De grassi mitocon_2016_def
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Il sequenziamento esomico
di madre-padre-figlio nella diagnosi genetica
Anna De Grassi-- Dip. Bioscienze, Biotecnologie and Biofarmaceutica,
Università di Bari --
6°Convegno Nazionale Malattie Mitocondriali – Maggio 2016 Roma
IL GENOMA UMANO
Cas Kramer et. al, Leicester University (UK)
- circa 3G caratteri
- 130 volumi
- pagine stampate su entrambi i
lati (43,000 caratteri per pagina)
- Il genoma mitocondriale (16K
caratteri) occupa mezza facciata
Manuale identico per ogni cellula su “come si costruisce e si fa funzionare un essere umano”
E’ stato completato nel 2000 (dopo 10 anni di lavoro) al costo di 3,000M $
LA SEQUENZA NON E’ LA FUNZIONESequenza di 4 differenti caratteri, no spazi, no parole, no frasi
Esoni
(2%)
LA FUNZIONE DEGLI ESONI
DNA/Gene
Proteina
(sequenza di amino acidi)
ESOMA: 70M caratteri che codificano per ~30.000 proteine
Avere la sequenza di TUTTI gli ESONI significa avere la sequenza di TUTTE le PROTEINE
Ogni proteina ha un
ruolo nella cellula
Trascritto
IL SEQUENZIAMENTO ESOMICO
Costo di un esoma singolo a Marzo 2016
(ditta Novogene, 12G, 100X): 600$;
Tempo “crudo” richiesto: 21 giorni lavorativi
Esone
Cattura e
sequenziamento
Genoma
Oggi disponiamo dell’esoma di decine di
migliaia di persone diverse
Ognuno di noi (sano o malato) ha un esoma differente da quello di chiunque
altro (compreso quello di riferimento) per centinaia di migliaia di caratteri
Qual’è il carattere differente
(mutazione) che causa la patologia?
TROVARE le MUTAZIONI PATOLOGICHECome si fa a capire quale mutazione tra 100.000 “differenze” è patologica?
L’analisi del trio familiare serve a ridurre le dimensioni del pagliaio
1) I genitori sono geneticamente molto simili al figlio/a malato/a (meno mutazioni)
2) I genitori sono sani (combinazioni mutazionali presenti anche nei genitori non è
per definizione patologica)
Paziente Madre Padre
- mutazioni già note per essere patologica
- mutazioni non note ma in un gene associato a patologia
- mutazioni non note in geni non associati a patologie (“pagliaio”)
Genetic
diagnosis in
< 9-26%
patients
ESEMPIO
QUATTRO PAZIENTI
Pazienti affetti da sospetta patologia mitocondriale:
1) Patologia neurologica e muscolare
2) Difetti di uno o più complessi della catena respiratoria
3) (ridotta quantità di DNA mitocondriale)
Precedenti analisi del DNA con esito negativo:
1) nel DNA mitocondriale
2) nell’esoma del solo paziente
Istituto Besta, Milano (Valeria Tiranti)
Policlinico Gemelli, Roma (Serenella Servidei)
ANALISI dell’ESOMA DEL TRIO FAMILIARE
100.000
70M caratteri x 100 x 3
300
10.000
<10
+
290
Mutazioni rispetto al genoma di riferimento (100%)
Mutazioni rare nella popolazione umana (10%)
Mutazioni rimanenti dopo il confronto con i genitori (0.3%)
Mutazioni in porzioni cod. proteine e siti di splicing
+
Mutazioni in porzioni non codificanti
IL GENE PATOLOGICO PIU’ PROBABILE
TRIO A
GENE: CRAT - carnitina O-acetil trasferasi mitocondriale (non associato a patologia)
MUTAZIONI: due missenso in eterozigosi composita (non note)
TRIO B
GENE: TSFM – fattore di elongazione traduzionale mitocondriale (associato a patologia)
MUTAZIONI: una de novo sinonima (non nota)
TRIO C
GENE: SLC25A10 – trasportatore mitocondriale (non associato a patologia)
MUTAZIONI: codone di stop prematuro + intronica in eterozigosi composita (non note)
TRIO D
GENE: DNAJB5 – presunta “heat shock protein” (associato a patologia dominante*)
MUTAZIONI: una de novo intronica (non nota)
1) dimostrare che le mutazioni alterano l’attività o quantità della proteina
2) dimostrare che la proteina alterata è la causa della malattia
* Gonzaga-Jauregui et al., 2015, Cell Reports 12, 1169–1183
ESPERIMENTI PRELIMINARI - CRAT -
Acetil-CoA + Carnitina CoA + Acetil-Carnitina
minuti
Cellule controllo (100%) Cellule paziente (100%)
MARKER MITOCONDRI (Citrato sintasi)
CRAT
Cellule controllo (100%) Cellule paziente (10%)
minuti
Asso
rba
nza
minuti
Asso
rba
nza
minuti
carnitina carnitina
ESPERIMENTI PRELIMINARI - SLC25A10 -
β-ATPase
SLC25A10Proteina ridotta(western blot)
Trascritto ridotto o
con struttura alterata
Pzctrl PzctrlM
PCR su libreria cDNA RT-PCR su libreria cDNA
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
ctrl Pz
RINGRAZIAMENTI
- Valeria Tiranti
- Eleonora Lamantea
- Daniele Ghezzi
- Vito Porcelli
- Pasquale Scarcia
- Ciro Leonardo Pierri
- Luigi Palmieri
- Angelo Vozza
- Carlo Marobbio
- Giovanni Parisi
- Giuseppe Punzi
Serenella
Servidei