Curso teórico-práctico de HPLC y UHPLC generales Utilizar disolventes de alta pureza. Filtrar...
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Curso teórico-práctico de HPLC y UHPLC Agilent, WTC- Barcelona Sergio Catalá Agilent Technologies Agilent FSE LC-MS
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Curso teórico-práctico de HPLC y UHPLC
Agilent, WTC-
BarcelonaSergio Catalá
Agilent Technologies
Agilent FSE LC-MS
Agilent, WTC-BarcelonaSergio Catalá
Agilent Technologies
Agilent FSE LC-MS
Objetivos:
• Introducción parámetros Test
Idoneidad (”System Suitability”).
• Buenas Prácticas para evitar
problemas en U/HPLC.
Idea / Recomendación práctica.
TS “Troubleshooting”
Introducción y Consideraciones Prácticas en
HPLC/UHPLC
Introducción: el Objetivo de la Cromatografia
Conseguir separar todos los componentes de la muestra con la mínima
dispersión de la banda cromatográfica, para conseguir la máxima eficacia
y capacidad de separación de picos cromatográficos.
DetectorInyector
Columna
Recomendaciones generales
Utilizar disolventes de alta pureza.
Filtrar fases móviles y muestras a través
de filtros de 0,22µm.
Considerar la miscibilidad, la solubilidad y
el pH (2.3-9.5) de las fases móviles.
Realizar una etapa de lavado entre
muestra y muestra.
Después de un análisis realizar una etapa
de lavado de columna y otra de lavado de
instrumento.
Tareas Diarias (Antes de empezar)
1100/1200/1260 Series:
· Cambiar las fases móviles.
· Revisar la cantidad de solución de lavado de sellos y de
lavado de aguja (si están instaladas).
· Purgar todos los canales del sistema a un flujo de 5ml/min
durante 15 min.
· Instalar la columna y acondicionar todo el sistema durante
15-20 min.
· Encender la lámpara.
Pág.:
Tareas Diarias (Antes de empezar) 1290:
· Opción Prime: Ésta opción realiza durante un tiempo estipulado la inyección
de un cierto volumen de fase móvil a una elevada velocidad por todos los canales
del equipo.
· Opción Purge: La opción de purga en éstos instrumentos es automática; no
hay que abrir ninguna válvula, se puede escoger el volumen del flujo y el tiempo
que se quiere realizar.
·Opción Conditioning: Permite eliminar microburbujas de aire que hayan
podido quedar y acondiciona el sistema en las condiciones iniciales que se desee.
Pág.:
Parámetros a monitorizar durante el análisis:
· Presión.
· Rizado de la Presión (Ripple).
· Ruido de la linia de base.
· Tiempos de retención.
· Área/altura y forma de los picos.
Vista frontal y esquema sistema HPLC 1200
Pág.:
Código de Colores Agilent.
Color I.D.
Red 0.12 mm (0.005 inches)
Green 0.17 mm (0.007 inches)
Blue 0.25 mm (0.01 inches)
Orange 0.50 mm (0.02 inches)
1220 Infinity 1260 Infinity 1290 Infinity
Agilent, WTC-BarcelonaSergio Catalá
Agilent Technologies
Agilent FSE LC-MS
Estrategia para la resolución de problemas en HPLC
Problemas más comunes en HPLC:
·Presión
- Sobrepresión.
- Fuga.
- Fluctuaciones de presión.
· Reproducibilidad
- Tiempos de retención.
- Área.
· Linearidad.
· Ruido en la línea de base.
· Sensibilidad.
· Picos.
- Forma no Gaussiana.
- Desdoblamiento.
- Picos fantasma.
Pregunta: ¿ El problema es del método (columna, disolvente…)
o del instrumento?
·
Pág.:
Resolución de problemas:
Instrumento o método
· Sobrepresión
· Reproducibilidad
· Sensibilidad
· Picos
· Ruido línia de base
Método
· Picos fantasma
Instrumento
· Fuga.
· Fluctuaciones.
Resolución de problemas Agilent
1100/1200 HPLC
Problemas más comunes en HPLC:
·Presión
- Sobrepresión.- Fuga.
- Fluctuaciones de presión.
· Reproducibilidad
- Tiempos de retención.
- Área.
· Linearidad.
· Ruido en la línea de base.
· Sensibilidad.
· Picos.
- Forma no Gaussiana.
- Desdoblamiento.
- Picos fantasma.
Sobrepresión:
.
Causas:
· Columna contaminada.
· Frita válvula de purga contaminada.
· Atasco en el mezclador.
· Atasco en la válvula de inyección.
· Atasco en el asiento.
· Atasco en la aguja.
· Atasco en el horno de columnas.
· Atasco en la celda de flujo.
Problemas más comunes en HPLC:
·Presión
- Sobrepresión.
- Fuga.
- Fluctuaciones de presión.
· Reproducibilidad
- Tiempos de retención.
- Área.
· Linearidad.
· Ruido en la línea de base.
· Sensibilidad.
· Picos.
- Forma no Gaussiana.
- Desdoblamiento.
- Picos fantasma.
Fuga
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· Revisar todas las conexiones.
· Fuga en los cabezales de la bomba.
· Fuga en la válvula de inyección.
· Fuga en la válvula de entrada.
· Fuga en la válvula de purga.
· Fuga en la válvula de salida.
Problemas más comunes en HPLC:
·Presión
- Sobrepresión.
- Fuga.
- Fluctuaciones de presión.
· Reproducibilidad
- Tiempos de retención.
- Área.
· Linearidad.
· Ruido en la línea de base.
· Sensibilidad.
· Picos.
- Forma no Gaussiana.
- Desdoblamiento.
- Picos fantasma.
Fluctuaciones de presión:
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Posibles causas:
· Aire en el sistema.
· Válvula de entrada defectuosa.
· Filtros obturados.
· Válvula de salida defectuosa.
· Desgasificador defectuoso.
Pressure Ripple ≤ 1 %
Problemas más comunes en HPLC:
·Presión
- Sobrepresión.
- Fuga.
- Fluctuaciones de presión.
· Reproducibilidad
- Tiempos de retención.
- Área.
· Linearidad.
· Ruido en la línea de base.
· Sensibilidad.
· Picos.
- Forma no Gaussiana.
- Desdoblamiento.
- Picos fantasma.
Reproducibilidad en tiempos de retención:
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Causas:
· Bomba
· Válvula de entradadefectuosa.
· Columna
· Fluctuaciones de temperatura.
· Columna defectuosa.
Problemas más comunes en HPLC:
·Presión
- Sobrepresión.
- Fuga.
- Fluctuaciones de presión.
· Reproducibilidad
- Tiempos de retención.
- Área.
· Linearidad.
· Ruido en la línea de base.
· Sensibilidad.
· Picos.
- Forma no Gaussiana.
- Desdoblamiento.
- Picos fantasma.
Reproducibilidad en altura y/o área de pico:
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Rotor
seal.
Metering device
seal.
Pump.
Column.
· Aguja defectuosa.
· Asiento defectuoso.
· Rotor Seal defectuoso.
Problemas más comunes en HPLC:
·Presión
- Sobrepresión.
- Fuga.
- Fluctuaciones de presión.
· Reproducibilidad
- Tiempos de retención.
- Área.
· Linearidad.
· Ruido en la línea de base.
· Sensibilidad.
· Picos.
- Forma no Gaussiana.
- Desdoblamiento.
- Picos fantasma.
Linearidad
Área de los picos no es
linear.
Inyector:
• Rotor seal.
• Aguja parcialmente obturada.
Detector:
• Saturación.
Meteing device
seal.
Problemas más comunes en HPLC:
·Presión
- Sobrepresión.
- Fuga.
- Fluctuaciones de presión.
· Reproducibilidad
- Tiempos de retención.
- Área.
· Linearidad.
· Ruido en la línea de base.
· Sensibilidad.
· Picos.
- Forma no Gaussiana.
- Desdoblamiento.
- Picos fantasma.
Ruido en la línia de base:
Noise. Time
.
mAU
Signal
height.
Causas:
· Aire en el sistema
· Desgasificador defectuoso.
· Pulsos de la bomba.
·Fase móvil en mal estado.
· Celda de flujo sucia.
Bomba/desgasificador
Parar flujo
¿Ruido?
yes no
Detector
Ruido en línea de
base
Problemas más comunes en HPLC:
·Presión
- Sobrepresión.
- Fuga.
- Fluctuaciones de presión.
· Reproducibilidad
- Tiempos de retención.
- Área.
· Linearidad.
· Ruido en la línea de base.
· Sensibilidad.
· Picos.
- Forma no Gaussiana.
- Desdoblamiento.
- Picos fantasma.
Sensibilidad
Respuesta del detector es
pequeña.
• Insuficiente cantidad de
muestra inyectada.
• Detector:
• Lámpara agotada.
• Celda de flujo sucia.
• Absorción disolvente
elevada.
Problemas más comunes en HPLC:
·Presión
- Sobrepresión.
- Fuga.
- Fluctuaciones de presión.
· Reproducibilidad
- Tiempos de retención.
- Área.
· Linearidad.
· Ruido en la línea de base.
· Sensibilidad.
· Picos.
- Forma no Gaussiana.
- Desdoblamiento.
- Picos fantasma.
Desdoblamiento de picos:
Pág.:
Coelución de compuestos debido
a que la fase estacionaria de la
columna no está bien
acondicionada y/o está
desgastada. Los compuestos no
interaccionan bien y no se pueden
separar.
Ensanchamiento de picos:
Pág.:
Initial
(SilGel Silica;Single Endcap)
Time, min.
0 2 4 6 8 10 12 14
Dete
cto
r R
esponse
COLUMN A
After 1826Column Volumes
1. URACIL2. NORTRIPTYLINE3. DOXEPIN4. AMITRIPTYLINE5. TRIMIPRAMINE
1
2 3
4
5 COLUMN A Todos los picos anchos
· Perdida de la eficiencia de la
fase estacionaria de la columna
· Volumen de inyección elevado.
· Elevada viscosidad de la fase
móvil.
Ensanchamiento de un solo pico:
· Elución tardía de un compuesto.
· compuesto de elevado peso
molecular (proteína o polímero)
Colas de pico:
Pág.:
Normal. Tailing.
2000
1500
1000
500
0
0 5 10 15 20 25
Time (min)
·
· Interacciones residuales de la fase
estacionaria con alguno de los compuestos.
· Compuesto coeluyendo junto con otro.
· Pérdida de eficacia de la fase estacionaria.
· Contaminación de la pre-columna.
· Volumen de inyección elevado.
Picos negativos
Pág.:
Normal. Negative.
Causas:
• La absorbancia de la muestra es inferior a la de la
fase móvil.
• Más común en RID..
• En DAD, la absorción de la referencia es superior a la
absorción de la muestra.
20% to 100% MeOH Gradient.
No Sample Injected.
Picos fantasma – Picos que aparecen al inyectar un
blanco.
Problema – Fase móvil.60
15
30
15
03 7 15 17
Picos Fantasma
Resumen resolución de problemas
• Excluir errores del método.
• Localizar el problema en el instrumento.
• Realizar la reparación.
• Realizar los tests de comprobación.
• Verificar que el problema se ha resuelto.
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Agilent, WTC-Barcelona
Sergio Catalá
Agilent Technologies
Agilent FSE LC-MS
Mantenimiento HPLC
Áreas de Mantenimiento de un Sistema
HPLC 1200
Maintenance Overview
Solvent inlet Pump Autosampler Detector
Limpiar los filtros. PTFE frita.
Sellos.
Sello de oro
(OBV)
Cambiar
sellos si la
opción de
lavado de
sellos está
instalada.
Limpiar:
Pistones.
.
Aguja.
Asiento.
Rotor seal.
Lámpara.
Limpiar celda de
flujo
Tests.
Column
Compartment
Cambiar el sello
del rotor si la
válvula de
selección de
columnas está
instalada.
Tests a Realizar en un sistema HPLC 1200
Bomba Inyector Detector
Test de
presión.
Test de fugas.
Inyección de un
standard.
Horno de
Columnas
Test del horno. Test de intensidad.
Test de ruido de fondo
Test Holmio..
Bomba binária
Cabezales de la bomba
Válvula de selección de disolventes (Opcional).
Mantenimiento:
Sellos,
Válvula de entrada
Válvula de salida,
Válvula de purga,
Pistones.
Cabezal de la bomba
Plunger housing.
Pump head.
Outlet ball valve.
Active inlet valve.
Purge valve.
Pist
ons.
Active
inlet
valve.
Se
als
.Support
rings.
Purge
valve.Outlet
ball
valve.
Lock
screw.
Cabezales con lavado de sellos
Seal
support
ring.
Gaske
t.
Wash Seal.
Gasket.
Wash seals.
Seal support ring.
Seal keeper.Tubing.
Peristaltic Pump.
Válvula de purga
PTFE frit.
Gold Seal.
Plastic cap.
1. Separar la válvula de purga del
cabezal.
2. Sacar el sello de oro.
3. Sacar la frita antigua.
1. Instalar la nueva frita.
2. Instalar el sello de oro nuevo.
3. Reinstalar la válvula de purga.
Limpiar o intercambiar la válvula de salida
Valve housing.
Gold Seal.
Plastic cap.
1. Desconectar el capilar de la válvular
de salida.
2. Desconectar la válvula de salida del
cabezal.
3. Sacar el sello de oro.
a. En las bombas binarias, cambiar el
filtro.
• Sonicar la válvula durante 15 min.
• Cambiar el sello de oro.
• Reinstalar la válvula de salida.
Binary pump OBV.
Válvula de entrada
Cartridge.
1. Desenchufar el cable de la válvula.
2. Separar la válvula del cabezal.
3. Cambiar el cartucho.
4. Instalar la válvula en el cabezal.
6. Conectar el cable.
Cabezal de la bomba
1. Desconectar todos los
capilares.
2. Desenchufar el cable
de la válvula de
entrada.
3. Sacar los dos tornillos.
4. Extraer el cabezal del
modulo..
4 mm screw.
4 mm screw.
Pist
ons.
Active
inlet
valve.
Se
als
.Suppor
t rings.
Purge
valve.Outlet
ball
valve.
Lock
screw.
¿La bomba está bien?
Pump Ripple estable.
Test de presión.
Inyección de un estándar:
· Tiempo de retención acceptable.
· Área aceptable.
Mantenimiento del Inyector
Vista frontal del inyector
Cambiar el sello del rotor.
Cambiar la aguja.
Cambiar el asiento.
Limpiar las guías.
Realizar el test de presión.
Válvula de
inyecciónAguja/asiento
Válvula de inyección
Tools:
Hexagonal key.....9/64
inch
Wrench.................1/4 inch
Injecton
Valve
7
65
32
1
4
1. Stator screws
2. Stator head
3. Stator face
4. Stator ring
5. Rotor seal (Vespel or
Tefzel)
6. Isolation seal
7. Valve body
Isolation seal
Rotor seal
Cambiar el sello del rotor
1. Desconectar todos
los capilares y los tres
tornillos.
2. Separar el cabezal de la válvula y el filtro
del soporte.
3. Sacar el sello del rotor.
4. Instalar el aislante.
5. Instalar el nuevo sello.
Stator head
Stator face
Stator ring
Replacing the Rotor Seal – Part Two
6. Instalar el soporte.
8. Poner los tornillos en el
cabezal.1.Bomba
6. Columna
Asiento4.Waste
3.Bloqueado
2. Meetering
Device
9.Reconectar los capilares.
7. Instalar el filtro en el cabezal de la
válvula.
Cambio de aguja y asiento
Antes de empezar se ha de seleccionar en el software la
opción de cambio de aguja (ChemStation/ Lab Advisor):
Lab Advisor:Instant Pilot:
Service and Diagnostics
Maintenance
Cambiar la aguja
1. Seleccionar la opción
Needle down en el
software.
2. Desconectar el loop de
inyección.
3. Desconectar la aguja. 4. Instalar la aguja nueva.
Cambio de asiento
1. Desconectar el
capilar del asiento en la
válvula de
inyección.(port 5).
2. Con un
destornillador
plano sacar el
asiento.
Antes de empezar se ha de seleccionar en el software la
opción de cambio de aguja (ChemStation/ Lab Advisor):
3. Insertar el nuevo
asiento.
Detectores Diode Array y
Longitud de onda variable.
Cambio de lámpara
Paso 1: Sacar los dos tornillos que
sujetan la lámpara.
Paso 2: Instalar la lámpara nueva.
Paso 3: Realizar tests específicos del
detector.
Deuteriu
m lampDetector cellTungste
n lamp
Preguntas
Agilent, WTC-
BarcelonaSergio Catalá
Agilent Technologies
Agilent FSE LC-MS
