Curso de Microbiología cap v
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CAPÍTULO V
FISIOLOGÍA
BACTERIANACURSO DE MICROBIOLOGÍA UNIVERSIDAD DE LAS AMÉRICAS
UDLA
ESCUELA DE INGENIERÍA AMBIENTAL
OBJETIVOS
Conocer las particularidades fisiológicas, desarrollo y crecimiento de los
microorganismos y su importancia para la Biosfera.
Identificar las rutas metabólicas microbianas comunes a todos los organismos
vivos y específicas para estos, en especial las de obtención de energía.
Analizar los mecanismo de reproducción de microorganismos.
Comparar los mecanismos de motricidad microbiana con la de los organismos
eucariotas.
CONTENIDO
Fisiología bacteriana:
1. Crecimiento. Cinética microbiana
2. Metabolismo: Catabolismo y anabolismo. Rutas metabólicas
3. Nutrición: Procesos de membrana. Obtención de energía
4. Reproducción: Tipos
5. Movimiento.
CINÉTICA MICROBIANA
CRECIMIENTO MICROBIANO
“El crecimiento de células, microorganismos, células vegetales y animales,
puede mirarse bajo dos aspectos o tipos de crecimiento reproductivo.
a) Células individuales o población de células en crecimiento sincronizado
para estudio del ciclo de vida celular. Procesos en laboratorio.
b) División estocástica de la población, o división al azar.
CRECIMIENTO MICROBIANO
MEDICIÓN DEL CRECIMIENTO MICROBIANO .
El cálculo del número de células que existen en una suspensión se
puede llevar a cabo mediante :
1. el recuento celular (microscopía),
2. número de colonias),
3. masa celular (peso seco, medida del nitrógeno celular,
turbidimetría) o
4. actividad celular (grado de actividad bioquímica con relación al
tamaño de la población).
Todos estos métodos se clasifican en dos apartados: métodos
directos y métodos indirectos.
CRECIMIENTO MICROBIANO
Métodos directos:
Recuento del número
de células en una
cámara Thoma
Peso seco celular
Determinación de
nitrógeno o de
proteínas totales
Determinación de DNA
CRECIMIENTO MICROBIANO
Métodos indirectos:
1. Recuento de colonias en placa
2. Recuento sobre filtro de membrana
3. Consumo de oxígeno
4. Liberación de dióxido de carbono
5. Concentración de un enzima constitutivo
6. Decoloración de un colorante
7. Incorporación de precursores radiactivos
8. Medida de la turbidez
CRECIMIENTO MICROBIANO
El peso seco (contenido de sólidos) de las
células bacterianas que se encuentran en una
suspensión se obtiene por el secado de un
volumen en un horno a 105°C hasta peso
constante. Esta técnica es útil para grandes
volúmenes de muestra.
La desventaja de este método es que
componentes volátiles de la célula pueden
perderse por el secado y puede existir alguna
degradación.
También la muestra seca puede recobrar
humedad durante el pesado, principalmente si
el ambiente tiene una humedad relativa alta.
CRECIMIENTO MICROBIANO
PESO ESPECÍFICO ANHIDRO:
ρ0 = Peso anhidro
Volumen Anhidro
PESO ESPECÍFICO A H% DE HUMEDAD
ρk = Peso al H% de humedad
Volumen al H% de humedad
Cuando la humedad es del 12 %,se llama peso
específico normal
CRECIMIENTO MICROBIANO
ABSORCIÓN:
La nefelometría mide la luz dispersada por
una solución de partículas.
La turbidimetría mide la luz dispersada
como un decrecimiento de la luz
transmitida a través de la solución.
Los métodos de dispersión de la luz son las
técnicas más utilizadas para monitorear el
crecimiento de los cultivos bacterianos.
CRECIMIENTO MICROBIANO
Turbidimetría: La turbidimetría mide la reducción de la transmisión de luzdebido a partículas de una suspensión y cuantifica la luz residual transmitida.
CRECIMIENTO MICROBIANO
RECUENTO MICROSCÓPICO:
Para estos recuentos se utilizangeneralmente cámaras de recuentos,aunque también pueden realizarse apartir de muestras filtradas enmembranas y transparentes o teñidascon colorantes fluorescentes (Naranjade acridina).
Las cámaras más utilizadas son las deHawksley y la de Petroff-Hausser. Laprimera tiene la ventaja que puede serutilizada con objetivos de inmersión,aunque la mayoría de los recuentos serealizan con objetivos secos.
CRECIMIENTO MICROBIANO
Recuento de microorganismos.
Tipo de cuadroArea
[cm2]
Volumen
[ml]
Factor
[1/Volumen]
Cuadrado total 1.00 x 10-2 2.00 x 10-5 5.00 x 104
Cuadrado grande 4.00 x 10-4 8.00 x 10-7 1.25 x 106
Cuadrado pequeño 2.50 x 10-5 5.00 x 10-8 2.00 x 107
CINÉTICA MICROBIANA
CINÉTICA DE CRECIMIENTO DE UN CULTIVO INTERMITENTE
CINÉTICA MICROBIANA
La fase Lag, en la que el microorganismo se adapta a lasnuevas condiciones y pone en marcha su maquinariametabólica para poder crecer activamente. La duración deesta fase es variable y en general es mayor cuanto másgrande sea el cambio en las condiciones en las que seencuentra el microorganismo.
La fase de crecimiento exponencial. El número debacterias crece en forma exponencial en un tiemporelativamente corto
CINÉTICA MICROBIANA
La fase estacionaria, en la que no hay aumento netode microorganismos, lo que no significa que no sedividan algunos, sino que la aparición de nuevosindividuos se compensa por la muerte de otros.
La fase de muerte, en la que el número demicroorganismos vivos disminuye de formaexponencial con una constante k que depende dediferentes circunstancias.
16
CINÉTICA MICROBIANA
EFECTO DE LA CONCENTRACIÓN DE SUSTRATO .
la generación del producto se mantiene constante mientras la concentración delsustrato no sea limitante. Esto se definiría como
[ES] = [Et] [S]
[S] + (k2 + k -1) / k1
La velocidad inicial de la reacción está determinada por
v = k2 [ES]
Si definimos KM como (k2 + k -1) / k1 y Vmax como k2 [Et], obtenemos que
v = Vmax [S] / KM + [S]
Esta es la ecuación de Michaelis-Menten.
CINÉTICA MICROBIANA
Estos últimos dos parámetros son importantes, porque nos dan información
directa sobre cuán bien el microorganismo se une al sustrato (KM) y sobre
cuán bien el microorganismo convierte el sustrato en producto una vez se une
(Vmax).
De hecho, KM es la constante de disociación dinámica del microorganismo con
el sustrato, y
Vmax es la concentración molar del microorganismo por la constante catalítica
(Kcat).
Km, es igual a la concentración de sustrato, bajo la cual la concentración
molar microbiana (velocidad de reacción);es igual a la mitad de la
concentración molar máxima. Cada sepa, se caracteriza por una valor de Km
específico.
CINÉTICA MICROBIANA
RELACIONES MATEMÁTICAS:
En un cultivo estático con crecimiento
exponencial el tiempo de generación celular es
equivalente al tiempo de generación del cultivo y
viene dado por 1/k. En un quimiostato, el tiempo
de generación en cultivo es la inversa del ritmo de
crecimiento instantáneo de un cultivo, el cual se
expresa por la siguiente ecuación diferencial:
dx = μx ó μ= 1 dx
dt x dt
CINÉTICA MICROBIANA
Donde x es el número de células o la concentración del organismo (miligramos
de peso seco por mililitro) a un tiempo t, y μ es el ritmo o velocidad de
crecimiento instantáneo. Con la integración de la ecuación anterior entre los
límites xo y xt, se obtienen la siguiente ecuación:
ln xt -ln xo = μt
o, como se expresa generalmente la solución,
Xf = xo e μt
μ = k(ln 2) = 0.693 k
Con esta fórmula, se puede calcular μ, el ritmo de crecimiento instantáneo para
un quimiostato, multiplicando k por 0.693
Tasa (µ) ideal de crecimiento
microbiano
21
Ecuación del proceso
La ecuación de un proceso aeróbico, muestra como el
conocimiento de la fórmula del contaminante, es
fundamental, para determinar la cantidad de O2. A
partir de la ecuación es factible hacer el cálculo
(extrapolación), del volumen de oxígeno necesario por
m3 de residuos.
22
CnHaObNc + (2n + 0,5 a - 1,5c –b)/2 O2→nCO2 + cNH3 + a-3c/2 H2O
Grafico construido a partir datos
experimentales
23
0
20
40
60
80
100
120
1 2 3 4 5 6
CO
NCEN
TRACIÓ
N E
N p
pm
ln UFC
DEGRADACIÓN VS UFC
TPHs
Ufc
Ejemplo de cálculo de tasa de
crecimiento microbiano
24
CEPAS 4 horas 24 Horas lnN1 lnN2 K
Cepa 132 160 3,40 5,07 0,081
Cepa 221 92 3,04 4,52 0,124
Cepa325 112 3,21 4,71 0,075
Cepa 415 63 2,70 4,13 0,071
Cepa 59 42 2,19 3,73 0,077
Cepa 641 85 3,71 4,44 0,036
Cepa 763 154 4,14 5,03 0,044
Cepa 86 41 1,79 3,71 0,126
Cepa 912 43 2,48 3,76 0,064
𝑲 =𝒍𝒏𝑵𝟐 − 𝒍𝒏𝑵𝟏
𝒕𝟐 − 𝒕𝟏
Conteo rutinario de control durante un proceso de
biorremediación
25
CEPAUfc x106
I II III IV V
Cepa 132 0,08 0,51 0,09 0,78
Cepa 221 1,10 1,80 2,60 3,70
Cepa325 0,70 0,40 0,80 0,95
Cepa 415 0,05 0,90 0,70 1,00
Cepa 59 0,03 0,20 0,50 0,84
Cepa 641 0,80 0,92 1,40 1,70
Cepa 763 0,70 0,92 1,10 1,20
Cepa 86 0,02 0,04 0,05 0,08
Cepa 912 0,03 0,80 0,67 0,97
Tiempo 24h 30 días 60 días 90 días 120 días
Ejemplo de cálculo de la Tasa de
Biodegradación
26
CepaMuestra A ppm Muestra B ppm
I II III IV V I II III IV V
X1 5000 4629 3731 2978 2120 850 837 819 798 720
X2 5000 4896 4662 4132 3700 850 652 387 105 78
X3 5000 4021 3657 2133 1867 850 812 779 721 720
X4 5000 4729 4119 3027 2630 850 845 832 812 801
X5 5000 4502 4194 3645 3112 850 827 814 802 798
X6 5000 4679 4510 4467 4230 850 721 413 156 94
X7 5000 4003 3729 2765 2079 850 691 396 138 97
X8 5000 4867 4622 4139 4002 850 800 784 726 710
X9 5000 4902 4762 4473 4137 850 770 625 251 112
Tiempo/días
0 30 60 90 120 0 30 60 90 120
27
Capa X1 Capa X2 Capa X3
lnCo/C=kt lnCo/C=kt lnCo/C=kt
Ln 5000/4629= 0,07
Ln 5000/3731=0,29
Ln 5000/2978=0,51
Ln 5000/2120=0,85
ln5000/4896= 0,02
ln5000/4662= 0,06
ln5000/4132= 0,19
ln5000/3700= 0,30
ln5000/4021= 0,21
ln5000/3657= 0,31
ln5000/2133= 0,85
ln5000/1867= 0,98
Pendiente = Y2-Y1 / X2 – X1 Pendiente = Y2-Y1 / X2 – X1 Pendiente = Y2-Y1 / X2 – X1
K=0,85-0,07/1-120
K=0,78/119
K= 0,0065
K=0,30-0,02/1-120
K=0,28/119
K= 0,0023
K=0,98-0,21/1-120
K=0,77/119
K= 0,0064
Capa X4 Capa X5 Capa X6
lnCo/C=kt lnCo/C=kt lnCo/C=kt
ln5000/4729= 0,05
ln5000/4119= 0,19
ln5000/3027= 0,50
ln5000/2630= 0,64
ln5000/4502= 0,10
ln5000/4194= 0,17
ln5000/3645= 0,31
ln5000/3112= 0,47
ln5000/4679= 0,06
ln5000/4510= 0,10
ln5000/4467= 0,11
ln5000/4230= 0,16
Pendiente = Y2-Y1 / X2 – X1 Pendiente = Y2-Y1 / X2 – X1 Pendiente = Y2-Y1 / X2 – X1
K=0,64-0,05/1-120
K=0,59/119
K= 0,0049
K=0,47-0,10/1-120
K=0,37/119
K= 0,0031
K=0,16-0,06/1-120
K=0,1/119
K= 0,00084
Capa X7 Capa X8 Capa X9
lnCo/C=kt lnCo/C=kt lnCo/C=kt
ln5000/4003= 0,22
ln5000/3729= 0,29
ln5000/2765= 0,59
ln5000/2079= 0,87
ln5000/4867= 0,02
ln5000/4622= 0,07
ln5000/4139= 0,18
ln5000/4002= 0,22
ln5000/4902= 0,019
ln5000/4762= 0,048
ln5000/4473= 0,11
ln5000/4137= 0,18
Pendiente = Y2-Y1 / X2 – X1 Pendiente = Y2-Y1 / X2 – X1 Pendiente = Y2-Y1 / X2 – X1
K=0,87-0,22/1-120
K=0,65/119
K= 0,0054
K=0,22-0,02/1-120
K=0,20/119
K= 0,0016
K=0,18-0,019/1-120
K=0,161/119
K= 0,0013
Variación de lnCo/C sustrato
28
X1 X2 X3 X4 X5 X6 X7 X8 X9
lnCo/C lnCo/C lnCo/C lnCo/C lnCo/C lnCo/C lnCo/C lnCo/C lnCo/C
0 0 0 0 0 0 0 0 0
0,07 0,02 0,21 0,05 0,10 0,06 0,22 0,02 0,019
0,29 0,06 0,31 0,19 0,17 0,10 0,29 0,07 0,048
0,51 0,19 0,85 0,50 0,31 0,11 0,59 0,18 0,11
0,85 0,30 0,98 0,64 0,47 0,16 0,87 0,22 0,18
Variación comparativa de lnCo/c de
sustrato
29
Tiempo de vida media
30
X1 X2 X3
t= - ln (0,5)/0,0065
t= -(-0,69)/0,0065
t= 106,6 días.
t= - ln (0,5)/0,0023
t= -(-0,69)/0,0023
t= 300 días.
t= - ln (0,5)/0,0064
t= -(-0,69)/0,0064
t= 107,8 días.
X4 X5 X6
t= - ln (0,5)/0,0049
t= -(-0,69)/0,0049
t= 140,8 días.
t= - ln (0,5)/0,0031
t= -(-0,69)/0,0031
t= 222,5 días.
t= - ln (0,5)/0,00084
t= -(-0,69)/0,00084
t= 821,4 días.
X7 X8 X9
t= - ln (0,5)/0,0054
t= -(-0,69)/0,0054
t= 127,7 días.
t= - ln (0,5)/0,0016
t= -(-0,69)/0,0016
t= 431,2 días.
t= - ln (0,5)/0,0013
t= -(-0,69)/0,0013
t= 530,7 días.
Tiempos de vida media de los
residuos
31
Cepa TIEMPO (días) A TIEMPO (días)B
X1 106,6 575,0
X2 300,0 40,58
X3 107,8 690,0
X4 140,8 1533,3
X5 222,5 1916,6
X6 821,4 40,8
X7 127,7 43,2
X8 431,2 750,0
X9 530,7 43,1
Tiempos de vida comparativos
32
0
500
1000
1500
2000
2500
1 2 3 4 5 6 7 8 9
Tie
mp
o/d
ías
Cepa microbiana
Tiempos de vida comparativos de Sustrato A y SustratoB
TPHs
HAPs
Eficiencia comparativa
33
𝒀 = 𝑪𝒇 𝒙 100
𝑪𝒐
Cepa % A % B
X1 57,60 15,29
X2 26,00 90,80
X3 62,60 15,29
X4 47,40 5,76
X5 37,76 6,11
X6 15,40 88,94
X7 58,42 88,58
X8 19,96 16,47
X9 2,60 86,82
Testigo 0 0
RUTAS METABÓLICAS
Clasificación de los microorganismos
Clasificación de los microorganismos
Según la fuente de carbono que
emplean
Según el punto de vista biosintético
Según la fuente de energía
QUIMIOTROFOS
QUIMIOTROFOS
QUIMIOTROFOS
ANABOLISMO Y CATABOLISMO
Dos procesos simultáneos, como la oxidación y reducción
ANABOLISMO Y CATABOLISMO
Una expresión del flujo permanente de materia y energía
Transformaciones biológicas del carbono
OXIDACIÓN BIOLÓGICA
Visión general
metabolismos
Metabolismo
intermedio
Metabolismo
intermedio
METABOLISMO INTERMEDIO
Biosíntesis de aminoácidos
Reacciones
de óxido
reducción
bacteriana
Alternativas
metabólicas
Obtención de ATP
Fosforilación de sustrato
Obtención de ATP
Flujo de electrones en la fosforilación oxidativa
Comparativo
de los dos
tipos de
fosforilización
Rutas del piruvato
Carboxilación del piruvato
CUESTIONARIO
Para qué es necesario la determinación de la tasa de crecimiento microbiano?
¿Qué importancia tiene la determinación del tiempo de vida media de u
sustrato?
¿Cómo se determina la tasa de degradación (consumo del sustrato) y cuál es
su importancia ambiental y práctica en ingeniería ambiental?
¿Cuál es la relación entre la curva de crecimiento microbiano y curva de la
tasa de degradación? ¿Que relevancia técnico legal tiene?
¿Cuál s le metabolito central de todo el metabolismo microbiano y por qué se
dice eso?
¿Cuáles son las etapas del esquema general del metabolismo?
¿Cuáles son las rutas que sigue el piruvato?
CUESTIONARIO
¿En qué se diferencian los dos tipos de fosforilación?
Esquemáticamente represente la cadena respiratoria y diga ¿cuál es su
importancia en el metabolismo biológico?
¿Qué tipo de reacciones de oxido reducción biológica se implementan en el
metabolismo intermedio?
¿Qué rol cumplen en el metabolismo NAD+, FAD+ y ADP?
Elabore un esquema que represente al anabolismo ligado al catabolismo.
¿Por qué acetil coenzima A es importante para la síntesis de proteína?
Elabore una tabla de clasificación de los microorganismos por la fuente de
energía que utilizan.
Cuestionario
¿Qué representa Km (Ks) y cuál es su importancia para ciencias ambientales?
Describa las etapas de la curva de crecimiento microbiano.
Diferencias entre medición turbidimétrica y nefelométrica.
Enumere los métodos indirectos de conteo microbiano
BIBLIOGRAFÍA
Jeffrey C. Pommerville. (2011). Alcamo´s Fundamental of Microbiology, Ninth
edition. Jones and Bartlett Publishers. Cap IV.
Kurt Konhauser. (2007). Introduction to Geomicrobiology. Blackwell
Publishing. Cap III.
Trivedi P.C. (2010). Text Book of Microbiology. Aavishkar Publishers. India.
Anne Maczulak. (2011). Encyclopedia of Microbiology. Facts On File, Inc.