i

DAFTAR ISI

Halaman

SAMPUL DALAM ......................................................................................... i

PRASYARAT GELAR ................................................................................... ii

LEMBAR PENGESAHAN ............................................................................ iii

PENETAPAN PANITIA PENGUJI ............................................................... iv

SURAT PERNYATAAN BEBAS PLAGIAT ................................................ v

UCAPAN TERIMA KASIH ............................................................................ vi

ABSTRAK ...................................................................................................... viii

ABSTRACT ..................................................................................................... ix

DAFTAR ISI ................................................................................................... x

DAFTAR TABEL ........................................................................................... xiii

DAFTAR GAMBAR DAN SKEMA .............................................................. xiv

DAFTAR SINGKATAN ................................................................................ xv

DAFTAR LAMPIRAN .................................................................................... xvi

BAB I PENDAHULUAN ............................................................................... 1

1.1 Latar Belakang ................................................................................. 1

1.2 Rumusan Masalah ............................................................................ 5

1.3 Tujuan Penelitian ............................................................................. 5

1.4 Manfaat Penelitian ........................................................................... 6

BAB II KAJIAN PUSTAKA ........................................................................ 7

2.1 Histologi Tulang .............................................................................. 7

2.2 Penyembuhan Fraktur ...................................................................... 10

2.2.1 Tahap-tahap Penyembuhan Fraktur ....................................... 10

2.2.2 Bone Turnover Marker pada Penyembuhan Fraktur ............. 14

2.2.3 Faktor-faktor yang Mempengaruhi Penyembuhan Fraktur ... 16

ii

2.3 Nutrisi yang Mempengaruhi Penyembuhan Fraktur ........................ 17

2.4 Tanaman Kelabat ............................................................................. 21

2.5 Pengaruh Biji Kelabat terhadap Penyembuhan Fraktur ................... 23

BAB III KERANGKA BERPIKIR, KONSEP, DAN HIPOTESIS ............... 28

3.1 Kerangka Berpikir ........................................................................... 28

3.2 Kerangka Konsep ............................................................................ 31

3.3 Hipotesis Penelitian ......................................................................... 31

BAB IV METODE PENELITIAN ................................................................ 33

4.1 Rancangan Penelitian ....................................................................... 33

4.2 Lokasi dan Waktu Penelitian ........................................................... 35

4.3 Penentuan Sumber Data ................................................................... 36

4.3.1 Populasi .................................................................................. 36

4.3.2 Sampel Penelitian .................................................................. 36

4.3.3 Besar Sampel ......................................................................... 36

4.3.4 Teknik Pengambilan Sampel ................................................. 37

4.3.5 Kriteria Pemilihan Sampel ..................................................... 37

4.4 Variabel Penelitian ........................................................................... 38

4.4.1 Identifikasi Variabel .............................................................. 38

4.4.2 Definisi Operasional Variabel ............................................... 39

4.5 Bahan Penelitian .............................................................................. 41

4.5.1 Hewan Coba .......................................................................... 41

4.5.2 Bahan untuk Perlakuan .......................................................... 41

4.5.3 Bahan untuk Operasi ............................................................. 41

4.6 Instrumen Penelitian ........................................................................ 42

4.7 Prosedur Penelitian .......................................................................... 43

4.7.1 Preparasi Material .................................................................. 43

4.7.2 Pembagian Kelompok Hewan Coba ...................................... 43

iii

4.7.3 Pelaksanaan Perlakuan .......................................................... 43

4.7.4 Pembuatan Preparat Histologi Jaringan Tulang Fraktur

Menggunakan Pewarna Hematoksilin-Eosin (HE)................. 45

4.7.5 Imunohistokimia (IHK) Anti-Mouse Osteocalcin Antibody pada

Fracture Tertutup .................................................................... 46

4.7.6 Imunohistokimia (IHK) Anti-Mouse Colagen Type I Antibody

pada Fracture Tertutup............................................................ 47

4.8 Analisis Data .................................................................................... 49

BAB V HASIL PENELITIAN ........................................................................ 50

5.1 Analisis Sampel ............................................................................... 50

5.1.1 Analisis Deskriptif ................................................................. 50

5.2 Analisis Inferensial .......................................................................... 54

5.2.1 Uji Normalitas dan Homogenitas .......................................... 54

5.2.2 Uji One-Way ANOVA ........................................................... 56

5.2.3 Uji Kruskal-Wallis ................................................................. 63

BAB VI PEMBAHASAN ............................................................................... 65

6.1 Subjek Penelitian ............................................................................. 65

6.2 Pengaruh Ekstrak Kelabat terhadap Diameter Kalus ....................... 66

6.3 Pengaruh Ekstrak Kelabat terhadap Osteocalcin ............................. 68

6.4 Pengaruh Ekstrak Kelabat terhadap Kolagen Tipe I ........................ 69

BAB VII SIMPULAN DAN SARAN ............................................................ 71

7.1 Simpulan .......................................................................................... 71

7.2 Saran ................................................................................................ 71

DAFTAR PUSTAKA ..................................................................................... 72

iv

DAFTAR TABEL

Halaman

5.1 Distribusi frekuensi subjek penelitian masing-masing kelompok ................. 50

5.2 Reratadiameter kalus dan osteocalcin pada masing-masing kelompok

perlakuan dan kontrol .................................................................................... 51

5.3 Persentase ekspresi kolagen tipe I pada masing-masing kelompok perlakuan

dan kontrol ...................................................................................................... 53

5.4 Uji normalitas data variabel-variabel penelitian dengan Shapiro-Wilk ........... 55

5.5 Uji Homogenitas varian data variabel-variabel penelitian dengan Levene’s

Test .................................................................................................................. 56

5.6 Hasil uji komparabilitas data post-test variabel penelitian untuk kelompok

perlakuan dan Kontrol ..................................................................................... 57

5.7 Hasil uji post-hoc LSD antar variabel penelitian untuk kelompok perlakuan

dan Kontrol...................................................................................................... 58

5.8 Hasil uji Kruskal-Wallis data post-test variabel penelitian untuk kelompok

perlakuan dan Kontrol ..................................................................................... 64

v

DAFTAR GAMBAR

Halaman

2.1 Gambaran Histologi Osteoblas dan Osteosit ................................................ 8

2.2 Gambaran Histologi Osteoklas ....................................................................... 9

2.3 Gambaran Histologi Tulang Lamelar.............................................................. 10

2.4 Tahap-tahap Penyembuhan Fraktur ................................................................ 11

2.5 Gambar Kalus.................................................................................................. 12

2.6 Tahap Pembentukan Kalus Pada Tulang Tikus .............................................. 14

2.7 Komponen Sel Pada Setiap Tahap Pembentukan Kalus Pada Tulang Tikus .. 14

2.8 Bagan Bone turn over marker ......................................................................... 16

2.9 Gambar Tanaman Kelabat............................................................................... 21

3.1 Bagan Kerangka Berpikir ................................................................................ 30

3.2 Bagan Kerangka Konsep ................................................................................ 31

4.1 Bagan Post Test Only Control Group Design ................................................. 33

4.2 Bagan Alur Penelitian ..................................................................................... 48

vi

DAFTAR SINGKATAN

ALP : Alkaline Phosphatase

BALP : Bone alkali phospatase

BAP : Bone Alkaline Fosfatase

BMP : Bone Morphogenetic Protein

CTX : C-terminal telopeptid

DPD : Deoxypyridinoline

HYP : Hydroxyproline

IGF-1 : Insulin Growth Factor - 1

IL-1 : Interleukin 1

IL-6 : Interleukin 6

NO : Nitric Oxide

NTX : N-terminal telopeptid

OPG : osteoprotegerin

PAG : Periaqueductual Grey Matter

PDGF : Platelet Derived Growth Factor

PYD : Pyridinoline

RANKL : Receptor activator of nuclear factor NF-kB ligand

TGF-ß1 : Transforming Growth Factor

TRAP : Tantrate-resistant acid phospatase

VEGF- A : Vascular Endothelial Growth Factor - A

vii

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran 1. Surat Keterangan Kelaikan Etik

Lampiran 2. Surat Keterangan Selesai Melakukan Penelitian

Lampiran 3. Surat Keterangan Hasil Pemeriksaan Histopatologis

Lampiran 4. Hasil Pemeriksaan Histopatologis

Lampiran 5. Data Analisis SPSS

Lampiran 6. Foto Dokumentasi Penelitian

viii

ABSTRAK

KESEMBUHAN PATAH TULANG TERTUTUP FEMUR TIKUS PUTIH

YANG DIBERIKAN EKSTRAK BIJI KELABAT (TRIGONELLA

FOENUM-GRAECUM) LEBIH BAIK JIKA DIBANDINGKAN DENGAN

TANPA DIBERIKAN EKSTRAK BIJI KELABAT

Penyembuhan patah tulang dipengaruhi oleh faktor internal dan eksternal.

Faktor internal terdiri dari lokasi, konfigurasi, vaskularisasi, usia pasien, penyakit

yang ada, status hormonal. Faktor eksternal terdiri dari status gizi, obat-obatan

dan olahraga. Pilihan suplementasi herbal yang dapat membantu penyembuhan

patah tulang adalah biji kelabat yang memiliki tiga senyawa aktif, diosgenin,

trigonellin dan 4-hidroksi-L-isoleusin yang dapat menginduksi pembentukan

tulang.

Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengetahui pengaruh pemberian

ekstrak biji kelabat secara oral terhadap diameter kalus, ekspresi osteocalcin dan

ekspresi kolagen tipe I pada penyembuhan fraktur tulang femur tikus putih.

Penelitian ini menggunakan model Post Test-Only Control Group. Tulang femur

tikus putih difrakturisasi kemudian diukur diameter kalus, ekspresi osteocalcin,

dan ekspresi kolagen tipe I antara kelompok dengan dan tanpa pemberian ekstrak

biji kelabat.

Diameter kalus, ekspresi osteocalcin dan kolagen tipe I pada kelompok

perlakuan secara signifikan lebih besar daripada kelompok kontrol dengan nilai p

masing – masing 0.001, 0.000 dan 0.000 (p<0,05). Diameter kalus pada kelompok

pemberian ekstrak kelabat 250 mg selama 14 hari (2307,453 ± 482,287µm) lebih

besar dari yang diberikan selama 28 hari (1870,347 ± 402,799µm), namun

diameter kalus secara signifikan lebih besar pada pemberian ekstrak dengan dosis

250 mg (2307,453 ± 482,287µm) dibandingkan dengan dosis 500 mg (1728,818 ±

182,586µm) dalam waktu 14 hari dengan p = 0,020 (p <0,05). Sedangkan

osteocalcin (23,00 ± 1,224) dan ekspresi kolagen tipe I (ekspresi padat 16.17%)

pada kelompok perlakuan lebih tinggi dengan 500 mg dosis untuk pemberian

selama 28 hari dengan nilai p=0,000 (p <0,05).

Pemberian ekstrak biji kelabat meningkatkan diameter kalus tergantung dosis,

tapi tidak tergantung pada lama waktu pemberian. Ekspresi osteocalcin dan

kolagen tipe I juga lebih tinggi dengan pemberian ekstrak biji kelabat yang dapat

membantu proses penyembuhan patah tulang.

Kata kunci: fraktur, diameter kalus, osteocalcin, kolagen tipe I

ix

ABSTRACT

FRACTURE HEALING OF CLOSED FRACTURE IN WHITE RAT

FEMUR TREATED WITH FENUGREEK SEED EXTRACT IS BETTER

THAN THOSE WITHOUT FENUGREEK EXTRACT

Fracture healing of the bone is affected by internal and external factors.

Internal factors consist of location, configuration, vascularization, patient age,

existing disease, hormonal status. External factors consist of nutritional status,

medication and exercise. Suplementation choices that can help to force the

fracture healing that categorized as herbal are introduced recently. Fenugreek seed

has three active compound diosgenin, trigonellin and 4-hydroxy-L-isoleucine that

can induce bone formation.

The goal of this research are to know the effects of giving fenugreek seed

extract orally to the callus diameter, osteocalcin expression and colagen type I

expression on the bone healling of the femur fracture of the white rat. This is

experimental research using Post Test-Only Control Group Design. White rats

had its femur fracturized and the callus diameter, osteocalcin expression, and

kolagen type I expression measured compared between the group with and

without Fenugreek seed administration.

Callus diameter, osteocalcin and collagen type I expression on treatment

group significantly greater than control group with p value 0,001, 0,000 and 0,000

respectively (p<0,05). The callus diameter on fenugreek extracts 250 mg for 14

days (2307,453 ± 482,287µm) was greater than for 28 days (1870,347 ±

402,799µm), however it shows significant greater diameter with doses 250 mg

(2307,453 ± 482,287µm) than 500 mg (1728,818 ± 182,586µm) in 14 days with

p=0,020 (p<0,05). Whereas the osteocalcin (23,00 ± 1,224) and collagen type I

(severe expression 16.17%) expression in treatment group were higher with in 500

mg dose for 28 day administration with p value 0,000 (p<0,05).

Fenugreek seed administration increase the callus diameter dose

dependently but did not depend on time administration. Osteocalcin and collagen

type I expression also higher with fenugreek administration aiding the fracture

healing proccess.

Keywords : funegreek, fracture, callus, osteocalcin, type 1 collagen

1

BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Berbagai usaha telah dilakukan untuk dapat mempercepat penyembuhan

tulang pada fraktur baik secara farmakologis maupun non farmakologis. Berbagai

suplemen yang terbuat dari bahan kimia maupun herbal dikatakan dapat

mempercepat penyembuhan patah tulang. Suplemen untuk membantu proses

penyembuhan tulang pada fraktur yang beredar dipasaran hampir sebagian besar

terbuat dari bahan kimia. Penggunaan suplemen berbahan dasar kimia dalam waktu

cukup lama dikhawatirkan dapat menimbulkan efek samping terhadap tubuh. Saat

ini pilihan suplemen untuk membantu penyembuhan tulang pada fraktur dengan

bahan dasar herbal sudah mulai diperkenalkan. Bahan ini diyakini dapat

mengurangi resiko efek samping.

Proses penyembuhan tulang pada fraktur dipengaruhi oleh berbagai faktor,

baik faktor internal maupun eksternal. Faktor internal antara lain lokasi fraktur,

konfigurasi fraktur, kondisi vaskularisasi di area fraktur, umur, penyakit penyerta,

serta status hormonal pada pasien tersebut. Faktor eksternal antara lain nutrisi, obat-

obatan, serta exercise. Telah terdapat berbagai penelitian untuk mencari cara untuk

memodifikasi penyembuhan tulang pada suatu fraktur, salah satunya dengan

pemberian nutrisi atau substansi tertentu (Thompson, 2010).

Pada penyembuhan fraktur, terjadi berbagai proses mulai dari fase

hematom, inflamasi, proliferasi dan remodelling. Di setiap fase penyembuhan

2

tersebut terdapat berbagai marker bone turnover penting yang mengalami

perubahan serta secara umum dapat dimodifikasi untuk mendapatkan peningkatan

kecepatan penyembuhan tulang setelah mengalami fraktur (Sousa dkk, 2015). Pada

fase inflamasi, terdapat dominasi mediator inflamasi seperti IL-1, IL-6, TGF-β1,

BMP serta kolagen tipe-III. Sedangkan pada fase proliferasi terjadi pembentukan

kalus dimana terjadi peningkatan aktivitas BMP-2 dan 4 serta pembentukan produk

kolagen tipe-I. Sedangkan pada fase remodelling terjadi pembentukan BMP-1 dan

7 serta produk kolagen tipe-I (Sousa dkk, 2015).

Proses penyembuhan fraktur memerlukan nutrisi lebih banyak daripada

kondisi normal untuk sistem skeletal. Nutrisi yang diperlukan dapat berupa bahan

yang bersifat antioksidant seperti vitamin E, Vitamin C, atau alpha-lipoic acid, serta

beberapa mineral penting dalam bone turn over seperti kalsium, fosfor, atau zinc.

Protein dalam bentuk asam amino juga dibutuhkan untuk pembentukan produk

kolagen tipe-I sebagai bahan matriks tulang (Brown, 2012; Sousa dkk, 2015).

Pemberian suplemen asam amino dapat meningkatkan insulin growth factor-1

(IGF-1) yang mempunyai efek positif terhadap pembentukan kolagen tipe-I sebagai

matriks tulang. Asam amino spesifik yang diperlukan dalam penyembuhan fraktur

adalah lysine, arginine, proline, glycine, cystine dan glutamine. Lysine diketahui

bermanfaat untuk meningkatkan absorpsi kalsium pada matriks tulang serta

membantu regenerasi suatu jaringan yang rusak (Brown, 2012).

Tanaman kelabat (Trigonella foenum-graecum) merupakan salah satu

tanaman rempah yang banyak ditanam di beberapa tempat di benua Eropa, Afrika

Utara, Asia, Argentina, Kanada, Amerika dan Australia. Tanaman ini juga sering

3

dimanfaatkan sebagai obat karena memiliki beberapa efek terapeutik terhadap

beberapa penyakit, antara lain penyakit diabetes mellitus dan hiperkolesterol.

Tanaman tersebut juga dapat mencegah berkembangnya penyakit kanker. Efek

pleitropik tanaman kelabat disebabkan oleh kandungan- kandungan zat tertentu

yang terdapat di biji dan daunnya (Kaur dkk, 2011; Shleel, 2014).

Biji kelabat memiliki kandungan nutrisi yang cukup banyak berupa

karbohidrat, protein dalam bentuk asam amino, lipid, serat, vitamin C serta

sejumlah mineral seperti potassium, kalsium, sodium dan phospor yang cukup

tinggi (Kaur dkk, 2011; Ali dkk, 2012; Shleel, 2014). Pada sistem skeletal, biji

kelabat memiliki tiga bahan aktif utama yaitu diosgenin yang merupakan sapogenin

steroid dalam bentuk glikosida (saponin) sebanyak 0,57 – 0,67%, trigonellin yang

merupakan suatu alkaloid yang bersifat phytoestrogenik sebanyak 0,24 – 0,73%

serta 4-hydroxi-L-isoleucine yang merupakan suatu asam amino sebanyak 0,68 –

1,26% (Folwarczna dkk, 2014). Kandungan ketiga bahan aktif ini rata – rata sama

antara satu sama lain dalam 1% biji fenugreek yang dipulverisasi.

Menurut penelitian oleh Yen (2004), kandungan Diosgenin pada biji kelabat

mempunyai efek angiogenesis melalui induksi Vascular Endothelial Growth

Factor-A (VEGF-A) oleh estrogen receptor pada osteoblas. Penyembuhan fraktur

memerlukan suplai darah yang adekuat sehingga diperlukan perbaikan pada

pembuluh darah yang sebelumnya telah rusak akibat energi penyebab fraktur

ataupun fraktur itu sendiri (Yen, 2006). Pada penelitian yang dilakukan oleh

Alcantera dkk. (2011), diosgenin pada ekstrak batang Wild Yam (Dioscorea

Villossa) dapat meningkatkan bone formation dengan menstimulasi sintesis dan

4

sekresi dari kolagen tipe 1 dan ALP serta bone marker protein Runx2 (Bone-

Spesific Transcription Factor Runt-Related Transcription Factor 2) dan ekspresi

osteopontin (Alcentera dkk, 2011).

Folwarczna dkk. (2014), juga melakukan penelitian terhadap efek biji

kelabat terhadap komponen mekanik tulang pada tikus. Kandungan aktif 4-hydroxi-

L-isoleucine pada biji kelabat dapat meningkatkan komponen mekanis pada tulang

kanselus metaphysis tibia tikus (Folwarczna dkk, 2014). Penelitian lain oleh Al-

Sobayil (2008), didapatkan bahwa pemberian biji tanaman kelabat dapat

menstimulasi pembentukan tulang dan menghambat resorpsi tulang pada

penyembuhan fraktur mandibula pada unta. Pada penelitian tersebut digunakan

biomarker tulang, yaitu pyridinoline (PYD), bone alkaline fosfatase (BAP) serta

osteocalcin untuk mengetahui aktivitas pembentukan tulang dan resorpsi tulang

(Al-Sobayil, 2008).

Berdasarkan beberapa penelitan tersebut diatas, peneliti ingin melakukan

penelitian pada tikus putih karena tikus putih sering digunakan sebagai binatang

percobaan awal sebelum diteruskan pada manusia. Dari uraian latar belakang

masalah tersebut, biji kelabat memiliki beberapa substansi yang dapat membantu

mempercepat penyembuhan fraktur sehingga peneliti ingin mengetahui

kesembuhan patah tulang tertutup femur tikus putih yang diberikan ekstrak biji

kelabat jika dibandingkan dengan tanpa pemberian ekstrak biji kelabat yang dimana

dapat dievaluasi melalui diameter kalus, ekspresi osteocalcin dan ekspresi kolagen

tipe I.

5

1.2 Rumusan Masalah

1. Apakah diameter kalus pada penyembuhan patah tulang tertutup femur tikus

putih lebih tebal dengan pemberian ekstrak biji kelabat per oral jika

dibandingkan dengan tanpa pemberian ekstrak biji kelabat?

2. Apakah ekspresi osteocalcin pada penyembuhan patah tulang tertutup femur

tikus putih lebih tinggi dengan pemberian ekstrak biji kelabat per oral jika

dibandingkan dengan tanpa pemberian ekstrak biji kelabat?

3. Apakah ekspresi kolagen tipe I pada penyembuhan patah tulang tertutup

femur tikus putih lebih padat dengan pemberian ekstrak biji kelabat per oral

jika dibandingkan dengan tanpa pemberian ekstrak biji kelabat?

1.3 Tujuan Penelitian

1. Untuk membuktikan pengaruh pemberian ekstrak biji kelabat per oral

terhadap diameter kalus pada penyembuhan patah tulang tertutup femur

tikus putih.

2. Untuk mebuktikan pengaruh pemberian ekstrak biji kelabat per oral

terhadap ekspresi osteocalcin pada penyembuhan patah tulang tertutup

femur tikus putih.

3. Untuk membuktikan pengaruh pemberian ekstrak biji kelabat per oral

terhadap ekspresi kolagen tipe-I pada penyembuhan patah tulang tertutup

femur tikus putih.

6

1.4 Manfaat Penelitian

Manfaat Teoritis

1. Penelitian ini diharapkan dapat memberikan data mengenai efek

pemberian ekstrak biji kelabat per oral terhadap diameter kalus pada

penyembuhan fraktur.

2. Penelitian ini diharapkan dapat memberikan data mengenai efek

pemberian ekstrak biji kelabat per oral terhadap ekspresi osteocalcin pada

penyembuhan fraktur.

3. Penelitian ini diharapkan dapat memberikan data mengenai efek

pemberian ekstrak biji kelabat per oral terhadap ekspresi kolagen tipe-I

pada penyembuhan fraktur.