione da 23 a 25, si ritiene che questa origi-ni dalla pubblicazione di un’indagine condotta pro-prio per verificare l’entità della variazione del con-tenuto di acido butirrico nel burro di origine euro-pea. Su 136 campioni provenienti da 9 nazionieuropee, è stato determinato un valore medio di4.0 g di butirrato di metile/100 g di grasso ed unrange di variabilità di 0.8 g/100 g di grasso [7]. Lanecessità di riferirsi ad un contenuto “standard” diacido butirrico nel grasso di latte per poter definirela composizione del mèlange è dunque un’altradelle problematiche legate al calcolo del contenu-to di materia grassa lattiera in un prodotto misto.Infatti la composizione in acidi grassi e quindianche in acido butirrico del grasso di latte è sog-getta ad una notevole variabilità naturale, poiché lafrazione lipidica è il costituente lattiero maggior-mente influenzato da fattori endogeni, ma soprat-tutto esogeni, primo fra tutti l’alimentazione anima-le [8].Malgrado a livello di gruppo di lavoro della Comu-nità Europea siano stati effettuati numerosi ring testper validare il metodo analitico [9], ancora non si ègiunti alla pubblicazione di un metodo ufficiale perla quantificazione del burro nei prodotti misti. E’

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probabile che tale carenza sia dovuta soprattuttoalle incertezze che ancora persistono sul valoremedio di acido butirrico a cui potersi riferire. Infattile conclusioni del lavoro in ambito europeo hannoindicato che la quantificazione del contenuto digrasso di latte nei prodotti misti tramite la valutazio-ne del contenuto di acido butirrico è certamente unmetodo preciso in termini di ripetibilità e riproduci-bilità del dosaggio di questo acido, ma la variabili-tà naturale del contenuto di acido butirrico puòdeterminare deviazioni dal reale tenore di materiagrassa lattiera nei mélanges fino ad un valore di±10%. Notevolmente più precisa è la valutazionedel contenuto di burro nei mélanges, quando èdisponibile il grasso lattiero puro e quindi il valoredi acido butirrico viene riferito direttamente al valo-re del medesimo acido nella materia prima di par-tenza [9]. Purtroppo nella pratica quotidiana delleanalisi di controllo dei prodotti pronti al consumo,non sono mai disponibili le materie prime di parten-za e, di conseguenza, appare difficile poter dimi-nuire l’errore di valutazione dei componenti dellamiscela.Alla luce di queste problematiche e data la cre-scente presenza sul mercato di grassi misti a

diversa percentuale di burro, la SottocommissioneGrassi Vegetali ed Animali ha ritenuto opportunoimpostare uno studio sulle caratteristiche composi-tive di questi grassi misti allo scopo di verificarel’efficacia anche di altri parametri, oltre all’acidobutirrico, nella caratterizzazione di questi prodotti.Sono state quindi preparate miscele di margarina eburro, a diverse percentuali, ed è stato chiesto ailaboratori partecipanti a questa indagine, di appli-care tra le tecniche analitiche comunemente inuso, quelle che si riteneva potessero fornire risulta-ti utili alla caratterizzazione del contenuto di burronei mélanges.

MATERIALI E METODI

Sono state preparate miscele a composizionevariabile tra 2 diversi tipi di grassi vegetali (GV eFV) e 2 burri (GB e FB), secondo lo schema pre-sentato in Tabella I. Le miscele sono state prepa-rate per pesata tra i due costituenti anidri. Ai 6laboratori partecipanti allo studio, sono statiquindi distribuiti i 12 campioni anidri insieme adaltri due campioni di prodotti misti, pronti allavendita e contenenti circa il 20% di umidità. Questi due campioni erano stati prodotti diretta-mente dalle aziende che hanno fornito i prodottibase, utilizzando gli stessi grassi vegetali e lostesso burro anidro impiegati per le altre misce-le. Per tali campioni, siglati come G15x e F2x eforniti direttamente dai produttori, era indicato uncontenuto del 14,6 e del 2% di burro, riferito peròal prodotto tal quale, inclusa l’umidità. Poiché il contenuto di materia grassa era pariall’80%, il valore della materia grassa butirrica,riferito a 100 g di materia grassa totale era pari al18.25 e al 2.5%. Per tali campioni era dunquenecessaria una fase di eliminazione dell’acquaprima di procedere alle analisi sulla matrice lipi-dica.I campioni sono stati analizzati dai differenti labo-ratori applicando le seguenti tecniche analitiche:Laboratorio A: Composizione in acidi grassimediante gas cromatografia con colonna da 100m, applicando la metodica di transesterificazioneriportata nello standard ISO 15884 [10], e com-posizione sterolica [11], previa saponificazione[12] e derivatizzazione [13].Laboratorio B: Composizione in acidi grassimediante gas cromatografia con colonna da 100m, applicando la metodica di transesterificazioneriportata nel metodo IUPAC [14]; composizione intrigliceridi applicando la metodica ufficiale per ilburro [15].Laboratorio C: Composizione in acidi grassimediante gas cromatografia con colonna da 30m secondo il metodo ISO 15885 [16], applicandola metodica di transesterificazione riportata nellostandard ISO 15884 [10]; composizione in trigli-ceridi secondo la metodica ufficiale per il burro[15].Laboratorio D: Composizione in acidi grassimediante gas cromatografia con colonna da 30m secondo il metodo ISO 15885 [16], applicandola metodica di transesterificazione riportata nellostandard ISO 15884 [10].Laboratorio E: composizione sterolica secondo ilmetodo ISO 12078 [17]Laboratorio F: contenuto in butirrato di metileottenuto previa metilazione a freddo [10] ed ana-lisi gascromatografica dei metilesteri con colon-na da 60 m.

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Tabella I - Composizione dei campioni analizzati

RISULTATI E DISCUSSIONE

IL DOSAGGIO DELL’ACIDO BUTIRRICOUna prima valutazione è stata fatta verificando irisultati forniti dal laboratorio F, che ha applicato leindicazioni del vigente regolamento [4], ha cioèdeterminato esclusivamente il contenuto di butirra-to di metile, quantificandolo mediante il metil vale-rato, come standard interno (Tab. II).I valori di ripetibilità ottenuti appaiono nei limiti ripor-tati da Molkentin [9] (4.29%), ad eccezione dei cam-pioni GB e F5 che mostrano risultati più elevati.I dati di metil butirrato sono stati quindi moltiplicatisia per il fattore 25, indicato nel Regolamento CE(Fig. 1A), sia per un fattore calcolato in base alreale contenuto di C4 dei due campioni di burro-base, utilizzati per predisporre i due set di miscele(Fig. 1B). I risultati mostrano come, per tutte le misceleapprontate a partire dai 2 costituenti anidri, l’utiliz-zo del fattore standard 25 porta a risultati che sidiscostano dal valore reale per percentuali netta-mente superiori rispetto ai risultati ottenuti calco-lando la percentuale di burro in miscela sulla basedel reale contenuto del metil butirrato del burro dipartenza.

Tale risultato conferma quanto già sottolineato daMolkentin [9] relativamente alla difficoltà di utilizza-re un fattore fisso per il calcolo della percentuale diburro in miscela, a seguito della non trascurabilenaturale variabilità del contenuto in acido butirriconel grasso di latte.

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Tabella II - Risultati ottenuti dal laboratorio F, applicando il metodoriportato nel Regolamento CE No. 904/2008 [4] (r % = ripetibilità e-spressa in termini percentuali rispetto al valore medio delle 2 repliche)

Figura 1 - Contenuto di materia grassa lattiera calcolato utilizzando il fattore 25 (A) ed il reale contenuto di C4 del burro base (B). La linea trat-teggiata indica i valori teorici e le tabelle riportano le differenze percentuali delle medie ottenute, per ciascun livello, rispetto ai valori teorici.

I risultati dei campioni di mélanges F2x e G15x,indicati nei grafici con una croce, si discostano daivalori teorici (2.5 e 18.25) in maniera superiorerispetto alle altre miscele, con entrambi i metodi dicalcolo. Questo comportamento potrebbe derivareda un’ulteriore fonte di variazione costituita dal pro-cedimento di anidrificazione del campione.

LA COMPOSIZIONE IN TRIGLICERIDII laboratori B e C, hanno applicato la metodica uffi-ciale dei trigliceridi nel burro [15]. Si ritiene oppor-tuno sottolineare che i parametri indicati in talemetodica per la verifica della presenza di grassiestranei al burro (5 parametri S e relativi limiti digenuinità), sono inapplicabili per la problematicarelativa ai mélanges, poiché sono stati messi apunto a partire dalla composizione del burro genui-no, per identificare aggiunte di grassi diversi nellamatrice burro e non la presenza di burro nelle mar-garine, come è il caso dei mélanges. Peraltro lametodica gascromatografica per la determinazio-ne della composizione trigliceridica percentuale ècomunque applicabile a qualsiasi tipo di matricelipidica. Questa procedura (Fig. 2) consente laseparazione di 16 gruppi di trigliceridi identificati in

base alla somma degli atomi di carbonio dei 3acidi grassi che li costituiscono (da 24 a 54). Ven-gono indicati solo i trigliceridi con numero di atomidi carbonio pari, ma in realtà l’area di ciascunpicco è comprensiva anche di quella del picco anumero di atomi di carbonio dispari immediata-mente successivo. La Figura 3 riporta la composizione media in trigli-ceridi ottenuta per i due campioni di burro anidro(A) e di margarina (B). I risultati mostrano notevolidifferenze tra i due campioni di margarina, rispettoai due campioni di burro, che appaiono invecemolto simili tra di loro. Le differenze maggiori si evi-denziano nei trigliceridi a 48, 50 e 54 atomi di car-bonio. Tale comportamento è certamente ascrivibi-le alla possibilità di utilizzare differenti tipi di grassi

per produrre la margarina, mentre la variabilitàdella composizione trigliceridica del burro è legataalle sole variazioni stagionali che comunque nonsono in grado di determinare differenze pari aquelle mostrate dalle margarine. Inoltre tranne cheper il C24, che è presente in tracce nel burro edassente nelle margarine, non è possibile individua-re costituenti che siano presenti solo in una delledue matrici (il C26 è presente in tracce in una delle2 margarine). Conseguentemente la possibilità di utilizzare i datidella composizione trigliceridica come parametroper il calcolo della presenza di burro nel mélange,è legata alla necessità di individuare trasformatematematiche delle variabili originali che, se possi-bile, tengano conto anche della diversità dellematerie prime. I dati ottenuti dalle miscele sonostati quindi valutati statisticamente con l’obiettivoprincipale di individuare i costituenti maggiormen-te correlati con la percentuale di burro aggiunto. Itrigliceridi a 40, 42, 44 e 46 atomi di carboniohanno mostrato i valori più elevati di coefficiente dicorrelazione (da 0.996 a 0.998) con alti livelli disignificatività (P<0.01).La somma dei valori di questi 4 costituenti è statapoi rapportata alla somma di C50 e C54, costituen-ti che maggiormente sono influenzati dalla compo-sizione della margarina di base. Il rapporto(C40+C42+C44+C46/C50+C54) è stato calcolatosulle miscele dal 2 al 20% di burro. E’ stata quindicalcolata l’equazione di regressione con le diversepercentuali di burro ed il coefficiente di regressio-

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Figura 2 - Esempio di profilo GC di un grasso di latte, ottenuto se-condo il metodo ufficiale [15].

Figura 3 - Risultati della composizione trigliceridica % delle 2 mate-rie prime usate per produrre le miscele.

ne. Una prima valutazione dei risultati ha eviden-ziato un errore di quantificazione molto elevatosulle miscele al 2 e 2.5% di burro (più del 75% delvalore teorico), mentre decisamente più accettabi-li sono parsi i risultati ottenuti sulle miscele a piùalto contenuto in burro. Tale risultato era per certiversi prevedibile, data l’impossibilità di trovarecostituenti presenti solo in una delle due matrici.L’equazione è stata ricalcolata utilizzando solo lemiscele con contenuto in burro a partire dal 5% edi risultati sono riportati nella Figura 4.Lo scostamento ottenuto rispetto al valore teorico èsimile per le medesime percentuali di burro nelledue diverse matrici vegetali G e F e mediamentenon supera il 12%. Solo il campione di mélangenon anidro, così come osservato nel caso deldosaggio dell’acido butirrico, fornisce valori indifetto rispetto al reale contenuto, pari al 14.4%.

LA COMPOSIZIONE IN ACIDI GRASSILa composizione in acidi grassi è stata determina-ta da 4 laboratori (A, B, C, e D) utilizzando metodi-che codificate, ma differenti, soprattutto per ciòche riguarda la separazione cromatografica. L’im-piego di colonne lunghe a specifica polarità con-sente infatti una miglior separazione di alcuni costi-tuenti, in particolare degli isomeri geometrici. Allostesso tempo un tale livello di separazione rendemolto complessa la corretta identificazione dei pic-chi, soprattutto relativamente a quei costituenti pre-senti in bassa quantità. Questo tipo di separazione[18] rappresenta una notevole risorsa nel settoredella ricerca, ma, non essendo ancora validata,può determinare un incremento di errore nella valu-tazione quantitativa, soprattutto se si vogliono con-frontare i risultati provenienti da diversi laboratori.Per questo motivo i dati dei 4 laboratori sono statiuniformati, sommando, quando necessario, i pic-

chi dei diversi isomeri (es. C18:1 e C18:2 cis/trans)e percentualizzando i risultati. La Tabella III riportai valori medi e le deviazioni standard dei risultatiottenuti dalle diverse miscele e dai campioni puri diburro e margarina. Allo scopo di individuare parametri utili alla corret-ta quantificazione del burro in miscela sono statiselezionati quegli acidi grassi che erano assentinei campioni di margarina puri e che potevanoquindi costituire un marker della presenza delburro nei mélanges. Oltre al C4, sono stati indivi-duati il C10:1, C14:1, C15iso, C15anteiso, C17iso,e C17anteiso. Ad eccezione del C4, che è presen-te in quantità del 3-4% circa nel burro, gli altri sonoacidi considerati come minori, perché presenti,nella maggior parte dei casi, in concentrazioneinferiore all’1%. Nel grasso di latte, gli acidi grassidispari, a catena ramificata, derivano in gran partedalla microflora del rumine [19] e questa origine negiustifica l’assenza nei grassi di origine vegetale.Data la loro bassa concentrazione, il loro utilizzocome singolo parametro potrebbe portare ad unimportante errore di dosaggio della quantità diburro in miscela; di conseguenza si è preferito pro-cedere al calcolo di una regressione multiplamediante metodo PLS.La Figura 5 riporta il risultato ottenuto con l’equa-zione calcolata utilizzando tutti i dati, ad eccezionedi quelli ottenuti dalle materie prime di base e daidue campioni F2x e G15x, come era stato fatto peri trigliceridi.I risultati, espressi in termini di scostamento mediodal valore teorico, mostrano una buona linearità dirisposta (R2 =0.991), con l’eccezione delle miscelecon il 2% di burro ed il corrispondente mélangeF2x. Ancora una volta il campione di mélange al18.25% di burro, espresso sul grasso totale, calco-lato sulla retta di calibrazione, fornisce valori infe-

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Figura 4 - Contenuto di materia grassa lattiera calcolato utilizzando il rapporto tra trigliceridi. La linea tratteggiata indica i valori teorici e le ta-belle riportano le differenze percentuali delle medie ottenute, per ciascun livello, rispetto ai valori teorici. I punti indicati con una croce indicanole repliche del campione G15x.

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Tabella III - Medie e deviazioni standard degli acidi grassi. I valori derivano dalle 2 repliche di ciascuno dei 4 laboratori (A, B, C, D)

riori al teorico dichiarato.Si è proceduto quindi alla validazione del modellomatematico con lo scopo di verificare la sua effica-cia quando applicato a campioni di mélangesincogniti, ottenuti da burri e margarine non impie-gati per il suo calcolo. Poiché non erano disponibi-li altri campioni di mélanges a composizione nota,è stata effettuata una simulazione matematica uti-lizzando composizioni medie in acidi grassi di lattidi diversa origine tratti dalla letteratura [20]. Sonostate quindi calcolate delle ipotetiche miscele al 5,10 e 20% con la margarina FV. Si ritiene opportunosottolineare che, utilizzando acidi grassi che nonsono presenti nella matrice vegetale, la scelta dellamargarina per il calcolo è ininfluente agli effetti del

risultato. Non si è ritenuto opportuno effettuaresimulazioni matematiche con miscele al 2%, inquanto l’efficacia del modello su tale percentuale siera già mostrata non soddisfacente. I risultati otte-nuti (Tab. IV) indicano che il modello di regressio-ne multipla fornisce buone predizioni, nell’interval-lo di percentuali studiato, anche quando applicatoa campioni di diversa origine rispetto a quelli utiliz-zati per il calcolo. Infatti le percentuali di scosta-mento rispetto al valore teorico, pur essendo un po’più elevate rispetto a quelle ottenute sui campionioriginali (Fig. 5), non superano mai il 10%, adeccezione di un campione al 5% di grasso di latte.I risultati ottenuti in validazione possono essereconfrontati con quelli ottenuti con la determinazio-

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Figura 5 - Contenuto di materia grassa lattiera ottenuto dall’equazione di regressione multipla calcolata con alcuni acidi grassi. La linea trat-teggiata indica i valori teorici e la tabella riporta le differenze percentuali delle medie ottenute, per ciascun livello, rispetto ai valori teorici. I puntiindicati con una croce indicano le repliche dei campioni F2x e G15x.

Tabella IV - Contenuto percentuale degli acidi grassi inclusi nel modello matematico delle miscele utilizzate per la validazione e corrisponden-te risultato dell’applicazione del modello.

ne del C4 utilizzando il fattore 25, per il calcolodella percentuale di burro. In entrambi i casi infattiè rappresentata la situazione in cui ci si trova quan-do si analizzano miscele, senza avere a disposizio-ne le materie prime di base, situazione che rappre-senta la realtà quotidiana dei laboratori di control-lo. Il modello di regressione multipla sembra pro-durre un minor scostamento dal reale contenuto diburro nel mélange, rispetto a quello riportato inFigura 1A.

LA COMPOSIZIONE IN STEROLILa determinazione della composizione sterolica èstata effettuata dai laboratori A ed E, utilizzandodue metodi che sostanzialmente differiscono per iltipo di standard interno utilizzato: 5α-colestano illaboratorio A e betulino il laboratorio E, e fornendoi risultati come mg/100 g grasso. Oltre al contenu-to in colesterolo ed al totale degli steroli, il labora-torio A ha quantificato i singoli steroli delle diversematrici che, nel caso delle due margarine pure (FVe GV) consentono di confermare quanto già osser-vato con trigliceridi ed acidi grassi, relativamentealla differenza di composizione di questi due pro-dotti (Fig. 6).

Come si può osservare le due margarine non sonodel tutto prive di colesterolo lasciando ragionevol-mente supporre che siano state prodotte utilizzan-do grassi vegetali come ad esempio il grasso dicocco o palma che contengono questa molecola,se pur in quantità modeste [21].Relativamente ai due campioni di burro, entrambi ilaboratori hanno evidenziato un contenuto più eleva-to di colesterolo nel campione FB (304 mg/100 g illab. A e 386 mg/100 g il lab. E) rispetto al campioneGB (272 mg/100 g il lab. A e 282 mg/100 g il lab. E). Ciascuno dei due laboratori ha calcolato le corre-lazioni tra il contenuto di colesterolo e la percen-tuale di burro per ciascuno dei due set di campio-ni, ottenendo un’ottima linearità di risposta, uncoefficiente di regressione pari a 0.999, ed unapercentuale di scostamento dal valore teorico del

tutto simile a quello ottenuto con l’acido butirrico,calcolando la percentuale di burro in miscela sullabase del reale contenuto del metil butirrato delburro di partenza (Fig. 1 B).Obiettivo di questo studio è però il calcolo dellapercentuale di burro in campioni dei quali non siabbiano a disposizione le materie prime, cioè diverificare la possibilità di utilizzo di una formula dicalcolo che sia generalizzabile con il minor errorepossibile.Data la differenza osservata tra i due laboratori neldosaggio del colesterolo sul medesimo campionedi burro, con particolare riferimento al campioneFB, molto probabilmente dovuta alla differenza neimetodi applicati, è stato deciso di esprimere i datidi colesterolo in termini percentuali rispetto al con-tenuto totale di steroli, invece che in valore assolu-to rispetto a 100 g di grasso, prima di effettuare lesuccessive valutazioni statistiche. Utilizzando i datidei due laboratori espressi in percentuale, è statacalcolata la retta di regressione sui campioni dellaserie G con contenuto dal 2 al 20% di burro.L’equazione della retta ottenuta, che ha mostratouna ottima linearità (Fig. 7, valori indicati dai cer-chi), è stata poi applicata ai campioni della serie F

(valori indicati dai triangoli) ed ai due mélangesF2x e G15x (valori indicati dalle croci), per effettua-re la validazione. La Tabella V riporta i risultati ottenuti sia in calibra-zione (campioni G) che in validazione (campioniF), espressi in termini di scostamento medio dalvalore teorico.I valori ottenuti in calibrazione sono parsi decisa-mente soddisfacenti, ad eccezione del campionea più basso contenuto di burro, mentre l’erroresubisce un notevole incremento quando si utilizzala retta per quantificare campioni che non faceva-no parte del set di calibrazione. Inoltre si ripetel’errore di sottovalutazione del campione G15x edappare invece non valutabile il campione F2x, a

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Figura 6 - Composizione sterolica delle 2 margarine usate per pro-durre le miscele.

Figura 7 - Contenuto di materia grassa lattiera calcolato utilizzan-do il contenuto % di colesterolo. I cerchi neri indicano i campioniusati per il calcolo della retta di regressione, i triangoli indicano icampioni usati per la validazione. I punti indicati con una croce indi-cano i campioni F2x e G15x.

basso contenuto di burro.I buoni risultati ottenuti in calibrazione indicano chel’espressione del risultato in termini percentuali,può permette di superare la variabilità del risultatodovuta al differente laboratorio e metodo, mentre irisultati meno soddisfacenti in predizione, soprat-tutto per le percentuali di burro più basse, confer-mano l’influenza non trascurabile delle materieprime, anche relativamente al contenuto in coleste-rolo, sul possibile utilizzo di questo parametro perla quantificazione del contenuto di burro nei mélan-ges.

CONCLUSIONI

L’obiettivo del lavoro, svolto dalla Sottocommissio-ne “Grassi Vegetali e Animali”, consisteva nel sot-toporre ad indagine i diversi costituenti del burroallo scopo di individuare i parametri più efficaci perquantificare la presenza del grasso di latte nei pro-dotti misti, quali ad esempio i mélanges.L’efficacia dei diversi parametri studiati è statavalutata soprattutto in termini predittivi, conside-rando cioè la loro precisione nella comune praticadi un laboratorio di controllo che non ha a disposi-zione le materie prime che sono state utilizzate perprodurre il mélange, ma solo il prodotto finito. Uti-lizzando questo approccio e relativamente al rangedi concentrazione studiato nelle miscele (dal 2 al20% di burro), si possono trarre alcune considera-zioni.Il calcolo della percentuale di burro secondo leindicazioni del Regolamento CE in vigore, ottenutocioè moltiplicando per il fattore 25 il contenuto dimetilbutirrato, quantificato mediante metilvaleratocome standard interno, porta ad un errore di valu-tazione superiore al 12%, anche per contenuti diburro maggiori del 10%. Le ragioni di tale risultato,peraltro in linea a quanto indicato in letteratura,sono da ricercarsi sia nelle difficoltà oggettive del

dosaggio di un costituente così volatile, sia nellavariabilità naturale degli acidi grassi del burro.Un errore di quantificazione più contenuto (10%circa), per miscele maggiori o uguali al 5% diburro, è stato ottenuto quando, a fianco dell’acidobutirrico sono stati considerati altri acidi grassi,parimenti caratteristici della matrice latte e quindiassenti nei grassi di origine vegetale. La procedu-ra analitica in questo caso non ha previsto l’uso distandard interni, poiché i dati sono stati espressi intermini di singola percentuale di ogni acido gras-so, rispetto al totale degli acidi grassi. Inoltre, for-nendo una chiara indicazione di quali acidi grassiinserire nel calcolo e sommando gli eventuali iso-meri separati, risulta possibile, per ogni laboratorioscegliere un diverso tipo di colonna gascromato-grafica.Risultati meno soddisfacenti sono stati ottenuti uti-lizzando i trigliceridi ed il colesterolo. Nel casodella composizione in trigliceridi non è stato possi-bile individuare costituenti caratteristici, mentre lanotevole differenza nel contenuto in colesterolodelle due matrici di grasso di latte, è all’originedella scarsa precisione di questo indice, quandoapplicato per calcolare la quantità di burro neimélanges.Considerazioni separate meritano i risultati ottenutisui due mélanges, a contenuto di burro noto (2.5 e18.25% per 100 g di materia grassa) pronti per lavendita. Mediante tutti i parametri investigati inquesto studio, il prodotto al 2.5% ha fornito semprerisultati più elevati, mentre quello al 18.25%, haprodotto sempre risultati inferiori alla percentualedichiarata. Il comportamento del campione al 2.5%deriva certamente dalla difficoltà, osservata contutti gli indici considerati, di quantificare contenuticosì bassi di grasso lattiero, cui inevitabilmente siaccompagna un ampliamento dell’errore. Menospiegabile è invece il sottodosaggio ottenuto per ilcampione al 18.25%. In questo caso si ritiene che,al possibile errore derivante dal processo di elimi-nazione dell’acqua cui il campione doveva neces-sariamente essere sottoposto prima dell’analisi, siaccompagni una probabile imprecisione durante lamiscelazione effettuata, su scala industriale,durante il processo produttivo.I risultati ottenuti in questa indagine non hannoconsentito di individuare, tra i costituenti studiati,un indice che permetta di ridurre sensibilmentel’errore di dosaggio del burro nei mélanges, effet-tuato con il solo acido butirrico. Peraltro i buonirisultati ottenuti utilizzando insieme all’acido butirri-co anche altri acidi grassi minori, a numero diatomi di carbonio dispari e ramificati, potrebbesuggerire un uso congiunto dei due parametri,considerando che, dal punto di vista analitico,entrambi possono essere ottenuti dal medesimoprofilo gascromatografico.

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Tabella V - Risultati dello scostamento dai valori teorici di contenutoin burro, ottenuti mediante il dosaggio del contenuto in colesterolo.

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Ricevuto 12 aprile 2011Accettato 20 maggio 2011

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La plaine de Gioia Tauro est située du coté tyrrhénien de la Province de Reggio Calabria,le Sud d’Italie. Dix cultivars italiens (3 autochtones calabrais: Cassanese, Ottobratica etSinopolese et 7 allochtones: Coratina, Itrana, Leccino, Nocellara messinese, Nociara,Pendolino et Picholine) ont été cultivés dans cette plaine et ils ont été destinés à l’extrac-tion de l’huile d’olive. La récolte a été effectuée chaque 15 jours, pendant toute la durée dela saison oléicole et ce, pendant trois années successives. Le but de cette étude est demettre en évidence la composition en stérols de ces différents cultivars ainsi que l’in-fluence de la date de récolte aux différents composés stéroliques. Mots clés: huile d’olive, stérol, insaponifiable

Sterol composition of oils extracted from olives cultivars of the province ofReggio Calabria (South of Italy)The plain of Gioia Tauro is located on the Tyrrhenian coast in the Province of Reggio Cal-abria, South of Italy. Ten Italian cultivars (Three autochthonous cultivars from the CalabriaRegion: Cassanese, Ottobratica and Sinopolese and seven allochthonous cultivars:Coratina, Itrana, Leccino, Nocellara messinese, Nociara, Pendolino and Picholine) weregrown on this plain and were destined for olive oil extraction. Harvesting was done every15 days throughout the olive season for three successive years. The purpose of this studyis to highlight the sterol composition of different cultivars and the influence of the harvestdate on different sterol compounds.Key words: olive oil, sterol, unsaponifiable

Composition en stérols des huilesextraites d’olives de cultivars de la

province de Reggio Calabria (Sud d’Italie)

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A.M. Giuffrè1*L. Louadj1

M. Poiana1

A. Macario2

1Dipartimento di Biotecnologieper il Monitoraggio

Agroalimentare ed Ambientale,Facoltà di Agraria, Università

degli studi Mediterranea diReggio Calabria (RC), Italia2Dipartimento di Ingegneria

Chimica e dei Materiali, Facoltàdi Ingegneria, Università della

Calabria-Rende (CS), Italia

*CORRESPONDANCE:Angelo Maria Giuffrè

Dipartimento Bio.M.A.A.Facoltà di Agraria

Università degli Studi Mediterraneadi Reggio Calabria

C. da Melissari89122 Reggio Calabria, Italy

e-mail: [email protected]: +39-965-814998

Fax: +39-965-311092

INTRODUCTION

Les stérols font partie des constituants mineursdes corps gras, ce sont des composés tétracy-cliques comportant 27 à 29 atomes de carbone[1]. Ils sont présents sous forme libre (80%) etestérifiée [2]. Ils représentent 30 à 60% de l’insa-ponifiable (la fraction du lipide qui, après hydrolysebasique ou saponification, est très peu solubledans l’eau et soluble dans les solvants desgraisses). Les stérols proviennent de la saponifica-tion d’esters d’acides gras [1, 3]. Dans le règnevégétal, les stérols les plus abondants sont le β- Sitostérol, suivi du Campestérol et du Stigmasté-rol [3]. L’huile d’olive est la source de lipides ali-mentaires, par excellence, considérant ses vertus.Les propriétés de l’huile d’olive en alimentationhumaine sont liées à sa partie glycéridique et sesconstituants mineurs. La fraction insaponifiable del’huile d’olive vierge constitue 0,4 à 0,8%, les sté-rols totaux sont de l’ordre de 115 à 154 mg/100 gd’huile, les stérols libres représentent 60 mg/100 gd’huile [4]. Dans une huile d’olive vierge, les stérolsles plus trouvés sont le β-Sitostérol, 5-Avenasté-rol et Campestérol avec des pourcentages respec-tifs d’environ 80 à 85%, 7% et 2,90 à 4% [5,6].Selon l’étude qui a été faite par Rivera del Álamo etal., [5], il a été démontré que le changement dansla teneur du Campestérol est indépendant duchangement saisonnier ainsi que de la zone géo-graphique de culture, du système d’extraction etdu stade de maturation du fruit utilisé dans la pro-duction de l’huile d’olive. Les stérols et les alcoolssont des composants importants dans l’authentifi-cation chimique des variétés d’huile d’olive vierge[5]. Le Cholestérol est présent à des faibles quan-tités, allant de 2 mg/kg d’huile d’olive, pour unehuile vierge jusqu’à environ 3 mg/kg d’huile d’olive,pour une huile brute de grignons d’olives [7]. Dansdes études de Cercaci et al. [6] et Salvador et al.[8], il a été démontré que la teneur en stérolstotaux, dans les huiles d’olive vierges extra obte-nues avec différentes technologies d’extraction,pendant la même période de récolte, ne varie pas.Cette même composition ne diffère pas en fonctiondes différentes technologies de broyage, demalaxage et de la quantité d’eau utilisée pour ladilution de la pâte d’olives [6]. Par contre, elledépend de la période de récolte (β-Sitostérol et 5-Avenastérol), utilisant les mêmes technologies [6].Pendant la maturation des olives, le taux de stérolstotaux diminue [2]. Dans la même étude de Cer-caci et al. [6], ils supposent que la dégradation oula transformation du 5-Avenastérol, après un moisde récolte des olives, est due à l’appauvrissementnaturel en antioxydants (spécialement les polyphé-nols), durant la maturation des olives [6]. La teneuren stérols totaux dépend aussi de la zone géogra-

phique [8]. Les phytostérols ont un impact positif dans la dimi-nution du cholestérol total et LDL-cholestérol,contenus dans le sang du corps humain. Une dosede 3,4 g/jour est suffisante afin de réduire cesconcentrations, ce qui entrainerait une réductiondes risques cardiovasculaires [9]. L’objectif de cette étude est de mettre en évidencela fluctuation de la composition des stérols, deshuiles d’olives de différents cultivars italiens, enfonction de l’année de récolte ainsi que de lapériode de récolte, de différencier ces cultivarsentre eux.

MATÉRIEL ET MÉTHODES

MATÉRIEL Les olives ont été récoltées de dix différents culti-vars italiens: Cassanese, Coratina, Itrana, Leccino,Nociara, Ottobratica, Pendolino, Picholine,Sinopolese et Nocellara Messinese. Ces cultivarssont destinés surtout pour l’extraction d’huile.L’échantillonnage a été effectué de la premièresemaine d’octobre jusqu’à la mi-janvier, avec desintervalles de 15 jours entre les prélèvements et ce,pendant trois saisons de récolte successives2005/2006, 2006/2007 et 2007/2008. Les olives ontété récoltées jusqu’à ce qu’elles ne sont plus pré-sentes sur l’olivier. Les oliveraies de tous les culti-vars ayant un âge supérieur à vingt ans, étaientlocalisées dans le même microclimat et situéesdans la région caractéristique de Gioia Tauro dansla province de Reggio Calabria, coté tyrrhéniencaractérisé par un climat pluvieux et humide, avecune altitude d’environ 100 m au-dessus du niveaude la mer. Pour chaque cultivar, dix oliviers ont étéchoisis dans des endroits différents de la zone étu-diée et environ 5 kg d’olives ont été récoltées auhasard, pour chaque olivier. Les huiles ont été extraites utilisant un broyeur delaboratoire «Mini 30» de la firme Agrimec Valpe-sana, Calzaiolo, S. Casciano V.P. (Florence), ayantune capacité de 40 kg. Après la cueillette, lesolives sont immédiatement lavées et triturées avecun marteau-broyeur. La pâte résultante a été mixéeà une température comprise entre 15 et 20°C, pen-dant 35 min et pressée en utilisant une pressehydraulique avec une augmentation continue de lapression, jusqu’à 200 bar. Après la séparation parcentrifugation de la phase huileuse, l’huile a été fil-trée sur du papier filtre, donc elle a été conservéedans des récipients de 100 mL en verre sombre(ombré) jusqu’au moment de l’analyse.

Détermination des stérolsLes stérols ont été déterminés selon la méthodedécrite dans l’annexe V du Règlement CEE2568/91 [10]. L’huile d’olive a été saponifiée avec

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de l’hydroxyde de potassium en solution dansl’éthanol, tout en utilisant le α-Cholestanol commeétalon interne, elle est analysée avec la techniqueTLC-GC. Les insaponifiables ont été extraits àl’éther éthylique. La fraction des stérols a étéséparée de l’extrait insaponifiable par chro-matographie sur plaque de gel de silice basique.Les stérols récupérés dans le gel de silice sonttransformés en silyl-éthers triméthyles et ont étéanalysés par un chromatographe en phasegazeuse Perkin Elmer, modèle 8600, avec undétecteur FID à 250°C, un système d’injection à250°C, une colonne capillaire SE54; 30 m delongueur x 0,32 mm de diamètre interne, 0,5 μmépaisseur du film. Les conditions de travail étaientles suivantes: gaz porteur (hélium); à la pression10 psi, le gaz auxiliaire (hydrogène à 15 psi et air à22 psi), température de l’injecteur (280°C); tem-pérature du détecteur (290°C); température du four(270°C) et un volume d’injection de 1 μL.

Analyse statistiqueAfin de déterminer les différences entre les para-mètres et les variétés, le logiciel XLSTAT a été uti-lisé. Les figures de la variation des différents para-mètres en fonction de la date de récolte ont étéeffectuées par le logiciel Excel.

RÉSULTATS ET DISCUSSION

Les résultats seront discutés selon les réglementa-tions actuelles de la Communauté EuropéenneN°2568/91 [10] et du Conseil Oléicole InternationalCOI/T.15/NC n.3/Rev.1 [11], en précisant que cesdeux normes, concernant les stérols, rapportentles mêmes indications. La règlementation euro-péenne a été revue plusieurs fois et toutes lesmises à jour qui ont été effectuées sont rassem-blées dans un seul document «le texte conso-lidé 1991R2568-01/11/2003» [12]. Le Tableau Ireprésente la teneur moyenne, en stérols des diffé-rents cultivars, des trois saisons. Nous pouvonsconstater que le composant le plus important dansles dix cultivars est le β-Sitostérol avec un pour-centage allant de 80,8%, pour le cultivar Nociara,à 88,7% pour le cultivar Cassanese. Le deuxièmecomposant le plus important est le 5-Avenastérol,la valeur la plus élevée de ce composant estobservée chez le cultivar Nociara (205 ppm) et lecultivar Cassanese montre la valeur la plus petite,trois fois inférieure (66,7 ppm). Le troisième com-posant majoritairement présenté est le Campesté-rol avec des valeurs allant de 38 ppm pour lavariété Pendolino à 65 ppm pour la variété Picho-line. Toutes les variétés ont un pourcentage deCampestérol inférieur à 4%, restant en dessousdes valeurs limitées par les réglementations de laCommunauté Européenne [12] et du Conseil Oléi-

cole International [11]. Les résultats trouvés sur lestrois composants ayant un taux le plus élevé sonten concordance avec des résultats antérieurs, telsque le travail de Rivera del Alamo et al. [5] qui aporté sur le cultivar Cornicabra; les résultats deCercaci et al. [6] sur une huile d’olive provenantd’un mélange de deux cultivars Dritta et Leccino etceux de Cunha et al. [2] sur des huiles d’olivesmonovariétales portugaises.Le paramètre du β-Sitostérol apparent qui corres-pond à la somme de la teneur en β-Sitostérol et 4autres phytostérols adjacents (Clerostérol, Sitosta-nol, 5-Avenastérol et le 5,24-Stigmastadienol).Sachant que les niveaux de ce paramètre, pourtoutes les variétés, sont supérieurs à 93%, limiteminimum régulée par la CE [12] et le COI [11]. Dece fait, la somme des stérols restant ne dépassepas 7%, ce qui confirme l’authenticité des huilescorrespondantes [13]. Le rapport Campestérol/Stigmastérol le plus élevéest observé chez le cultivar Picholine (4,5) et leplus faible chez le cultivar Sinopolese (2,0). Alorsque le rapport β-Sitostérol/5-Avenastérol le plusélevé est observé chez le cultivar Cassanese(20,9) et le plus faible chez Nociara (7,1). La valeurla plus élevée en Cholestérol est 5,3 ppm (0,3%),observée chez le cultivar Picholine et 2,8 ppm(0,18%) est la teneur la plus faible observée chezle cultivar Leccino. Concernant la teneur en stérols totaux, la valeur laplus élevée a été observée chez le cultivar Picho-line, suivie du cultivar Sinopolese, avec respective-ment 1885 et 1840 ppm et, la plus petite valeur aété observée chez le cultivar Ottobratica avec1354 ppm. Tous les valeurs de la teneur en stérolstotaux de tous les cultivars sont supérieures à lalimite inférieure exigée par la Régulation Euro-péenne [12] et du COI [11], qui est de 1000 ppm. Les Figures 1 et 2 représentent l’analyse en com-posantes principales, les deux fonctions de l’ana-lyse statistique expliquent 49,3% de la variance(respectivement 32,3 et 17,0%). Selon la Figure 1,nous constatons qu’il y a une différence entre lesdifférents cultivars, surtout le cultivar Sinopolesequi est indépendant des autres mais il n’y a pas dedifférence par rapport aux saisons de récoltes.Dans la Figure 2, nous constatons que l’effet varié-tal de Cassanese, Ottobratica, Pendolino et Itranan’est pas dépendant des différentes variables parrapport aux autres cultivars. Le cultivar Sinopoleseest étroitement lié au β-Sitostérol et le Campestérolet le cultivar Nociara est étroitement lié au 5-Ave-nastérol. La Figure 2 montre aussi que le 5-Avenas-térol est en corrélation négative avec le β-Sitostérolet ceci confirme les résultats d’autres auteurs[6,13]. Observant les Figures 3 et 4, nousconstatons que la teneur en stérols totaux chez lamajorité des cultivars allochtones, diminue avec le

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Figure 1 - Analyse des composantes principales basée sur les profils de tous les stérols des différentes variétés avec 3 ans successifs de récolte.Ca: Cassanese; Co: Coratina; I: Itrana; L: Leccino; N: Nociara; O: Ottobratica; P: Pendolino; H: Picholine; S: Sinopolese; M: Nocellara messinese. 5: saison 2005-2006, 6: saison 2006-2007, 7: saison 2007-2008. Observations avec la somme des Cosinus carrés ≥ 0,00

Figure 2 - Projection des variables sur le plan factoriel. Ca: Cassanese; Co: Coratina; I: Itrana; L: Leccino; N: Nociara; O: Ottobratica; P: Pendolino; H: Picholine; S: Sinopolese; M: Nocellara messinese. 5: saison 2005-2006, 6: saison 2006-2007, 7: saison 2007-2008. Observations avec la somme des Cosinus carrés ≥ 0,00

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Figure 3 - Teneur en stérol total (ppm) (Cultivars allochtones)

Figure 5 - Teneur en β-Sitostérol (%) (Cultivars allochtones)

Figure 4 - Teneur en stérol total (ppm) (Cultivars autochtones)

Figure 6 - Teneur en β-Sitostérol (%) (Cultivars autochtones)

temps jusqu’à la mi-décembre et puis la teneurtend à augmenter légèrement. Alors que la teneuren stérols totaux, chez les cultivars autochtones,diminue sans augmenter à la fin de la saison. LesFigures 5 et 6 montrent l’évolution de la teneur enβ-Sitostérol en fonction du temps. Chez les culti-vars allochtones comme chez les cultivars autoch-tones, la teneur en β-Sitostérol suit le même par-cours que la teneur en stérols totaux, mais cettelégère augmentation de cette teneur est observéeà partir du début décembre chez les cultivarsallochtones et à partir de début novembre chez lescultivars autochtones. Contrairement aux deuxpremiers paramètres, nous constaterons que lateneur en 5-Avenastérol (Figures 7 et 8) augmenteen fonction du temps (cultivars allochtones et

autochtones). Chez le cultivar Nociara et Pendolinoainsi que chez le cultivar Sinopolese, cette teneura tendance a diminuer à partir du mois de décem-bre. Pour la majorité des cultivars allochtones, lerapport Campestérol/Stigmastérol (Figures 9 et 10)augmente au début de la saison, mais il a ten-dance a diminuer vers la mi-octobre jusqu’au mois

Figure 7 - Teneur en 5-Avenastérol (%) (Cultivars allochtones)

Figure 9 - Rapport Campestérol/Stigmastérol (Cultivars allochtones)

Figure 8 - Teneur en 5-Avenastérol (%) (Cultivars autoctones)

de décembre, où le rapport augmente encore unefois atteignant presque les mêmes valeurs initiales.Le cultivar Coratina suit un parcours contraire où lerapport tend à diminuer et augmente à partir de lami-octobre. Pour le cultivar Nocellara Messineseainsi que les cultivars autochtones, le rapport tendà diminuer pendant la saison de récolte et il aug-mente vers le début du mois de décembre.

CONCLUSION

Les résultats ont montré que la composition desstérols est fortement influencée par la composante«cultivar», en effet, bien que les 10 cultivars ont étécultivés dans la même zone de culture qui estplutôt étroite et donc dans les mêmes conditionsmicroclimatiques et même s’ils ont reçu les mêmespratiques culturales, y compris la fertilisation, ilsont montré une claire différence dans la composi-tion en stérols des dix cultivars pris en compte, iln’y avait pas de différence due à l’année de pro-duction, et donc aux conditions climatiques dechacune des trois années.

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Received, March 28, 2011Accepted, May 24, 2011

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Figure 10 - Rapport Campestérol/Stigmastérol (Cultivars autochtones)

The aim of this research was to develop and test a RP-HPLC/ELSD analytical procedurewhich can be both a suitable method for milk triacylglycerol determination and a usefultool for pre-separation of TAG fractions for further GC/MS identification. This applicationcan be usefully adopted when a Liquid Chromatography/Mass Spectrometry apparatus isnot available. RP-HPLC technique, with the conditions chosen, provided, in less than 20minutes of analysis, a TAG profile including 30 peaks, most of them well resolved. A sim-ple, home-made Stream Splitter System (SSSy) was assembled and used to collect, beforethe ELSD entrance, both milk fat triacylglycerol fractions and pure triacylglycerol mole-cules, which were then submitted to GC/MS analysis for identification. Finally the RP-HPLC/ELSD technique was applied for the evaluation of the adulteration of milk fat withdifferent amounts (5-50%) of beef tallow and palm kernel oil. The preliminary results sug-gested that even amounts of the adulterating fats lower than those tested can be detectedby the data obtained by RP-HPLC/ELSD profiles.Key words: Evaporative Light Scattering Detector; milk fat; triacylglycerols; GC/MS

Applicazione della tecnica HPLC/ELSD per lo studio e il frazionamento deitrigliceridi del grasso di latteIn questa ricerca è stata sviluppata e testata una procedura analitica RP-HPLC/ELSD perla determinazione dei trigliceridi del grasso di latte, utilizzabile anche come strumento dipre-separazione per ottenere frazioni purificate idonee ad ulteriori identificazioni, tramiteGC/MS. Tale applicazione può dimostrarsi di notevole utilità quando non è disponibileuno strumento LC/MS. Con le condizioni RP-HPLC scelte, è stato ottenuto, in meno di 20 minuti di analisi, unprofilo trigliceridico comprendente 30 picchi, la maggior parte dei quali ben risolti. Un semplice sistema di divisione dell’eluato HPLC prima del detector light scattering(Stream Splitter System - SSSy) ha consentito di raccogliere sia frazioni, sia singoli pic-chi che poi sono stati sottoposti ad analisi GC/MS per l’identificazione. Infine la tecnica RP-HPLC/ELSD è stata applicata per la valutazione della adulterazione delgrasso di latte con diverse quantità di grassi estranei (5-50%), in particolare sego e oliodi palma. Dai risultati preliminari pare ragionevole ipotizzare che le informazioni conte-nute nei profili RP-HPLC/ELSD possano consentire l’individuazione di questi grassi estra-nei anche in quantità inferiori a quelle valutate. Parole chiave: Light Scattering Detector; grasso del latte, trigliceridi, GC/MS

Application of High Performance Liquid Chromatography/Evaporative Light Scattering Detector (HPLC/ELSD)for the study and the fractionation of milk fat triacylglycerols

M. Povolo*G. Contarini

CRA-FLC Centro di Ricerca perle Produzioni Foraggere eLattiero-CasearieLodi, Italy

*CORRESPONDING AUTHOR: Dr.ssa Milena PovoloCRA-FLC Centro di Ricerca per leProduzioni Foraggere e Lattiero-CasearieVia A. Lombardo 1126900 Loditel. +39 0371 45011fax +39 0371 35579e-mail: [email protected]

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1. INTRODUCTION

Triacylglycerols are by far the main lipid class inbovine milk, accounting for 97-98%, and more than400 different fatty acids have been reported asbeing components of milk TAGs [1]. The largenumber of fatty acyl moieties in milk fat gives riseto one of the most complex naturally occurring fats,making the separation itself difficult. The study oftriacylglycerol (TAG) composition can be carriedout by using different analytical techniques, suchas gas-chromatography (GC), high performanceliquid chromatography (HPLC), supercritical fluidchromatography (SFC) [2-7]. The introduction ofthe universal evaporative light-scattering detector(ELSD) has made the resolution of TAGs of differentedible oils and fats possible using the reversed-phase high performance liquid chromatography(RP-HPLC) with gradient elution [8-10]. As far as the performances of the two principalchromatographic techniques are concerned, theadoption of polarizable capillary columns allows agood separation of TAGs by gas chromatography,even if it does not give a complete resolution of thesingle TAG molecules [11], which also occurs byapplying a traditional RP-HPLC separation [12]. Animprovement in the separation of milk TAGs isobtained by the connection in series of two or threeHPLC columns [13-15]. This approach requires along analysis time and particular care in the instru-mental handling, especially when a large numberof samples should be analysed under repeatabilityconditions. Thus, in order to obtain a satisfactoryresolution useful to the identification of the singlemilk fat TAG molecules, two or more chromato-graphic systems should be applied [16-18]. Inrecent years liquid chromatography mass spec-trometry (LC-MS) and multidimensional tech-niques, i.e. GCxGC, LCxLC and SFCxSFC, [19-26]highly improved the separation allowing goodresults to be obtained. As for the determination ofpositional distribution of fatty acids in the triacyl-glyceride molecule different techniques have beentested, including chiral-phase HPLC [27-31]. Nev-ertheless, most of this chromatographic equipmentis very expensive and require experienced person-nel. The aim of this research was to develop a RP-HPLC/Evaporative Light Scattering Detector(ELSD) analytical procedure which could be a use-ful tool of pre-separation for a further detailed MSidentification, when a LC/MS apparatus is not avail-able. Being ELSD a destructive detector, a streamsplitter system (SSSy) was inserted at the end ofHPLC column and its performance was investigat-ed by recovering different milk fat fractions. Theeffectiveness of SSSy was confirmed also on fatsamples pre-fractionated by solid phase extraction

(SPE) modified with silver ions.As regards milk fat purity, the Official EU method[32] is currently the most powerful method avail-able for detecting the addition of foreign fat to milkfat. This method is based on the determination oftriacylglycerols and the comparison of five different“S” values, calculated by using specific TAGs andsuitable coefficients derived from multiple linearregressions, with limits. The detection limits of thevarious foreign fats range between 4 and 6.4% andthe highest values are observed particularly asregards beef tallow. The performances of the RP-HPLC/ELSD were then investigated in order to ver-ify if this analytical approach could be helpful inmilk fat purity control.

2. EXPERIMENTAL

2.1. SAMPLES Cow milk was sampled from the bulk milk tank ofthe dairy herd of CRA-FLC. Fourteen anhydrousmilk fats of known origin were obtained from buttersamples collected at five butter factories in North-ern Italy. Anhydrous beef tallow and palm kernel oilwere supplied by manufacturing industries.

2.2. REAGENTSAcetonitrile, acetone, pentane, hexane anddichloromethane from Sigma (Milwaukee, WI, USA)were HPLC grade. The following TAG standards(purity 99%) were purchased from Sigma: tride-canoylglycerol, tridodecanoylglycerol, tritetrade-canoylglycerol, trihexadecanoylglycerol, trioctade-canoylglycerol, tri-cis-9-hexadecenoylglycerol, tri-cis-9-octadecenoylglycerol, tri-cis-9,12-octadeca-dienoylglycerol and tri-cis-9,12,15-octadeca-trienoylglycerol.

2.3. EXTRACTION OF LIPIDSMilk fat was extracted according to the procedureof ISO method [33]. In order to favour the break-down of the globule membrane, milk sample (100ml) was added with 20 ml of NH3 (25%, v/v) andmixed with 80 ml of ethanol (96%, v/v). The extrac-tion was performed with 200 ml of a mixture ofdiethyl ether–pentane (1:1, v/v). The solvent phasewas filtered through 50 g of anhydrous Na2SO4 andevaporated under vacuum.

2.4. HPLC ANALYSISThe analyses were carried out using a ShimadzuLC-10 Advp (Kyoto, Japan) HPLC equipped withtwo pumps and a SEDEX 75 (S.E.D.E.R.E,Alfortville, France) ELSD (operating temperature40°C, air pressure 3.5 bar). A Discovery-RP-18 col-umn (250 x 4 mm ID, particle size 5 µm) with a pre-column module that contained inserts of the samephase, was purchased from Supelco (Bellefonte,

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USA). Milk fat (20 mg) was dissolved indichloromethane (2 ml) and manually injectedusing a 5 µl injection loop. The column operated ina room conditioned at 22°C. During the first 5 min-utes of the analysis the concentration was 30%dichloromethane and 70% acetonitrile. The con-centration of dichloromethane was then increasedto 60% over 20 min. The re-equilibration time was 5minutes. Flow-rate was 1 ml/min.

2.5. STREAM SPLITTER SYSTEM (SSSy)The system is very simple and consists merely of alow dead volume peek T-piece, connected, on oneside, to the HPLC tubing coming out from the HPLCcolumn and, on the other side, to two narrow-bore(0.01”) HPLC tubings connected to the detectorand to the collection vessel. In this way the mobilephase flow eluting out of the column is split into twoequal parts. The length of tubing to the collectorvessel was calculated in order to obtain the bestcorrespondence to that of tubing to the detectornebulizer. As a consequence, TAG fractions or sin-gle peaks eluting from the HPLC column could becollected immediately while they are producing anELSD signal.

2.6. GC/MS ANALYSISA Thermo Finnigan (Thermo Electron Corporation,Woburn, MA) Trace/GC coupled with a ThermoFinnigan MS/Plus quadruple mass spectrometerwas used. Sample (1.0 µl) was injected using aPTV/splitless injector, and during the injectionphase, 1 min splitless mode was applied. The PTVinjector was initially held at 80°C for 0.1 min, thenramped to 350°C at the rate of 10°C/sec. Oventemperature was held at 250 for 3 min, pro-grammed to 360°C at a rate of 3°C/min and held at360°C for 25 min. Helium was used as carrier gas at a flow rate of 1.0ml/min. A CB-TAP (Varian, Middelburg, NL) capil-lary column (25 m x 0.25 mm ID., 0.10 µm filmthickness) was used. MS temperatures adoptedwere as follows: source 250°C, interface 360°C.Acquisition was performed in EI mode (70 eV) by0.4 scans per second and the mass range usedwas m/z 70-900. The identification of the TAGstructure was performed according to literaturedata [34,35].

2.7. PRE-SEPARATION OF MILK LIPID TAG BY Ag+-SPEMilk fat sample (20 mg) was dissolved in 0.3 ml ofdichloromethane. A Discovery DSC-SCX (1 g sta-tionary phase) SPE cartridge (Supelco) was modi-fied with AgNO3 as described by Christie [36] andconditioned with 10 ml of dichloromethane. Theelution scheme adopted was that applied byKemppinen et al. [37]. Saturate TAGs were extract-ed with 8 ml of pentane:dichloromethane (1:1, v/v).

Monoene TAGs were extracted with 7 ml of (99:1,v/v) dichloromethane:acetone, and diene TAGswere extracted with 10 ml of dichloromethane:ace-tone (95:5, v/v). The final elution with 7 ml of ace-tone provided the fraction containing the trieneTAGs.

2.8. FATTY ACID COMPOSITION OF SATURATED FRAC-TIONFatty acids composition of the saturated fractionwere determined as methyl esters, prepared bybase-catalyzed methanolysis of glycerides [38].FAME solution was injected into a HP6890 series(Agilent, Palo Alto, CA) gas chromatograph,equipped with a Supelcowax 10 (Sigma-Aldrich,Milan, Italy) capillary column (30 m length, 0.32mm I.D., 0.25 µm film thickness). On-column injec-tor was used and hydrogen (1.0 ml/min) wasadopted as carrier gas. The temperature programwas as follows: 40°C for 4 min, programmed to150°C at the rate of 25°C/min, held at 150°C for 1min, programmed to 220°C at the rate of 4°C/min,held at 220°C for 10 min; a flame ionisation detec-tor (FID) was used, maintained at 250°C. A refer-ence milk fat of known fatty acid composition(CRM164, Brussels, Belgium) was used to deter-mine fatty acid response factors.

3. RESULT AND DISCUSSION

3.1. MILK TAG PRE-SEPARATION BY HPLCThe choice of the mobile phase is a critical pointin the HPLC TAG analysis because thesolvent/stationary phase and TAGs/stationaryphase interactions have to be taken into account.Moreover milk fat TAGs, due to their high com-plexity in the fatty acid composition, have differ-ent solubility according to the polarity of the sol-vent. In this experiment, mobile phase was com-posed of acetonitrile, reported as “weak” organicsolvent, and dichloromethane as “strong” organicmodifier. While acetonitrile is the most commonly usedorganic solvent for the TAG RP-HPLC analysis,the choice of modifier solvent is more difficult. Lit-erature data reported acetone as the most usedmodifier [6], but Christie [39] suggested the addi-tion of dichloromethane for the milk fat analysis.Due to the presence in milk fat of saturated com-ponents of high molecular weight, the mixturedichloromethane-acetonitrile minimized the solu-bility problem encountered with acetone. Figure 1shows the milk fat TAG profile obtained by apply-ing a simple linear gradient of dichloromethane inacetonitrile. The profile shows a bimodal distribu-tion with 30 peaks numbered in consecutiveorder. The whole TAG elution was obtained in lessthan 20 minutes, but, as expected, the profile

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olution data in comparison with the precedingpeaks. Moreover these two fractions included themost abundant peaks of the profile. The secondfraction (B) was selected just for the opposite rea-sons; i.e. it contains low and not well resolvedpeaks and it seemed particularly useful to test theperformance of the manual stream splitter system(SSSy).Moreover, by analysing authentic TAG standardswith ECN ranging from 30 to 54 and applying themathematical procedure as described by Najeraet al. [40], it was possible to calculate the ECNrange of each fraction.

3.2. RECOVERY OF MILK FAT FRACTIONS BY SSSyBy this system it was possible to split the columneluate into two equal portions, which allowed agood signal sensitivity to be maintained, and therecovery of the selected fraction could be startedimmediately when it appeared in the chro-matogram. In order to collect a significant amountof each fraction, useful for other chromatograph-ic techniques, the recovery of the same fractionwas repeated three times and the eluates werecombined. Figure 2 shows the HPLC profile offraction B, collected as described above, dried,diluted with 0.05 ml of dichloromethane and re-injected. It is worth noting that a good purificationwas achieved, demonstrating the reliability of thehome-made SSSy. The re-injection of fractions Aand C produced similar results.

3.3. CHARACTERISATION OF HPLC TAG FRACTIONS BYGC-MSThe fractions recovered from the RP-HPLC weredried under N2, diluted with 0.1 ml of hexane andanalysed by GC/MS on a polarizable capillarycolumn. With this type of column the triacylglyc-erols are separated according to the chain lengthand, within the same chain length class, TAGs aresplit up in function of the degree of unsaturation.The TAG polarity increases with the degree ofunsaturation in the fatty acid and with the total

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contained a small number of peaks, each includ-ing different TAG molecules. In order to selectfractions that could be recovered and submittedto other analytical techniques for identification,the chromatogram was investigated. Table Ireports the resolution values calculated for the 30peaks as numbered in Figure 1. The choice of thefractions was made according to the following cri-teria. Fraction A and C (peak 7 to 11 and 22 to 26,respectively) were selected firstly on the basis ofthe resolution values. Starting from peak 7 and 22it was observed a significant improving of the res-

Table I - Resolution factors of TAG peak obtained RP- HPLC/ELSD(peaks are numbered as in Fig. 1)

Figure 1 - RP-HPLC/ELSD profile of milk fat TAGs. Numbering is thesame as in Table I.

Figure 2 - RP-HPLC/ELSD profile of the re-injection of the pooledmaterial (3 injections of the same milk fat) recovered in the time in-terval 11-12 minutes (fraction B in Fig. 1)

number of double bonds in the triacylglycerols.Thus, the triacylglycerols containing most of thehighest unsaturated fatty acids are more retainedby the stationary phase. With this column posi-tional isomers cannot be resolved as well asTAGs having the same number of carbon atoms,the same number of double bonds but differentfatty acids. The TAG profiles (Fig. 3) showed that each fraction,as expected, contained a higher number of TAGmolecular species than that of peaks recoveredfrom HPLC. The performances of the polarizablecapillary column allowed a sufficiently defined sep-aration, for MS identification, to be obtained. Only three TAG molecules having different unsat-uration were not resolved (peak no. 8 of FractionB, peaks no. 6 and no. 9 of Fraction C) eventhough this problem did not prevent their GC/MSrecognition (Tab. II). The identification of fattyacids esterified into the TAG molecules was per-formed by evaluating the presence of the typicalfragment ions [RCO]+, [RCO+128]+, [RCO+74]+

and [M-RCOO]+, according to Kalo and Kemp-

pinen [34] and Laasko [35]. The identification ofpeaks eluting in fraction. A showed, as main con-stituents, TAGs containing short acyl-chain fattyacids such as butyric and hexanoic acid.During the TAG characterization, a molecularspecies containing a very short acyl-chain (aceticacid) was detected (Tab. II). This result was inagreement with Parodi and Kalo et al. [41,28].The ECNs obtained by the GC/MS identification,confirmed those calculated at the end of HPLCanalysis.

3.4. RECOVERY OF A SINGLE TAG PEAK BY SSSyThe SSSy was also tested in order to verify itsability to recover a single HPLC peak. The accu-racy of this recovery can be more reliably verifiedif just one TAG species is included in the peakrecovered. For this scope, milk fat sample wasfractioned, before the HPLC analysis, accordingto the degree of unsaturation by applying a silverion SPE technique.Among the four fractions obtained (saturated,monoenes, dienes and trienes) only the saturatedone really contained TAGs including only saturat-ed fatty acids. This was confirmed by determiningthe fatty acid composition of this fraction (Tab. III).The presence in the same TAG molecule of fattyacids with both a different degree of unsaturationand a different number of carbon atoms caused apartial overlapping of the unsaturated SPE frac-tions. An overlapping of the same fractions wasalso observed by Kemppinen et al. [37]. Nevertheless each SPE fraction was injected intoHPLC/ELSD system and the most abundant peakswere recovered, dried, re-dissolved in 0.05 ml ofhexane and submitted to GC/MS analysis.Figure 4 shows the HPLC profile of the saturatedfraction together with the total ion chromatogramsof three collected peaks. It is worth noting thateach recovered peak produced a defined GC/MSprofile leading to a clear identification. Similar results were obtained by the recovery ofthe most abundant peaks of monoene, diene andtriene fractions (Fig. 5). Interesting considerationscan be made by observing the TAG identifica-tions of the three unsaturated fractions. Monoenefraction included also saturated TAGs (16-16-4and 16-14-4) suggesting the increasing of thepolarity of the TAG molecule due to the chemical-physical behaviour of the short chain fatty acids.In the same way, the presence on the same mol-ecule of both a short chain and a monounsaturat-ed fatty acid could produce a more intenseincreasing of the polarity, responsible for the elu-tion of TAG 18:1-16-4 in the diene fraction. Twoother TAG species (18:1-16-14 and 18:1-16-16)having only one monounsaturated fatty acidappeared in both monoene and diene fractions.

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Figure 3 - GC/MS total ion profiles of the three fractions obtained byRP-HPLC/ELSD analysis and collected by SSSy. Fractions A, B and C arethe same as in Figure 1 and numbering is the same as in Table II.

The presence of pairs of regioisomers can be areasonable hypothesis of this behaviour. Accord-ing to Angers et al. [42] oleic acid can be esteri-fied both in the sn 1,3 or sn 2 position eventhough the external positions are predominant forTAGs with ECN higher than 40. TAGs having oleicacid in one of the external positions could bemore easily retained by SPE stationary phasewith respect to those having oleic acid in sn 2position. The presence of these regioisomers cannot be demonstrated by GC/MS identification,but it is supported by similar results obtained byother authors [3].

3.5. EVALUATION OF MILK FAT ADULTERATION BYHPLC/ELSDIn the second part of this research the applicabilityof this HPLC approach, despite its reduced selectiv-ity, was investigated in order to verify if it could beused to characterize the purity of milk fat. For this scope, pure milk fat was mixed with 5, 10, 20and 50% of beef tallow and palm kernel oil and thesemixtures, together with the pure fats, were analysedby RP-HPLC (Fig. 6). These adulterating fats werechosen because they are not easily detectable, insmall amounts, even by applying the GC officialmethod for the evaluation of milk fat purity [32].

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Table II - Characteristics of GC/MS profiles of milk fat TAGs derived from the fractions A, B and C collected from HPLC/ELSD (Peaks are numbe-red as in Fig. 3)

As can be seen, significant differences wereobserved starting from the lower percentage ofadulterating fat. The beef tallow had a particular profile consistingof peaks eluting only in the second part of thebimodal distribution. When milk fat was mixed withdifferent beef tallow percentages, there was a gen-eral decrease of the concentration of peaks elutingwithin 12 minutes and an increase of peaks n. 24,27, 29 and 30. The ratio calculated between thevalue obtained by adding up the area of the peaks

1 to 23 and that obtained by adding up the area ofthe peaks 24 to 30 showed interesting differences(Tab. IV). The presence of 5% of beef tallow wasenough to produce a value falling outside therange obtained from the analysis of fourteen purebutter samples.The profile of palm kernel oil was characterized bythe high concentration of peaks n. 9 and n. 12. Asa consequence the ratio between the sum of thearea of these peaks and the remaining ones wasused to identify the presence of this fat in milk fat.The mixture containing 5% palm kernel oil almostdoubled the values obtained for pure milk fat. This result leads to the hypothesis that even small-er amounts of this adulterating fat may bedetectable, even though the method has to beinvestigated on a higher number of milk fat sam-ples to evaluate the range of its natural variability.

4. CONCLUSIONS

The stream splitter is a cheap system that can beassembled in a laboratory using common consum-able tools. The adoption of this system, at the endof the column and before the ELSD, demonstrated

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Table III - Fatty acid composition of the saturated fraction

Figure 4 - Saturated fraction obtained by silver ion SPE: RP-HPLC/ELSD chromatogram (A) and GC/MS profiles of the three peakscollected by SSSy (B, C and D).

Figure 5 - RP-HPLC/ELSD chromatograms of the monoene, diene andtriene fractions obtained from milk fat by silver ion SPE separation.

the possibility to collect, in a reliable way and inreal time, fractions or single peaks of milk fat TAGs.The fractions collected were easily submitted toother chromatographic techniques with or withoutderivatisation.The accurate dimensions of the SSSy give a good

signal sensitivity thereby enabling it to be used asboth analytical and preparative technique. From this system it was possible to combine theinformation deriving from chromatographic tech-niques based on different principles of separation,and consequently increase the reliability of theidentification. Moreover, independently of the application ofSSSy, the RP-HPLC/ELSD analytical procedurehere developed, despite the limited selectivity,seemed to be able to produce, in a short time, aTAG profile including critical information about pos-sible milk fat adulteration. More analyses are inprogress to validate the results obtained on thissubject.

ACKNOWLEDGMENTS

The authors would like to acknowledge the Supel-co Italy for its technical support.

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Figure 6 - RP-HPLC/ELSD profiles of pure milk fat, beef tallow, palmkernel oil and of mixtures of milk fat with 5% of beef tallow and palmkernel oil.

Table IV - Parameters applied for milk fat purity evaluation (Peak areais numbered as in Fig. 1)

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Received April 28, 2011Accepted May 31, 2011192


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Trans fatty acids are commercially produced when unsaturated fatty acids undergo hydrogenation. Tothe best of our knowledge, information on TFA content of local and international foods in Jordan are notavailable. The aim of this study was to analyze TFA content of selected Arabic foods including import-ed and locally produced foods to explore the variability in TFA content among food groups and withina product category. A total of 122 local and imported commercial foods were analyzed using gas liquidchromatography. Data showed that average TFA levels in food groups in Jordan varied from 2.46±0.97g/100g fat to high up to 5.6±4.9 g/100 g fat. Bread and bakery group contained 2.46% TFA, milk anddairy products (3.87%), sausages & Luncheon meats (3.84%), snacks (3.93%) while fast food(4.16%), fat and oils (4.5%) and baked sweets (5.6%) contained higher levels of TFA. Among milk anddairy products, TFA content of the traditional foods in this food group such as Jameed and Arabic cheesewere 3.64% and 4.8%, respectively. Similarly, the % of TFA varied considerably within the snacks groupranging from very low of 1.47% in chips up to 20.38% in popcorn. Among fast foods group, the high-est percentage of TFA was found in Shawerma and burgers (5.6% and 5.31%, respectively). In bakedsweets, TFA content has accounted for 2.45 - 20.76 g/100g fat; the highest percentage of TFA has beenobserved in doughnuts and Baqlawa. The TFA content ranged from 1.54 - 7.23%/100 g fat in a locallyproduced fast food items such as falafel. The amount of TFA (g/100 g fat) in 9 Arabic sweet items and8 samples of sweet biscuits varied significantly. Considerable variations in TFA content were also seenin two samples of French fries that ranged from 1.49 to 5.76 g/100 g of fat. Among the imported fooditems, the levels of TFA in five popcorn items ranged from 2% to over 40% as compared to 1.26% ina locally produced popcorn. In conclusion, this study provides a large database on TFA levels in foodsand food groups that are consumed in Amman, Jordan. It also demonstrates a wide variation in TFAcontent in different brands of the same food item. Thus, regulations should be made to control TFA con-tent in foods, particularly by controlling the use of hydrogenated fats in food production and to includeTFA content on food labels. Labeling regulations should also include fast foods due to the fact that asample of 4-5 medium pieces of falafel contains an average of ~ 4% of TFA and one sandwich of shaw-erma (= ~135 g) contains up to 5.6% of TFA.

Variabilità del contenuto in acidi grassi trans in prodotti locali selezionati e importati inGiordaniaGli acidi grassi trans sono commercialmente prodotti quando gli acidi grassi insaturi subiscono l’idro-genazione. Per quanto a nostra conoscenza, informazioni sul contenuto di TFA in cibi locali e interna-zionali in Giordania, non sono disponibili. Lo scopo di questo studio era quello di analizzare il conte-nuto di TFA in alimenti arabi selezionati, sia importati che locali, per indagare la variabilità del contenu-to di TFA tra i vari gruppi alimentari e all’interno di una categoria di prodotti. Sono stati analizzati un tota-le di 122 prodotti alimentari locali e importati mediante analisi gascromatografica. I dati hanno mostra-to che i livelli medi di TFA negli alimenti in Giordania variavano da 2,46±0,97 g/100 g di grasso fino a5,6±4,9 g/100 g di grasso. Pane e prodotti da forno contenevano 2,46% di TFA, latte e prodotti lattie-ro-caseari (3,87%), salsicce e carne (3,84%), snack (3,93%), mentre contenevano più alti livelli di TFAi fast food (4.16%), gli oli e grassi (4,5%) e i dolci da forno (5,6%). Tra i prodotti lattiero-caseari, il con-tenuto di TFA dei cibi tradizionali in questo gruppo di alimenti come il formaggio Jameed e formaggi diprovenienza araba era del 3,64% e del 4,8%, rispettivamente. Allo stesso modo, la percentuale di TFAvaria notevolmente all’interno degli snack e va da un valore molto basso di 1,47% nei chips fino ad unvalore di 20,38% nei popcorn. Tra il gruppo dei cibi fast food, la più alta percentuale di TFA è stata tro-vata in Shawerma e hamburger (5,6% e 5,31% rispettivamente). Nei dolci da forno, il contenuto di TFAha rappresentato da 2,45 a 20,76 g/100 g di grasso; la più alta percentuale di TFA è stata osservata inciambelle e Baqlawa. Il contenuto di TFA variava da 1,54 a 7,23%/100 g di grasso in fast food di pro-duzione locale come falafel. La quantità di TFA (g/100 g di grasso) in 9 articoli di dolci arabi e 8 cam-pioni di biscotti variava in modo significativo. Considerevoli variazioni nel contenuto di TFA sono stateriscontrate anche in due campioni di patatine fritte, con un range da 1,49 a 5,76 g/100 g di grasso. Trai prodotti alimentari importati, i livelli di TFA in cinque varietà di popcorn variavano dal 2% ad oltre il40% rispetto all’1,26% di una produzione locale. In conclusione, questo studio fornisce una grandebanca dati sui livelli di TFA in alimenti e gruppi di alimenti che vengono consumati ad Amman, in Gior-dania e dimostra inoltre una grande variabilità del contenuto di TFA nelle diverse marche dello stessoprodotto. Pertanto, devono essere emanati regolamenti per controllare il contenuto di TFA negli alimen-ti, in particolare per il controllo dell’uso di grassi idrogenati nella produzione alimentare e per imporredi includere il contenuto di TFA nelle etichette degli alimenti. I regolamenti per l’etichettatura devonocomprendere anche i fast food in quanto un campione di 4-5 pezzi medi di falafel contiene una mediadi circa il 4% di TFA e un sandwich di shawerma (= ~ 135 g) contiene fino al 5,6% di TFA.

Variability in trans fatty acid content of selected local

and imported foods in Jordan

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R. Mashal*K. Al-IsmailH. Al-Domi

T. Al-Mousa

Department of Nutrition and Food Technology, Faculty of AgricultureUniversity of Jordan

*CORRESPONDING AUTHORDr. Rima Hussein Mashal

Assistant Professor of Nutritionand Dietetics, Department of

Nutrition and Food Technology,Faculty of AgricultureUniversity of Jordan

P.O. Box 13701, Amman11942 Jordan

email: [email protected]: 00962-6-5355000-22415

INTRODUCTION

Most natural unsaturated fatty acids in foods existin the cis-isomer form. Trans fatty acids (TFA) arestereo-isomers of the naturally occurring cis-unsat-urated fatty acids [1, 2]. Trans fatty acids are com-mercially produced when unsaturated fatty acidsundergo hydrogenation. This process of fat refine-ment involves the addition of hydrogen moleculesto oils in order to increase their melting point andtherefore, improve their physical and functionalproperties, stability and utility [1, 3]. Several stud-ies have reported that TFA are similar in conforma-tion and behavior to saturated fatty acids [1, 2, 4,].Moreover, the isomerization process occurs also inthe rumen of cattle resulting in low levels of TFA inbeef and dairy products [1, 5, 6].The extent of hydrogenation is determined by theunsaturated fatty acid content of the oil and thedesired stability and physical properties of the endproduct [7]. However, hydrogenation also removesthe essential unsaturated fatty acids (α-linolenicacid (18:3 n-3) and linoleic acid (18:2 n-6)) [1, 5],because they tend to oxidize with prolonged stor-age or with exposure to high temperatures [8, 9].TFA content of foods is variable in processedfoods, in hydrogenated oils, and in smalleramounts, in meats and milk products [1, 6, 7]. Themajor sources of TFA in the US are baked foods(37% TFA), deep-fried foods (36%), and mar-garines (11 - 49%) [10].Several studies have shown that TFA intake isassociated with increased risk of CHD [1, 8, 11,12]. Innis et al. (1999) have conducted a studyinvestigating the variability in TFA content in foodswithin a food category. The authors stated that thevariability in TFA content of foods could result inmisclassification of TFA intake of individuals,hence, weaken the relative risk (RR) estimates ofCHD. Therefore, accurate and updated food com-position tables with values for specific foods, bybrand or by the fats and oils in a product must bemade available [7].Jordan is a lower middle-income Arabic countrythat has undergone considerable social develop-mental changes that have affected the lifestyle andeating patterns of Jordanians including cigaretteand shisha smoking and also a high intake of caf-feine. In addition, there has been a shift in thelifestyle from active to sedentary, and in the eatingpatterns from Mediterranean diet to fast food. TheMediterranean diet imitates the goals of the Ameri-can Dietetic Guidelines in which it promotes healthand reduces the risk of major chronic diseasesbecause it is high in desirable nutrients such asvitamins and dietary fiber, and low in undesirablenutrients as salt, cholesterol, and trans fatty acids[13]. In contrast, the fast food pattern is high in fats,

added sugars and salt, as well as it displaceshealthy foods from the diet including milk, cereals,fruits and vegetables [14]. The combination ofthese factors has posed dietary changes amongJordanians, increasing the probability of obesityand non-communicable diseases such as coronaryheart diseases and diabetes mellitus [15].To the best of our knowledge, information on TFAcontent of local and international foods in Jordan arenot available. Hence, findings of the present studywill provide a baseline data for other researchersregarding TFA levels in different foods consumed byJordanians. The objectives of this study were to ana-lyze TFA content of selected Arabic foods includingimported and locally produced foods that are avail-able in the market for the purpose of exploring thevariability in TFA content within a food group, andcomparing TFA content of the present data with otherpublished levels of TFA as well.

MATERIALS AND METHODS

SAMPLE SELECTIONA total of 122 local and imported commercial foodswith diverse origin of fats were purchased fromsuperstores, fast-food restaurants, bakeries andsweets’ stores in Amman, Jordan in summer, 2009.Food items were stored at an appropriate temper-ature (i.e.: room, refrigerated or frozen). All avail-able fat sources listed on the package label wererecorded. All food analyses were performed in aduplicate manner.

FAT EXTRACTIONThe fat extraction of dried or pre-dried food sam-ples was carried out by soxhlet method (AOACOfficial Method 963.15) [16]. In the case of mayon-naise and dried milk, the fat was extracted by themethod of Folch (1957) using chloroform: methanol(2:1) [17].

FATTY ACID METHYL ESTERS PREPARATIONFatty acid methyl esters (FAMEs) were preparedaccording to EC Regulation no. 2568/91 method.Briefly: 50 mg of lipid extract was weighed, dis-solved in 2 ml hexane (GC grade) and mixed byvortex for 1 min. A 200 μl of 2 M-potassium hydrox-ide prepared in anhydrous methanol was addedand mixed for 30 seconds until the solutionbecame clear, and then 200 μl of acetic acid wasadded and mixed for 30 sec. The prepared methylesters were analyzed using capillary GLC column(Restek, Rtx-225, USA, cross bond 50%-cyanopropylmethyl 50%-phenylmethyl polysilox-ane, 60 m, 0.25 mm/D, 0.25 μm df) immediatelyafter esterification by injection of 1μl of the hexanelayer through the injection port of the GLC (modelGC-2010, Shimadzu. Inc., Koyoto, Japan). The

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FAMEs were injected after adjusting the GLC con-ditions; column oven temperature for samples notcontaining milk fat was 165°C for 10 min, increasedto 185°C 1°C/min and kept at 185°C for 1 min, thenincreased to 220°C 3°C/min and kept at 220°C for20 min. Column oven temperature programming forsamples containing milk fat was 70°C for 1 min,increased to 165°C 20°C/min and kept at 165°C for10 min, then increased to 185°C 1°C/min and keptat 185°C for 1 min, then increased to 220°C5°C/min and kept at 220°C for 15 min. Injector tem-perature was 240°C, flame ionization detector tem-perature was 250°C, flow rate 0.8 ml/min Heliumand split ratio used was 80. The fatty acids methylesters of the trance isomers of oleic, linoleic and

linolenic were identified using chromatogram offatty acids standards [18].

RESULTS

A total of 122 food items in 7 different food cate-gories were analyzed from July to October, 2009.Total fat content (g/100g food), the percentage ofTFA of total fatty acids (g/100g fat), and TFA con-tent in food expressed as g/100g food or foodgroup of selected national and international foodswere determined. Data showed that TFA levels infood groups in Jordan varied from 2.46±0.97g/100g Fat to high up to 5.6±4.9 g/100g Fat as pre-sented in Table I and Table II.

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Bread and bakery group contained 2.46% TFA of100 g of fat, milk and dairy products (3.87%),sausages & Luncheon meats (3.84%), snacks(3.93%), while fast food (4.16%), fat and oils(4.5%) and baked sweets (5.6%) contained high-er levels of TFA.Data showed that TFA content varied among fooditems within a food group (Tab. II). For example,doughnuts contributed for the highest percentageof TFA (20.76%) among the baked sweets prod-ucts. The amount of TFA in milk and dairy prod-ucts ranged from 3.05% up to 4.1% in ice creamand processed cheese, respectively. TFA content of the traditional foods in this foodgroup such as Jameed and Arabic shite Nabulsicheese were 3.64% and 4.97%, respectivelyTable I. Jameed is an ingredient found in the Jor-danian dish called “mansaf.” Mansaf is the nation-al dish in Jordan that is made on special occa-sions. It is composed of meat, Jameed, thin wheatbread and rice. Jameed is a hard dry rocklike

form of yoghurt made from sheep’s milk and isdiluted when used in cooking. Arabic white cheese is the principle cheese con-sumed in Jordan and made up mainly from sheepor goat’s milk. TFA content of vegetable oils was0.61% as compared to 4.34% and 8.55% in butterand mayonnaise, respectively. Similarly, the % of TFA varied considerably withinthe snacks group ranging from very low of 1.47%in chips up to 20.38% in popcorn. Among fastfood groups, the highest percentage of TFA wasfound in Shawerma and burgers (5.6% and5.31%, respectively) Table II. Shawerma is a fastfood staple across the Arab world and Europe. It is made up of small pita breads which are slicedopen and filled with stoved grilled meat or chick-en, garlic sauce and pickles. Further, the range of TFA content of selectedbaked sweets such as knafeh, baqlawa, anddoughnuts was from 3.13% up to 20.76% with anaverage of 5.60%. The highest percentage of TFA

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has been observed in doughnuts and Baqlawa.Knafeh is a traditional dessert which is popular inthe Middle East and is known as Knafeh Nabul-siyeh to indicate the city of its origin Nablus, aprominent city in the West Bank of Palestine. It ismade of shredded fillo dough, butter, whiteNabulsi cheese, and syrup.Baklawa is a rich, sweet pastry made of layers ofphyllo pastry that are brushed with butter, filledwith chopped nuts and sweetened with syrup.The present study has also demonstrated consid-erable variations in TFA content among selectedfoods within a product category including locallyproduced and imported food items. For instance,the TFA content ranged from 1.54 - 7.23%/100 gfat in a locally produced fast food item such asfalafel as presented in Figure 1.The amount of TFA (g/100 g fat) in 9 Arabic sweetitems and 8 samples of sweet biscuits varied sig-nificantly as shown in Figures 2 and 3. The TFA content in two samples of dried milk wereapproximately 5% and 2.7% of total fatty acids. Considerable variations in TFA content were alsoseen in two samples of French fries that rangedfrom 1.49 to 5.76 g/100 g of fat. Surprisingly, the variability in TFA content wasless pronounced among 14 locally producedchip-snacks which ranged from 1.16 - 1.55% ascompared to 1.11 - 3.95% among 12 importedchip items. Similarly, the estimates of TFA were3.56 and 3.72% in two samples of jameed andranged between 2.35 - 4.4% in three samples ofArabic pastries.Among the imported food items, the levels of TFA(g/100 g fat) in five popcorn items ranged approx-imately from 2% to over 40% as compared to1.26% in a locally produced popcorn represent-ing differences of from 0.04 g to 5.9 g of transfatty acid per 100 g popcorn. The estimates of TFA in two different brands of

breakfast cereals have been 1.95% and 3.06%,respectively. The levels of TFA varied slightly in 11imported crackers and ranged from 0.97% to2.59% total fatty acid with a total average of 1.6%.Table III shows the levels of TFA (g/100 g fat) infoods analyzed in the current study and thoseprovided by USDA [19]. Paired t-test indicated that mean values of TFAlevels in 100 g fat were significantly lower in fatsand oils group (2.48 g/100 g fat) than those ana-lyzed by USDA (14.72 g/100 g fat) (p<0.05). On the contrary, mean values of TFA levels in 100g fat were significantly higher in cheese itemsanalyzed in the current study (4.12 g/100 g fat)than those analyzed by USDA (2.78 g/100 g fat)(p<0.05). The estimates of TFA of bread andsweet biscuits were also significantly lower in thepresent study as compared to USDA findings(p<0.05) [19]. Although, there was a considerable variationbetween TFA content of French fries in the presentdata as compared to values from the USDA [19],no significant difference was found due to discrep-ancy in sample size as presented in Table III.

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DISCUSSION

Trans fatty acids naturally occur in meats and milkand dairy products. They are also found in foods thatare made with hydrogenated or partially hydrogenat-ed oils. Many epidemiologic studies provided strongevidence relating TFA intake with the risk of CHD.Unfortunately, food composition tables that providethe TFA composition of foods to evaluate TFA dietaryintake is limited. Although few countries such as theUnited States, Germany and the United Kingdomhave a food composition database that include theTFA composition of foods in their database, thecapacity of these databases to show brand new TFAcomposition of the food items is uncertain [20]. Fur-ther, several study estimates of TFA intake werebased on old or incomplete databases [21]. Thevariability in TFA content within a product categorywould affect the estimates of the levels of TFA dietaryintake. Innis and others (1999) stated that the validi-ty of TFA content of foods could result in misclassifi-cation of TFA intake, hence, weaken the relative risk(RR) estimates of CHD. Therefore, accurate andupdated food composition tables with values forspecific foods, by brand or by the fats and oils in aproduct must be made available [7].In this context, the present study provides for the firsttime a database reference for TFA composition oflocally produced and imported food supply in Jor-dan and demonstrates the wide variability of TFAcontent among food groups and within a food cate-gory as well. The differences in the type of fat usedin the manufacturing or preparation process of fooditems give an explanation for the variability in TFAcontent of food supply. In this study, the average

total TFA content of seven food groups have rangedfrom 2.46±0.97% in bread and bakery food group upto 5.60±4.90% in baked sweets food group. It hasalso been found that the highest average total TFAcontent were in baked sweets, fats and oils, fast foodand snacks. Our data is in line with other studieswhich involved analysis of western food items. [1, 6,19, 22].Based on extensive body of epidemiological andexperimental evidence relating to the health implica-tions of TFA intake, the Joint WHO/FAO Expert Con-sultation on Diet, Nutrition, and the Prevention ofChronic Diseases recommended that the meandietary intake of TFA from hydrogenated oils and fatsshould be limited to less than 1% of energyintake [20]. Our findings showed that TFA percent-age of fats and oils group was significantly lower(2.48%) than TFA percentage of fats and oils ana-lyzed by USDA (14.72%) [19]. This could be attrib-uted to the fact that almost all fats analyzed by USDAhave contained hydrogenated cottonseed and soy-bean oils. On the other hand, none of the fat itemsthat were analyzed in the present study containedhydrogenated fat excluding two items which hadpartially hydrogenated palm oil. Further the USDAdatabase reported that the percentage of TFA inchips ranged from zero to 29.71% [19]. In our study,TFA content in 26 chips items ranged only from 1.11- 3.95%.Interestingly, the present study highlights the obser-vations that were reported by other researchers con-cerning the variability of TFA content within a prod-uct category. This variability is well pronounced insome locally produced and imported food itemsincluding falafel and Arabic sweets falafel, chips,

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popcorn and baked sweets as well. The amount ofTFA in 4 different samples of falafel ranged from 1.45to 7.23 per 100 g of fat. These values can be inter-preted into grams of TFA per 100 g of food whichmakes it easier to comprehend by the general pop-ulation. For instance, TFA intake would range from0.17 to ~ 1 g per 100 g serving of falafel which isequivalent to 9 medium pieces of falafel. Similarly, a100 g serving of 5 pieces of Arabic sweets(Baqlawa) would provide a range of 0.56 to ~ 2 g ofTFA. Additionally, the levels of TFA in two samples ofshawerma analyzed varied considerably andranged from 3.08 up to 8.12 g/100 g fat and werehigher than that (1.5g/100 g fat) reported by Rat-nayake and colleagues (2009) as well [6]. Variationin TFA levels might be explained by the type of fatused in food preparation and processing, if it ishydrogenated or non-hydrogenated, as well as bythe duration of changing the frying oil, as well as thenature of ingredients used in food preparation [23].Moreover, the levels of TFA (g/100 g fat) in fiveimported popcorn items ranged approximately from2% to over 40% which accounts for 0.04 g to 5.9 gof trans fatty acid per 100 g popcorn. The type of fatused in popcorn preparation was disclosed on thefood label. One of the five food items is made withhydrogenated fat, and two are made with partiallyhydrogenated fat in which TFA accounted for a min-imum of 30% of total fatty acids. The other two pop-corn items were prepared with non-hydrogenated fatand contained ≤ 3% of fat as TFA. This is in agree-ment with a Spanish study indicating that popcorn,especially microwave-prepared popcorn, containedhigh levels of TFA because hydrogenated oils areone of its basic ingredients [1]. Innis et al. (1999)results have also showed considerable variationsamong foods within a food category. TFA content in17 brands of crackers has ranged from 23% to 51%of total fatty acids (1-13 g/100 g food), which sug-gest differences in the fat type used in food process-ing [7]. In a more recent Canadian national study, thepercentage of TFA in crackers ranged from 0.4% to40.7% [6]. In contrast, the levels of TFA in 11 import-ed brands of crackers analyzed in the present studyvaried slightly and ranged from 0.97% to 2.59% totalfatty acid.The observed variability of TFA levels of foods withina food category/group in the present study is proba-bly due to that: First, refinement of vegetable oils toimprove their functional properties is carried out byhydrogenation. This process is affected by unsatu-rated fatty acid content, temperature, pressure, typeand amount of catalyst used, and agitation [1, 6, 8].Second, Hydrogenated oils are traditionally used forfrying in fast-food outlets and restaurants, which areknown for their relatively high content of TFA [7, 9].Third, in food preparation, producers could use non-hydrogenated, partially-hydrogenated, hydrogenat-

ed oils or a combination of these oils to achieve thedesired characteristic of the final product [6, 7].Finally, the type of oil/fat used might also vary withregional and national availability, costs and the cur-rent supplier [7].In a national study conducted in Canada, the authorsverified that the “Trans Fat Task Force” has recom-mended that all vegetable oils, soft and spreadablemargarines sold to consumers must not containmore than 2% of TFA from total fat content, and forother purchased foods, the total TFA content mustbe limited to 5% of total fat [6]. In the present study,the percentage of TFA from total fat in popcorn, may-onnaise, falafel, shawerma and baked sweets hasbeen greater than 5%. Moreover, some types of fatsthat are currently analyzed had TFA levels higherthan 2% of total fat. This suggests replacing the fry-ing oils of restaurants and food factories with non-hydrogenated unsaturated liquid oils as is suggest-ed by Ratnayake and associates (2009) [6].Many researchers have highlighted the significanceand the need for stating the amount of TFA contenton food labels [4, 5, 24]. In line with this, Neuhouserand colleagues (1999) have examined the relation-ship between label use and diet. The results provideevidence that the association between reading nutri-tion labels and eating low fat diet was significantlyhigh. This is providing evidence regarding the mainrole of food labeling in helping individuals to selectlower fat foods, hence reducing or at least minimiz-ing TFA intake [25].In addition, labeling regulations should also includefast foods due to the fact that a sample of 4-5 medi-um pieces of falafel contains an average of ~ 4% ofTFA and one sandwich of shawerma (= ~ 135 g)contains up to 5.6% of TFA. However, improving thehydrogenation process through modification of tem-perature, pressure, catalyst, and starting oils candecrease the formation of TFA. Moreover, new foodtechnologies such as genetic engineering of oil seedplants may result in lowering the TFA content of theUS diet [10]. In Europe, food producers’ respondedand TFA-free margarine is available in the market;these products are becoming also available in theUS markets [8]. Recently, the FDA proposed newregulations to require that the amount of TFA beincluded in the nutrition fact panel. The FDA is con-vinced that the new regulations will provide beneficialnutrition information so that consumers will not bemisled about the negative impact of a specific prod-uct on CHD risk, and it would help consumers tomaintain healthy dietary habits as well [24]. Overall,the FDA Advisory Committee proposed new regula-tions to include TFA levels on food labels, with satu-rated fat equal to the sum of saturated and TFA [4].In conclusion, this study provides a large databaseon TFA levels in foods and food groups that are con-sumed in Amman, Jordan. It also demonstrates a

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wide variation in TFA content in different brands ofthe same food item. Thus, regulations should bemade to control TFA content in foods, particularlyby controlling the use of hydrogenated fats in foodproduction and to include TFA content on foodlabels. It is also recommended to pose legislationson the food industry to replace hydrogenated fatswith unsaturated liquid oils. This would reduce TFAlevels in outlet foods, hence reducing the risk ofCHD [6, 8, 9].

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[15] A. Alwan, H. Takruri, A. As’ad, A. Belbeisi,Country profile. In: A. Alwan and S. Kharab-sheh (Eds.), Nutrition in Jordan, Amman: Min-istry of Health, Ministry of Agriculture, andWorld Health Organization, 16-29 (2006).

[16] P. Cunniff, Official Methods of Analysis ofAOAC International. 16th edition. Arlington,Va.: Association of Official AnalyticalChemists 31, 10 (1995).

[17] J. Folch, M. Lees, G. Stanely, A simplemethod for the isolation and purification oftotal lipids from animal tissues. Journal of Bio-logical Chemistry 226, 497-509 (1957).

[18] EC Regulation, 2568, 1991. On the character-istics of olive oil and olive residue oil and rel-evant methods of analysis. Official JournalL248 (1991).

[19] J. Exler, L. Lemar, J. Smith, Fat and fatty acidcontent of selected foods containing transfatty acids. United States Department of Agri-culture (USDA) (2009).

[20] C. Skeaff, Feasibility of recommending certainreplacement or alternative fats. European Jour-nal of Clinical Nutrition 63, S34–S49 (2009).

[21] D. Allison, S. Egan, L. Barraj, C. Caughman, M.Infante, J. Heimbach, Estimated intakes of transfatty and other fatty acids in US population. J. Am. Diet Assoc. 99, 166-174 (1999).

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[23] M. Ledoux, P. Juaneda, J-L. Sebedio, Transfatty acids: Definition and occurrence infoods. European Journal of Lipid Science andTechnology, 109, 891-900 (2007).

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[25] M. Neuhouser, A. Kristal, R. Patterson, Use ofFood Nutrition Labels is Associated with LowerFat Intake; J Am Diet Assoc. 99, 45-50 (1999).

Received June 8, 2011Accepted June 24, 2011

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10th EURO FED LIPID CONGRESSFats, Oils and Lipids: from scienceand technology to health

Cracow Poland, 23-26 Settembre 2012Il Congresso avrà luogo presso l’Auditorium Maxi-mum dell’Università Jagellonica di Cracovia.I temi principali del Congresso sono:Health & Diseases- Analytical, Imaging, Authenticity, Lipidomics- Physical Chemistry- Processing- Biotechnology- Oxidation and Antioxidants- Lipids in Animal Science- Oilseeds, Plant Breeding,- Olive Oil- Palm Oil- Rapeseed Oil- SustainabilityAl momento non sono disponibili ulteriori infor-mazioni. Per aggiornamenti collegarsi al sito:www.eurofedlipid.org/meetings/cracow/index.htm

14th EXTECH ADVANCES IN EXTRAC-TION TECHNIQUES

Messina, 24-26 Settembre 2012Il Simposio Internazionale 14th Extech advancesin extraction techniques sui progressi delle tec-nologie di estrazione del campione, si svolgeràall’Università degli Studi di Messina, presso laFacoltà di Scienze nei giorni dal 24 al 26 Settem-bre, 2012 (Presidente del Simposio Prof. L. Mon-dello).Il Simposio è incentrato sui fondamenti, lo svilup-po di nuovi approcci e nuove tecnologie di estra-zione e preparazione del campione in diversearee delle scienze analitiche.Per ulteriori informazioni consultare la pagina:

http://www.chromaleont.it/extech/

ALGAE BIOMASS SUMMITDenver, Colorado 24-27 Settembre 2012

Il VI° Congresso annuale Algae Biomass Summitavrà luogo a Denver, Colorado, dal 24 al 27 set-tembre 2012 presso il Downtown Hotel SheratonDenver. L’evento dinamico riunisce professionisti prove-nienti da tutti i settori delle industrie di algheinclusa l’utilizzazione. L’evento, organizzato daAlgae Biomass Organization e coprodotto daBBI International, riunisce i produttori, attuali efuturi, di prodotti provenienti da fonti rinnovabilied energia, i produttori di colture di alghe, auto-rità locali, specialisti, industriali, progettisti,

imprenditori e dirigenti. Per informazioni consultare la pagina:http://biodieselmagazine.com/events/browse/

EUROPEAN COATINGS CONFERENCE Polyurethanes for high performancecoatings

Berlin Germany, 25-26 Settembre 2012 L’European Coatings Conference, “Polyuretha-nes for high performance coatings“ si proponedi discutere le ultime tendenze, le tecnologie e dipresentare gli ultimi sviluppi dei rivestimentipoliuretanici.Il Convegno, rivolto ai produttori di materieprime, ai formulatori di rivestimenti e agli utentifinali, affronterà argomenti riguardanti le ricerchee gli sviluppi applicativi dei rivestimenti.La pre-conferenza “Fundamentals of polyuretha-ne coatings” darà l’opportunità di aggiornare leconoscenze dei requisiti generali, della chimicae delle tecnologie dei sistemi di finitura poliure-tanici.Il programma dettagliato verrà pubblicato onlinea partire dal 21 maggio 2012.Per ulteriori informazioni contattare:

Matthias Janz, Project Manager EventsTel. +49 511 9910-273

FOOD-ING INTERNATIONALSalone internazionale e conferenzaper l’industria degli ingredienti ali-mentari

Milano – Fieramilanocity, 25-27 Settembre 2012Sta suscitando notevole interesse Food-IngInternational 2012, la nuova esposizione e con-ferenza dedicata agli ingredienti food & bevera-ge per tutti i settori dell’industria alimentare edelle bevande, che si svolgerà dal 25 al 27 set-tembre 2012 a Fieramilanocity. Sono già nume-rose, infatti, le aziende del settore che hannoaderito alla manifestazione, un’opportunità unicaper i produttori e i distributori di ingredienti food& beverage, un settore in cui l’Italia svolge unruolo di primo piano.Food-Ing International si svolgerà in contempo-ranea con la terza edizione di Nuce Internatio-nal, il salone internazionale per l’industria nutra-ceutica, cosmeceutica, functional foods & drinkse health ingredients, con cui nasceranno fortisinergie.Food-Ing International 2012 è la fiera in cui i pro-duttori e i distributori hanno l’opportunità di pre-sentare le ultime novità relative a ingredienti(farine, cereali, prodotti caseari, gelatine, amidi,

CONGRESSI Notiziario

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Notiz

iario lieviti, addensanti, aromatizzanti, coloranti, dolci-

ficanti, oli, grassi, amminoacidi), tecniche di pro-duzione e nuove tecnologie applicate a food &beverage (biotecnologie e nanotecnologie). Sirivolge, in particolare, agli operatori dei Paesi delsud-est europeo e del bacino del Mediterraneo,area nella quale l’Italia svolge un ruolo fonda-mentale. L’industria alimentare italiana, infatti, contribui-sce in modo determinante alla diffusione delmade in Italy e, insieme ad agricoltura, indotto edistribuzione, rappresenta la prima filiera econo-mica del Paese. Secondo i dati di Federalimen-tare, in Italia il “mondo” potenzialmente interes-sato a visitare Food-Ing International 2012 fattu-ra oltre 120 miliardi di euro l’anno e acquista etrasforma circa il 70% delle materie prime nazio-nali. Oltre tre quarti delle esportazioni alimentari,inoltre, sono costituite da prodotti industriali dimarca, per un valore di oltre 20 miliardi di euro. Il programma di Food-Ing International 2012 ècompletato da conferenze e workshop, con ilcoinvolgimento di qualificati rappresentanti delmondo industriale, associativo, accademico eistituzionale. Nell’ambito di Food-Ing International 2012 saràinoltre possibile usufruire di MyPartnering, efficacestrumento per il business one to one che, tramiteun apposito software creato da Artenergy Publi-shing, consentirà di individuare gli operatori piùindicati per fissare incontri mirati durante i giorni difiera in grado di favorire nuove opportunità. All’interno di Food-Ing International 2012 saràallestita anche la speciale Area R&D, che favori-rà l’incontro, il dialogo e il confronto tra il mondodella ricerca scientifica e quello dell’impresa,creando le condizioni ottimali per avviare colla-borazioni volte allo sviluppo di business innova-tivi. L’Area R&D garantirà visibilità ai principaliattori della ricerca italiana ed estera: università,spin off, centri di ricerca pubblici e privati. Ulteriori informazioni sono disponibili su:www.fooding.pro

WORLD CONGRESS ON OLEO SCIENCE & 29th ISF CONGRESS(WCOS 2012)

Arkas Sasebo, Nagasaki, Japan30 Settembre - 4 Ottobre, 2012

In seguito ad una crescente richiesta di tecnolo-gie sostenibili in campo oleicolo, La Japan OilChemists’ Society organizza il Congresso mon-diale (WCOS 2012) a Nagasaki per celebrare 51anni di Meeting annuale.

WCOS 2012 prevede sessioni interessanti su: oli, grassi in nutrizione umana, scienza delladetergenza e delle interfasi, sviluppo di tecnolo-gie nel settore degli oli e dei grassi, biodiesel ebiocarburanti, biochimica e biotecnologia deilipidi, ossidazione dei lipidi e antiossidanti, chi-mica dei lipidi e sintesi organiche, tecniche ana-litiche, alimenti e mangimi. Saranno invitati esperti da tutto il mondo. È atti-vo il call for papers.Per aggiornamenti collegarsi al sito:

www2.convention.co.jp/wcos2012/welcome.html

PRACTICAL SHORT COURSE ONVEGETABLE OIL PROCESSING ANDPRODUCTS OF VEGETABLE OIL/BIO-DIESEL

College Station-Texas, USA, 7-11 Ottobre 2012Il corso è rivolto a chi opera nel campo dellalavorazione dell’olio vegetale ed è interessato aipiù recenti sviluppi nella purificazione, idrogena-zione, interesterificazione, deodorizzazione dellesostanze grasse, nella produzione di biodiesel edei grassi-trans free:-Managers, Ingegneri -R & S -Venditori e responsabili Marketing-Responsabili Controllo Qualità -Specialisti del settore

Argomenti del corso:New methods in vegetable oil refining and pro-cessingLatest methods in bleaching, hydrogenation,interesterification, and deodorization of majorvegetable oils• Production of biofuels• Production of non-trans fats• Filtration SystemsPer informazioni aggiornate consultare la pagina:http://foodprotein.tamu.edu/fatsoils/scvegoil.php

AMERICAN ASSOCIATION FOR AERO-SOL RESEARCH (AAAR) - “31st ANNUAL CONFERENCE”

Minneapolis, Minnesota, USA, 8-12 Ottobre 2012L’Associazione Americana per Aerosol Research(AAAR) è un’organizzazione, senza scopo dilucro, per studiosi e ingegneri che desideranopromuovere ed informare sui progressi tecnicinel campo della ricerca aerosol.L’Associazione promuove lo scambio di informa-

zioni tra i propri membri e con altre disciplineattraverso conferenze, simposi, e la pubblicazio-ne di una rivista di settore, Scienza e TecnologiaAerosol (AS&T).Tutte le aree scientifiche dell’aerosol sono ben rappresentate dagli Iscritti all’Associazione. Necitiamo alcune: ambiente in senso globale,microcontaminazione, inquinamento atmosferi-co, strumentazione/misurazione, chimica del-l’aerosol, sintesi dei materiali, fisica dell’aerosol,aerosol nel settore farmaceutico, lavoro e salutepubblica, filtrazione/separazione, scienze atmo-sferiche, combustione, aerosol biologici, metro-logia/standard, qualità dell’aria interna, aerosolradioattivi/sicurezza nucleare.Impegnata nello sviluppo della scienza aerosol enella sua applicazione ad importanti problemisociali, AAAR offre un forum internazionale per laformazione, la comunicazione e networking tra iprincipali ricercatori aerosol. A tale proposito il Comitato organizzatore è lietodi invitare alla AAAR 31st Conferenza annuale,che si terrà a Minneapolis, Minnesota, USA,dall’8 al 12 ottobre, 2012. L’evento, al quale par-tecipano esperti di fama internazionale, è la piat-taforma ideale per discutere i più recenti pro-gressi, le tecnologie e presentare gli ultimi svi-luppi.Il programma scientifico prevede tre simposispeciali che toccano diversi aspetti della scien-za e della tecnologia aerosol1 - Synthesis of Functional Materials UsingFlames, Plasmas and Other Aerosol Methods; 2 - Aerosol Nucleation: From Clusters toNanoparticles; 3 - The Indoor Microbiome. Inoltre il programma tecnico sarà caratterizzatoda sessioni orali e sessioni poster.Per ulteriori informazioni sul programma consul-tare la pagina:

http://2012.aaar.org/welcome

27th INTERNATIONAL FEDERATIONOF SOCIETIES OF COSMETIC CHE-MISTS CONGRESS (IFSCC) - Beautyin diversity a global village

Johannesburg, South Africa, 15-18 Ottobre 2012South African Society of Cosmetic Chemistsospita la 27th International Federation of Soci-eties of Cosmetic Chemists Congress presso ilSandton Convention Centre nelle giornate dal 15al 18 ottobre 2012. Il tema del Congresso sarà: “Beauty in diversity a global village“.

Gli argomenti saranno i seguenti:Cosmetics: Physical, Chemical, Biological andEngineering• Developments in Active Research• Research and Development – Materials and

Formulae• Personal Care Manufacturing and Control

Systems• Advances in Preservation Technology and

Hygiene• Naturals – Research and Development

Advances• Quality Control and Quality Assurance• Emulsion and Surfactant Technology• Today and Beyond

Protective Strategies• Personal Care – Protection, Repair and

Improvement• Sunscreens – Technology, Assessment and

Safety• Anti Ageing – Science and Technology• Disorders – Skin, Hair and Scalp

Well-Being and Beauty Cosmetics• Decorative Cosmetics• Neurobiology – Wellness and Well Being• Hair Care – Technology, Research and

Advances

Society and Cosmetics• Nanotechnology – Science, Technology, Pit

falls• Advances in Delivery Systems and Technolo-

gy• Sensory Technology and Evaluation• Efficacy and Assessment – Validation, Sub-

stantiation and Toxicology• Legislation and Regulation – Global Require-

ments• Global Trends and Scientific Marketing• Speciality Cosmetics• Sustainability• Safety, Health and the EnvironmentPer informazioni:

Segreteria del CongressoGlobal Conferences Africa (Pty) Ltd

P O Box 651817Benmore, 2010

Tel +27 11 676 3464Fax +27 086 504 0721

Email: [email protected]

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Notiziario

WORKSHOP ON GLYCEROL MARKE-TING USES AND CHEMISTRY

Milano, 18 - 19 Ottobre 2012La disponibilità di importanti quantità di glicero-lo a prezzo ridotto sul mercato, causato dal-l’enorme sviluppo della produzione di biodieselin Europa e nel Mondo intero ha stimolato nuoveiniziative di ricerca a partire da questa molecola.Nuovi impieghi del glicerolo tal quale o comemateria prima per nuove trasformazioni chimi-che che in passato non erano economicamenteipotizzabili sono ora possibili. Questo Workshop, progettato e organizzato alloscopo di rendere note e discutere queste nuoveopportunità, sarà organizzato in tre differentisessioni. Nella prima sessione saranno discussii futuri scenari della produzione e del mercatodel glicerolo negli anni a venire. La seconda ses-sione sarà dedicata alle trasformazioni chimichebasate sulla molecola di glicerolo, mentre nell’ul-tima si discuterà degli usi tecnici del glicerolo talquale, con particolare riferimento all’impiegocome ingrediente nei fluidi refrigeranti, qualesostituto dei glicoli etilenico e propilenico.L’evento sarà organizzato nel corso di duemezze giornate consecutive, il pomeriggio delgiorno 18 Ottobre ed il mattino del giorno suc-cessivo.Lingua ufficiale: inglese.A causa della ridotta capienza della sala ilnumero dei partecipanti sarà ridotto a 30. Incaso di adesioni in numero notevolmente supe-riore la sede del Workshop potrebbe cambiare.In ogni caso il Workshop si terrà a Milano.La quota di partecipazione è fissata in 220 Euro,evening dinner incluso.Due posti a tariffa ridotta (80 Euro) sono riserva-ti per studenti PHD (dinner non incluso).Informazioni aggiornate relative al programmadelle giornate ed alle modalità di partecipazionesono in pubblicazione su: www.eurofedlipid.orge www.sissg.it. Per ulteriori informazioni contattare: Dr. Paolo Bondioli, INNOVHUB-SSOG, ServizioTecnologie.

E-mail: [email protected].

WORLD CONFERENCE ON FABRICAND HOME CARE

Singapore, 29-31 Ottobre 2012AOCS annuncia la Conferenza che si terrà pres-so lo Shangri-La Hotel di Singapore nelle giorna-te dal 29 al 31 ottobre 2012. Un evento semprepiù importante, che porterà avanti la tradizione

della Conferenza mondiale di Montreux che sitiene ogni quattro anni.Avrà un programma rilevante al passo con le ulti-me tendenze con l’intento di allargare la parteci-pazione ad un pubblico sempre più ampio edare ai visitatori nuove opportunità di networ-king.Con il tema “Driving Performance throughSustainable Innovation“, si prevedono quattrosessioni di mezza giornata sui seguenti argo-menti: - Balancing the Shifting Market Dynamics with

Economic Realities: What is Ahead?- Resource Management, Product Performance,

and Environmental Responsibility: What is theWinning Formula?

- Innovative Supply Systems and ManufacturingParadigms: What are the Solutions?

- Revolutionary Products and BreakthroughTechnologies: What is Driving the Future?

La Conferenza è resa unica anche per l’interven-to di relatori leader nel settore.AOCS vista l’esigenza di restare al passo con latecnologia in continua evoluzione, ospiterà ilConvegno ogni due anni, alternando le città diSingapore e Montreaux. L’organizzazione è giàattiva per la Conferenza 2014 a Montreaux.Per maggiori informazioni su Singapore 2012:

http://singapore.aocs.orge-mail: [email protected]

32nd PRACTICAL SHORT COURSE ONVEGETABLE OIL EXTRACTION

College Station, Texas-USA, 4-8 Novembre 2012Obiettivi del Corso:- offrire formazione pratico-teorica riguardo ilprocesso di preparazione del seme, l’estrazionedell’olio, l’influenza delle scelte tecnologiche suipanelli proteici e sulla qualità dell’olio- presentare le ultime informazioni in tema disicurezza.Per informazioni dettagliate sul programmascientifico consultare la pagina:http://foodprotein.tamu.edu/extractionprotein/sc

vegoil.php

MASS SPECTROMETRY 2012Biopolis - Singapore, 7-8 Novembre 2012

Evento leader nel settore che si svolgerà dal 7all’8 novembre 2012 a Biopolis, Singapore.La fiera-conferenza, svilupperà i temi fondamen-tali riguardanti le migliori prassi sulle tecniche eapplicazioni della spettrometria di massa.

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Notiz

iario

L’evento sarà caratterizzato da presentazioniorali, con un programma di grande interesse alquale interverranno relatori internazionali, e dasessioni poster.La fiera internazionale presenterà strumentazio-ni e attrezzature per gli specialisti delle analisinel settore farmaceutico, alimentare, ambientalee medico.Il programma scientifico sarà caratterizzato dapresentazioni riguardanti i seguenti temi:• Analytical Method Management• Collision/Fragmentation• Interpretation and Informatics• LIMS, ELN, regulatory considerations• Emerging Technology• Industrial applicationsL’organizzazione promuove la partecipazionedelle aziende interessate in qualità di sponsor,espositori, relatori o delegati. Per quanto riguarda le informazioni relative alprogramma scientifico, ai dettagli espositivi,all’invio degli abstract ed in ultimo alle modalitàdi iscrizione consultare la pagina:http://www.sepscience.com/Conferences/Mass-

Spectrometry-2012

WORLD ETHANOL & BIOFUELS SO12Munich, Germany, 5-8 Novembre 2012

L’evento si svolgerà all’Hilton Munick Park Hotela Monaco dal 5 all’8 novembre 2012.Partecipare alla conferenza vi permetterà di:- sviluppare e approfondire argomenti con

esperti internazionali dei settori interessati aibiocarburanti

- Incontrare produttori, dirigenti ed esperti cheoperano nel settore

- aggiornarsi sulle ultime ricerche e sviluppi delsettore ed incontrare dirigenti al fine di stabili-re nuovi contatti di networking

- avere l’opportunità di partecipare a tavolerotonde, indagini, workshop e stabilire nuoverelazioni commerciali.

Il programma della conferenza è attualmente infase di sviluppo. Per aggiornamenti sul program-ma scientifico consultare la pagina:

http://web.agraevents.com/

INTERNATIONAL PACKTECH INDIAMumbai, 6-8 Novembre 2012

Dopo che gli eventi The International PackTechIndia e drink technology India 2010, organizzatirispettivamente da Messe Duesseldorf GmbH,Messe Duesseldorf India, Messe Muenchen

GmbH e MMI India Pvt.Ltd, si sono conclusi conrisultati senza precedenti, superando le aspetta-tive in termini di quantità e qualità degli esposi-tori e dei visitatori, gli organizzatori hanno volutoripetersi con International PackTech India 2012.International PackTech India si rivolge ad unpubblico tecnico qualificato, ingegneri edimprenditori; a tutta la filiera di trasformazionedei prodotti alimentari e delle bevande, alla tec-nologia di confezionamento, ai produttori dimacchine e sistemi per l’imballaggio e la stam-pa di materiali da imballaggio, allo scopo di farconoscere le ultime novità e gli sviluppi delpackaging, fornendo agli esperti del settore lapossibilità di entrare in un mercato in continuosviluppo ed espandere la propria posizione.Per maggiori informazioni consultare il sito web:

www.packtech-india.com

SCS FORMULATESOCIETY OF COSMETIC SCIENTISTS

13-14 Novembre 2012Annotare l’evento. La manifestazione è dedicataai formulatori dell’industria di prodotti per la curae l’igiene personale.Al momento non sono disponibili ulteriori infor-mazioni. Collegarsi periodicamente alla pagina:

http://www.scsformulate.co.uk/exhibition.asp e-mail: [email protected]

NOVEL SOURCES FOR OMEGA-3 FORFOOD AND FEED

Copenhagen, Denmark, 14-15 Novembre 2012La domanda di acidi grassi omega-3 marinipolinsaturi per mangimi, alimenti funzionali eprodotti farmaceutici, è in aumento. Per moltianni l’olio di pesce prodotto da pesci selvatici èstata la più importante fonte di acidi grassiomega-3 marini. Tuttavia, la produzione di olio dipesce è rimasta stabile nell’ultimo decennio enon è previsto un suo aumento per ragioni disostenibilità. Pertanto, per soddisfare le richiestefuture di nuove fonti di acidi grassi omega-3 permangimi, sarà necessario ricorrere all’integrazio-ne con nuovi prodotti alimentari e farmaceutici.Durante questo incontro verranno discussi diver-si aspetti legati alla produzione, applicazione enutrizionali di nuove fonti di acidi grassi omega-3, che possono includere organismi unicellulari,ad esempio batteri, microalghe e lievito, macro-alghe, vegetali geneticamente modificati.Si discuterà anche sulle applicazioni di questenuove fonti di acidi grassi omega-3 nei mangimi

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Notiziario

destinati ai pesci e agli animali, alimenti, integra-tori alimentari e prodotti farmaceutici; l‘effettodell’uso delle nuove fonti di omega-3 sulle pro-prietà dei mangimi, performance di crescita deipesci e animali, gli effetti nutrizionali negli esseriumani così come gli effetti sulla qualità dei pro-dotti alimentari finali compresi gli aspetti di ossi-dazione. Gli alimenti possono includere prodottidella pesca, carne e uova che sono stati arric-chiti con acidi grassi omega-3 attraverso l’ali-mentazione o attraverso l’arricchimento del pro-dotto finale. Il programma tecnico è caratterizzato da dueSessioni:Session 1: Production of Novel Sources ofOmega-3, including GMOSession 2: Use of Novel Sources of Omega-3 inFeed, Food and Pharma.Per informazioni aggiornate consultare la pagina:

http://www.eurofedlipid.org/meetings/copen-hagen2012/

2012 EFFoST ANNUAL MEETING Montpellier - France, 20-23 Novembre 2012

L’Annual Meeting EFFoST 2012 si terrà a Mon-tpellier in Francia, dal 20 al 23 novembre 2012.L’obiettivo è quello di focalizzare e sviluppareargomenti riguardanti gli alimenti, la salute, lasicurezza alimentare e la sostenibilità.I temi principali:- Food production: security, safety, health and

well-being of consumers- Environmental impact and economic competi-

tiveness- Advanced scientific approaches: methods,

tools and instrumentsIl meeting annuale 2012 EFFoST offrirà unasignificativa opportunità ai leader dell’industria eal mondo accademico per discutere le nuoveopportunità ed i problemi che si presenterannonel prossimo futuro.Per informazioni dettagliate sugli argomenti delmeeting e per inviare poster o relazioni consulta-re la pagina:

http://www.effostconference.com/index.html

INTERNATIONAL CONFERENCE AND EXHIBITION ON COSMETOLOGY& COSMETICS

Hyderabad International Convention Centre, India 23-24 Novembre 2012

OMICS Group è lieto di invitarvi a questo eventostraordinario che riunisce in un mix unico e inter-

nazionale di grande e medio Pharma, le societàdi cosmetici e le principali Università. La Confe-renza sarà piattaforma ideale per condividereesperienze e collaborazioni tra industria emondo accademico, per valutare le tecnologieemergenti in tutto il mondo attraverso ricerca dibase e studi clinici. Il programma scientifico si concentrerà sugliattuali progressi nella ricerca, nella produzione enell’uso dei cosmetici, con particolare attenzionesul loro ruolo nel mantenimento della salute enella prevenzione degli effetti collaterali.http://www.omicsonline.org/cosmetology2012/

79th ANNUAL NATIONAL INSTITUTEOF OILSEED PRODUCTS (NIOP) CONVENTION

Scottsdale, Arizona, USA 10-12 Marzo 2013L’Istituto Nazionale dei Prodotti Oleosi (NIOP), èun’associazione commerciale internazionalecon l’obiettivo principale di promuovere il busi-ness di aziende ed enti impegnati in acquisto,vendita, lavorazione, trasporto, stoccaggio euso di oli vegetali e materie prime.Da oltre 70 anni, NIOP ha soddisfatto le esigen-ze di una grande varietà di attività. L’elenco comprende importatori ed esportato-ri, campionatori, operatori di trasporto, interme-diari, laboratori di prova e serbatoi di stoccag-gio, trasformatori, raffinerie, industrie alimenta-ri, compagnie di assicurazione, aziende pro-duttrici di cosmetici, operatori di piantagioni dicocco e di palma. Circa 120 aziende associate in 15 Paesisosterranno NIOP con la loro adesione. Almomento non sono disponibili informazioni sulprogramma scientifico: consultare periodica-mente il sito:

www.niop.org

104th AOCS ANNUAL MEETING & EXPO

Palais des Congrès de Montréal Montréal, Québec, Canada 28 Aprile - 1 Maggio 2013

L’incontro annuale 104th AOCS & Expo è leadermondiale di business ed un forum scientifico sugrassi, oli, tensioattivi, lipidi, e materiali annessi.AOCS avrà il piacere di accogliere nelle giorna-te dal 28 aprile al 1 maggio, 2013 in Montréal,Québec, Canada, tutti coloro che saranno inte-ressati a parteciparVi.Il sito dell’Incontro sarà presto disponibile.

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Notiz

iario

SHELF-LIFE TECNICHE DI MONITORAGGIO E QUALITÁdi Monica Bononi e Fernando Tateo144 pag. con tabelle e figure, Volume rilegato (2012).Chiriotti Editori - Pinerolo, TorinoISBN 978-88-96027-09-7

Il termine “shelf-life” indica il “periodo di tempo”entro il quale può ritenersi garantito un livelloaccettabile di appetibilità, di rispetto degli stan-dard analitici e di sicurezza di un alimento. I mol-teplici fattori che determinano il deperimentoqualitativo di un alimento nel tempo si classifica-no idealmente in tre categorie: fattori fisici (luce,temperatura, radiazioni elettromagnetiche), chi-mici (reazioni chimiche di vario genere) e biolo-gici (reazioni enzimatiche, proliferazioni microbi-che, infestazioni). L’industria alimentare deve pertanto adottaretecnologie produttive atte a limitare l’influenza diquesti fattori e deve attuare controlli in fase diconservazione, al fine di identificare le cause edi tempi di decadimento delle caratteristiche chesi considerano indici di qualità di un prodotto. Itesti raccolti in questa monografia costituisconouna trattazione multidisciplinare sulle problema-tiche e sul monitoraggio di shelf-life: gli aspettianalitico-strumentali, microbiologici, nutrizionalie di accettabilità per il consumatore sono trattatiallo scopo di stimolare alla formazione di basedell’operatore del settore food.Lungi dal volersi considerare esaustiva, la tratta-zione di argomenti relativi a discipline diverse hail compito di fornire larghi spunti di accesso allostudio del problema della previsione dei tempiottimali di stoccaggio di materie prime e prepa-razioni alimentari derivate.

Indice:Fondamenti chimico-analitici per la valutazionedi “vita ottimale” degli alimenti e possibili para-metri utili alla misura1.1 Introduzione1.2 Criterio del monitoraggio dei marker di

sicurezza e di accettabilità1.3 Metodiche analitiche strumentali per iden-

tificazione e monitoraggio di marker1.4 Classificazione dei marker secondo l’ori-

gine

Le alterazioni di natura microbiologica e nuovisistemi di valutazione per gli studi di shelf-life2.1 Introduzione 2.2 Ruolo dei microrganismi nello studio di

shelf-life

2.3 Metodi microbiologici per lo studio dishelf-life

2.3.1 Microbioal challenge test2.3.2 Microbiologia predittiva2.3.3 Confronto tra tecniche tradizionali e tecni-

che innovative2.3.4. Saggi immunologici2.3.5. Saggi genetici2.4 Conclusioni 2.5 Bibliografia

Aspetti nutrizionali nello studio della shelf-life 3.1 Premessa 3.2 I composti bioattivi e la conservazione e

trasformazione degli alimenti3.3 Bibliografia

Shelf-life e consumatori4.1 Premessa4.2 Shelf-life di mercato e shelf-life percepita4.3 Studio delle etichette4.4 Shelf-life e comportamento dei consuma-

tori4.5 Shelf-life dei prodotti della IV gamma4.6 Shelf-life chimica, fisica e sensoriale e fat-

tori che la influenzano4.7 Shelf-life e responsabilità GDO4.8 Conclusioni 4.9 Bibliografia

La certificazione di prodotto della shelf-lifecome strumento di marketing nel settoreagroalimentare

FUNCTIONAL FOODS Concept to productEdited by Maria Saarela, VTT, Finland (Woodhead Publishing Series in Food Science,Technology and Nutrition: Number 205) First Edition 2000, Second Edition 2011ISBN 978-1-84569-592-7, 640 pagine www.woodheadpublishing.com

Il libro è suddiviso in 3 sezioni, la prima, genera-le, dedicata alla definizione degli alimenti funzio-nali e alla relativa legislazione europea, america-na, asiatica ed oceanica, con una sezione dedi-cata all’ analisi delle esigenze, delle aspettativee dell’ accettabilità dei consumatori e alla lorocapacità di percepire l’ importanza delle dichia-razioni nutrizionali e il ruolo degli alimenti sullostato della salute.La seconda sezione approfondisce le relazionitra gli alimenti funzionali e il loro ruolo nella pre-

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NotiziarioLIBRI

venzione e nel mantenimento di un buon livellodi benessere, individuando i meccanismi fisiolo-gici di come la dieta e lo stile di vita possonoinfluenzare lo sviluppo di alcune patologie croni-che gravi. Gli argomenti riguardano gli effettiprotettivi dei micronutrienti presenti nella dieta,in particolare quelli del mondo vegetale.La terza parte riguarda lo sviluppo di nuovi pro-dotti alimentari funzionali, in quanto la produzio-ne, la distribuzione e le tecniche di processodevono essere condotte al meglio per conserva-re le componenti biologicamente attive e perrenderli più prontamente biodisponibili: tale pro-blema riguarda soprattutto le popolazioni la cuialimentazione dipende da pochi tipi di coltiva-zioni soffrendo di deficit nutrizionali.Il libro è ben organizzato in quanto ciascunacategoria alimentare viene trattata in capitoliseparati con particolare attenzione agli sviluppifuturi dal punto di vista delle riformulazioni ali-

mentari, più funzionali dal punto di vista salutisti-co e dell’ evoluzione del mercato.Ciascun capitolo è inoltre corredato da un’ ampiabibliografia pertinente e moderna, riporta nume-rosi indirizzi web in cui trovare indicazioni relati-ve ai claims consentiti, opinioni scientifiche dell’EFSA e informazioni nutrizionali.Gli alimenti trattati sono quelli di origine vegeta-le, gli oli e i grassi (ω-3 e PUFAs), i prodotti lat-tiero caseari, la carne, il pesce e gli apportatoridi fibra.Il libro può essere un valido supporto per ricer-catori, professionisti dell’ industria, studenti tec-nologi e nutrizionisti in quanto tratta tutti gli svi-luppi relativi agli alimenti funzionali, è multidisci-plinare spaziando, dalla medicina alla legislazio-ne, alla microbiologia, alla tecnologia alimentaree alla nutrizione.

Pierangela Rovellini

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Notiz

iario

Laboratorio

di analisi sensoriale

Oliva vergine

Divisione SSOG Silvia Tagliabue

Responsabile Laboratorio Analisi Sensoriale Tel.: 02.706497.78 - Fax: 02.2363953 - E-mail: [email protected]

Il Reg. CEE 2568/1991 stabilisce i parametri chimico-fisici e i metodi per il controllo di qualità de olio di oliva. La valutazione organolettica (Panel test), introdotta nel regolamento comunitario, concorre alla definizione

ca di appartenenza.

olio di oliva vergine nelle categorie:

OLIO EXTRA VERGINE DI OLIVA OLIO DI OLIVA VERGINE OLIO DI OLIVA LAMPANTE

etti. Fornisce inoltre indicazioni sulle caratteristiche

La valutazione organolettica è qualificata da un livello di affidabilità paragonabile a quello delle prove analitiche e viene eseguita da un panel di assaggiatori selezionati e addestrati, avvalendosi di tecniche statistiche per il trattamento dei dati. Il nostro Panel è riconosciuto dal MiPAF (Ministero delle Politiche Agricole Alimentari e Forestali) come comitato di assaggio incaricato del controllo ufficiale delle caratteristiche degli oli di oliva vergini e degli oli DOP e IGP e dal COI (Consiglio Oleicolo Internazionale). La valutazione organolettica è accreditata da ACCREDIA. Il Panel è al servizio produzione, di enti certificatori e della grande distribuzione.

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