Cytogenetika človeka I

zaoberá sa štúdiom chromozómov (ich počtom, zaoberá sa štúdiom chromozómov (ich počtom, morfológiou, segregáciou) za normálnych a morfológiou, segregáciou) za normálnych a patologických podmienok a koreláciou týchto patologických podmienok a koreláciou týchto nálezov s fenotypomnálezov s fenotypom

chromozómy (ako ich vidíme v mikroskope) chromozómy (ako ich vidíme v mikroskope) predstavujú organizáciu DNA , ktorá sa vyskytuje predstavujú organizáciu DNA , ktorá sa vyskytuje len krátko, v určitom štádiu bunkového cyklu (v len krátko, v určitom štádiu bunkového cyklu (v metafáze cyklu M)metafáze cyklu M)

majú dôležitú úlohu pri zabezpečovaní správneho majú dôležitú úlohu pri zabezpečovaní správneho a presného rozdelenia genetického materiálu a presného rozdelenia genetického materiálu (DNA) do dcérskych buniek počas mitotického a (DNA) do dcérskych buniek počas mitotického a meitického delenia buniekmeitického delenia buniek

Bunkový cyklus

Morfológia chromozómov

Chromozómy majú podľa stupňa špiralizácie a Chromozómy majú podľa stupňa špiralizácie a kondenzácie v nich uloženej DNA odlišný kondenzácie v nich uloženej DNA odlišný morfologický vzhľadmorfologický vzhľad

interfáza – dešpiralizované dlhé vlákna, interfáza – dešpiralizované dlhé vlákna, pozorovateľné len elektrónovým mikroskopompozorovateľné len elektrónovým mikroskopom

Morfológia chromozómov – pokr.

metafázametafáza – najvhodnejšia fáza bunkového cyklu – najvhodnejšia fáza bunkového cyklu na sledovanie chromozómovna sledovanie chromozómov– chromozómy sú maximálne špiralizovanéchromozómy sú maximálne špiralizované– skladajú sa z 2 chromatíd vzniknutých skladajú sa z 2 chromatíd vzniknutých

autoreduplikáciouautoreduplikáciou– primárna konstrikcia (zaškrtenie)primárna konstrikcia (zaškrtenie)

• rozdeľuje chromozóm na dve ramenározdeľuje chromozóm na dve ramená• obsahuje centroméruobsahuje centroméru

– sekundárna konstrikciasekundárna konstrikcia• v jej oblasti sa nachádza jadierkový v jej oblasti sa nachádza jadierkový

organizátororganizátor

Morfológia ľudských chromozómov

Triedenie ľudských chromozómov

SkSku-u-pinpinaa

autozóautozó--

mymy

gonozgonozó- myó- my

charakteristika chromozómovcharakteristika chromozómov počet počet mužmuž

počet počet ženažena

AA 1 - 31 - 3 -- veľké viac-menej metacentrickéveľké viac-menej metacentrické 66 66

BB 4 - 54 - 5 -- veľké submetacentrické veľké submetacentrické 44 44

CC 6 - 126 - 12 XX stredne veľké submetacentrickéstredne veľké submetacentrické 1515 1616

DD 13 - 13 - 1515

-- stredne veľké akrocentrickéstredne veľké akrocentrické 66 66

EE 16 - 16 - 1818

-- malé submetacentrickémalé submetacentrické 66 66

FF 19 - 19 - 2020

-- malé metacentrickémalé metacentrické 44 44

GG 21 - 21 - 2222

YY malé akrocentrickémalé akrocentrické 55 44

SpoluSpolu 4646 4646

Morfológia ľudských chromozómov

Usporiadanie DNA v chromozóme

nukleozómový reťazecnukleozómový reťazec – prvá úroveň – prvá úroveň špiralizáciešpiralizácie– nukleozómnukleozóm

• oktamér histónov H2A, H2B, H3 a H4 oktamér histónov H2A, H2B, H3 a H4 • obtočený DNA dĺhej 146 bp (1,75 otáčok)obtočený DNA dĺhej 146 bp (1,75 otáčok)• H1 stabilizuje nukleozómH1 stabilizuje nukleozóm

spacer

Usporiadanie DNA v chromozóme – pokr.

lešenie

Elektrón mikroskopový obraz chromatínu a nukleozómovej reťaze

chromatínové vlákno

nukleozómový reťazec

Elektrón mikroskopový obraz chromozómového lešenia

Elektrón mikroskopový obraz rôznych štádií kondenzácie DNA

Elektrónový mikroskopový obraz chromozómov

Ultraštruktúra chromozómov –pokr.

Podľa intenzity sfarbenia, stupňa kondenzácie a Podľa intenzity sfarbenia, stupňa kondenzácie a intenzity transkripcie sa chromatín delí:intenzity transkripcie sa chromatín delí:

euchromatín euchromatín – dekondenzovaný v interfázedekondenzovaný v interfáze– slabo sa farbiaci bázickými farbivamislabo sa farbiaci bázickými farbivami– DNA je skoro syntetizovaná v S fázeDNA je skoro syntetizovaná v S fáze– geneticky aktívny (obsahuje exprimované gény)geneticky aktívny (obsahuje exprimované gény)

heterochromatínheterochromatín– kondenzovaný aj v interfázekondenzovaný aj v interfáze– silne sa farbiacisilne sa farbiaci– DNA syntetizovaná neskoršie v S fázeDNA syntetizovaná neskoršie v S fáze– geneticky neaktívnygeneticky neaktívny

Ultraštruktúra chromozómov – pokr.heterochromatín sa delí na:heterochromatín sa delí na:

konštitutívny heterochromatínkonštitutívny heterochromatín– pretrváva v kondenzovanom stave počas celého pretrváva v kondenzovanom stave počas celého

bunkového cyklu vo všetkých bunkách a vo bunkového cyklu vo všetkých bunkách a vo všetkých vývinových štádiách organizmuvšetkých vývinových štádiách organizmu

– nachádza sa predovšetkým v centromérach a často nachádza sa predovšetkým v centromérach a často v telomérachv telomérach

– v interfáze vytvára zhluky označnené ako v interfáze vytvára zhluky označnené ako chromocentráchromocentrá

fakultatívny heterochromatínfakultatívny heterochromatín– v niektorých štádiách ontogenézy alebo v niektorých v niektorých štádiách ontogenézy alebo v niektorých

typoch buniek sú euchromatínového char. v iných typoch buniek sú euchromatínového char. v iných heterochromatínovéhoheterochromatínového

– napr. obsahujú gény, aktívne len v určitých štádiách napr. obsahujú gény, aktívne len v určitých štádiách ontogenézy, alebo chromatín jedného X chr. u žienontogenézy, alebo chromatín jedného X chr. u žien

Počet chromozómovpočet, tvar a veľkosť chromozómov sú stále a počet, tvar a veľkosť chromozómov sú stále a druhovo špecifické znakydruhovo špecifické znakypočet chromozómov človekapočet chromozómov človeka: : – 46 (23 párov) – diploidný 46 (23 párov) – diploidný (v somatických (v somatických

bunkách)bunkách)– 23 – haploidný 23 – haploidný (v gamétach)(v gamétach)– bol presne stanovený až v roku 1956 (Tjio a Levan)bol presne stanovený až v roku 1956 (Tjio a Levan)

z toho 22 párov autozómov a 1 pár gonozómov z toho 22 párov autozómov a 1 pár gonozómov (XX/XY)(XX/XY)karyotyp karyotyp – súbor chromozómov v somatickej bunke– súbor chromozómov v somatickej bunke– zápis:zápis: 46,XX – ženský, 46,XY – mužský) 46,XX – ženský, 46,XY – mužský)– označenie označenie karyotypkaryotyp sa používa aj na obraz sa používa aj na obraz

metafázických chromozómovmetafázických chromozómov usporiadaných podľa usporiadaných podľa štandardnej klasifikácieštandardnej klasifikácie

idiogram idiogram – schematické (idealizované) znázornenie – schematické (idealizované) znázornenie karyotypukaryotypu

Normálny karyotyp muža

Normálny karyotyp ženy

Idiogram

Počet chromozómov – pokr.

počet chromozómov nie je v žiadnom vzťahu s počet chromozómov nie je v žiadnom vzťahu s komplexnosťou organizmu alebo fylogenetickým komplexnosťou organizmu alebo fylogenetickým postavením druhupostavením druhu

kvasinkakvasinka 3232

drozofiladrozofila 88

mucha domácamucha domáca 1212

škorpiónškorpión 44

moľmoľ 224224

kurčakurča 7878

myšmyš 4040

gibongibon 4444

šimpanzšimpanz 4848

človekčlovek 4646

Chromozómová analýza

Najvhodnejším štádiom chr. a. je metafáza resp. Najvhodnejším štádiom chr. a. je metafáza resp. prometafázaprometafázazískať dostatočný počet metafazických buniek je získať dostatočný počet metafazických buniek je možné len kultiváciou v možné len kultiváciou v tkanivových kultúrachtkanivových kultúrach– najčastejšie používané bunkynajčastejšie používané bunky – – leukocyty, leukocyty,

fibroblasty, kostná dreň, bunky plodovej vodyfibroblasty, kostná dreň, bunky plodovej vodyfytohemaglutinín – fytohemaglutinín – stimuluje bunkové deleniestimuluje bunkové deleniekolchicín – kolchicín – zablokuje mitózu v metafáze (inhibuje zablokuje mitózu v metafáze (inhibuje deliace vretienko)deliace vretienko)hypotonizáciahypotonizácia – zabezpečí vhodné prietorové – zabezpečí vhodné prietorové rozloženierozloženiefixácia fixácia na podložnom sklíčkuna podložnom sklíčkufarbenie farbenie – sú známe rôzne techniky, umožňujúce – sú známe rôzne techniky, umožňujúce individuálnu identifikáciu jednotlivých chromozómov s individuálnu identifikáciu jednotlivých chromozómov s rôznou rozlišovacou schopnosťourôznou rozlišovacou schopnosťou

Schéma cytogenetickej analýzy

Mikroskopický pohľad na metafazické chromozómy

Konvenčné farbenie chromozómov

C-prúžky

G-prúžkovanie(R-prúžkovanie, opačný obraz)

SCE – výmena seterských chromatíd

FISH – fluorescenčná in situ hybridizáciakombinácia klasickej a molekulárnej cytogenetikykombinácia klasickej a molekulárnej cytogenetiky

Dôkaz translokácie pomocou FISH

Multifarebná FISH

Komparatívna genómová hybridizácia - CGH

Komparatívna genómová hybridizácia - CGH

Prietoková cytometria (flow cytometry)

umožňuje rýchle a presné meranie množstva DNAumožňuje rýchle a presné meranie množstva DNA

Analýza interfázových chromozómov

X-chromatín X-chromatín (Barrovo teliesko)(Barrovo teliesko)

Y-chromatín

FISH na interfázovom jadre

chromozóm č.13

chromozóm č. 21

Chromozómová determinácia pohlavia

22 párov autozómov22 párov autozómov

1 pár gonozómov (pohlavných chromozómov)1 pár gonozómov (pohlavných chromozómov)

chromozómové pohlavie typu chromozómové pohlavie typu „drozofila“„drozofila“– homogametické pohlaviehomogametické pohlavie (46,XX) – (46,XX) – ženskéženské– heterogametické pohlavie (46,XY)heterogametické pohlavie (46,XY) – mužské – mužské

chromozómové pohlavie jedinca je určené v momente chromozómové pohlavie jedinca je určené v momente oplodnenia (k fenotypovému pohlaviu ale vedie ešte oplodnenia (k fenotypovému pohlaviu ale vedie ešte dlhá cesta)dlhá cesta)– všetky vajíčka môžu mať iba X chromozómvšetky vajíčka môžu mať iba X chromozóm– spermie môžu mať X rep. Y chromozóm (pomer 1 : spermie môžu mať X rep. Y chromozóm (pomer 1 :

1)1)– teoretický pomer počatí jedinca ženského alebo teoretický pomer počatí jedinca ženského alebo

mužského pohlavia je mužského pohlavia je 1 : 1, 1 : 1, pri narodení to je 1 : pri narodení to je 1 : 1,061,06

Chromozómová determinácia pohlavia - pokr.

Pohlavné chromozómy a diferenciácia pohlavnej sústavy

rozhodujúce je rozhodujúce je prítomnosť Yprítomnosť Y a a nie počet X nie počet X chromozómuchromozómuTDF TDF ((TTestes estes DDetermining etermining FFactor) actor) na Y chr. spúšťa na Y chr. spúšťa premenu indiferentných embryonálnych gonád na premenu indiferentných embryonálnych gonád na semenníkysemenníkyv neprítomnosti TDF vývin pokračuje smerom ženských v neprítomnosti TDF vývin pokračuje smerom ženských vnútorných pohlavných orgánovvnútorných pohlavných orgánovsekundárne pohlavné znaky sú pod kontrolou sekundárne pohlavné znaky sú pod kontrolou hormónov vnútorných pohlavných orgánovhormónov vnútorných pohlavných orgánov– ženský fenotyp – 45,X0, 47,XXX, ženský fenotyp – 45,X0, 47,XXX, – mužský fenotyp – 47,XXY, 48,XXXY, 47,XYY ...mužský fenotyp – 47,XXY, 48,XXXY, 47,XYY ...

chromozómové pohlavie sa nemusí zhodovať s chromozómové pohlavie sa nemusí zhodovať s fenotypovým pohlavím (mutácie v génoch zapojených fenotypovým pohlavím (mutácie v génoch zapojených do diferenciácie pohlavia)do diferenciácie pohlavia)

„Kompenzácia dávky“ (hypotéza Lyonovej)

X chr. je nosičom génov ako hociktorý autozómX chr. je nosičom génov ako hociktorý autozóm

Y chr. obsahuje veľmi málo génov a sú odlišné od génov Y chr. obsahuje veľmi málo génov a sú odlišné od génov na X (okrem pseudoautozomálnej oblast na konci na X (okrem pseudoautozomálnej oblast na konci krátkych ramien)krátkych ramien)

ženy majú dvojnásobné množstvo X-viazaných génov ženy majú dvojnásobné množstvo X-viazaných génov dvojnásobná dávka produktov – dvojnásobná dávka produktov – v skutočnosti v skutočnosti

neplatíneplatí

Hypotéza Lyonovej – Hypotéza Lyonovej – kompenzácia dávky inaktiváciou kompenzácia dávky inaktiváciou jedného z dvoch X chr. u ženyjedného z dvoch X chr. u ženy

uskutočňuje sa vo včasnom štádiu blastogenézy (okolo uskutočňuje sa vo včasnom štádiu blastogenézy (okolo 12. dňa12. dňa

je náhodná (v niektorých bunkách sa inaktivuje X je náhodná (v niektorých bunkách sa inaktivuje X maternálneho v iných paternálneho pôvodu)maternálneho v iných paternálneho pôvodu)

ale je fixovaná vo všetkých následných generáciách ale je fixovaná vo všetkých následných generáciách buniek danej líniebuniek danej línie

Hypotéza Lyonovej – pokr.

ženský organizmus predstavuje mozaikuženský organizmus predstavuje mozaiku

inaktívny X chr. v interfáze tvorí inaktívny X chr. v interfáze tvorí X-chromatín X-chromatín (Barrovo (Barrovo teliesko)teliesko)– počet Barrových teliesok sa rovná počtu X chr. počet Barrových teliesok sa rovná počtu X chr.

mínus 1mínus 1

45,XO = 45,XO = OO, 46XY = , 46XY = 00, 46,XX = , 46,XX = 11, 47,XXX = , 47,XXX = 22, 47,XXY , 47,XXY = = 11

replikácia DNA v ňom prebieha neskôrreplikácia DNA v ňom prebieha neskôr

je geneticky takmer inertný (niektoré gény ale sú je geneticky takmer inertný (niektoré gény ale sú exprimované)exprimované)

inaktivácia nie je úplnáinaktivácia nie je úplná– osoby s odchýlkou od normálneho počtu X chr. osoby s odchýlkou od normálneho počtu X chr.

klinicky nie sú úplne zdravéklinicky nie sú úplne zdravé• napr. 45,X0 – Turnerov syndrómnapr. 45,X0 – Turnerov syndróm• 47,XXY – Klinefelterov syndróm, a pod.47,XXY – Klinefelterov syndróm, a pod.

Prejav X chr. mozaicizmu Čierne a oranžové škvrny sú zapríčinené rozdielnými alelami v tom istom lokuse na X chr. Kaliko mačka je heterozygotná pre tieto alely a je vždy samička.

Evolúcia chromozómov

DefinícieDefinícieortológia ortológia – homologické chromozómy/úseky u rôznych – homologické chromozómy/úseky u rôznych druhovdruhovparalógia paralógia - homologické úseky/gény v rámci druhu na - homologické úseky/gény v rámci druhu na rôznych chromozómových lokalizáciáchrôznych chromozómových lokalizáciáchsynténia synténia – lokusy na tom istom chromozóme (nemusia – lokusy na tom istom chromozóme (nemusia byť vo väzbe, keď sú dostatočne ďaleko od seba)byť vo väzbe, keď sú dostatočne ďaleko od seba)

Typy chromozómových zmien v evolúcii Typy chromozómových zmien v evolúcii frekventné prestavby veľkého rozsahu, aj medzi príbuznými frekventné prestavby veľkého rozsahu, aj medzi príbuznými

druhmidruhmiduplikácie genómuduplikácie genómuinverzieinverzietranslokácie/fúzietranslokácie/fúzie

Duplikácia genómu (tetraploidizácia)

• Duplikácia genómu vedie k prechodnej tetraploidii, pokiaľ sa chromozómovou divergenciou neobnoví diploidia

• V línii vedúcej k stavovcom genómová duplikácia sa vyskytla pravdepodobne dvakrát

Paralogické segmenty na chr. 12 a 17

Paralogické segmenty chr. 12 a 17 sú asi pozostatkom dávnej genómovej duplikácie

Evolúcia chromozómov – pokr.čím vzdialenejšie druhy, tým nižší rozsah konzervácie synténiečím vzdialenejšie druhy, tým nižší rozsah konzervácie synténie

– medzi človekom a myšou je to okolo 10 Mb (výnimku tvorí X medzi človekom a myšou je to okolo 10 Mb (výnimku tvorí X chr., väčšina ľudských sekvencií má ortologické sekvencie na X chr., väčšina ľudských sekvencií má ortologické sekvencie na X chr. myší)chr. myší)

Rozdiely medzi príbuznými druhmi

čínsky muntjac – 46 chr. indický muntjac – samec 7 chr., samička 6 chr.

Porovnávacia cytogenetika primátovvýrazná podobnosť v štruktúre morfológii a vo vzoroch výrazná podobnosť v štruktúre morfológii a vo vzoroch prúžkov chromozómov medzi človekom a vyššími prúžkov chromozómov medzi človekom a vyššími primátmi (šimpanz, gorila, orangutan)primátmi (šimpanz, gorila, orangutan)počet chromozómovpočet chromozómov– primáti: primáti: 24 párov24 párov– človek: človek: 23 párov23 párov

• chr. č. 2 u človeka – výsledok fúzie 2 chr. č. 2 u človeka – výsledok fúzie 2 akrocentrických chrom. u šimpanzaakrocentrických chrom. u šimpanza

• dôkaz: repetitívne telomerické sekvencie a ich dôkaz: repetitívne telomerické sekvencie a ich orientácia u človeka, pozostatky 2 centromér chr. orientácia u človeka, pozostatky 2 centromér chr. š.š.

identický prúžkový profil u všetkých 4 druhov na chr. 6, identický prúžkový profil u všetkých 4 druhov na chr. 6, 13, 19, 21, 22 a X13, 19, 21, 22 a Xveľká podobnosť chr. 3, 11, 14, 15, 18, 20 a Y u človeka, veľká podobnosť chr. 3, 11, 14, 15, 18, 20 a Y u človeka, šimpanza a gorilyšimpanza a gorilyúsek cca 100kb u čl. a š. translokovaný z chr. 1 na Y (u úsek cca 100kb u čl. a š. translokovaný z chr. 1 na Y (u gor. a oran. to nie je)gor. a oran. to nie je)väčšina rozdielov sú typu inverzií, ale vyskytujú sa aj väčšina rozdielov sú typu inverzií, ale vyskytujú sa aj translokácietranslokácie

Chromozómy u primátov

Vznik chr. 2 u človeka fúziou 2 akrocentrických chr. šimpanza

H – človek

C – šimpanz

G – gorila

O - orangutan

Chromozómy u primátov

Pericentrická inverzia chr. 5 u šimpanza

Chromozómy u primátov

Extrémna podobnosť chr. 6 u všetkých 4 druhov, rozdiel len v prítomnosti telomer. heterochromatínu na 6p u šimpanza a na obidvoch koncoch chr. 6 u gorily