This work has been digitalized and published in 2013 by Verlag Zeitschrift für Naturforschung in cooperation with the Max Planck Society for the Advancement of Science under a Creative Commons Attribution4.0 International License.

Dieses Werk wurde im Jahr 2013 vom Verlag Zeitschrift für Naturforschungin Zusammenarbeit mit der Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung derWissenschaften e.V. digitalisiert und unter folgender Lizenz veröffentlicht:Creative Commons Namensnennung 4.0 Lizenz.

Das Verhalten von Adenosindiphosphat, Adenosintriphosphat und anorganischem Phosphat in Yoshida-Ascites-Tumorzellen

nach Einwirkung von Röntgenstrahlen V o n H . M A A S S , G . H Ö H N E , H . A . K Ü N K E L u n d G . H . R A T H G E N

A u s d e r U n i v . - F r a u e n k l i n i k H a m b u r g - E p p e n d o r f ( D i r e k t o r : P r o f . D r . G.SCHUBERT) ( Z . N a t u r f o r s c h g . 12 b , 5 5 3 — 5 5 6 [ 1 9 5 7 ] ; e ingegangen am 14. F e b r u a r 1957)

Z u r w e i t e r e n K l ä r u n g d e r in f r ü h e r e n V e r s u c h e n n a c h g e w i e s e n e n s t rah len- induz ier ten G l y k o l y s e -h e m m u n g i n Y o s h i d a - A s c i t e s - S a r k o m z e l l e n w u r d e n d i e s tat ionären K o n z e n t r a t i o n e n an A D P , A T P u n d a n o r g a n i s c h e m P h o s p h a t in d e n g l u c o s e - u m s e t z e n d e n T u m o r z e l l e n nach e iner R ö n t g e n b e s t r a h -lung m i t 2 5 k r b e s t i m m t . E s e r g a b sich daraus e in deut l i ches A n s t e i g e n d e r s ta t i onären A D P - K o n zentrat ion u n d e in A b s i n k e n d e s A T P u n d anorgan is chen P h o s p h a t s in d e n bes t rah l ten Z e l l e n . D i e E r g e b n i s s e z e i g e n , d a ß d i e V e r s c h i e b u n g e n d e r N u c l e o t i d k o n z e n t r a t i o n nicht Ursache , s o n d e r n F o l g e der G l y k o l y s e h e m m u n g s i n d . A u c h d i e A b n a h m e des anorgan is chen P h o s p h a t s ist n icht f ü r d i e ver-minder te G l y k o l y s e l e i s t u n g verantwort l i ch zu machen . V i e l m e h r m a c h e n es d i e B e f u n d e wahrsche in -l ich, d a ß d i e S t r a h l e n w i r k u n g auf d e r S tu fe d e r T r i o s e p h o s p h a t - D e h y d r i e r u n g a n g r e i f t , z u m a l nach J o d a c e t a t - V e r g i f t u n g d e r A s c i t e s - T u m o r z e l l e n g le i chart ige V e r ä n d e r u n g e n d e r Z w i s c h e n s t o f f - K o n z e n -trat ionen zu b e o b a c h t e n w a r e n .

In einer vorangegangenen Mitteilung1 konnte berichtet werden, daß die von uns nachgewiesene Hemmung der anaeroben Glykolyse in Yoshida-Ascites-Sarkomzellen nach einer Röntgenbestrahlung mit 10 und 20 kr2 auf der Blockierung eines Reak-tionsschrittes unterhalb der Triosephosphat-Stufe beruhen muß. In weiteren Versuchen sollte geklärt werden, ob eines der zwischen der Phosphoglycerin-aldehyd- und der Brenztraubensäure-Stufe gelege-nen Fermente durch die Strahleneinwirkung ge-hemmt oder Veränderungen von Coferment-Konzen-trationen für den Umsatz des Triosephosphats limi-tierend werden. Nach den Untersuchungen von A S H W E L L und H I C K M A N 3 ist nämlich für den gestör-ten Abbau des Fructosediphospats in Milzhomo-genaten 3 Tage nach Ganztierbestrahlung eine Ver-minderung des Adenosindiphosphat (ADP)-Gehalts verantwortlich zu machen. Die Ursache hierfür liegt offenbar in einer strahlen-induzierten Aktivierung ADP-spaltender Fermente. Die Röntgenbestrahlung wird also in dem genannten Fall nicht innerhalb der Glykolysekette wirksam, sondern greift in Reaktio-nen ein, über die erst sekundär der Ablauf der Gly-kolyse beeinträchtigt wird.

Zur Klärung dieser Fragen wurden daher Bestim-mungen von Adenosindiphosphat (ADP) , Adenosin-

1 H . M A A S S , G . H Ö H N E , H . A . K Ü N K E L U . G . H . R A T H G E N , K l i n . W s c h r . 3 4 , 1095 [ 1 9 5 6 ] .

2 G . H . R A T H G E N , G . H Ö H N E , H . A . K Ü N K E L U . H . M A A S S , K l i n . W s c h r . 3 4 , 1094 [ 1 9 5 6 ] .

3 G . A S H W E L L U. J . H I C K M A N , J . b i o l . C h e m i s t r y 2 0 1 , 6 5 1 [ 1 9 5 3 ] .

triphosphat (ATP) und anorganischem Orthophos-phat in den stationär glykolysierenden Asciteszellen durchgeführt. Es war zu erwarten, daß die Analyse dieser Verbindungen darüber hinaus eine nähere Lokalisierung des Angriffspunktes der Strahlen-wirkung innerhalb der Glykolysekette erlaubt.

Material und Methodik Präparate

Die im Text benutzten Abkürzungen bedeuten: ATP = Adenosintriphosphat, ADP = Adenosindiphos-phat, DPN = Diphosphopyridinnucleotid, PBTS = Phos-phoenolbrenztraubensäure, BTS = Brenztraubensäure, FDP = Fructose-1.6-diphosphat, 3-PGS = 3-Phosphogly-cerinsäure, PGA = Phosphoglycerinaldehyd, DAP = Di-hydroxyacetonphosphat, 1.3-DiPGS = 1.3-Diphospho-glycerinsäure.

Milchsäure-Dehydrase, a-Glycerophosphat-Dehydrase, Triosephosphat-Dehydrase und Pyruvat-Kinase wurden in kristallisierter Form von der Fa. Boehringer, Mann-heim, bezogen, desgleichen DPN und enzymatisch re-duziertes DPNH. ATP war ein Produkt der Schwarz Laboratories Inc., New York.

Aldolase wurde nach den Angaben von C O R I 4 als Rohkristallisat gewonnen und nach B Ü C H E R 5 weiter ge-reinigt. Phosphoglycerat-Kinase haben wir aus Bäcker-hefe nach der Originalvorschrift von B Ü C H E R 6 isoliert.

Die als Substrat verwendete PBTS wurde als Silber-Barium-Salz, 3-PGS als Bariumsalz und FDP als Di-

4 J . F . T A Y L O R , A . A . G R E E N U . G . T . C O R I , J . b i o l . C h e m i -stry 1 7 3 , 5 9 1 [ 1 9 4 8 ] .

5 G . BEISENHERZ, H . J . BOLTZE, T . B Ü C H E R , R . C Z O K , K . H . G A R -BADE, E . M E Y E R - A H R E N D T U . G . P F L E I D E R E R , Z . N a t u r f o r s c h g . 8 b, 5 5 5 [ 1 9 5 3 ] .

6 T . BÜCHER, B i o c h i m . b i o p h y s i c a A c t a [ A m s t e r d a m ] 1, 2 9 2 [ 1 9 4 7 ] .

bariumsalz von der Fa. Boehringer, Mannheim, ge-liefert.

Die Bariumsalze wurden mit n-HCl in Lösung ge-bracht und das Barium durch Ausfällen mit Ammo-niumsulfat aus der Lösung entfernt. Der Uberstand wurde mit KOH auf PH 7,4 gebracht. Für sämtliche Lösungen wurde nur quarzdestilliertes Wasser ver-wandt.

Das Yoshida-Ascites-Sarkom züchteten wir durch fortlaufende Transplantation auf BD I-Ratten. Die ge-wonnenen Tumorzellen wurden mehrfach gewaschen und mit einer Dosis von 25 kr bei 200 kV, 20 mA und 2 mm Aluminium-Filterung mit einer Dosisleistung von 1050 r/min bei Zimmertemperatur bestrahlt. Die un-bestrahlte Kontrolle unterlag während dieser Zeit den gleichen Bedingungen. Sofort nach der Bestrahlung er-folgte die manometrische Messung der anaeroben Gly-kolyse in der üblichen Weise.

Bestimmung von ADP und ATP

Die Reaktion in den W a r b u r g - Gefäßen wurde nach 20 und 40 Min. durch Perchlorsäure (Endkonzen-tration 5-proz.) unterbrochen, das denaturierte Eiweiß durch Zentrifugieren entfernt und der Überstand mit 2-n. KOH neutralisiert. Die Konzentrationen an ADP und ATP wurden in zwei getrennten Ansätzen be-stimmt. Für die enzymatische Bestimmung dieser bei-den Nucleotide im optischen Test mit DPNH (366 m/u) folgten wir im Prinzip den Angaben von B Ü C H E R und Mitarbb. 7. Neben ADP wurde zunächst BTS, DAP und FDP mit Hilfe kristallisierter Milchsäure-Dehydrase, a-Glycerophosphat-Dehydrase und Aldolase bestimmt. Danach gaben wir 0,1ml PBTS (37 mg/ml), 0,05 ml einer m/2-MgCl2/KCl-Lösung zu, füllten mit m\2-Tri-äthanolamin-HCl-Puffer PH 7,4 auf ein Volumen von 6 ml auf und überführten in eine 40-mm-Küvette. Nach Ablaufen der in der PBTS enthaltenen BTS wurde Pyruvat-Kinase zugesetzt und aus der Extinktionsände-rung die Konzentration an ADP ermittelt.

Für die Analyse des ATP bedienten wir uns der Reaktion des ATP mit 3-PGS in Gegenwart von Phos-phoglycerat-Kinase und Mg++. Die anfallende 1.3-DiPGS wurde mit Triosephosphat-Dehydrase und DPNH zu PGA bei Anwesenheit eines Aldehydfängers umgesetzt. Der Ansatz war im einzelnen folgender:

Testansatz für die ATP-Bestimmung: Trilon pH 7,4 (10-proz.) 0,1 ml, Semicarbacidhydrochlorid molar 0,07 ml, 3-PGS m/5 0,4 ml, MgS04 molar 0,07 ml, Tri-osephosphat-Dehydrase Boehringer 0,04 ml, Phospho-glycerat-Kinase 0,015 ml, KOH 2-n. 0,015 ml, DPNH (50 mg/2,0 ml) 0,02 ml.

Gesamtüberstand mit m/2-Trap pn 7,4 auf 6,0 ml aufgefüllt, d = 40 mm.

Der Test war mit einem Blindgang von AE = 0,001/ min behaftet. Die wahre Extinktionsänderung wurde daher stets durch Extrapolation ermittelt.

Bestimmung von anorganischem Phosphat Da das Phosphat langsam aus den Zellen heraus-

diffundiert, aber keine Gleichverteilung zwischen Zel-len und Medium auftritt, mußten die Bestimmungen in den Zellen erfolgen. Wir waren daher gezwungen, die Reaktion in den W a r b u r g - Gefäßen durch inten-sives Abkühlen in einer Kältemischung zu unterbre-chen. Darafhin wurden die Zellen sofort durch hoch-touriges Zentrifugieren bei 0° C von der Umgebungs-flüssigkeit getrennt und dann erst, in diesem Fall mit Trichloressigsäure, aufgeschlossen. Perchlorsäure-Auf-schluß ist ungeeignet, da eine beträchtliche Menge des anorganischen Phosphats beim Neutralisieren mit KOH in den Kaliumperchlorat-Niederschlag übergeht. Die Bestimmung des anorganischen Phosphats erfolgte ko-lorimetrisch im Prinzip nach der Methode von F I S K E

und S U B B A R O W 8 . Die Messung der Farbintensität wurde im Photometer »Eppendorf" bei 578 m// durchgeführt und der entsprechende Phosphatgehalt einer Eichkurve entnommen. Als Phosphatstandard diente die m/15-KH2P04-Lösung der Fa. Merck.

Ergebnisse

Die Abb. 1 und 2 zeigen die Ergebnisse der Zwi-schenstoff-Bestimmungen 20 bzw. 40 Min. nach Glucosezusatz. Die Werte sind angegeben als /<Mole • 10~4 bezogen auf eine 100 y Stickstoff ent-

m

120

700

S 80

60

to

20

H L

CD unbestraft ••i bestrahlt mit 25 kr

H III fiLC0zl5n

100 yN - V

t BTS DAP FDP ADP ATP anorg.Ph. anaer. Glyk.

Abb . 1. Stationäre Konzentrationen von Glykolyse-Zwischen-stoffen, A D P , A T P und anorg. Phosphat in unbestrahlten und mit 25 kr röntgenbestrahlten Zellen des Yoshida-Ascites-

tumors. 20 Min. nach Glucosezusatz.

haltende Zellmenge. Vergleichsmessungen mit Zell-volumen-Bestimmungen nach dem Hämatokrit-Ver-fahren ergaben, daß 1 mm3 Zellen etwa 25 y N ent-halten. Das Verhalten der Glykolyse-Zwischenstoffe in den bestrahlten Yoshida-Ascites-Sarkomzellen entspricht unseren früheren Befunden, die damit

T . BÜCHER, G . PFLEIDERER tung.

u . K . H . G A R B A D E , i n V o r b e r e i - C . H . FISKE U . Y . S U B B A R O W , J . b i o l . C h e m i s t r y 6 6 , 3 7 5 [1925] ,

auch für kürzere Inkubationszeiten bestätigt werden konnten. Wie oben angedeutet, ist daraus zu schlie-ßen, daß der Angriffspunkt der Strahlenwirkung an einem Reaktionsschritt zwischen der Phosphoglyce-rinaldehyd- und der Brenztraubensäure-Stufe zu

• unbestraft mm bestrahlt mit 25 kr

n ulCOilSmin

1t IOJN

1 n n I BTS DAP FDP ADP ATP anorg.Ph. anaerGlyk.

A b b . 2 . S tat ionäre K o n z e n t r a t i o n e n v o n G l y k o l y s e - Z w i s c h e n -sto f fen , A D P , A T P u n d a n o r g . P h o s p h a t in unbes t rah l t en und mit 25 kr r ö n t g e n b e s t r a h l t e n Z e l l e n des Y o s h i d a - A s c i t e s -

tumors . 4 0 M i n . nach G l u c o s e z u s a t z .

suchen ist. Die Verschiebungen sind mit beginnen-der Normalisierung der Glykolyse weniger stark ausgeprägt, wie die 40 Min. nach Glucosezusatz ge-wonnenen Werte zeigen. In Übereinstimmung mit den Ergebnissen von H O L Z E R 9 an Hefe hat sich in den unbehandelten Zellen für die Glykolyse-Zwi-schenstoffe nach 20 Min. ein relativ stabiler statio-närer Zustand eingestellt. Dasselbe gilt in noch aus-gesprochenerem Maße für die beiden Nucleotide, während das anorganische Phosphat nach 40 Min. beträchtlich angestiegen ist. Vielleicht läßt sich dar-aus schließen, daß trotz ausreichender Energiever-sorgung durch die Glykolyse allmählich dephospho-rylierende Prozesse überwiegen. Die nach Bestrah-lung auftretenden Veränderungen der Nucleotid-Konzentrationen, die durch einen Anstieg des ADP und durch ein Absinken des ATP charakterisiert sind, sprechen eindeutig gegen die Annahme, daß für den Triosephosphat-Durchsatz das ADP verant-wortlich zu machen ist. Sie deuten vielmehr darauf hin, daß die Hemmung oberhalb der Phosphogly-cerat-Kinase oder Pyruvat-Kinase oder an diesen Fermenten selbst angreift. Weiterhin ist aus der Abbildung ersichtlich, daß mit zunehmender Gly-kolyseleistung auch ein Angleichen der Nucleotid-

9 H . HOLZER, 4 . C o l l o q u i u m Ges . P h y s i o l . C h e m . . S p r i n g e r 1 9 5 3 .

Konzentration an die Kontrollwerte stattfindet. Demnach ist anzunehmen, daß die beobachteten Ver-änderungen der ADP- und ATP-Konzentration nicht Ursache, sondern Folge der Glykolysehemmung sind.

Es kommt in den bestrahlten Zellen aber nicht nur zu Verschiebungen der ADP- und ATP-Konzen-trationen, sondern darüber hinaus auch zu einer Abnahme der Summe beider Nucleotide. Diese Tat-sache ist leicht verständlich, weil für die Bildung des ADP in der Myokinase-Reaktion weniger ATP zur Verfügung steht. Wahrscheinlich sind auch andere ATP-abhängige Prozesse gestört, wenn diese An-nahme für die Phosphorylierungs-Schritte der Glu-cose bis zum FDP auch nicht zuzutreffen scheint, wie die starke FDP-Anhäufung zeigt.

Alle bisher erhobenen Befunde sprechen eindeutig für die Blockierung eines Reaktionsschrittes unter-halb des Phosphoglycerinaldehyds, der auf Grund der Nucleotid-Bestimmungen wahrscheinlich die Tri-osephosphat-Dehydrierung selbst betrifft. Die Er-gebnisse der Phosphatbestimmung scheinen diese These zu stützen. Das deutliche Absinken des an-organischen Phosphats läßt nämlich den Gedanken aufkommen, daß für den Triosephosphat-Durchsatz die Phosphatkonzentration limitierend wird. Es müßte aber unabhängig davon geprüft werden, ob nicht durch Hemmung der Triosephosphat-Dehy-drase ähnliche Veränderungen des Phosphatspiegels entstehen können. Wir führten dazu Kontrollver-suche mit Jodessigsäure durch. Die Jodessigsäure-Konzentration richteten wir so ein, daß etwa eine 50-proz. Glykolysehemmung resultierte. In diesem Konzentrationsbereich wird nach den Untersuchun-gen H O L Z E R S 10, die wir auf Grund von Ferment-aktivitäts-Messungen auch für das Yoshida-Ascites-Sarkom bestätigen konntenn, innerhalb der Glyko-lysekette spezifisch die Triosephosphat-Dehydrase gehemmt. Wie die Werte der nächsten Abbildung (Abb. 3) erkennen lassen, kommt es in den jod-acetat-vergifteten Zellen zu Verschiebungen der sta-tionären Zwischenstoff-Konzentrationen, die fast zahlenmäßig mit denen nach strahlen-induzierter Glykolyse-Hemmung übereinstimmen. Auffälliger-weise trifft das auch für das anorganische Phosphat zu, obwohl man bei Hemmung der Triosephosphat-

1 0 H . H O L Z E R , E . H O L Z E R U . G . SCHULTZ, B i o c h e m . Z . 3 2 6 , 3 8 5

[ 1 9 5 5 ] ; H . H O L Z E R , J . H A A N U . S . S C H N E I D E R , 3 2 6 , 4 5 1 [ 1 9 5 5 ] .

11 H . MASS U. G . H . RATHGEN, S t r a h l e n t h e r a p i e , im Druck .

Dehydrase eher einen Anstieg, zumindest aber ein Gleichbleiben der Phosphatkonzentration erwarten würde. Somit ist unsere oben gemachte Annahme, nach der das Orthophosphat für die Depression der Glykolyse nach Röntgenbestrahlung verantwortlich sein soll, in hohem Grade unwahrscheinlich. Ent-sprechend gelang es auch nicht, die strahlen-geschä-digte Glykolyse durch Phosphatzusatz zu beschleu-nigen.

710 1 \

120 »

^ 700 •32 1 i 80

60

to

20

CD Kontrolle Wm nach OES

Glykolyse BTS DAP FDP ADP ATP Ph

A b b . 3. Einwirkung von JES (c = l , 3 • 10 — 5 -m. ) auf die an-aerobe Glykolyse und die stationären Zwischenstoff-Konzen-

trationen im Yoshida-Ascitessarkom.

Das eigentümliche Verhalten des anorganischen Phosphats nach Hemmung der Triosephosphat-Dehydrase ist zunächst schw-er zu deuten. Die An-nahme, daß es nach Strahleneinwirkung und Jod-essigsäure-Vergiftung zu einem vermehrten Austre-ten des Phosphats aus der Zelle infolge von Per-meabilitäts-Anderungen der Zellmembran kommt, hat sich nicht bestätigen lassen. Anorganisches Phos-phat tritt zwar allmählich in das Suspensions-medium über, so daß die Bestimmungen grundsätz-lich in den herauszentrifugierten Zellen durchge-führt wurden; eine Permeabilitäts-Steigerung tritt

nach Röntgenbestrahlung jedoch nicht auf. Kontroll-versuche zeigten nämlich, daß sowohl im Gesamt-ansatz als audi in der Suspensions-Flüssigkeit allein sowie in den Tumorzellen ein verminderter Phos-phatgehalt festzustellen war. Als mögliche Ursache für die Senkung des Phosphatspiegels käme eine Hemmung dephosphorylierender Fermente in Be-tracht. Eine verlangsamte ATP-Spaltung infolge der niedrigen ATP-Konzentration an der Adenosintri-phosphatase ist unwahrscheinlich, weil sich dann der ATP-Spiegel nicht wesentlich verändern dürfte. Audi durch die Mobilisierung des Glykogens, des-sen Spaltung anorganisches Phosphat verbraucht, können die genannten Befunde erklärt werden. Eine Klärung dieser Fragen soll mit Hilfe der Bestim-mung der verschiedenen Phosphatfraktionen ver-sucht werden.

Für die Deutung der strahlen-induzierten Glyko-lysehemmung lassen sich die Ergebnisse, vor allem die Parallelversuche mit Jodessigsäure, dahin-gehend verwerten, daß die Triosephosphat-Dehy-drase an der Entstehung des Glykolyseschadens mit großer Wahrscheinlichkeit wesentlich beteiligt ist. Ahnliche Zwischenstoff-Verschiebungen sind aller-dings auch dann zu erwarten, wenn das DPN auf der Stufe der Triosephosphat-Dehydrierung limitie-rend wird. Die Analyse der stationären DPN-Kon-zentration wird näheren Aufschluß über den Mecha-nismus der strahlen-induzierten Glykolysehemmung in Yoshida-Ascites-Sarkomzellen geben können.

Die Untersuchungen wurden mit Unterstützung der Deutschen F o r s c h u n g s g e m e i n s c h a f t durch-geführt. Herrn Doz. Dr. H O L Z E R vom Physiologisch-Che-mischen Institut der Universität Hamburg danken wir für wertvolle Ratschläge. Frl. H A N N E L O R E K A R U S sind wir für ihre Mitarbeit bei den Versuchen zu großem Dank verpflichtet.