Curs 1 Tehnici Biologie Moleculara
-
Upload
maria-magdalena-dringa -
Category
Documents
-
view
294 -
download
36
description
Transcript of Curs 1 Tehnici Biologie Moleculara
-
Metode si tehnici de biologie celulara si moleculara utilizate in cercetarea
biomedicala
Dr. Florin Iordache
-
Culturi de celule Metode de evaluare a citotoxicitatii, a stresului oxidativ si a
apoptozei Citometrie in flux Analiza ciclului celular Metode de dozarea a proteinelor Electroforeza, ELISA, Western blot Tehnici de imunohistochimie simpla si dubla Tehnica PCR si Real-Time PCR Variante si aplicatii ale tehnicii PCR: MS-PCR, SNP-PCR, PCR-
RFLP Microarray Secventiere genica Transfectie si clonare
Cuprins
-
Cnd sunt ndeprtate din esuturi, majoritatea celulelor vegetale i animale pot supravieui, se pot multiplica i chiar pot exprima proprietile lor difereniate dac li se furnizeaz nutrieni i condiiile adecvate
Proces realizat n laborator Culturi de celule pot fi vizionate la microscop sau analizate din punct de vedere biochimic, putnd fi explorate i efectele adugrii sau ndeprtrii unor molecule specifice, ca de exemplu hormoni i factori de cretere; n culturile mixte pot fi studiate interaciunile dintre un tip de celule i altul
Experimentele realizate n cultur - in vitro (pe sticl) Experimentele care se realizeaz pe organisme intacte - in vivo (pe
organisme vii) Celulele n cultur: - identice dpdv genetic (populaie omogen) cnd deriv
dintr-o singur celul parental- clon - pot manifesta variaie genetic (populaie heterogen) Celulele EK - mult mai dificil de cultivat dect majoritatea PK - necesit medii
complexe i sunt foarte susceptibile la contaminarea cu microorganisme (bacterii, drojdii i fungi)
CULTURI DE CELULE
-
secolul al XIX-lea - examinarea n detaliu a esuturilor i fragmentelor de organ n recipiente de sticl:
Sydney Ringer - dezvoltarea de soluii saline (NaCl, KCl, CaCl2, MgCl2) meninerea btilor unei inimi izolate de la un animal 1907 - Ross Harrison a stabilit metodologiei culturii tisulare: cultivarea unei
piese foarte mici de esut din tubul neural al unui embrion amfibian timpuriu ntr-o pictur de limf mbogit cu substane nutritive celulele crescute n aceste condiii, rmn vii i chiar difereniaz la neuroni ai cror axoni cresc n mediul de cultur
1912 - Alexis Carrel - cultivare de celule n diferite condiii: dac mediul este adecvat i schimbat cu regularitate - celulele pot crete n cultur pentru o perioad ndelungat de timp
1940 - laboratoarele lui Wilton Earle i Renato Dulbecco: dezvoltarea metodelor de cultivare a celulelor - piese de esut au fost disociate n suspensii de celule izolate, ce pot fi utilizate la iniierea culturilor celulare
1952 NATEREA domeniului culturilor celulare: introducerea tripsinizrii esuturilor (Moscona)
CULTURI DE CELULE
-
CULTURI DE CELULE
Endothelial Growth Factor EGF
Vascular Endothelial Growth Factor VEGF
Fibroblast Growth Factor FGF-B
Insulin Growth Factor IGF-1
Hydrocortisone
Fetal Bovine Serum
Ascorbic Acid
Heparin GA-1000
(Gentamicin, Amphotericin-B)
-
CULTURI DE CELULE
-
Cultura tisular - termen general pentru ndeprtarea celulelor, esuturilor i organelor dintr-un organism animal sau plant i plasarea lor ulterioar ntr-un mediu artificial favorabil creterii: un mediu lichid sau semisolid, care furnizeaz celulelor substane nutritive eseniale pentru supravieuire i cretere, plasat ntr-un recipient de cultur din sticl sau plastic
- se refer n general la creterea celulelor EK in vitro -cultura de celule mamaliene dar i la culturile de explant i de organ Cultura de organ - cultura tridimensional a ntregului organ sau fragmentelor
intacte de organ ce rein o parte sau toate caracteristicile histologice manifestate de ctre esutul respectiv in vivo; piesa este cultivat la interfaa lichid-gaz (pe un grid sau gel) - favorizeaz meninerea formei sferice sau tridimensionale
- reine interaciile celulare existente n esutul de origine tinde s manifeste proprietile difereniate specifice
- celulele nu cresc rapid (proliferarea celular este limitat la periferia explantului i este mai evident n esuturile embrionare) nu pot fi propagate
- necesit explant proaspt implic un effort mai mare i o mai slab reproductibilitate dect este realizat cu cultura de celule
CULTURI DE CELULE
-
Cultura de celule ndeprtarea celulelor din fragmentele de organ i ntreruperea interrelaiilor lor normale cu celulele nvecinate
se refer la celulele obinute prin dezintegrare enzimatic, chimic sau mecanic (celule ce provin dintr-un esut, cultur primar sau linie celular)
poate fi propagat ca suspensie celular (celulele din snge numai celulele albe sunt capabile de a crete n cultur) sau monostrat celular
O alternativ la a studia celulele n cultur primar este de a cumpra culturi celulare stabilizate (linii celulare de calitate superioar, care sunt testate cu atenie pentru a asigura autenticitatea celulelor ) de la organizaii:
- American Type Culture Collection (ATCC; www.atcc.org) -European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC;www.ecacc.org) - Coriell Institute for Medical Research (arginine.umdnj.edu). cercettorii obin (mprumut) linii celulare din alte laboratoare practic
larg rspndit; neajuns: riscul amestecrii sau contaminrii cu alte linii celulare sau
contaminrii cu microorganisme (micoplasma, bacterii, fungisau drojdii)
CULTURI DE CELULE
-
Cultura organotipic - celule de diferite tipuri sunt recombinate n rapoarte determinate experimental i relaii spaiale, pentru a crea un component al organului de origine
obinerea unui echivalent de piele: Keratinocitele epidermale cresc expuse la aer pe o matrice de colagen nativ de tip I (extras din tendon de coad de obolan sau piele de viel) n care sunt nglobate fibroblaste viabile
- reorganizeaz matricea prin producerea de componente ale MEC - celulele sunt hrnite prin difuzia mediului de cultur de la baza recipientului de
cultur (medii definite sau ce conin ser)
CULTURI DE CELULE
-
Cultura histotipic (histiotipic sau histocultura) - cultivarea unui singur tip celular la densitate mare ntr-o matrice tridimensional
Permite studiul interaciilor celul-celul i celul-matricereconstituirea structurilor celulare tridimensionale n:
agregate celulare n suspensie (celulele disociate sunt cultivate pe un agitator giratoriu ce le permite s reasocieze n clusteri tridimensionali de 150- 240 m denumii sferoizi mas heterogen de celule: proliferative, latente i necrotice)
gel de colagen (celule epiteliale mamare structuri tubulare i glandulare mamare, celule endoteliale structuri vasculare)
Celulele din sferoizi - menin funciile lor difereniate pe o perioad extins de cultur i ofer caracteristicile din vivo ntr-o manier uor de manipulat in vitro
Aplicaii ale culturilor de sferoizi: - Teste de toxicitate - Studii de metabolism - Screening de medicamente (ofer potenialul de a reduce semnificativ numrul de
animale folosit n screening de medicamente) Celule capabile de a forma sferoizi: HUVEC (Human Umbilical Vein Endothelial Cells),
HUAEC (Human Umbilical Artery Endothelial Cells), HUSMC, (Human Uterine Smooth Muscle Cells) HMVEC (Human Microvascular Endothelial Cells), celule din citotrofoblast uman, BAEC (Bovine Arterial Endothelial Cells), celule din gliom C6 i diferite tipuri celulare epiteliale
CULTURI DE CELULE
-
CULTURI DE CELULE
Sferoizii de hepatocite proprieti tipice esutului: au suprafae netede i structur compact, hepatocitele din interior comunic prin canale delimitate de tight junctions similare canaliculelor biliare existente n Formarea sferoizilor depinde de proprieti celulare diverse: molecule de adeziune, interacii celul-MEC, sarcina de suprafa celular, formarea de complexe joncionale
-
CULTURI DE CELULE
-
cultur de mas se cultiv un numr mare de celule care colonizeaz baza recipientului i formeaz un strat de celule relativ uniform
- celulele care supravieuiesc procedurii de izolare se divid - dup un numr de generaii formeaz un monostrat celular
cultur clonal - numrul de celule cultivate este relativ mic astfel nct ele se fixeaz de suport la o anumit distan unele de celelalte
- proliferarea celulelor determin formarea de colonii individuale sau clone celulare, ale cror membri sunt derivai din aceeai celul iniial
Cele dou tipuri de culturi celulare tind s aib: - cerine de cretere diferite - caracteristici diferite - avantaje diferite n ceea ce privete studiul activitilor celulare
CULTURI DE CELULE
-
CULTURI DE CELULE
-
celulele aderente (majoritatea celulelor normale) - dependente de fixarea de suport i se propag ca un monostrat celular
- proliferarea celular - numai prin aderare de suport - nceteaz cnd celulele devin confluente inhibiie de contact a
creterii (Abercrombie i Heaysman (1954) fenomen incomplet elucidat) -contactele celul-celul prin glicoproteine specifice din membrana
plasmatic a cror component glican interacioneaz cu receptori principalul principiu reglator al creterii celulare
- E-cadherina molecul de adeziune homofilic important n inhibiia de contact a celulelor epiteliale normale (inhibat sau pierdut n
numeroase carcinoame) celulele n suspensie - pot supravieui i prolifera fr a fi fixate de
suport (celulele hematopoietice, anumite linii celulare transformate i celule derivate
din tumorile maligne pot fi crescute n suspensie independente de fixare
CULTURI DE CELULE
-
CULTURI DE CELULE
1)Tipul epitelial-like: - celule care sunt fixate de support i apar aplatizate i poligonale - keratinocite epidermale umane n cultur primar 2) Tipul limfoblast-like: - celule care nu se fixeaz de substrat n mod normal i rmn n suspensie cu o form sferic neutrofile polimorfonucleare umane 3) Tipul fibroblast-like: - celule care sunt fixate de support i apar alungite i bipolare, formnd frecvent vrtejuri n cultura confluent - fibroblaste dermale n cultur primar
-
Culturile primare - multiplicarea celulelor ce migreaz dintr-un fragment de esut (cultura de explant): fibrinogenul i trombina favorizeaz aderarea esutului de suport
-prin dezintegrarea esutului prin metode enzimatice (tripsina, hialuronidaza, colagenaza), chimice (EDTA) sau mecanice
Cultura de explant: piese mici de esut fixate de recipientul de cultur i plasate n mediul de cultur celulele individuale se vor deplasa din esutul explantat pe suprafaa suportului de cultur, de unde vor ncepe s se divid i s creasc
CULTURI DE CELULE
-
Culturile celulare finite (secundare): formate dup prima subcultivare (pasaj) a culturii primare numr limitat de diviziuni senescen fibroblastele umane normale 50-100 dublri populaionale senescen
Extinderea potenialului proliferativ introducerea unor gene virale transformante (gena T-large antigen din virusul simian SV40)
Linii celulare continue: potenial proliferativ nelimitat att timp ct sunt meninute condiiile de cultivare = imortalizate - se coreleaz frecvent cu tumorigenicitatea celulele
CULTURI DE CELULE
-
Avantajele liniilor celulare - imortalitatea celular - mai uor de manipulat dect culturile celulare primare sau finite - modele experimentale extrem de puternice cea mai mare parte din - observaiile dobndite folosind liniile celulare poate fi aplicat tipului celular iniial Dezavantajele liniilor celulare - nu sunt normale - sufer modificri genetice (aberaii cromozomiale: poliploidie,
translocaii cromozomiale, etc) comportarea lor in vitro nu poate reprezenta situaia in vivo
- morfologie modificat prin comparaie cu tipul celular iniial - pierd caracteristica de inhibiie de contact (ele pot crete suprapuse formnd focare) Exemplul clasic de linie celular imortal HeLa - celule epiteliale umane dintr-un carcinom cervical transformat de HPV 18
(Henrietta Lacks, n 1951) - celule aderente George i Margaret Gey (Johns Hopkins Hospital -Baltimore)
- nu manifest inhibiia de contact - trstur clasic a celulelor tumorale - nu sunt tumorigene n animale; transformare cu un virus oncogen devin tumorigene
CULTURI DE CELULE
-
Henrietta Lacks
1920-1951
CULTURI DE CELULE
-
MEDIILE COMPLETE Aminoacizi Vitamine Sruri Glucoz Suplimente organice Hormoni i factori de cretere Antibiotice Ser
CULTURI DE CELULE
-
CULTURI DE CELULE
-
MTT (MTS) assay - proliferare celularasi citotoxicitate - reducerea unei saruri de tetrazoliu galbene MTT (bromura de 3
(4,5dimetiltiazoliu)-2,5-difeniltetrazoliu) la formazan de culoare albastru-inchis 570 (nm)
- formazanul insolubil in apa poate fi solubilizat cu izopropanol, DMSO sau alt solvent organic
Metode de evaluare a citotoxicitatii, a stresului oxidativ si a apoptozei
CellTiter 96 Non-Radioactive Cell Proliferation Assay (Promega)
Cell Viability and Proliferation ( Sigma-Aldrich)
Vybrant MTT Cell Proliferation Assay Kit (Life Technologies)
-
LHD assay - studii de citotoxicitate
Metode de evaluare a citotoxicitatii, a stresului oxidativ si a apoptozei
-
GSH assay - evaluarea stresului oxidativ
Metode de evaluare a citotoxicitatii, a stresului oxidativ si a apoptozei
-
Marcarea celulelor cu Acridine Orange/Bromura de etidiu Caracteristicile morfologice in urma colorarii: - caracteristicile nucleare normale: cromatinei verde stralucitor cu
structura organizata -celulele apoptotice au nucleul condensat si / sau fragmentat,
membrana veziculare, si condensare citosolica - in stadiul incipient de apoptoza, celulele sunt impermeabile la
bromura de etidiu si nucleul este colorat in verde - In timpul etapele ulterioare ale apoptozei, celulele au nucleul
condensat si / sau fragmentat care se coloreaza in rosu/portocaliu - Celulele necrotice prezentat o coloratie rosie nucleara, dar cromatina
nu este condensata.
Metode de evaluare a citotoxicitatii, a stresului oxidativ si a apoptozei
-
Metode de evaluare a citotoxicitatii, a stresului oxidativ si a apoptozei
Marcarea celulelor cu Acridine Orange/Bromura de etidiu
-
Metode de evaluare a citotoxicitatii, a stresului oxidativ si a apoptozei
-
Marcarea celulelor cu substante fluorescente vitale - in prezent sunt utilizati o gama larga de compusi care patrund in celula
si devin fluorescenti: rodamina, calceina, coumarina, fluoresceina. - In ultimii ani s-au dezvoltat fluorocromi care permit urmarire pe termen
mai lung a viabilitatii celulelor (6-10 generatii), timp de 1- 2 saptamani in cultura.
Metode de evaluare a citotoxicitatii, a stresului oxidativ si a apoptozei
CMTPX
-
Metode de evaluare a citotoxicitatii, a stresului oxidativ si a apoptozei
-
7-AAD (7-Aminoactinomycin D)
Metode de evaluare a citotoxicitatii, a stresului oxidativ si a apoptozei
-
Anexina V-FITC - Se leaga de fosfatidilserina expusa la exteriorul membranei celulare lezate
Metode de evaluare a citotoxicitatii, a stresului oxidativ si a apoptozei
-
Bromdeoxiuridina, Iodura de propidiu, Hoechst - proliferarea si viabilitatea celulara prin analiza ciclului
celular - metoda folosita citometrie in flux
Metode de evaluare a citotoxicitatii, a stresului oxidativ si a apoptozei
-
Flux=miscare, citos=celula, metrie=masurare Analizeaza celule aflate n suspensie din: snge, lichid sinovial,
ganglioni limfatici, tumori solide
Este o metod de surare a caracteristicilor fizice i/sau biochimice ale particulelor (celule, nuclei, organite celulare):
Mriea Granularitatea Cantitatea de ADN Atigee de suprafa
Metod de sortare a celulelor
CITOMETRIE IN FLUX
-
CITOMETRIE IN FLUX
-
CE MASOARA CITOMETRIA DE FLUX LA NIVELUL CELULELOR? Dimensiunea celulelor
Forma (Granularitatea) celulelor
Proteinele de suprafata ale celulelor, clusteri de diferentiere (CD)
Proteinele citoplasmatice - prin permeabilizarea membranei celulare
Densitatea celulelor
CITOMETRIE IN FLUX
-
ETAPE
1. Prepararea suspensiei de celule
2. Marcarea celulelor
3. Achiziia datelor
4. Stocarea datelor
5. Interpretarea datelor
CITOMETRIE IN FLUX
-
Plasmocite producatoare de Ac
Antigen
Fuzionarea celulelor HIBRIDOM Mielom
Anticorpii monoclonali sunt purificati
Clonele dorite se cultiva sau se congeleaza
Testarea clonelor
Hibridoamele se separa si se cultiva
Cultivarea hibridoamelor
Mentinerea hibridoamelor in soareci
CITOMETRIE IN FLUX
HGPRT-
HGPRT-
HGPRT- = Hipoxantin-guanozin-ribozil-transferaza
HAT = hipoxantin-aminopterina-timidina
HGPRT+
-
Ac. monoclonali
- Toate moleculele de Ac sunt identice dpdv imunochimic si
recunosc acelasi epitop de pe un antigen
- Specificitate f. mare
- Fara variatii de la un lot la altul
Ac. policlonali
-fiecare molecula de Ac va recunoaste epitopi diferiti de pe Ag
- Poate satura u atige, emitand un semnal mai mare - Este mai putin specific
- Poate avea variatii mari de la un lot la altul
Ac. izotip
Legare nespecifica - alte regiuni ale Ac se pot lega la epitopii Ag.
- Pentru a cuantifica acest efect se foloseste Ac. izotip: Ac ale
carui regiuni variabile sunt nespecifice. Prin urmare, orice legare
va fi datorata interactiei nespecifice a regiunii constante cu Ag
CITOMETRIE IN FLUX
-
CITOMETRIE IN FLUX
-
CITOMETRIE IN FLUX
-
CITOMETRIE IN FLUX
-
Sistem fluidic
Sistem optic
Sistem electronic
COMPONENTELE CITOMETRULUI IN FLUX
CITOMETRIE IN FLUX
-
SISTEMUL FLUIDIC - celulele sunt analizate individual pentru a realiza acest lucru, celulele sunt invelite intr-un flux de lichid acest proces este numit focusare hidrodinamica"
Ac de injecie Lichid de nveli Camer de curgere
Flux Laminar
(sir indian)
CITOMETRIE IN FLUX
-
SISTEMUL OPTIC DE EXCITAIE Intersectarea cu un fascicul de lumina surse laser:
Fascicul luminos dispersia luminii i stimularea fluorocromilor (emisia de fluorescenta)
CITOMETRIE IN FLUX
Argon
UV 350/364 nm Visible 458 465 472 488 496 502 515 nm
Krypton
UV 350/356 nm Visible 468 476 482 520 530 568 647 676 nm
Helium/Neon 633 nm
-
SISTEMUL OPTIC Conversie semnal optic semnal electronic semnal digital Detectori pentru:
Lumina dispersat: n fa (FSC), lateral (SSC) Emisia de fluorescen: ~ cantitatea de fluorocromi informatii calitative i cantitative Filtre optice Elemente optice de focalizare (lentile si oglinzi dicroice)
CITOMETRIE IN FLUX
-
Dichroic mirrors
1 2 3
Band Pass
Filters
Photo-
multiplier
tubes
Laser(s)
Cell
Collection
Lenses
Scatter
Low & High
angle
CITOMETRIE IN FLUX
-
Dispersia luminii Forward Scatter (FS) dimensiunea
Side Scatter (SS) granularitatea Forward Scatter
LASER
LASER
Side Scatter
CITOMETRIE IN FLUX
-
Sistemul electronic preia datele colectate si le
transmite computer-ului
CITOMETRIE IN FLUX
-
ANALIZA DATELOR OBTINUTE Software-ul permite analiza datelor brute obtinute, atat grafic cat i
numeric Parametri diferii (variabile pe un grafic) indica lucruri diferite
Lumina imprastiata in unghi mic este captata de fotodetectorul forward scatter (FSC) - indic dimensiunea celulei, n timp ce lumina imprastiata in unghi mare este captata de fotodetectorul side scatter (SSC) indica granularitatea celulei
Ali parametri care se pot observa pe un grafic includ diferiti markeri fluorescenti folositi pentru a colora celulele
CITOMETRIE IN FLUX
-
TIPURI DE HISTOGRAME CITOMETRIE IN FLUX
-
GRAFIC DOT-PLOT PENTRU FITC I PE Grafice paraetri: puct = particul dot-plot)
FITC+ / PE+
FITC: FL1
PE: FL2
FITC- / PE-
FITC+
PE+
CITOMETRIE IN FLUX
-
Control OdDHL C4HSL PQS HHQ
IL 6
IL-1
ICAM-1
PECAM- 1
P- SELECTIN
VE- Cadherin
CD 146
CITOMETRIE IN FLUX
-
SORTAREA CELULELOR Separarea unei (sub)populaii celulare dintr-un amestec in functie de fluorescenta Etape: 1.Identificarea criteriului 2.Marcarea cu Ac + fluorocromi 3.Identificarea celulelor 4.Separarea celulelor una cate una (transducer sonicator) pt ca fiecare celula sa fie intr-o picatura de lichid 5.ncrcare cu sarcini pozitive/negative/fr 6.Deflectare spre tuburi colectoare placi magnetice 7.Centrifugare
CITOMETRIE IN FLUX
-
Analiza ciclului celular
CITOMETRIE IN FLUX
-
APLICATII Cercetare: microbiologie, biologie celulara, cancer, imunologie, boli
cardiovasculare, inflamatie, nanomedicina
Clinica: Identificarea unor molecule HLA; Determinarea unor autoanticorpi asociati plachetelor in
trombocitopatii Studiul ciclului celular monitorizarea transplantelor Analiza subpopulaiilor limfocitare (HIV -> scaderea nr. de limfocite T
CD4) Diagnosticul, evoluia, prognosticul tumorilor maligne solide si a
hemopatiilor maligne
CITOMETRIE IN FLUX
-
Expresia aberanta a unor antigene pe suprafata celulelor
- Imunofenotiparea prin citometrie in flux este in mod particular utila pentru subtiparea
limfoamelor/leucemiilor cu celula B compuse predominant din celule mici
- Expresia CD5 la nivelul celulelor B este in general raportata ca un fenotip aberant, desi
exista populatii mici de celule B normale mature CD5+, aflate de obicei in sangele periferic.
Astfel expresia CD5 trebuie interpretata in corelatie cu alte anomalii, incluzand restrictia
lantului usor de Ig (sIg) sau alterarea intensitatii prezentei CD20, CD22 si CD79b.
- Expresia bcl-2 pe celulele B CD10+ . In conditii normale, bcl-2 este absent.
Antigenele de suprafata in limfoamele/leucemiile cu celula B mica
NHL sIg CD5 CD10 CD23 CD11c CD103 CD25
CLL/SLL Slab + - ++/+ - - -
MCL + + -/+ -/+ - - -
Folicular + - + +/- - - -
LPL + - - - - - -
MZL + - - - +/- slab - -
SMZL + - - - +/- slab +/- slab -
Hairy
cell
+ - -/+ - ++ + +
NHL = limfom non-Hodgkin, CLL = leucemie limfocitara cronica, SLL = limfom cu limfocite mici,
LPL = limfom limfoplasmocitar, MCL = limfom cu celule de manta (folicul limfoid), MZL = limfom
de zona marginala (folicul limfoid), SMZL = limfom de zona marginala splenic
-
METODE DE DOZARE A PROTEINELOR
1.Determinarea concentratiei proteice prin spectrofotometrie Absorbtia radiatiilor in UV de catre proteine depinde de continutul acestora in
tirozina si triptofan (si intr-o masura mai mica de Phe si legaturile disulfurice). Astfel absorbanta la 280 nm variaza in functie de proteine, pentru 1 mg/ml solutie proteica de la 0 la 4.
Avantajul acestei metode consta in simplitate si sensibilitate. Proba este total recuperabila, variatia intre proteine este mica ceea ce permite determinari absolute ale proteinelor
Dezavantajul consta in faptul ca aparatul trebuie bine calibrat. Multe bufere si alti compusi interfera cu citirea: acetat, succinat, citrat, ftalat, barbiturat gruparile hem, gruparile piridoxal
-
METODE DE DOZARE A PROTEINELOR
2. Dozarea proteinelor prin metoda Lowry Aceasta metoda se bazeaza pe : - reactia biuretului in care legaturile peptidice ale proteinelor reactioneaza cu Cu2+ in conditii alcaline pentru a reduce Cu+ care reactioneaza cu reactivul Folin-Ciocalteau - reactia Folin-Ciocalteau, al carui principiu consta in reducerea fosfomolibdatului de tungsten prin oxidarea aminoacizilor aromatici (in special tirozina si triptofan) cu ajutorul Cu.
Interfera cu: SDS, pH, buffer, acizi nucleici, zaharuri, medicamente, lipide saruri
-
METODE DE DOZARE A PROTEINELOR
3. Dozarea proteinelor prin metoda BCA (acid bicinchoninic) Legarurile peptidice, cisteinele, triptofanul, tirozinele din lanturile laterale ale proteinelor reduc Cu2+ din sulfatul de cupru la Cu+ (reactie dependenta de temperatura), cantitatea de Cu+ redus fiind proportionala cu cantitatea de proteina din reactie. Apoi 2 molecule de BCA chelateaza fiecare ion de Cu+ formand un complex colorat in mov care absoarbe puternic la o lungime de unda de 562 nm.
-
4. Dozarea proteinelor prin metoda Bradford Aceasta metoda este mai simpla, mai rapida si mai sensibila decat Lowry. Metoda consta in capacitatea de legare a colorantului Commassie Blue la proteine (in special de aminoacizii aromatici). Studiile au aratat ca colorantul liber poate exista in 3 forme ionice. Dintre cele 3 forme incarcate ale colorantului care predomina in solutia de reactiv formele rosu si verde au absorbanta la 470 nm si 650 nm. Forma rosie a colorantului doneaza electronii liberi la gruparile ionizabile ale proteinelor care modifica starea native a proteinelor, expunandu-si astfel gruparile hidrofobice. De aceste grupari se leaga prin interactii de tip van der Waals colorantul. Aceste legaturi sunt stabilizate si cu ajutorul intercatiilor ionice. Forma anionica albastra care se leaga la proteine are un maxim de absorbanta la 590 nm, astfel cuantificarea proteinelor poate fi estimata prin determinare colorantului albastru prin masurarea absorbantei la 590-595 nm (570-610 nm). Colorantul se pare ca se leaga de resturile de arginina, lizina si histidina ale proteinelor. Aceasta metoda interfera cu detergenti, amfoliti, pH foarte alcalin, cantitati mari de Tx100, SDS.
METODE DE DOZARE A PROTEINELOR
-
1937 Arne Tiselius- aparat sofisticat care sa permita separarea diferitelor particule in prezenta unui camp electric
1948 Tiselius- Premiul Nobel pentru Chimie (separarea coloizilor prin metode electroforetice)
1960 Vin Thorne - electroforeza acizilor nucleici
ELECTROFOREZA
-
Denumirea: gr. Electron= electric, lat. Phore = purttor, evideniindu-se astfel rolul esential al campului electric
reprezint o metod de analiz i separare bazat pe migrarea particulelor solide incarcate electric dispersate ntr-un lichid sub aciunea unui cmp electric
Moleculele de ADN sunt incarcate negativ si vor migra spre polul pozitiv
ELECTROFOREZA
-
Fortele care determina mobilitatea electroforetica depind de: voltajul
aplicat (65-75 V), sarcina neta a moleculelor, masa moleculara si
coeficientul de frictiune
- teoretic: 5 v/cm
ELECTROFOREZA
-
Cuva (tanc) de electroforeza 2 electrozi conectati la o sursa de curent Gel de electroforeza (pentru o migrarea mai buna a moleculelor) un lichid (tampon de electroforeza)
ELECTROFOREZA
-
Gelul de electroforeza - Gel de agaroza (polizaharid, D-galactoza and 3,6-anhidro-L-
galactopiranoza, extras din alge)
- Gelurile de agaroza au o concentratie de 1-5%, in functie de dimensiunea fragmentelor ce trebuie separate
- Gelurile de agaroza permit separarea acizilor nucleici cu dimensiuni intre 100-1500 pb
ELECTROFOREZA
-
Gel de poliacrilamida: permit separarea acizilor nucleici cu dimensiuni intre 60-450 pb si a proteinelor
- dezavantaje: neurotoxic si cancerigen
Gelurile de agaroza se formeaza prin incalzirea agarozei la cuptorul cu microunde timp de 3-4 minute. Aceste geluri polimerizeaza formand o
retea cu ochiuri de dimensiuni variabile in functie de concentratia gelului
Gelurile de poliacrilamida polimerizeaza la temperatura camerei in prezenta unor agenti de polimerizare
Gelurile cu concentratie mica (< 3%) separarea moleculelor cu MM mare
Gelurile cu concentratie mare (> 3%) separarea moleculelor cu MM mica
ELECTROFOREZA
-
Gel de agaroza Gel de poliacrilamida
260, 250
+ +
- -
Gel de agaroza
200
260 250
200
ELECTROFOREZA
-
Tamponul de electroforeza - TAE: Tris, acid acetic, EDTA
- TBE: Tris, acid boric, EDTA
- Acid citric
- Glicina
- Acid fosforic
TRIS = tris(hidroximetil)aminometan
Pentru vizualizarea fragmentelor de acizi nucleici :
- colorarea gelului: bromura de etidiu, Syber Green, EvaGreen,
GelGreen, GelRed sau
- Colorarea tamponului: bromura de etidiu
ELECTROFOREZA
-
ELECTROFOREZA
-
Tipuri de electroforeza
In functie de suportul folosit:
1. Electroforeza in solutie libera = electroforeza capilara
2. Electroforeza pe diferite suporturi: hartie, film, geluri
In functie de planul de electroforeza: 1. Electroforeza orizontala acizi nucleici 2. Electroforeza verticala - proteine
ELECTROFOREZA
-
Electroforeza pentru acizi nucleici 1. In gel de agaroza
2. DGGE (denaturing gradient gel electrophoresis): electroforeza in gel in
gradient denaturant
3. TGGE: (temperature gradient gel electrophoresis): electroforeza in gel in
gradient de temperatura
- Ambele metode sunt folosite in domeniul biomedical (mutatii) si ecologie
microbiana
4. PFGE (pulse field gel electophoresis): electroforeza in camp pulsatoriu
- Gel de agaroza, dar voltajul este schimbat in 3 directii (1 catre centru
gelului, 2 care actioneaza intr-un unghi de 60o)
- Pentru genotipare, epidemiologie moleculara
ELECTROFOREZA
-
DGGE
ELECTROFOREZA
-
Electroforeza pentru separarea proteinelor 1. PAGE: in gel de poliacrilamida
2. SDS-PAGE: electroforeza in conditii denaturante
- Agenti de denaturare: SDS, uree si formamida
1. IEF (focusare izoelectrica): se realizeaza intr-un gradient de pH, fiecare
proteina migrand pana atinge punctul unde pH = pI
2. 2DGE (Two-dimensional gel electrophoresis): IEF si SDS-PAGE (pH
izoelectric si MM)
ELECTROFOREZA
-
ELECTROFOREZA
-
ELECTROFOREZA
-
Electroforeza biochimie clinica Electroforeaza proteinelor serice: albumina, 1 globuline,
2 globuline, 1 globuline, 2 globuline, globuline - malnutritie, malabsorbtie, sindrom nefrotic, neoplazii,
hepatita, boli autoimune
Electroforeza hemoglobinei anemie Electroforeza lipoproteinelor boli cardiovasculare
ELECTROFOREZA
-
Pentru evidenierea complexelor Ag-Ac se folosesc moleculele indicator pentru marcarea unuia dintre reactani, de obicei a anticorpilor. Cele mai folosite teste sunt acelea care folosesc un anticorp secundar marcat, pentru a evidenia legarea anticorpului primar de antigen.
Anticorpul secundar poate fi marcat cu: - radioizotopi - fluorocromi - substane chemiluminiscente - enzime Toate testele cu molecule marcate se pot realiza n dou variante:
- competitive i - necompetitive
METODE IMUNOLOGICE- ELISA
-
ENZIMA SUBSTRAT
PEROXIDAZA DE HREAN (HRP) OPD (o-phenylenediamine)
TMB (3,3',5,5' tetramethylbenzidine)
DAB (diaminobenzidina)
ABTS (2,2'-azino-di [3-ethylbenzthiazoline]
sulfonate)
5AS
FOFATA)A ALCALIN PA pNPP (p-nitrophenylphosphate) BCIP/NBT (5-bromo- 4-chloro-3-indolyl-
phosphate/nitroblue tetrazolium)
-GALACTOZIDAZA (GAL) ONPG (o-nitrophenyl-D galactopyranoside)
MUG (4-methylumbelliferyl galactoside)
UREAZA Uree bomcresol
METODE IMUNOLOGICE- ELISA
-
n testele competitive, toi reactivii se adaug simultan n reacie, iar Ag marcat intr n competiie cu Ag nemarcat al eantionului, pentru un numr limitat de situsuri de legare ale anticorpilor. Cantitatea de marker legat este invers proporional cu concentraia Ag din eantion: cu ct este detectat mai mult marker, cu att concentraia Ag n eantion este mai mic.
METODE IMUNOLOGICE- ELISA
-
n testele necompetitive, antigenul din eantion se combin cu anticorpii n exces fixai de faza solid. Anticorpul absorbit pasiv pe o faz solid este anticorp de captare. Antigenul necunoscut din eantionul analizat reacioneaz cu anticorpul de captare. Dup splare pentru ndeprtarea Ag nelegat, n reacie se adaug al doilea Ac marcat. n acest caz, cantitatea de marker este direct proporional cu cantitatea de Ag din proba analizat.
METODE IMUNOLOGICE- ELISA
-
METODE IMUNOLOGICE- ELISA
-
METODE IMUNOLOGICE- ELISA
-
VA MULTUMESC PENTRU ATENTIE !