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Coliformes Coliformes totales, totales, termotolerantes termotolerantes y y Escherichia coli Escherichia coli por el método por el método
de filtración de membrana ( FM )de filtración de membrana ( FM )Bióloga: Carmen Vargas G.
OPS / CEPIS
Curso sobre métodos bacteriológicosCurso sobre métodos bacteriológicospara el análisis de Agua Potablepara el análisis de Agua Potable
23- 27 de octubre del 200023- 27 de octubre del 2000Lima - PerúLima - Perú
Centro Panamericano de Ingeniería Sanitaria y Ciencias del Ambiente Enviromental Protection Agency
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Coliformes totales
Coliformestermotolerantes
RELACIÓN ENTRE COLIFORMESRELACIÓN ENTRE COLIFORMESTOTALES, TERMOTOLERANTES Y TOTALES, TERMOTOLERANTES Y E. E. colicoli
EscherichiaEscherichia coli coli
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ORGANISMOS COLIFORMES
3 Bacterias Gram-negativas, forma de bastoncillos
3Se desarrollan en presencia de sales biliares u otros
agentes tensoactivos
3Tienen propiedades de inhibición.
3Fermentan la lactosa a 35-37°C, produciendo gas,
ácido y aldehído en 24-48 horas.
3Son oxidasa negativa y no forman esporas.
3Presentan actividad a la ββ-galactosidasa
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DEFINICIÓN
GRUPO COLIFORME ( FM )
Bacterias aerobias y anaerobias facultativas,
gram negativas, no esporuladas y de forma alargada
que desarrollan una colonia roja con brillo metálico
en un medio tipo Endo que contiene lactosa a
inoculación de 35 ± 0,5°C - 24 hrs.
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GRUPO COLIFORMEGRUPO COLIFORME
GÉNEROSGÉNEROS FUENTEFUENTE
EscherichiaEscherichia HECES (HECES (humanos y animaleshumanos y animales))
KlebsiellaKlebsiella HECES, AMBIENTEHECES, AMBIENTE
EnterobacterEnterobacter HECES, AMBIENTE HECES, AMBIENTE
CitrobacterCitrobacter AMBIENTEAMBIENTE
SerratiaSerratia AMBIENTEAMBIENTE
ORGANISMOS PATÓGENOS EN EL AGUAORGANISMOS PATÓGENOS EN EL AGUA
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MÉTODOS PARA COLIFORMESMÉTODOS PARA COLIFORMESTOTALESTOTALES
Método de filtración por membrana (FM)Método de filtración por membrana (FM)
Un total de 100 ml de muestra en uno o más filtros; por ejemplo,1 filtro con 100 ml ó 4 filtros con 25 ml cada uno.
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Preparación de diluciones decimales
Muestra de agua
cruda
Dilución
10-1
Dilución
10-3
Dilución
10-2
10 ml
Agua de dilución
amortiguada
10 ml 10 ml
90 ± 2 ml 90 ± 2 ml90 ± 2 ml
10 ml 10 ml 10 ml
1 ml 0,1 ml 0.01 ml
100 ml 25 ml50 ml
100 ml 50 ml 10 ml
Volumen filtrado
Placas con AGAR m-FC ó ALMOHADILLAEMBEBIDA ENCALDO m-FC
VOLUMEN DE MUESTRA
ORIGINAL FILTRADA
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COLIFORMES TOTALES - VERIFICACIÓN DEL FMMuestra
Agar mEndo 35° ± 0.5°C, 24 h
Crecimiento+, Gas+
Caldo lactosado verde brillantebilis 35 ± 0.5° C, 24 - 48 h
Coliformes totales verificados
Crecimiento+, Gas+
a) Seleccionar ≤≤ 5 colonias con brillo metálico, ob) Trasladar las colonias con un hisopo del filtro a
Caldo lauril triptosa 35° ± 0.5°C, 24 - 48 h
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DEFINICIÓN
Bacterias que forman parte del grupo Coliforme, bacilos gram – negativos, no esporulados que fermentan la lactosa con producción de ácido y gas a 44.5 ± 0,2 °Cdentro de las 24 ± 2 hrs.
La mayor especie en el grupo de coliformes termotolerantes es la E. Coli.
COLIFORMES TERMOTOLERANTES(fecales)
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MÉTODO PARA COLIFORMES TERMOTOLERANTES
Se realiza a partir de coloniaspositivas de coliformes totales enplacas con medio m – Endo, lascuales son transferidas en tubosconteniendo medio EC, durante 24hrs.
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CONFIRMACIÓN DE COLIFORMES TERMOTOLERANTES
MUESTRA
AGAR m-ENDO ó m-ENDO LES
35°C ± 0,5 °C / 24 HRS
SELECCINAR 5 COLONIAS VERDE DORADO Y CONBRILLO METÁLICO
COLIFORMES TERMOTOLERANTES ( fecales)
CALDO EC 44,5 °C ± 0,2 °C / GAS (+) 24 HRS
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PRUEBA PARA COLIFORMESTERMOTOLERANTES POR MF SOLO CON
AGUA DE LA FUENTE
MUESTRA
COLIFORMES TERMOTOLERANTES( fecales )
Medio m - FC
44,5 °C ± 0,2 °C / 24 hrs.
COLONIAS AZULES
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DEFINICIÓN
Escherichia coli
Bacteria Coliforme que posee la enzima ββ- dGlucoronidasa y es capaz de romper el sustrato4-metil umbeliferil glucorónido ( MUG) con la producción de fluorescencia cuando crece enlos medios EC – MUG a 44.5 ± 0,2 °C en 24 ± 0,2 horas en Agar nutritivo con MUG a 35°C ± 0,5 en4 horas
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E. coli MÉTODO DE FILTRACIÓN DE MEMBRANA
MUESTRA
AGAR m-ENDO ó m-ENDO LES 35°C ± 0,5 °C / 24HRS
FLUORESCENCIA LUZ UV 366 nm
CALDO EC + MUG 44,5 °C ± 0,2 °C/ gas (+) 24 hrs
SELECCINAR 5 COLONIAS VERDE DORADO YCON BRILLO METÁLICO
E. coli
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E. coliFILTRACIÓN DE MEMBRANA – MEMBRANA FILTRANTE
( MÉTODO DE MATES SHAFFER)
MUESTRA
AGAR m-ENDO ó m-ENDO LES 35°C, 24 Hrs
E. coli
AGAR NUTRITIVO + MUG 35,5 °C ± 0,2 °C / 4 hrs
a) Seleccionar ≤≤ 5 colonias con brillo metálico.b) Trasladar el filtro al
FLUORESCENCIA LUZ UV 366 nm
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VENTAJAS DEL MÉTODO DE
FILTRACIÓN POR MEMBRANA
• Proporciona recuentos directos.
• Es más preciso ( se obtienenresultados más reproducibles) quela prueba de FTM o NMP.
• Rápido y fácil de realizar.
• Analiza mayores volúmenes demuestras con bajas concentracionesde organismo.
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Calculo de la densidad de coliformes porel método de filtración de membrana
Colonias de coliformes/100 ml = Colonias de coliformes contados x 100
ml de muestra filtrada
Se expresa en UFC / 100 µµl
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DESVENTAJAS DEL MÉTODO DE
FILTRACIÓN POR MEMBRANA
• Intervienen los altos niveles deturbiedad.
• Los coliformes debilitados puedensobrevivir mejor en la prueba de FTMo NMP.
• Las altas concentraciones de nocoliformes interfieren en el recuento.
• Efecto del tipo de filtro de membrana.
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VERIFICACIÓN• VERIFICAR TODAS LAS COLONIAS DE
COLIFORMES TOTALES SI HAYIGUALDAD O MENOR A 5 COLONIAS ENEL FILTRO.
• VERIFICAR 5 COLONIAS ELEGIDASALEATORIAMENTE DEL FILTRO CONMÁS DE 5 COLONIAS EN EL FILTRO.
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TASA DE VERIFICACIÓNTASA DE VERIFICACIÓNmétodo de filtración por membranamétodo de filtración por membrana
1. Porcentaje de verificación =
(Número total de tubos positivos)
(Número total de tubos inoculados)
X 100
2. Recuento de coliformes totales verificados =
Fracción % de verificación x (Coliformes/100 ml)*
* Recuento en membrana
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RECOMENDACIONES
Analizar 100 ml de muestra, independientedel método elegido.
*
La muestra debe analizarse dentro de las 30 horasde recolección.
*
Usar etanol al 95% en medio m-Endo (alcohol nodesnaturalizado)
*
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RECOMENDACIONES(CONTINUACIÓN)
Realizar el control apropiado de esterilidad: agar, caldo, amortiguador de fosfato y filtros.
*
Probar los nuevos lotes de filtros para la recuperacióny efectos en la morfología de las colonias.
*
No guardar el agar por más de 2 semanas; desecharlas almohadillas humedecidas con el medio de cultivodespués de 96 horas.
*