1

Culturing Human Cells: Optimizing Growth Conditions for Immunotherapy 

Webinar October 1, 2014 

 [0:00:00]  Slide 1  Sean Sanders:  Hello, everyone, and a very warm welcome to this Science/AAAS webinar. 

My name is Sean Sanders and I'm editor for custom publishing at Science and I will be the moderator for today's webinar presentation, "Culturing Human Cells: Optimizing Growth Conditions for Immunotherapy". 

   In  our  webinar  today,  we  will  broadly  discuss  the  process  of 

immunotherapy,  as well  as  examine  in more  detail  some  of  the most critical steps necessary to generate a therapeutic dose of modified cells. It  is  one  thing  to  grow  human  cells  in  culture  for  research,  but  the isolation  and  culture  of  high  quality  cells  that  will  eventually  be  re‐injected back into a donor is quite another. 

   Growth  and  survival  needs  to  be  optimized  and  quality  control  is 

paramount.  There  is  often  only  a  single  opportunity  for  successful treatment,  so  the  chances  of  success  need  to  be maximized,  including high  yield  isolation  of  good  quality  cells  from  patients,  cell  culture conditions, cell characterization, and reperfusion back into the patients. 

   Our speakers today will describe how  immunotherapy  is currently being 

applied  in the clinic, as well as discuss some of the  factors necessary to optimize the culture conditions to produce cells suitable for clinical use. It is my great pleasure to introduce those speakers to you now. 

   To my  left  is Dr. Laurence Cooper  from MD Anderson Cancer Center  in 

Houston, Texas. Next to him  is Dr. Michelle Janas from GE Healthcare  in Cardiff, Wales. A warm welcome to both of you! Thanks for being here. 

 Dr. Laurence Cooper: Hello!  Dr. Michelle Janas:  Thank you.  

2

Sean Sanders:  Before we  get  started,  some  important  information  for  our  audience. Note  that  you  can  resize  or  hide  any  of  the windows  in  your  viewing console. The widgets at the bottom of the console control what you see. Click on these to see the speaker bios or download a PDF of the slides. 

   Each  of  our  guests  will  give  a  short  presentation  followed  by  a  Q&A 

session,  during which we will  address  questions  submitted  by  our  live online  viewers.  So  if  you're  joining  us  live,  start  thinking  about  some questions now and submit them at any time by typing them into the box on  the  bottom  left  of  the  viewing  console  and  clicking  the  "Submit" button.  If  you don't  see  this box,  just  click  the  red Q&A widget  at  the bottom of the screen. 

   Please do remember to keep your questions short and concise as that will 

give them the best chance of being put to our panel. You can also  log  in to  your  Facebook,  Twitter  or  LinkedIn  accounts  during  the webinar  to post  updates  or  send  tweets  about  the  event.  Just  click  the  relevant widgets at the bottom of the screen. For tweets, you can add the hashtag #sciencewebinar. 

   Finally, thank you to GE Healthcare for sponsoring today's webinar. Now, 

I'd like to introduce our first speaker, Dr. Laurence Cooper.  Slide 2    Dr.  Cooper  is  a  tenured  professor  at  The  University  of  Texas  MD 

Anderson  Cancer  Center  in  Houston  with  joint  appointments  in  the Division of Pediatrics and Department of Immunology. He is section chief of  Cell  Therapy  at  the Children's  Cancer Hospital  at MD Anderson  and associate director of the Center for Cancer Immunology Research. 

   He was recruited to join the Children's Cancer Hospital in 2006 where he 

cares  for  children  undergoing  bone marrow  transplantation  and  leads scientific efforts  to develop new  treatment approaches which pair gene engineering with immunotherapy. 

   Dr. Cooper is also undertaking the first protocols using a new approach to 

gene  therapy  based  on  the  Sleeping  Beauty  transposon/transposase system and has helped develop clinical‐grade activating and propagating cells for numerically expanding lymphocytes for human applications. 

   A warm welcome, Dr. Cooper!  Slide 3 

3

 Dr. Laurence Cooper:  Thank you very much, Sean, and thank you for inviting me and a good day 

to  everybody.  I'm  going  to  talk  to  you  for  about  the  next  20 minutes about how bioprocessing can be used for advanced T cell therapy. 

 Slide 4    This  is  based  on  two  core  principles  really,  the  premise  as well  as  the 

promise of adoptive cell therapy. In other words, the administration of T cells  to  patients,  and  I'm  going  to  focus most  of my  remarks  for  the application for oncology. 

   First off, the premise is that T cells could be manufactured or modified ex 

vivo  to  improve  their  therapeutic  potential  in  vivo,  and  this  has  really driven  a new  field. And  increasingly,  a  field  is being  commercialized  in which T cells are administered to patients in distress. 

   There have been some outstanding examples where T cells, for instance, 

have  been  genetically modified  to  target  a molecule  called  CD19,  and there've been Lazarus moments where  those CD19 specific T cells have been  introduced  into patients and have resulted  in dramatic anti‐tumor effects. 

   This sets  the stage now really  for understanding how bioprocessing can 

be used to generate T cells that have specificity and potency, and using essentially the tricks of the trade, how we can do cell culture, how we can do genetic modification to generate a biologic product. 

 Slide 5    First off, to give some sense of the history and really before 2013 when 

Science Magazine had named T cell therapy among its signature events of the last year is that T cells were being produced at medical centers really across the planet. 

 [0:05:03]    I'll comment really more on the North American experience here where 

individual investigators and teams were producing those T cells and they were being infused there at points‐of‐care. 

   In other words, a patient would come to a medical center. He or she will 

get  their  T  cells  manufactured  at  that  medical  center  and  then  the biology would be uncovered at a particular site. That has driven the field 

4

to date and it's allowed for both advances, but increasingly it's becoming under question as we think about commercializing or industrializing the T cell therapy space. 

   For  instance,  if T cells are  infused at multiple points of care, then  it has 

essentially limited the number of patients that can be infused. What's the size,  for  instance,  of  the  manufacturing  suite  that's  available  at  any particular medical  center  and  how many  patients  could  be  processed through that manufacturing site? 

   It also has  limited  the numbers of T cells  that are manufactured and  in 

some ways, our trials are powered to the maximally‐manufactured dose, not  necessarily  the  maximally‐tolerated  dose.  How  many  flasks,  for instance, can you grow to generate the therapeutic product? 

   The  distribution  of  T  cell manufacturing  across multiple  campuses  has 

fueled a  lot of  innovation, but has uncovered  real heterogeneity  in  the manufacturing  processes.  How  I,  for  instance,  grow  T  cells  at  the MD Anderson Cancer Center may be a lot different, for instance, than how T cells  are  grown,  for  instance,  at  the  University  of  Pennsylvania,  Sloan Kettering, NCI, et cetera. 

   As a result of this, and I think this is where I will spend a lot of time today, 

the bioprocessing of  these T cells,  the art and  the science of growing T cells is asynchronous essentially with the manufacturing process. In other words, we are generating ideas in the good laboratory practice area that are  out  of  step  with  what's  actually  being  applied  in  the  good manufacturing practice facilities. 

 Slide 6    Many medical  centers,  ourselves  included,  have  developed  a  code  of 

conduct where we've assembled a team approach. For instance, we have a  research group  that does  fundamental biology uncovering new  ideas, for instance, around the T cell and its ability to target tumor cell. 

   That's passed to a development group, typically speaking, growing the T 

cells  in  an  organized way  under  good  laboratory  practices  that  they're going  to hand off  to  the manufacturing  team who makes  the biological product. It's handed off again to the trials team so that those T cells can indeed be  infused  into patients, and then we have to make a statement about authenticity. Did something actually happen for that patient? 

 

5

  Here, we're joined by our colleagues who understand correlative studies. A simple question, do the T cells persist in that patient? Do they home in that patient? 

   All of this is wrapped up under a complex web of regulatory affairs both 

at the institutional level as well as the federal level. The reason to set the stage here for you is that all of this has to be taken into account with the idea  that  you're  manufacturing  a  cell,  that  you're  undergoing bioprocessing. 

 Slide 7    This may not be immediately visible to our audience, and I'll drill in just a 

second, but  I want to spend a few moments with you  just exploring the regulatory  landscape because anything that we do  is the manufacturing suites has to essentially be approved. What is that approval process? 

 Slide 8    So I've taken the last slide and divided it really into two for the purposes 

of just blowing up the text so you can see it. You can see now that there are a variety of boxes  that have  to essentially be passed, and  these are stage gates. 

   For instance, if one is going to source out the viral vector, if you're going 

to have a third party contractor generate your lentivirus, your retrovirus, or for instance in our world, in our DNA plasmids, who's doing that? What is the authenticity of that product? What are the checkpoints essentially that allow the regulatory agencies to approve that? 

   What are the processes that you would take to migrate your  idea, your 

platform technology, through essentially the burdens of institutional and federal  review?  Well,  if  it's  in  the  federal  review,  you  have  to  pass through the NIH‐OBA, in other words, the RAC. Your responses to the so‐called Appendix M documents are critical  in their ability to  look at your technology and ask questions about your technology. 

   And then in parallel, you are working with your institution to go through 

the various regulatory bodies, for instance, your CRC, your IBC, et cetera, to achieve regulatory compliance. 

 Slide 9  

6

  Again,  the  slide  is  sort of  a  two‐step  slide here  and  I'm  giving  you  the second half of  this. You  can  see  that as  the  regulatory approvals  come into focus, you still continue to have to meet the needs of the federal and the institutional regulatory bodies. 

   Putting all this together allows you to open your trial and the reason to 

emphasize  this  is  that  when  teams  are  developing  the  bioprocessing steps, it's critically important to keep in mind that at the end of the day, you're going to need federal regulatory approval. 

 [0:10:04]    There are many outstanding ideas and advances that are being practiced 

in many major centers, as well as  in our colleagues  in  industry. Some of those,  for  instance, will never  see  the  light of day because  they're not essentially ready for regulatory approval and therefore, compliance. 

 Slide 10    I give  the audience  just a  few bullet points here of some  links  that you 

can  turn  to  if  you wish  to  learn  a  little  bit more  about  the  regulatory affairs, particularly the federal landscape. 

 Slide 11    Now, I'd like to really tunnel into what it is to do bioprocessing, what it is 

to make a T cell, and I have divided my comments here about the product actually  touching  the  patient,  as  well  as  the  idea  of  what  it  is  as  a biologist touching the product. 

 Slide 12    We're going to just spend the first slide looking at what it is when a T cell 

flows  into a human being, and  this  isn't necessarily  the  topic of  today's webinar,  but  I'll  just  introduce  the  concepts  to  the  audience  because these are the types of things that have to be thought about to generate a product  that has  therapeutic optimism, and we'll  just highlight some of them here. 

   For  instance, what  is  the  recipient and  the environment  that he or  she 

has when those T cells are infused? Are you going to, for instance, infuse patients  that have a very high  tumor burden? We've  seen examples of where that actually can result in dramatic anti‐tumor effects, but those T cells can be synchronously activated by essentially seeing the bioburden 

7

of antigen, for  instance, T cells that are targeting CD19 or activated and could  produce  a  lot  of  cytokines  that  can  actually  injure  the  patient during essentially that patient's journey to complete response. 

   Are you going to infuse your T cells with cytokines? Are you going to give 

them IL‐2? Are you going to give them IL‐7, IL‐15, these types of cytokines that activate T cells through the common gamma chain? Are you going to infuse one dose of T cells or multiple doses of T cells? How are you going to power your trial in terms of intra‐patient dose escalation versus inter‐patient dose escalation? 

   Again, a  lot of biology here, a  lot of variables, and  I want  to make  the 

audience essentially aware that as T cells enter  into the human system, as they're applied, essentially one would have to uncover and think about each one of these variables that I've noted on the slide. 

 Slide 13    Let's just now roll back the processing,  if you would, and go to the good 

manufacturing practice facility. Let's think about it now in terms of what it  is to set up a bioprocessing event to generate T cells that have a code of conduct that would come, for instance, in the autologous setting from the patient, go through the manufacturing process, and then be returned to that patient. 

   This slide now  is  in  large  format print so that  the audience can see.  I'm 

just  going  to  pick  out  a  few  of  these  boxes  really  as  vignettes  to  go through and start to understand the variables that would touch on each of these steps. I would add that I think a successful manufacturing team has to have the entire constellation in mind if you're going to achieve the types of products that are going to meet essentially your patient's needs. 

   Let's begin really  in the box at the top where we're now tunneling  in on 

the idea of how do you source the T cells? Where are they coming from?  Slide 14    For  instance, many practitioners are obtaining T cells  from  steady‐state 

apheresis, and steady‐state apheresis really is the word that's used to say that  we're  collecting  T  cells  by  apheresis  in  the  absence  of  a  growth hormone, for instance, GCSF. 

   Well,  that  steady‐state  apheresis  can  be  accomplished  under  standard 

operating  procedures.  There's  nothing  particularly  special  about  this 

8

particular moment  except when  you  start  to  think  about what  it  is  to apherese a patient who has, for instance, received a lot of chemotherapy, who may be lymphopenic. 

   Those numbers of T cells that are circulating in that patient, once those T 

cells  are  being  collected  in  the  drum,  in  the  spinning  drum  of  the apheresis apparatus, it can be very few and it can be quite difficult for the technician in the apheresis center, for he or she to introduce the probe to just suck out the river of white blood cells when that band of white blood cells is few and far between. 

   It's  one  thing  to  mobilize  patients  with  GCSF  and  suck  out  the 

immobilized white blood cell product when  there are  large numbers of circulating white blood  cells.  It's another  thing when you  consider how you harvest T  cells  from patients  that are  lymphopenic using  the  same type of apparatus. 

   For instance, in our program and I think for others in the community that 

are online  today, we  think about alternatives  to apheresis. Apheresis  is expensive.  It's actually  invasive.  It hurts.  I don't know how many of  the audience that have been out there who've been platelet donors, but  it's obviously a life‐benefitting thing and you should become platelet donors, but  essentially  you  have  to  have  catheters  in  your  arms  to  become  a donor. 

 [0:15:12]    Contrast  that  with  a  simple  venipuncture  for  the  purposes  of  blood 

banking, giving up a unit of blood,  for  instance,  if you were donating to the Red Cross. Well, that same code of conduct could be the type of way that  you harvest T  cells  for  the purposes of  then  going on  and making your T cell product. 

   So  why  is  it  that  we  couldn't  get  T  cells  from  using  common  blood 

banking  processes? Again,  these  are  the  types  of  things  and  questions that  are  on  our minds  as we  develop  our  code  of  conduct  to make  a biologic product. 

   I also add another bullet point that circulating T cells  in adult blood are 

not the only source of T cells. Those, for  instance, are generating T cells now from neonatal blood or in other words, umbilical cord blood. 

 Slide 15  

9

  Let's  return  to  our  diagram  and  just  tunnel  in  on  another  point  of discussion, and  that  is, what  type of environment are you going  to use when  you  propagate  the  T  cell?  What  are  those  elements  that  are essentially going to be used to activate the T cell? 

 Slide 16    The first question  is do you want to activate the T cell at all? We have a 

general  understanding  that  those  T  cells  that  are  activated  certainly through non‐physiologic mechanisms undergo a program event  in which they're differentiated and can actually turn to a terminally differentiated state  in  that  they  could not  recycle  their effective  functions. They're  in some ways one‐hit or one‐kill wonders. 

   It  seems  suboptimal  to be making T cells  that would participate  in  that 

type of biology, so a  thought  is, can you harvest T cells  from  the blood and minimally manipulate them in short periods of culture time, or if you are indeed culturing them, culture them under physiologic conditions? 

   There's a variety of shots on goal here, the ways to tickle a T cell,  if you 

would, to activate it can be done using artificial means and there are two main areas there. For  instance, there are beads. These beads come  in a variety of sizes, microbe scale to nanoscale. 

   These  beads  are  decorated  with  molecules  typically  derived  from 

antibody  that would  crosslink,  for  instance, CD3 or  crosslink CD28, and they would  be  used  to  try  and  provide  a  physiologic  growth  signal  to those T cells to activate those T cells, to propagate them to numbers, to swell the number of T cells that are actually in the tissue culture to meet some type of therapeutic dose. 

   Again,  I  return  the  audience  to  those  initial  comments  with  if  you're 

dosing  that  patient  to  have multiple  infusions  or  if  you're  dosing  that patient to have a dose escalation,  it's going to be critically  important to make sure  that your manufacturing approach, your ability essentially to grow those cells can be met. 

   You don't have to use beads. You can use cells as essentially the ability to 

activate a T cell  to proliferate. Here  I'm referring  to,  for  instance,  these so‐called  artificial  antigen  presenting  cells  or  I  like  to  refer  to  them  as activating and propagating cells. 

   These cells are  typically derived  from  tumor cells. We use K562 cells as 

our  source  material.  Many  in  the  community  use  the  same  type  of 

10

cellular template and these are decorated with molecules that allow the T cell to have some type of co‐stimulation event, for instance, through 4‐1‐BB  ligand  or  CD28  along  with  an  activation molecule,  pick  one,  for instance, anti‐CD3. 

   Into that constellation then of the propagating technology flows ancillary 

material  that  also  has  to  be  sourced  under  the  appropriate  control systems  for  good  manufacturing  practice.  Here,  I'm  referring  to,  for instance, the soluble cytokines. What other growth factors are you going to add? There's terrific  literature now commenting on the  idea that you would  add  IL‐7,  1521,  that  would  allow  "younger"  T  cells  to  be propagated through the bioprocessing steps. 

 Slide 17    Let's return again to the diagram and now tunnel into another particular 

piece of the puzzle, and that is the type of gene transfer event.  Slide 18    Here, I've listed the common approaches to introduce a transgene into a 

T  cell.  For  the most  part, we  should  just  direct  our  comments  for  this particular  moment  to  the  idea  that  we're  introducing  a  targeting molecule;  for  instance, we're  introducing  a  T  cell  receptor  complex  or introducing a single chain chimeric antigen receptor or CAR. 

   There are a variety of ways to put these  immunoreceptors  into a T cell. 

You  can  use  virus.  There  are  two  major  flavors  of  virus.  There's  the retrovirus  and  the  lentivirus,  and  the  audience will  have  its  particular reasons for choosing one over the other. 

   At  the Anderson campus, we have brought  to practice a new approach 

based on non‐viral  gene  transfer.  It has  its merits,  as well  as  it has  its detractors.  The  way  we're  doing  it  is  using  supercoil  DNA  plasmids derived  from  the  so‐called  Sleeping  Beauty  system  that  is  a transposon/transposase  system  that  can  be  used  to  stably  introduce  a chimeric antigen receptor or a T cell receptor. 

 [0:20:11]    There's also an emerging literature on introducing immunoreceptors into 

T  cells  that  are  not  stably  integrated.  Here,  I'm  referring  to  the electrotransfer  of  in  vitro  transcribed  RNA,  the  codes  for  a  chimeric antigen  receptor,  and  then  the physiologic decay of  that mRNA means 

11

that the introduced immunoreceptor decays over time. This is something that is expected and enjoyed to try and increase the therapeutic window of this particular way of gene transfer. 

   Here,  the  audience  is presented with  a  list of  gene  transfer modalities 

and it will be up to the individual team to pick which modality meets the need  for  their  particular  design  of  experiments  and  their  particular patient, but again, I'm introducing the idea that there are many different types of variables that are needed to be understood. 

 Slide 19    We return to the diagram and we're going to tunnel into another piece of 

the puzzle.  Slide 20    That  is  the  types  of  propagation  technology  where  you're  looking  at 

different  modalities,  as  I've  talked  about,  beads,  artificial  antigen presenting  cells,  et  cetera,  and  then  how much  time  are  you  going  to allow those T cells to exist in culture. 

   We  alluded  to  the  fact  that  T  cells  that  are  propagated  for  very  long 

periods  of  time  might  undergo  replication  senescence.  The  telomere length might be shortened and they essentially would have very curtailed in vivo persistence. 

   How can one, for instance, overcome that? Do you use IL‐21 for instance 

to  activate  through  the  STAT  pathway  to  essentially  up‐regulate  the telomerase activities,  to keep your  telomere  lengths  lengthened  in  that propagation  time  period?  Again,  these  types  of  biology,  these fundamental discoveries  can  inform on  the  types of bioprocessing  that one would use to advance your therapeutic product to the clinic. 

 Slide 21    The last time we'll return to this diagram and again, we're just pulling out 

some ideas here, and that is the final product formulation.  Slide 22    I think many of us in the community share the idea that for T cell therapy 

to  advance,  you  have  to  be  cryopreserving  your  product  and  then infusing  it  at  the  time  essentially  of  need.  This makes  a  lot  of  sense 

12

because  many  of  our  patients  are  medically  fragile  and  they  don't necessarily meet eligibility criteria at a particular  time  that's convenient for  the manufacturing  facility, whereas  if  you  had  those  products  that were essentially cryopreserved, they can be  infused when the patient  is "ready". 

   What  does  that  look  like  in  terms  of  manufacturing?  What  are  the 

cryoprotectants  that we're using?  Is  this  idea  that DMSO  is going  to be the way of preserving T cell going forward or is there a new biology? Are there new ways of freezing and thawing cells to maintain viability? Again, these are variables that are critically important for us to make a product that would essentially have therapeutic potential. 

 Slide 23    Let's  now  assume  that  that  product  has  been made  and  that  you've 

digested  that  large  table  and  those  variables.  The  bioprocessing  team also has to have authenticity. We have to have a sense that those T cells that are being made meet a set of release criteria. 

   Those  release  criteria  come  in  two major  flavors.  One  is  actually  not 

release criteria at all. It's in process testing, but this is critical for us to not only understand the types of products that are being made today, but in order to prepare us to make next generation products tomorrow. 

   One of  the  types of  correlative  studies  that  can be undertaken,  I  share 

with  the audience a paper  that  is an  immunology  review and  this  table essentially shows some of those  in process and  in testing that  I take on with my team back at the MD Anderson campus, and you can read that with me or offline. 

 Slide 24    I also reveal the type of release testing that makes up the certificate of 

analysis.  These  are  the  go/no  go  decisions  that  would  essentially  say whether  or not  that  T  cell  product  could  be  infused  and  you  can  read them along with me. Again, these are published material. 

 Slide 25    As we get to the closing comments, I want to leave the audience with this 

idea  that  the  ability  to  manufacture  T  cells  is  in  really  two  broad campuses.  One  is  that  the  manufacture  product  being  essentially generated at multiple points of  care.  In other words, we're making  the 

13

products where  the patients  reside  at different  campuses  really  across the globe now. 

   That  is  to  be  contrasted with  an  idea  that  actually  is  being  populated 

increasingly by industry in which there's a centralized manufacturing that T  cells  will  flow  to,  to  be made,  and  then  will  be  released  and  then distributed out to multiple points of care. 

   The  comments  I've  shared with  you  around  how  bioprocessing will  be 

used  to  optimize  the  T  cell  product will  essentially  influence  how  you generate  products  using  both  of  those  types of  schema, distributed or centralized manufacturing, again, important variables to consider. 

 [0:25:14]  Slide 26    Looking towards the future, there are a number of challenges that I share 

with you and that we're also thinking about  in our manufacturing teams in that at the current time, the resources that are available to undertake clinical trials are currently  limiting the amount of bandwidth we have to take  innovative  ideas from the development team to the manufacturing team. 

   We're  also  in  a  frame  of  mind  that  one  technician  is  producing  one 

product. This is not necessarily the case, but it gives the audience a sense of  the  amount  of  personnel  and  sweat  equity  that's  needed  by  these terrific technicians that we employ  in our GMP  facilities to manufacture those products. Essentially, the manufacturing of T cells is an art as much as it is a science of the present time. 

   The reason for that  is that there are simply too many variables that  I've 

alluded  to  and  there's  essentially  two  little  infrastructure  in  place  to adequately inform on what products, on what ideas to take forward from the GLP  to  the GMP process. We  really need better  correlative  studies that allow us to say which idea is a go and which is not a go. 

 Slide 27    As we go forward and conclude now for my comments, I'll just share this 

slide here and  I want  to accelerate  just a  little bit  so we have  time  for questions. You can read these along with me,  in this  idea that there are really some  important milestones  to be made,  for  instance, automation being a critical one to reduce the demands on our technical colleagues. 

14

 Slide 28    This  is  how  I  think  about  cell  therapy.  It's  a  fun  slide.  This  is  how,  for 

instance, I talk about T cell therapy, how Cooper explains it, and you can read the rest of the slide. These essentially circles that are popping up on your screen show you that what we think about today, the ideas we have for a particular patient may not meet what the needs of the patient really are. 

   Again, this  idea that we can close the  loop here, we can have bench‐to‐

bedside and actually iterative science, going back from the bedside to the bench,  is  critically  important  in  the  bioprocessing  world  as  we  make better products.  

 Slide 29    In conclusion, the distribution of T cells, getting essentially our ideas from 

the GMP facilities to the patient is actually a limiting step. We have many different variables that need to be addressed and we have an  imperfect knowledge base. This is what makes it both exciting as well as a challenge to be on this field. 

   I would  submit  to  the audience  that  the human experience  is  the only 

valid  experience.  We  have  to  do  a  better  job  in  our  community, accelerating the pipeline and the translation time to go  from essentially the manufacturing  suite  to  the bedside,  and  there  really  is  an ongoing need to refine our processes. 

 Slide 30    Thank you very much  for  listening  to me.  I appreciate you bearing with 

me  and working  through  those  slides,  and  I'm  available  offline  if  you should wish to contact me. 

 Sean Sanders:  Great! Thank you so much, Dr. Cooper. We're going to move right on to 

our second speaker today, and that is Dr. Michelle Janas.  Slide 31    Dr. Janas  is trained as an  immunologist, primarily  in the development of 

the adaptive  immune system. Dr. Janas pursued postdoctoral training at the  Queensland  Institute  of  Medical  Research  in  Brisbane  and  the 

15

Babraham Institute in Cambridge in the United Kingdom before becoming a senior scientist for cell therapy technologies at GE's Cardiff, Wales site.  

   In  her  current  role  at  GE  Healthcare,  she  is  focused  on  developing 

solutions  that  allow  cell  therapies  to  become  a mainstream  treatment option. 

   Welcome, Dr. Janas.  Slide 32  Dr. Michelle Janas:  Thank you, Sean, and thank you to everybody for logging in today.  Slide 33    T cell  therapies offer  the  latest  in new cancer treatments. However,  for 

every  T  cell  dose  that's  generated,  there's  a  very  complex  workflow behind it. 

   Broadly speaking, cells are taken from the patient either through a blood 

draw or  from a TRIM or biopsy. T cells are then separated and selected for. The T cells are activated and expanded in culture, and in some cases, the  T  cells  are  genetically modified,  so  they  express  a  unique  tumor‐recognizing a receptor. The T cells are then harvested, concentrated, and infused  back  into  the  patient.  It's  this  workflow  that  causes  many problems for scientists, clinicians, and regulatory bodies alike. 

 Slide 34    To illustrate that, for example, if a typical cell dose for an adult is 10⁸ cells 

per kilogram, for an adult male, that may equate to 10 billion cells, and using traditional tissue culture techniques, that would equate to 50 tissue culture  flasks. This  is neither safe nor practical and alternative methods need to be found and developed. 

 [0:30:10]  Slide 35    When  considering  those  alternative  methods,  there  are  several  key 

points  to consider. First  is  that any  solution must be  scalable. The cells should be able to be cultured within a single vessel and that vessel needs to  be  able  to  accommodate  the  increasing  volumes  as  this  culture progresses. 

16

   The  system  should be automatable and  this  is  to  reduce  the  chance of 

human  error  through  the manufacturing  process.  The  cells  should  be contained within a single use container to eliminate any potential cross‐contamination with other patient cells. The system should be closed and that's to eliminate the chance of contamination with adventitious agents through the handling of the product. 

   Finally, the process should be robust and compliant, and as Laurence was 

talking about, it needs to meet the approval of regulatory agents such as the FDA. 

   In  terms  of  the  expansion  phase  of  this  process,  growing  cells  in  a 

bioreactor has been adopted across the field.  Slide 36    The Xuri Cell Expansion Systems have been used  to generate T cells  for 

therapy. Xuri is the name that some of you might have previously known as the wave bioreactor. 

   In the Xuri bioreactors, cells are grown within a single plastic bag that sits 

on top of a heated rocking platform. The rocking platform keeps cells  in suspension  and  it  allows  for  sufficient  oxygen  transfer  through  a  large volume of media so that the cells can grow in normoxic conditions. 

   Finally, the bioreactor allows for media perfusion, which enables cells to 

grown at much higher cell concentrations than what they would be under normal traditional tissue culture techniques. 

 Slide 37    Let's concentrate on perfusion. What is perfusion? Well, it's a very simple 

process of removing media from a culture and adding fresh media to the culture while keeping the entire volume of the culture the same. This is a way to remove waste and feed cells simultaneously. 

 Slide 38    Now, I want to demonstrate today the effect the perfusion has on T cells 

grown  in  bioreactors.  The  experiment  or  protocol  we  use  is  to  take peripheral blood mononuclear cells, activate them with beads  in a static culture, and after  five days when  the T  cells are  in exponential growth phase, they're transferred on to the Xuri bioreactor. 

17

   The  cells  are  grown  for  an  additional  nine  days  and  during  that  time, 

perfusion  is enabled.  In  terms of  the  amount of perfusion, we use  cell concentration as a guide. For example, when cells reach two million cells per mille, 50% of the culture  is perfused. That's equivalent to 500 milles from a one‐liter culture in a 24‐hour period. 

   When the cells are between 10 million and 15 million cells per mille, we 

increase the perfusion rate to 75% of the culture volume. Once the cells reach  about  15 million  cells per mille, we perfuse  100% of  the  culture media every 24 hours. This method is scalable for both one‐liter and five‐liter culture volumes. 

 Slide 39    When  we  follow  that  experimental  protocol,  we  generate  a  growth 

kinetic curve that  looks  like the one you can see on the screen now. So from a starting population of 15 million cells of PBMCs, we finish typically with 20 billion  T  cells,  and  that's  a 400‐fold expansion.  The  cells  reach much higher cell densities than they would using traditional tissue culture techniques and  in  this example here,  the  cells have  reached 20 million cells per mille. 

 Slide 40    If we set up another bioreactor treated  in the exactly the same way but 

without perfusion, we find that at about day ten of culture, which is three days after perfusion would've normally been initiated, the cells go into a growth  arrest. We  find  that  the  cells  in  this  case  don't  reach  densities above eight million cells per mille. 

 Slide 41    We  also  find  that  the  cells  that  are  growing  in  conditions  without 

perfusion begin to die and they have  loss of viability. And by the end of culture, Day 14, we're  typically  looking at a population of 80%  viability compared  to  the  T  cells  that  are  grown  in  the  presence  of  perfusion where their viability is typically above 95%. 

 [0:35:13]  Slide 42  

18

  I wanted to have a look at the reasons why this growth arrest occurs and this  loss  of  viability  occurs.  The  first  thing  we  looked  at  was  the concentrations of two key metabolites that we see in culture, lactate and ammonia. Lactate  is the product of glycolysis and ammonia  is a product of glutamine metabolism. 

   We  found  that  in  the  absence of perfusion, both  lactate  and  ammonia 

accumulated  in  the  culture  and  remained  at  high  concentrations, whereas  where  perfusion  is  enabled,  these  metabolites  are  removed from the culture and held at much lower concentrations. 

   Now, both  lactate and ammonia have been shown to  inhibit cell growth 

and  cause  loss of  viability  in  immortalized  cell  lines, but we wanted  to demonstrate what happens when  lactate  is cultured  in  the presence of primary T cells.  

 Slide 43    To do  this, we  took T  cells  that were  in  the exponential growth phase. 

The  cells  were  washed  and  re‐plated  in  the  presence  of  increasing concentrations of lactic acid. The cells were left for 24 hours and then the fold expansion and the viability of the cells were measured. 

   We found that at above 20 millimole of lactic acid or 20 millimole of lactic 

acid and above, we found that there was growth inhibition of the T cells, and that 30 millimole of lactic acid and above, we saw a loss of viability. 

   This  then demonstrates  the  real  importance of making  sure  that  these 

metabolites  are  removed  from  culture  in  order  to maintain  a  healthy bioreactor culture and in order to maintain the health of the T cells. 

 Slide 44    Perfusion not only  removes metabolites, but  it  also ensures  that  there 

are  sufficient  growth  factors  around.  We've  also  measured  the concentration of glucose in the media and IL‐2. 

   In  the presence of perfusion, both of  these  growth  factors  are held  at 

constant  concentrations,  whereas  in  the  absence  of  perfusion,  the concentrations of both of these growth factors drops, and  in the case of IL‐2, have become negligible by the end of culture. 

 Slide 45  

19

  We  know  that  glucose  is  an  important  energy  source  for  T  cells when they're expanding, but what about IL‐2? We wanted to look at this more closely.  In this case, again, we set up parallel bioreactor cultures except one  of  the  bioreactors  was  cultured  with  perfusion  and  the  other without.  Except  in  this  case,  in  the  culture  without  perfusion,  daily injections of IL‐2 were given and the concentration of IL‐2 that was given to  the  bioreactor  was  the  equivalent  to  that  being  delivered  through perfusion in the parallel bioreactor. 

   We found that these additions of IL‐2 did not really abrogate the growth 

arrest that we see  in the absence of perfusion. However, the viability of these T cells was equivalent  to  that of T cells grown  in  the presence of perfusion. This data  shows  that  IL‐2  is  really critical  for maintaining  the viability of T cells throughout the culture. 

 Slide 46    Perfusion  is  important  for  growing  T  cells  of  high  cell  densities  in 

bioreactor  conditions.  Now,  I  want  to  just  switch  to  talk  to  you  and introduce  to  you  about  another  method  for  determining  cell concentration in bioreactor cultures. 

 Slide 47    And  by  extension,  I  will  also  introduce  to  you  a  way  to  automate 

perfusion. Going back to our previous slide, one of the key components of a manufacturing process for T cell therapies is that the system should be a closed one, and that is to eliminate the chance of any contamination that might happen. 

   However,  in order to determine the concentration of cells  in the Cellbag 

and  therefore  in order  to determine  the perfusion  rate  that  should be set,  samples  need  to  be  taken.  And  when  samples  are  taken,  the sampling  port  is  opened  and  the  closed  nature  of  the  bioreactor  is compromised, although very briefly. 

 Slide 48    The  latest model of the Xuri Cell Expansion System, the W25, allows for 

the  continuous  monitoring  of  both  the  pH  in  the  media  and  in  the dissolved  oxygen  concentration.  An  optical  sensor  is  embedded  in  the bottom  of  the  Cellbag  and  is  connected  externally  by  an  optical  fiber cable. 

 

20

[0:40:09]  Slide 49    Dissolved oxygen  is a  relative measure of  the amount of oxygen  that  is 

dissolved  in the culture media. Saturation  is considered to be 100% and that  is what freshly prepared media has. However, media are  incubated in the presence of 5% CO2 and have a dissolved oxygen concentration of 95%, which is what we typically have when we culture T cells and we use 5% CO2. 

 Slide 50    We took continual measurements of dissolved oxygen throughout seven 

independent  bioreactor  cultures,  so  seven  independent  donors  were used, and we found that as we the concentration of the cells increase in the bioreactor, the concentration of dissolved oxygen decreases, and this is not a surprise. It makes perfect sense that the more cells that are in the culture, the more respiration that will occur, the more oxygen is used up, and the lower the dissolved oxygen concentration will be. 

   What we found that was surprising  is this relationship  is  linear and  it's a 

very  tight  relationship  with  an  R²  value  of  94%.  We  can  exploit  this relationship  and  use  it  to  extrapolate  the  T  cell  concentration  in  the Cellbag without having to take a sample. 

 Slide 51    For  example, when  the  dissolved  oxygen  concentration  is  at  60%,  that 

correlates to a cell concentration in the bag of 20 million cells per mille.  Slide 52    By  extension,  because  we  use  cell  concentration  to  set  what  our 

perfusion rate should be, we can use this relationship between dissolved oxygen and cell concentration to set perfusion rates. 

   For  example,  using  the  rates  that  I've  described  in  our  experimental 

protocol,  if  the  dissolved  oxygen  concentrations  are  between  75%  and 87%, we  should  set  the perfusion  rate  to be 50%. Also,  if  the dissolved oxygen concentration drops below 66%, we should use a perfusion rate of 100%. 

 Slide 53 

21

   Just to summarize then, throughout this talk, I've shown you that media 

perfusion  enables  cells  to  be  grown  at  high  cell  densities.  Perfusion  is important for both the addition of critical growth factors and the removal of  unwanted  metabolites.  I've  shown  you  that  dissolved  oxygen  is  a predictor  of  T  cell  density  and  I've  shown  you  that  dissolved  oxygen readings  can  be  used  to  set  perfusion  rates  and monitor  the  growth kinetics of T cell cultures without having to take a sample. 

 Slide 54    This work was completed by the GE Healthcare team  in Cardiff, UK, and 

the GE Global Research Center  in Niskayuna  in the USA. I'd  like to thank you for your attention. 

 Slide 55  Sean Sanders:  Great! Thank you so much, Dr. Janas, and many thanks to both Dr. Janas 

and Dr. Cooper  for  the very engaging presentations. We've got a  lot of questions  come  in,  so we're  going  to  get  right  to  those now,  the ones submitted by our live online audience. 

   Just  a  quick  reminder.  If  you're  watching  live,  you  can  still  submit 

questions  by  typing  them  into  the  text  box  and  clicking  the  "submit" button. 

 Slide 56    If  you don't  see  the box on  your  screen,  click  the  red Q&A  icon and  it 

should appear.    We've got a broad range of questions from the beginning to the end, so 

I'm going to throw one at you, Dr. Cooper, to start off with looking at the end of the process. 

   What is the success rate of T cell therapy that you've seen more broadly, 

and  then  more  specifically,  what  is  your  success  rate  of  the reprogramming process  in the T cell therapy? And also, this viewer asks what the time period is for the whole process. 

 Dr. Laurence Cooper:  Thank you. This  is  really getting at  the excitement  that T cell  therapy  is 

with  us  in  terms  of  the  types  of  anti‐tumor  responses  you  can  see  in patients.  

 

22

  I'm going to take the opportunity for this question actually and just parse it a  little bit more broadly, and  that  is  that T  cell  therapy, as  it's being practiced, I think has to be understood in the context of a patient. Here, let's just take one particular example. 

   There  is  a  chimeric  antigen  receptor  or  CAR  targeting  CD19  and  they 

come  in  two major  flavors  right now. What  I mean by  that  is  that  the activation molecules can be divided into T cell receptors or CARs that are activated  through  CD28 married  to  CD3  zeta  versus  4‐1‐BB  or  CD137 married to CD3 zeta. 

   Those  two  molecules  essentially  can  have  activity  against  a  B  cell 

malignancy  and  they're  probably  as  equipoised  in  the  literature  about those two types of immunoreceptors targeting, for instance, ALL, a B cell leukemia that has CD19 on the surface. 

 [0:45:12]    Those same molecules that are used to target ALL have a different set of 

biology when they use to target another B cell leukemia that's chronic in nature  called  chronic  lymphocytic  leukemia  or  CLL.  There,  instead  of seeing the major advances in terms of the anti‐tumor effect, the patients who are enjoying  in  the ALL area,  the patients with CLL are  seeing  less essentially complete responses, less durable responses. 

   Look, we've got the same immunoreceptor going into two different types 

of patients. I think what this audience member is prompting me is around the idea that even though we have the same design, the context that that design has put  into the place, the types of T cells that they're being put into, the source material from a patient with ALL versus CLL, the types of CD19 that are on the target cell, is that CD19 presented or is it presented along  with  inhibitory  molecules,  for  instance,  inhibiting  the  T  cells through the PD1 pathway? All of that then is context‐dependent.  

   So what  I would say to sort of summarize this  little piece  is that for the 

biologic processing,  I think the successful team has to keep their eye on the  idea  that  the  cells  you're making  have  to meet  the  needs  of  the patient  and  to  be  able  to  essentially  build  receptors  that  are  not necessarily one size fits all, but you may actually have to get quite specific and you may have to personalize for the disease, ALL versus CLL, or even personalize for the patient, and that really is to be determined. 

 Sean Sanders:  That actually brings me nicely to a second question for you, and that  is, 

are  there  ways  to  determine  whether  certain  patients  are  better 

23

candidates  for  immunotherapy  than  others  and  are  certain  T  cell population simply not going to grow? 

 Dr. Laurence Cooper:  Yeah, that's a great question and this  is something that keeps me up at 

night. We don't,  to be honest, have a great  idea about which patient  is going to do better  in terms of antitumor response versus another. Let's now move away  from  the B cell malignancy sphere and  talk about now solid tumors. 

   Here, I think, there's really going to be some heavy  lifting that has to be 

uncovered not only to understand which antigens we're going to go after. There  isn't a B cell antigen or a  lineage antigen that's the equivalent on the solid tumor space, so we may have to make T cells with a variety of targeting molecules to represent the heterogeneity of antigen expression for a given patient. Not only  that, but what patient might be better or more  favorable? What's  the  tumor microenviroment  for  that particular patient? 

   Look,  hope  is  not  lost  here.  The  reason  there,  I  think,  is  a  lot  of 

excitement  in  the  field  is  that  what  we've  seen  in  the  area  of  B  cell malignancies, as well as actually some other antitumor effects, gives you a sense that it can work. 

   I think where the field will be advanced, for instance, with our colleagues 

at GE Health,  is to recycle and tighten up that translational arc so that if we want to go after, for  instance, a patient with pancreas cancer, he or she is brought into the hospital, we biopsy the tumor microenvironment, we  do  our  very  best  to  understand  those  types  of  T  cells  that will  be infused, and then we do the heavy lifting. 

   We say, "Did  it work?"  If  it didn't work, what are the biologic correlates 

that allow us to say why  it failed and how do we then get back  into the bioprocessing steps to make a better product? 

 Sean Sanders:  Any comments from you, Dr. Janas?  Dr. Michelle Janas:  No.  I think Dr. Cooper did a great  job there.  I think certainly  in terms of 

solid tumors, one of the most promising is in the melanoma world. We've talked  about  leukemia, but  also we  should  acknowledge  the  success  in the melanoma treatment as well. 

 Sean Sanders:  Excellent! Well,  let me give you a question, Dr. Janas. Do problems with 

the quantity of ex vivo manufactured T cells reflect the inability to select 

24

the correct T cell specificity  i.e.  the highest efficiency against  the  target because highly effective T cell should survive and proliferate in vivo? 

 Dr. Michelle Janas:  That's a  really good question,  this question of numbers, and  I  think  the 

field at the moment  is still really unsure of  itself  in terms of what  is the correct dose to give to patients. 

   Certainly,  from  a  starting  block,  more  is  better  seem  to  be  the 

philosophy, but there is a shift away from that now to looking at what are the best  sub‐populations of T cells  that are going  to go and do  the  job once they get infused back into the patient.  

   Yeah, there  is a thought that for example, central memory T cells might 

be  those unique  cells  that  are  going  to, when  they're  transferred back into the patient, proliferate the best, survive the longest. 

 [0:50:10]    However, if you take a patient with massive tumor burden, we also have 

to think of the huge  job that we're asking those T cells to do, and we're asking one T cell to go and essentially kill potentially thousands of other cells.  Here,  numbers  are  important  especially  I  think  for  solid  tumors where  even  ten  billion  cells  is  hardly  a match  for  a  solid  tumor  that's spread right throughout the body. 

 Dr. Laurence Cooper: And  I  join you  that  in  this  idea of  treating kilograms of  tumor  is one  in 

which  the  investigative  teams have  to measure quality versus quantity. This is a real tension and again, it's context‐dependent. If you're putting T cells  into a patient  in extremis with a  large bioburden of  tumor,  that  is one shot on goal. 

   If you're for  instance treating a patient  let's say with a brain tumor, that 

tumor  is anatomically  isolated, yet you may be delivering  the T cells  to the  venous  system,  so  you  have  to  have  the  T  cell  survive,  get  to  the tumor, and potentially then proliferate in that tumor, so you may need a different product. 

   Again,  I  think what  I  leave  the  audience with  this  is  this  idea  that  the 

human experience  is  the only  real valid experience and we have  to get into that area to understand if it's really going to work. 

 Sean Sanders:  Excellent! That actually brings me nicely to a second question I think for 

both of you, but  I'll come to you, Dr. Janas, first. Do you do any type of 

25

characterization on the T cells that you're working with and when would you perform this characterization? 

 Dr. Michelle Janas:  Through  our  experimental  protocol,  something  that  I  didn't  present 

today, we actually follow the cells right from the start of the culture to ‐‐ we take samples of Day 0, Day 5, Day 10, and Day 14, and we follow the maturation of those T cells. 

   I think it's important particularly in terms of process development here to 

make sure that your process that you're setting up  isn't resulting  in the outgrowth of a senescent population of T cells. That  is what Dr. Cooper was referring to before  in terms of you can push your cells so hard or T cells  so  hard  that  you might  get  fantastic  cell  growth,  but  in  the  end, they're  just  exhausted,  so  when  they  get  transferred  back  into  the patient,  they're not going  to do  the  job,  so you  really need  to monitor what you're actually looking for. 

   In terms of what we're  looking for, we follow the maturation markers.  I 

talked about central memory T cells before,  that you can divide your T cell population  into effective memory T cells, effector cells  in your naïve population, so we have a look at that. We also have a look at the types of cytokines that are being produced, and a great killer will produce a lot of interferon gamma, for example. 

 Dr. Laurence Cooper:  Yes, I think this is exactly right, is that ability to have two types of inquiry. 

One is obviously to meet the release testing. You have to have a product that essentially has validity and authenticity based on your  relationship with your  regulatory  team, but  importantly,  the development  team has to understand the types of biology that are ongoing in the tissue culture vessel or in the new Xuri system. 

   There,  flow  cytometry,  multiparameter  flow  cytometry  helps.  Gene 

signature  is a very useful tool to  look at panels of gene expression, and new biologies all the time being exposed to us. 

   For instance, the immunologists' comment as they think about translating 

into  immunotherapy, whether or not a so‐called T cell or stem cell type subset  of  T  cells  actually might  be  the  favorite  type  of  T  cell  to  carry forward. Again, new biology  is being revealed all the time, and how the bioprocessing team incorporates that biology and can do it in a way that meets regulatory compliance obviously is the key to the story. 

 

26

Sean Sanders:  That's a perfect lead in to the question I had pulled up next, which is, can you  talk a  little bit about  the use of  induced pluripotent stem cells and allogeneic T cells as well? 

 Dr. Laurence Cooper:  Right. Again,  this  is a  far‐reaching question, although maybe not  so  far 

because we've just heard from our Japanese colleagues that they're now for the first time using IPS, not for T cell work, but for restorative therapy. 

   IPS cell is a cellulous substrate for doing high‐end genetic engineering and 

then  essentially  those  manipulated  stem  cells  are  then  essentially differentiated into T cells. This is in some ways the promise land. We join with  the questioner about  this area and have our own biology. Others, for instance, the Sloan Kettering Group, have terrific biology in this space. 

 [0:55:06]    The reason that there's optimism around the IPS cell  is that the types of 

genetic  engineering  that  can  be  done,  putting  genes  in maybe with  a transposon/transposase  system,  taking  genes  out  with  your  favorite nuclease,  your  ZFN,  your  TALEN,  your  Cas9,  your  meganuclease, whatever,  that  genetic  manipulation  can  be  then  understood  at  the clonal level. 

   You  can  essentially  identify  safe  harbor  and  the  types  of  genetic 

engineering  that would  allow  then  you  to  have  a  sense  of  confidence, that  taking  that clone and propagating  from  then all  the daughter cells that would  essentially  be  genetically  engineered  to  exacting  standard, and  then  those would be generated  into a biologic product such as,  for instance, an off‐the‐shelf T cell  for  instance, something that  I'm actually working very hard on. 

   The  trick  of  course  is  that  the  genetic  engineering  and  the  genetic 

manipulation of  the  IPS cell stage  is going very well. The differentiation into the T cell and getting enough T cells from those IPS cells, that's really still exploratory, so I see this coming and to be honest, inevitable, but still work to be done. 

 Sean Sanders:  Dr. Janas, have you done any work with IPS?  Dr. Michelle Janas:  No,  we  haven't  done  any  work  with  IPS,  but  I'll  just  add  to  your 

comments as well.  I  think  some of  the promise also  lies  in  the  thought that IPS cells that are differentiated  into T cells will also be of a younger phenotype just as you mentioned before and therefore, you'll overcome some of  these problems about T cell senescence and  the  theory  is  that 

27

they'll be better able to survive for much longer periods in the body once they're transferred. 

 Dr. Laurence Cooper: A very good point, thank you.  Sean Sanders:  Dr.  Janas,  let me  stay with  you.  This  viewer  asks whether  the  T  cells 

require optimization with serum‐free media, so maybe you can talk about the media that you use. 

 Dr. Michelle Janas:  Yeah. At the moment, we use ex vivo media from Lonza. We supplement 

it with human serum and I should add that we also supplement it with IL‐2,  300  international  units  per  mille  is  what  we  use,  if  anybody  is interested. 

   I think that serum‐free is really where everybody wants to head. I think at 

the moment, it's a play‐off between serum‐free medias that are on offer that don't perform as well to generating a fantastic cell culture within the presence of sera. We're all trying to move towards serum‐free and I think that's where we should be heading. 

 Dr. Laurence Cooper:  Yeah, and that's the same for us. Our manufacturing group is led by Helen 

Huls  and  she  really  in  almost  real  time  as  we're  speaking  now  is generating  those  types  of  data  where  we're  taking  vendors  and understanding essentially the ability of their serum‐free media to support T cell growth. 

   We're  actually  finding  some  success  there  and  just  as  you're  saying,  I 

think  the  field,  to  be  honest,  is  almost  a  done  deal  now.  I  think  the transition  of  getting  away  from  serum  really  needs  to  be  taken  into account by the audience members. 

 Sean Sanders:  Dr. Cooper, a question for you. What might be the criteria that you would 

look at when choosing your gene transfer solution?  Dr. Laurence Cooper: Again, a critical question. Some of  this actually  is  the experience of you 

and your team. People have grown up in the lentiviral world or retroviral world and that's worked very well for them. 

   We actually  took a  step backwards when we were  thinking about gene 

transfer  and  said,  "What  is  it  that we  can  do  to  accelerate  the  arc  of translation  from bench to bedside?" and realized  that  for many people, viral‐based  systems  are  very expensive  and quite difficult  to make  in  a clinically compliant manner. 

 

28

  That's  the  reason  that we  have  advanced  the  Sleeping  Beauty  system, this DNA transposon/transposase technology to really reduce essentially the  time  to  take  an  idea  and  to  get  it  from  the  bench  to  the  bedside because DNA plasmid is cheap to make and there are many, many players out  there  either  in  your  own  facility  or  for  instance,  from  contract manufacturing groups that can make that DNA. 

   For us, we have seen the DNA approach as a democratizing approach that 

really will enable you  to accelerate and  reduce  the cost  to go  from  the bench to the bedside. 

 Sean Sanders:  Great!  I'm going  to  come back  to you, Dr.  Janas, with a quick question 

that  I  actually  want  to  ask  when  we  were  talking  about  media.  This viewer  says,  "If  you  perfuse  a  bag  with  fresh  medium,  doesn't  that change  the  relationship of dissolved oxygen  to cell density and can you continue to monitor the cell density over time in this way?" 

 Dr. Michelle Janas:  Yeah.  It's  a  very  good  question  and  we  were  concerned  about  that 

ourselves, but the data that  I showed was  in the presence of perfusion. The perfusion happened so slowly, so 500 milles over 24 hours or even a liter over 24 hours.  It's  literally drip, drip, drip  in, and the same out, but actually,  it doesn't affect that relationship and you can still use  it  in the presence of perfusion. 

 [1:00:09]  Sean Sanders:  Great!  I'm going to come back to Dr. Cooper with the  final question  for 

today, and that is maybe quite a broad one, so hopefully we can do this in a short time. 

   With the goal of overcoming the "art of manufacturing" and variabilities 

in patients and processing strategies, what parameters do you consider critical for control? 

 Dr. Laurence Cooper: Okay. Do you want a short answer?   Sean Sanders:  If possible.  Dr. Laurence Cooper: Again, we can  join offline  if  the audience member wants  to contact me 

directly.     Look,  the  critical  parameters  are  that  the  immunoreceptor  has  to  be 

stably expressed.  It has to be  in a cell that  is not a one‐hit wonder. You 

29

can't have a terminally differentiated state. You have to have a catalog of differentiated states coming out of that culture. 

   That T cell has  to exhibit an ability  to kill and  importantly  to  recycle  its 

killing. You cannot just kill one and undergo activation‐induced cell death, and  it  has  to  make  some  type  of  cytokine.  Gamma  interferon  is  an excellent cytokine because it can call in or recruit in other cells. 

   Essentially,  it's the ability to express the receptor. It's the ability to have 

that T cell, not be a highly differentiated cell to kill and to make cytokine. I think these are the four tenants at least that are the minimal threshold to generate a biologic product. 

 Sean Sanders:  Excellent! Well, we are unfortunately out of time for this webinar, so on 

behalf  of  myself  and  our  viewing  audience,  I  wanted  to  thank  our speakers very much  for being with us  today, Dr. Laurence Cooper  from MD Anderson Cancer Center and Dr. Michelle Janas from GE Healthcare.  

 Slide 57    Please  go  to  the URL  now  at  the  bottom of  your  slide  viewer  to  learn 

more  about  products  and  technologies  related  to  today's webinar  and look  out  for  more  webinars  from  Science  available  at webinar.sciencemag.org. 

   This  webinar  will  be  made  available  to  you  again  as  an  on‐demand 

presentation within about 48 hours from now. We're interested to know what you thought of the webinar. Send us an email at the address now up in your slide viewer, webinar@aaas.org. 

   Again,  thank  you  so much  to  our  panel  for  being  with  us  and  to  GE 

Healthcare  for  their  kind  sponsorship  of  today's  educational  seminar. Goodbye. 

 [1:02:16]  End of Audio