KVALITATIVNO I KVANTITATIVNO ODREĐIVANJE MONOKLONSKOG PROTEINA

U MM I SRODNIM POREMEĆAJIMA – kako koristiti metode i interpretirati nalaze

Danica Matišić

DIJAGNOZA MULTIPLOG MIJELOMA OSNIVA SE NA NALAZU KLASIČNOG TRIJASA:

NALAZU MONOKLONSKOG IMUNOGLOBULINA U SERUMU

I/ILI URINU

INFILTRACIJE KOŠTANE SRŽI PLAZMA STANICAMA (>10%)

OSTEOLITIČKIH ŽARIŠTA

IMUNOKEMIJSKU METODU ZA ODREĐIVANJE RAZREDA I TIPA MONOKLONSKOG IMUNOGLOBULINA, PRVI PUT OPISALI SU GRABAR I WILLIAMS 1953.GOD.

LABORATORIJSKA EVALUACIJA MONOKLONSKOG PROTEINA

Robert A, Kyle, David F. Keren,Raymond Alexanian,Usha Kallemuchikkal

1. Elektroforeza proteina u serumu i urinu:a) nisko rezolutne elektroforezeb) visoko rezolutne elektroforeze

2. Kvantitativno određivanje imunoglobulinaa) Nefelometrijski ili turbidimetrijskib) Radijalna imunodifuzija

3. Definiranje razreda i tipa monoklonskog imunoglobulinaa) Imunofiksacijab) Imunoelektroforeza c) Imunoselekcijad) Imunosupstrakcija: moguća samo uz kapilarnu elektroforezu 4. Kvantitativno određivanje monoklonske komponente a) Denzitometrijski

5. Kontrola kvalitete evaluacije monoklonskog proteinaKljučna komponenta interne kontrole: direktan kontakt biokemičara s kliničarem

o slučaju koji je neuobičajene prirode ili ako postoji bilo koja diskrepansa u nalazu

Vizualni pregled

Bez promjena

Bence Jones protein?

Klinička sumnja iliprisutnost monoklonske

vrpce

Imunofiksacija i/ili imunoelektroforeza

Elektroforeza proteina u mokraći

(100 x ukonc. uzorak)

Definicija M-P(određ. razreda i

tipa)

Negativ. nalaz

Prisutan BJ protein

Denzitometrijska kvantifikacija M-P

Imunofiksacija i/ili imunoelektroforeza

Opisni nalaz + klinička informacija daju

tumačenje nalaza

Elektroforeza serumskih proteina

NACIONALNA GRUPA ZA LIJEČENJEHEMATOLOŠKIH BOLESTI

Pododbor za laboratorijsku hematologiju i morfologijuIMUNOKEMIJA: D. Matišić, V. Preden-Kereković

Elektroforezaserum. prot.

Proteinogram

Imunofiksacija

Imunoelektroforeza

DIJAGNOSTIČKI ALGORITAM ZA DEFINICIJU MONOKLONSKOG PROTEINA (M-P)

1. Elektroforeza proteina u serumu i mokraći indicirana je za svakog bolesnika kod kojeg postoji sumnja na poremećaj plazma stanica.

Nisko rezolucijske elektroforeze:

elektroforeza na acetat-celulozi ili agarozi: razdvaja proteine na pet frakcija. Kod ove tehnike nije moguće

postići dobro razdvajanje β1-(transferin) i β2-globulinske frakcije (C3)

Visoko rezolucijske elektroforeze:

kapilarna zonska elektroforeza omogućuje bolje razdvajanje transferina i C3 u području kao i bolje

uočavanje niskih koncentracija M-proteina koji mogu putovati od 2 do gama područja

Elektroforeza serumskih proteina može se izvesti nisko i visoko rezolucijskim

tehnikama:

NISKO REZOLUCIJSKA ELEKTROFOREZA SERUMSKIH PROTEINA

1.Procjena približne koncentracije glavnih serumskih proteina: alb, alfa-1-AT,Hp,

alfa-2-M, C3, Tf, IgA i IgG

2.Detekcija monoklonskog proteina

3.Osjetljivost detekcije monoklonskog proteina je 2 g/L na acetat-celulozi i 1 g/L na agarozi

VISOKO REZOLUCIJSKA ELEKTROFOREZA SERUMSKIH PROTEINA – KAPILARNA ZONSKA ELEKTROFOREZA

Visoki stupanj rezolucije posljedica je više faktora:

primjena visokih napona (od 3-30 kV)

kontrola temperature

kontrola debljine sloja gela i

sama aplikacija uzorka

+

-

--

Visoko rezolucijski sustavi omogućuju razdvajanje proteina na 10 do 12 frakcija:

prealbumin, albumin, -lipoprotein, α1-kiseli glikoprotein (orozomukoid), α1-antitripsin, α2- makroglobulin, haptoglobin, transferin, -lipoprotein, C3, fibrinogen, CRP (kad je značajno

povišen) i -globulini koje uglavnom predstavlja IgG.

Figure 1. Electropherograms of a sample with an

IgM monoclonal protein.

(A), agarose electrophoresis (Hydragel 15 HR) on the Hydrasys system (Sebia); (B), capillary zone electrophoresis (Paragon 2000; Beckman-Coulter); (C), agarose electrophoresis (Hydragel 15 HR) on the Hydrasys system (Sebia) after mercaptoethanol treatment (10 µL of 1:10 dilution of mercaptoethanol added to 100 µL of serum). The fractions in panels A and C are albumin, 1-antitrypsin, -lipoprotein, 2-macroglobulin and haptoglobin, ß-lipoprotein, transferrin, C3, and the -globulin fraction. The small deflection in the mid-gamma region is an artifact. The arrow indicates the monoclonal protein.

Primjer CZE

Vizualni pregled elektroforeze

Bez promjena Klinička sumnja iliprisutnost monoklonske

vrpce

Imunoelektroforeza i/ili imunofiksacija ili

imunosupstrakcija

Opisni nalaz + klinička informacija daju

tumačenje nalaza

Hp-Hb

HbCRP

anoda + katoda -

Heidelberger-Kendallova krivulja

2.Za definiranje razreda i tipa M-proteina indicirana je imunoelektroforeza i/ili imunofiksacija ili

imunosupstrakcija koja je moguća samo uz kapilarnu zonsku elektroforezu

IMUNOELEKTROFOREZA

IMUNOFIKSACIJA

-iako je nalaz elektroforeze negativan kod suspektnih bolesnika treba naparaviti IF (IgD, IgE))

-imunofiksacija nije indicirana ako se ustvrdi poliklonska hipergamaglobulinemija

Metoda imunosupstrakcije

Elferogram kapilarne elektroforeze bolesnika s monoklonskom

gamapatijom: A: kontrolni elferogram ;

B: elferogram poslije inkubacije uzorka s antitijelom na teški lanac gama

(I gG); C: elferogram nakon inkubacije uzorka s antitijelom

na laki lanac kapa što znači da se radi o M- proteinu: I gG kapa tipa.

Imunoselekcija je imunokemijska tehnika kojom se mogu dokazati

monoklonski sintetizirani teški lanci.

U gelu agara, u koji su prethodno dodani antiserumi na vezane lake lance kapa i lambda tipa, elektroforetski se razdvoje proteini u serumu. Pri tom razdvajanju, dolazi do vezanja kompletnih molekula imunoglobulina, dok eventualno prisutni monoklonski slobodni teški lanci ostaju nevezani.

U slijedećem koraku izvodi se imunokemijska reakcija precipitacije slobodnih teških lanaca sa specifičnim antiserumom na γ (G), α (A) ili μ (M) teške lance.

3. M-protein je potrebno pratiti denzitometrijski ali IF nije potrebno ponavljati ako se nisu

dogodile promjene u migraciji M-proteina ili ako se nije pojavila nova vrpca

1

2 3

1 2 3

2. Nefelometrijski izmjereni Ig:

G = 4,6 g/L

A = 14,9 g/L

M = 0,62 g/L

Denzitometrijski izmjereni

IgA = 19,1 g/L

2. Nefelometrijski izmjereni Ig:

G = 26,3 g/L

A = 0,43 g/l

M = 0,35g/L

Denzitometrijski izmjereni:

IgG = 29,4 g/L

κ=8,16g/L λ=0,57g/L κ/λ=14,3

(κ =1,7-3,7; λ = 0,90-2,10

κ/λ= 1,35-2,65) Alb M-prot.

1

4

4

4. Za sve bolesnike s poremećajem plazma stanica potrebno je nefelometrijsko ili

turbidimetrijsko određivanje Ig da bi se ustvrdila koncentracija ostalih neuključenih Ig

4. Nefelometrijski izmjereni Ig:

G = 22,74 g/L

A = 0,14 g/l

M = 0,10 g/L

Denzitometrijski izmjer. G = 21,4 g/L

Nefelometrijski određeni Ig:

G=3,70 g/L

A=43,4 g/L

M=0,16g/L

Denzitometrijski određen: IgA=36,7g/L

5.Kod bolesnika s multiplim mijelomom, Waldenström

makroglobulinemijom i amiloidozom potrebno je

pratiti

promjene u koncentraciji M-proteina svakih 1-2 mj.;

dok je kod MGNZ dovoljno je: 1 x u godini

G = 16,3 g/L

G = 26,3 g/L G = 12,3 g/L

6. Hiperviskozni sindrom traži zamjenu plazme s indikacijama utemeljenim na

kliničkim značajkama

(viskozitet i elektroforezu seruma treba napraviti prije nego se plazma zamijeni,radi usporedbe

koncentracija M-proteina)

Primjer elektroforeze bolesnika s Waldenström m.

prije (A) i poslije (B) plazmafereze:

A B

7.Krioglobuline treba napraviti u svih bolesnika s M-proteinom koji pokazuju

osjetljivost na hladnoću, posebno kod onih sa M-IgM.

ključna komponenta interne

laboratorijske kontrole je izravan

kontakt biokemičara i kliničara o

slučaju koji je neuobičajene

prirode ili

ako postoji bilo kakav nesklad u

nalazu.

8. Kontrola kvalitete laboratorijske evaluacije

M-proteina:

Monoklonski slobodni lagani lanci

imunoglobulina, Bence-Jones proteini, (BJP), su homogena populacija, kapa (κ) ili lambda (λ) tipa, lakih lanaca imunoglobulina koje stvara maligni

klon B-stanica.

9. Svim bolesnicima s multiplim mijelomom, Waldenström makroglobulinemijom,

amiloidozom i srodnim bolestima potrebno je odrediti prisutnost i dnevno izlučivanje BJP

(IF:najmanje 100 x ukoncentriranog urina)

Bence-Jones protein

Sinteza i metabolizam lakih lanaca

Bence-Jones protein

Prisutan protein BJ

Negativ. nalaz: ako na elektroforetskoj slici 100x ugušćenog urina ne nalazimo

nikakvu suspektnu monoklonsku vrpcu

Elektroforeza proteina u mokraći

(najmanje 100 x ukonc. uzorak)

Preporuka je: koristiti 24 satni urin

Identifikacija BJP imunofiksacijom ili imunoelektroforezom

Elf.prot. u serumu

Elf.prot. u urinu

IE

Serum Free Light Chain Assay in Diagnosis and Monitoring of

Multiple Myeloma

D.E. Smith, A.R. Bradwell, G.P. Mead, H.D. Carr-Smith Article Archives: 2005, Volume 16, Number 1

Introduction

A distinguishing feature of the monoclonal gammopathies is the production of homogeneous populations of immunoglobulins by malignant clones of B-cells. Production of free light chains (FLCs) is an important feature of light chain diseases, such as light-chain myeloma (LCMM), primary systemic (AL) amyloidosis, and light-chain deposition disease (LCDD). However, in a retrospective study of 745 archived samples from patients with plasma cell disorders, 91% had abnormal FLC levels, and 97% had either elevated FLC levels or an abnormal ratio (see Table 1) [1-3]. Among those patients with intact immunoglobulin myeloma, 96% were found to have either elevated FLC levels or an abnormal ratio.

Referentni intervali za slobodne lake lance u serumu:

FREELITE™ Serum Free Light Chain Assays

FREELITE™ Serum Free Light Chain Assays

A: koncentracija lakih lanaca u serumu kod

zdravih ispitanika,bubrežnih

bolesnika i bolesnika sa MMLL kapa

i lambda tipa

A

B

B: koncentracija lakih lanaca u serumu kod

zdravih ispitanika,bolesnika sa NSMM i MMLL kapa i

lambda tipaOsjetljivost SPE

Osjetljivost IF

Kristali Bence-Jones proteina

Razumijevanje strukture kristala BJP moglo bi biti ključno za razvoj selektivne terapije lijekovima.

MicrogravitySpace is the laboratory of

the next millennium

Mikrogravitacijski uvjeti u svemiru su jedinstveni

okoliš za istraživanja koja vode novim produktima i

tehnologijama.STS-80

STS-95