Deborah Spaine TESTES FUNCIONAIS · TESTES FUNCIONAIS Deborah M.Spaine ReproduçãoHumana-UNIFESP...
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23/04/2012
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TESTES FUNCIONAISTESTES FUNCIONAIS
Deborah M.SpaineReprodução Humana- UNIFESP
2012
Testes FuncionaisTestes Funcionais
� Os testes funcionais não são
necessariamente realizados na rotina
laboratorial mas são úteis em certos casos
diagnósticos ou para fins de pesquisa.
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Testes funcionaisTestes funcionais
� Estresse oxidativo
� Integridade de membrana citoplasmática
� Integridade e reatividade do acrossoma
� Atividade mitocondrial
� Condensação da cromatina
� Fragmentação do DNA
� Testes interação espermatozóide x oócito
� Testes ligação zona pelúcida humana
� Teste penetração oócito hamster
Estresse Estresse oxidativooxidativo
Produção de EROs
Capacidade antioxidante
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Estresse Estresse oxidativooxidativo
Produção de EROs
Capacidade antioxidante
� Espermatozóides amorfos, mortos
� Leucócitos
� Íons metálicos
� Hipertermia testicular (varicocele)
Estresse Estresse oxidativooxidativo
Produção de EROs
Capacidade antioxidante
� Enzimático (SOD, GPx, catalase)
� Não-enzimático (Vitaminas C e E, ácido úrico)
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EROsEROs (espécies reativas de oxigênio)(espécies reativas de oxigênio)
� São metabólitos do oxigênio: ânion superóxido,
peróxido de hidrogênio,radicais hidroxil e
hidroperoxil e óxido nítrico
� Peroxidação de ácidos graxos poliinsaturados
� Fragmentação de DNA
� Lesão do axonema
� Redução do potencial eletrolítico mitocondrial
Detecção das Detecção das EROsEROs
� Antioxidantes enzimáticos:
◦ Catalase
◦ Glutationa peroxidase (GPx)
◦ Superóxido dismutase (SOD)
� EROs
� Peroxidação lipídica:
◦ MDA (TBARS)
◦ 8-isoprostano
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Testes funcionaisTestes funcionais
� Estresse oxidativo
� Integridade de membrana citoplasmática
� Integridade e reatividade do acrossoma
� Atividade mitocondrial
� Condensação da cromatina
� Fragmentação do DNA
� Testes interação espermatozóide x oócito
� Testes ligação zona pelúcida humana
� Teste penetração oócito hamster
Integridade de membrana plasmáticaIntegridade de membrana plasmática
� Permeabilidade seletiva
� Potencial eletrolítico
� Ácidos graxos poliinsaturados – lesão de
membrana – perda de permeabilidade
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Avaliação da integridade de Avaliação da integridade de membrana plasmáticamembrana plasmática
� Teste de expansão hipoosmótico
� Eosina-nigrosina
� Iodeto de propídeo / SYBR 14
� Monoazida de etídeo
Campo claro
Epifluorescênciaou
Citometria
TESTE HIPOOSMÓTICO (HOS)
� Considerado como teste de vitalidade
� Avaliar capacidade spm. sofrerem edema de cauda qdo.em contato solução hipoosmótica
� Entrada de líquido para o interior da célula com a finalidade de se estabelecer o equilíbrio osmótico. Como resposta, a membrana dos espermatozóides incha-se formando espaços líquidos na cauda
� A presença de inchaço indica que o transporte de fluidos através da membrana ocorreu normalmente, considerando a membrana íntegra do ponto de vista funcional
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TESTE HIPOOSMÓTICO (HOS)� Solução de 150 mOsm/L: citrato de sódio, frutose e água purificada
� Incubar a 37ºC por 30 minutos
� Leitura 400x entre lâmina-lamínula(200 spm)
� % spm. cauda inchada
� Valor de referência: 58% spm.cauda inchada
Iodeto de Iodeto de propídeopropídeo / SYBR 14/ SYBR 14
� Iodeto de propídeo – não penetra íntegro
� SYBR 14 – penetra apenas íntegro
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Testes funcionaisTestes funcionais
� Estresse oxidativo
� Integridade de membrana citoplasmática
� Integridade e reatividade do acrossoma
� Atividade mitocondrial
� Condensação da cromatina
� Fragmentação do DNA
� Testes interação espermatozóide x oócito
� Testes ligação zona pelúcida humana
� Teste penetração oócito hamster
Integridade e reatividade de acrossoma
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Reação Reação do do acrossomaacrossoma
� Permitir penetração na zona pelúcida
� Ocorre na ZP após “binding”
� Depende de influxo de cálcio
Integridade Integridade do do acrossomaacrossoma
� Corantes para acrossoma
� Lectinas(glicoproteínas)de ligação x acrossoma:
◦ membrana interna
◦ membrana externa
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LecitinasLecitinas
� PSA – membrana acrossomal interna
� PNA – membrana acrossomal externa
Íntegro
Danificado
Testes funcionaisTestes funcionais
� Estresse oxidativo
� Integridade de membrana citoplasmática
� Integridade e reatividade do acrossoma
� Atividade mitocondrial
� Condensação da cromatina
� Fragmentação do DNA
� Testes interação espermatozóide x oócito
� Testes ligação zona pelúcida humana
� Teste penetração oócito hamster
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Atividade mitocondrialAtividade mitocondrial
� Motilidade:
◦ consumo de ATP
◦ Integridade de proteínas do axonema
� Fonte de ATP:
◦ Atividade mitocondrial (fosforilação oxidativa)
◦ Glicólise anaeróbica
Proteínas do Proteínas do axonemaaxonema
� Imunohistoquímica
� 1D SDS-PAGE –Western blotting
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Atividade mitocondrialAtividade mitocondrial
� Potencial de membrana
mitocondrial
� Geração de ATP
� Perda de potencial – causada
pelo excesso de EROs
Atividade mitocondrialAtividade mitocondrial
� 3,3’ diaminobenzidina (DAB)
� Sondas fluorescentes
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DABDAB
DABDAB
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Testes funcionaisTestes funcionais
� Estresse oxidativo
� Integridade de membrana citoplasmática
� Integridade e reatividade do acrossoma
� Atividade mitocondrial
� Condensação da cromatina
� Fragmentação do DNA
� Testes interação espermatozóide x oócito
� Testes ligação zona pelúcida humana
� Teste penetração oócito hamster
Compactação da cromatinaCompactação da cromatina
� Espermiogênese
� Maturação final
� Alongamento das
espermátides
� Histonas – Protaminas
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Compactação da cromatinaCompactação da cromatina
� Humanos
� P1 : P2 → fragmentação de DNA
� Determinação:
◦ 1D SDS-PAGE - Western blotting
Compactação da cromatinaCompactação da cromatina
� Substituição de histona por protamina –estresse torsional
� Topoisomerase II:
◦ Endonuclease
◦ Ligase
� Alteração na função da Topo II:
◦Quebra randômica do DNA
◦ Endogenous nicks
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Testes funcionaisTestes funcionais
� Estresse oxidativo
� Integridade de membrana citoplasmática
� Integridade e reatividade do acrossoma
� Atividade mitocondrial
� Condensação da cromatina
� Fragmentação do DNA
� Testes interação espermatozóide x oócito
� Testes ligação zona pelúcida humana
� Teste penetração oócito hamster
Fragmentação de DNAFragmentação de DNA
� Origem da fragmentação
• Compactação da cromatina
• Apoptose
• Espécies reativas de oxigênio (EROs)
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ConsequênciasConsequências da Fragmentação de DNAda Fragmentação de DNA
� Impacto na fertilidade
• Diminuição de taxa de fertilização?• Diminuição no desenvolvimento embrionário• Diminuição na taxa de gravidez
� Efeito pro-mutagênico
• “as 3 opções do oócito”• Microdeleções no cromossomo Y
MicrodeleçõesMicrodeleções no Cromossomo Yno Cromossomo Y
� 10 a 15% dos homens inférteis
� Ocorrem no braço longo (Yq)
� Azoospermia factor (AZF)
AZFa ���� ausência completa de cel. germinativasAZFb ���� parada de maturaçãoAZFc ���� oligozoospermia grave até azoospermia
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Detecção da Fragmentação de DNADetecção da Fragmentação de DNA
� TUNEL
� Ensaio Cometa
� Laranja de Acridina
� SCSA
Ensaio CometaEnsaio Cometa
� Princípio
• Eletroforese � tamanho de fragmentos
• pH alcalino � > 13.0
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Ensaio CometaEnsaio Cometa
Ensaio CometaEnsaio Cometa
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ENSAIO COMETAENSAIO COMETA
CASACASA
((ComputerComputer AssistedAssisted
SpermSperm AnalysisAnalysis))
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HistóricoHistórico� Lord Rothschild - década de 40 – fotografias –
movimento e velocidade deslocamento
� 1978 – Expert Vision/Cell Track desenvolvido Motion
Analysis Corporation
� 1985 – motilidade – Cell Soft pela Cryo Resources
� 1986 – HTM 2000 pela Hamilton Thorne -análise espermática
� 1992 – HTM IVOS Sperm Analysis – computador +
microscópio – movimentos espermáticos - % móveis e
progressivos – média velocidade
AplicaçõesAplicações
� Experimentais
� Pesquisa diluidores seminais
� Crioprotetores
� Processamento
� Qualidade seminal
� Fertilidade
� Reprodução
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Influência da AnáliseInfluência da Análise
� Experiência do observador – velocidade e alterações
� Identificação da amostra – 1º passo
� Temperatura da Análise – 37˚C
� Efeito da diluição e diluidores
� Efeito do tempo da colheita e sua análise – velocidade (2 horas)
� Efeito da freqüência de aquisição imagens - 30 à 60 imagens/seg
� Métodos de processamento – congelamento, descongelamento,
diluição
Combinação de Hardware e SoftwareCombinação de Hardware e Software
�� Hamilton Thorne IvosHamilton Thorne Ivos
� Hardware: sistema óptico,
iluminação, digitalização, computador
� Software: motilidade, vitabilidade e morfologia
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Parâmetros analisadosParâmetros analisados
� motilidade total
� spm. móveis
� spm.progressivos
� % spm.móveis
� % spm.progressivos
� rápidos, médios, lentos e imóveis
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FuncionamentoFuncionamento
� Visualiza e digitaliza sucessivas imagens
(60 quadros por segundo)
� Processa e analisa imagens
� Fornece informações precisas e relevantes
sobre a cinética e contagem dos spm.
Variáveis Analisadas Variáveis Analisadas MotilidadeMotilidade
� VAP: velocidade média do percurso (µm/s)
� VSL: velocidade retilínea (µm/s)
� VCL: velocidade curvilínea (µm/s)
� ALH: amplitude do deslocamento lateral da
cabeça (µm)
� BCF: freqüência de batimento cruzado (Hz)
� STR: retilinearidade ( VSL/VAP, %)
� LIN: linearidade (VSL/VCL, %)
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IdentIdent
� Corante Hoechst 33342
� Análise da motilidade e concentração sem
interferência de detritos
Corante Hoechst 33342
Análise da motilidade e concentração sem interferência de detritos
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ViadentViadent
� Corante Hoechst 33258
� Análise da motilidade, concentração e
viabilidade
� Contagem:
- Móveis e concentração: iluminação padrão
- Viáveis: iluminação fluorescente
Corante Hoechst 33258
Análise da motilidade, concentração e viabilidade
Contagem: Móveis e concentração: iluminação padrãoViáveis: iluminação fluorescente
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TESTE HEMIZONA(HZA)TESTE HEMIZONA(HZA)
Avalia ligação spm. X ZP
Resultado: índice HZA = % spm ligados