CULTURA CELULAR. O que é? Conjunto de técnicas que permitem cultivar ou manter células isoladas...
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CULTURA CELULARCULTURA CELULAR
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O que é?O que é? Conjunto de técnicas que permitem cultivar ou manter células
isoladas fora do organismo onde existem, mantendo as características próprias;
- Podem fazer-se culturas a partir tecidos humanos, animais e vegetais;
A cultura de tecidos implica a prévia desagregação (mecânica ou enzimática) do tecido original e em que as células são cultivadas numa camada aderente, num substrato sólido ou em suspensão em meio de cultura.
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HistóriaHistória Primeiras culturas foram feitas a partir de fragmentos
de tecidos colocados em coágulos de plasma.
Grande avanço (1940): crescimento de linhagens celulares a partir de células isoladas que aderiam à superfície de placas de cultura
As células eram cultivadas em meios indefinidos: combinação de soro e extratos embrionários.
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HistóriaHistória
Em 1952:
Crescimento de células num meio contendo:
- Plasma de galinha - Extrato de embrião bovino - Soro de cordão umbilical
O meio era complexo e indefinido tornando impossível analisar as necessidades específicas para o crescimento de células animais.
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HistóriaHistóriaHARRY EAGLE
Realizou uma análise sistemática dos nutrientes necessários ao crescimento de células animais em cultura
Estudou o crescimento de duas linhagens de células:
-- células HeLa (Henrietta Lacks nasceu em 1920 e morreu de câncer do colo uterino em 1951. A partir de seu tumor, George Gey isolou a primeira linhagem imortal de células humanas, as chamadas células HeLa).
-- células L (fibroblastos de camundongos que não aderem entre si)
O meio em que cultivou estas células continha: -- Mistura de sais -- Carboidratos -- Aminoácidos -- Vitaminas suplementadas com soro de proteínas
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HistóriaHistóriaVARIANDO ESTES COMPOSTOS…
Eagle determinou os necessários para o crescimento celular:
-- Sais -- Glicose -- 13 a.a. -- Vitaminas -- Soro de proteínas
Atualmente ainda é usado o meio desenvolvido por Eagle como meio básico para cultura de células animais.
O seu uso permitiu aos cientistas cultivar uma ampla variedade de células sob condições experimentais definidas.
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ClassificaçãoClassificação
Cultura celular
Método cada vez mais utilizado que consiste em cultivar células isoladas fora do organismo onde existe.
Há dois tipos de cultura celular:
Cultura primária: cultura preparada diretamente de tecidos de um organismo, com ou sem passo inicial de fracionamento das células.
Cultura secundária: as células cultivadas foram retiradas de uma cultura primária, elas podem ser repetidamente subcultivadas desta forma, por semanas ou meses.
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HeterocarionHeterocarion: célula obtida por fusão de duas ou mais células
diferentes e que contenham mais de um núcleo funcional.
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HibridomaHibridoma
Linfócitos "fundidos" com células de mieloma, que tem a capacidade de se reproduzirem, em cultura, indefinidamente.
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Linhagem de célulasLinhagem de células
Culturas primárias:- Obtidas diretamente dos tecidos- Culturas heterogêneas- Mantêm-se pouco tempo em cultura- Propicias ao desenvolvimento de contaminações
Linhagens Celulares:- Obtidas de culturas primárias- Células imortalizadas (alteração genética)- Crescimento rápido e contínuo- Proliferação ilimitada ou limitada a um- elevado número de passagens
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Linhagem de célulasLinhagem de células
A uniformidade genética de uma linhagem de células pode ser melhorada pela clonagem celular, em que uma única célula é isolada e prolifera-se para formar posteriormente uma colónia;
Podem ser armazenadas em Nitrogênio líquido a - 196ºC, por um período muito longo e continuarem viáveis, quando descongeladas.
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Exemplos de cultura de célulasExemplos de cultura de células
Fig. 4 – Células em cultura
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PreparaçãoPreparaçãoA- Isolamento
Para preservar mais informações sobre cada tipo individual de células, os biólogos desenvolveram meios de dissociar as células dos tecidos e separar os vários tipos;
Fig. 5 - Centrifugadora
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IsolamentoIsolamento
Romper a matriz extracelular e as junções intercelulares que mantêm as células juntas;
As células de tecidos fetal ou neonatal são as melhores produções de células dissociáveis viáveis;
| |
Através de tratamento:
-- dissociação mecânica-- enzimas proteolíticas - (tripsina e colagenase)
-- agentes - (ácido etilenodiaminotetracético, EDTA)
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IsolamentoIsolamento Células grandes
são separadas das células pequenas e células densas de células não densas por centrifugação fracionada;
Fig.6 - Centrifugação fraccionada
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IsolamentoIsolamento Anticorpos que se ligam especificamente à superfície de
apenas um tipo de célula num tecido podem ser acopladas a várias matrizes como:
-- colágeno -- plástico | | |
para formar uma superfície de afinidade, à qual somente as células reconhecidas pelo anticorpo, se aderem.
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IsolamentoIsolamento Marcação específica
das células com anticorpos acoplados a um corante fluorescente, em seguida, a separação destas células marcadas das não marcadas num separador de células ativado por fluorescência;
Fig. 7 – Citometria de fluxo
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Preparação Preparação B- Cultivo em placas de cultura
Geralmente as culturas são feitas a partir de suspensão de células dissociadas de tecidos.
Fig.8 - Microdissecção
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Placa de culturaPlaca de cultura Ao contrário das bactérias, a maior parte das células de
tecidos não estão adaptadas para viverem em suspensão e necessitam de uma superfície sólida para crescerem e dividirem-se, que é agora usualmente a superfície plástica de uma placa de cultura de tecidos;
Certas culturas celulares incluem: Fatores de crescimentoFatores de crescimento + + TransferrinaTransferrina | | | |estimulam a proliferação celular transporta ferro para a célula
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Aminoácidos Vitaminas Sais Outros Proteínas (necessárias em meios sem soro, quimicamente definidos)
ArgininaCistinaGlutaminaHistidinaIsoleucinaLeucinaLisinaMetioninaFenilalaninaTreoninaTriptofanoTirosinaValina
BiotinaColinaFolatoNicotinamidaPantotenatoPiridoxalTiaminaRiboflavina
NaClKClNaH2PO4
NaHCO3
CaCl2
MgCl2
GlicosePenicilinaEstreptomicinaVermelho de fenolSoro
InsulinaTransferrinaFactores específicos de crescimento
Composição de um Meio Típico Adequado Composição de um Meio Típico Adequado para o Cultivo de Células de Mamíferospara o Cultivo de Células de Mamíferos
Fig.9 – Tabela de componentes de um meio típico
Algumas células não crescem nem se diferenciam se a placa não estiver coberta com componentes específicos da matriz extracelular
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Vantagens da Cultura CelularVantagens da Cultura Celular
Possibilidade de estudar fenômenos inacessíveis em tecidos intactos;
Controle das condições ambientais (pH, temperatura, concentração de O2 e CO2, etc);
Obtenção de células com boa homogeneidade e bem caracterizadas;
Economia de reagentes, tempo, etc.
Conhecimento de comportamento e função de uma população isolada de células;
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Dificuldades da Cultura CelularDificuldades da Cultura Celular
Gasto elevado de material;
Condição de crescimento da cultura;
Instabilidade de cultura celular;
Perda de características;
Dificuldade de extrapolação para o modelo de organismo intacto.
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LimitaçõesLimitações
Necessidade de operadores experientes (com conhecimentos da técnica em condições assépticas, etc);
Perda de características fenotípicas;
Necessidade do uso de marcadores devido à perda de características fenotípicas;
Instabilidade das células (sobretudo em linhas celulares imortais).
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Aplicações gerais da cultura celular
Produção de vacinas anti-virais;
Compreensão de fenômenos de neoplasia;
Estudo da Imunologia;
Ensaios de fármacos e cosméticos in vitro;
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Exemplo –uso diagnóstico de Exemplo –uso diagnóstico de células em cultivocélulas em cultivo
As células para análise cromossômica devem ter crescimento e divisão rápida em cultura.
As células mais acessíveis são os leucócitos, especificamente linfócitos T.
O procedimento seguinte, mostra como preparar, a curto prazo, uma cultura destas células adequadas para análise:
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Exemplo –uso diagnóstico Exemplo –uso diagnóstico cultura celularcultura celular
1) Obtém-se uma amostra de sangue periférico e acrescenta-se heparina para evitar coagulação;
2) A amostra é de seguida centrifugada a uma velocidade que permita aos leucócitos sedimentarem-se como uma camada distinta (gradiente – Fycoll)
3) Os leucócitos são colhidos, colocados em meio de cultura tecidual e estimulados a dividirem-se pelo acréscimo de um agente mitogênico (estimulante da mitose), a fito-hemaglutinina.
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4) A cultura é incubada cerca de 72 horas, até que as células se multipliquem rapidamente;
5) Acrescenta-se, então, uma solução diluída de colchicina, para impedir a conclusão da divisão celular, inibindo a formação de fusos e retardando a separação dos centrômeros. Em consequência, as células paradas na metáfase acumulam-se na cultura;
6) Em seguida, adiciona-se uma solução hipotônica para causar tumefação nas células, lisando-as e liberando os cromossomos, mas mantendo os centrômeros intactos;
7) Os cromossomos são fixados, espalhados em lâminas e corados e prontos para análises.
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Laboratório do Serviço de Biologia Laboratório do Serviço de Biologia Celular e Molecular da FMUPCelular e Molecular da FMUP
Fig.10 e 11 – Câmara de fluxo laminar
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Laboratório do serviço de Biologia Laboratório do serviço de Biologia Celular e Molecular da FMUPCelular e Molecular da FMUP
Fig.12 e 13 – Estufa de CO2
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Laboratório do serviço de Biologia Laboratório do serviço de Biologia Celular e Molecular da FMUPCelular e Molecular da FMUP
Fig. 13 - Centrífuga Fig. 14 – Microscópio Invertido
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ReferênciasReferências
Alberts, B; Bray, D; Lewis, J; Raff, M; Roberts, K; Watson, JD (1997). Biologia Molecular da Célula. 3a ed. Porto Alegre/RS: Editora Artes Médicas.
Tom Strachan, Andrew P. Read Human: Molecular Genetics;BIOS Scientific Publishers Limited; 1996; USA
Debergh, P.C.; Read, P.E. (1991) Micropropagation in: Debergh, P.C. & Zimmerman, R.H. (eds). Micropropagation: Technology and Application. London, Kluwer Acad. Publishers;
Geoffrey M Cooper: The Cell, a molecular approach; second edition; Site: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books