CULTIVO Y APLICACIONES DE LAS ALGAS

CULTIVO Y

APLICACIONES

DE LAS ALGAS

Biotecnología de los

microorganismos eucariotas

2013

Dra. Silvina M. Rosa

[email protected]

ALGAS

Organismos normalmente acuáticos, autótrofos con fotosíntesis

oxigénica (con algunas excepciones) generalmente más pequeños

y estructuralmente más simples que las plantas terrestres

Algas no son un grupo

monofilético

- no hay características que

definan el conj. completo

-no se puede asignar un

nombre formal

Pero algas incluye grupos

monofiléticos

Secuencia del 18S rDNA

provee evidencias de la

existencia de 8 o 9 grupos de

clados (divisiones) de algas

Filogenia molecular se

corresponde con las

relaciones establecidas por

las características celulares y

bioquímicas

DIVISIÓN CYANOBACTERIA DIVISIÓN RHODOPHYTA

DIVISIÓN CHLOROPHYTA

DIVISIÓN OCHROPHYTA

Clase Bacillariophyceae

(diatomeas)

Clase

Phaeophyceae

(algas pardas)

DIVISIÓN

EUGLENOPHYTA

DIVISIÓN DINOPHYTA

MACROALGAS: APLICACIONES

Abonos y fertilizantes

(Chondrus)

Medicina tradicional y

actual (Gigartina)

Alimentación humana en forma directa


Ulva Laminaria

Alimentación humana en forma directa


Porphyra


Producción industrial de ficocoloides

Ficocoloides

Compuestos coloidales producidos por macroalgas

Función estructural (componentes de la pared celular) en

las algas

Polisacáridos hidrofílicos (propiedades gelificantes,

emulsionantes y estabilizantes)

Mercado mundial: producción de 100.000 tn/año

equivalentes a 1 billón de dólares anuales (Kraan 2012)



Carragenanos

Polímero de unidades de

galactosa sulfatada

Fuertemente aniónico Chondrus

Algas rojas



Carragenanos

Aplicaciones

Helados, leche, comidas instantáneas,

dulces; panadería; cosméticos; pastas

dentales (80% de producción mundial

utilizado por la industria alimenticia)



Agar

Polímero de agarobiosa,

un disacárido compuesto

de D-galactosa y 3,6-

anhidro-L-galactosa

No iónico

Algas rojas

Gracillaria

Aplicaciones



Agar

Microbiología

Conservas de carne y pescado

Dulces (“gomitas”)

Espesante de mermeladas y jaleas

(80% de producción mundial

utilizado por la industria

alimenticia)

Farmacología (cubierta de pastillas

y emulsionante de laxantes)

Industria textil



Alginatos

Polímero de ácido manurónico

y ácido gulurónico

Aniónico

Algas pardas

Laminaria



Alginatos

Aplicaciones

En industria textil, papelera y colorantes,

estabilizantes de pintura

Medicina: emulsionante y

excipiente de fármacos

Odontología: obtención de

impresiones de los dientes

Perfumería: cremas para el

cuerpo, shampoo

Alimentación (30%

de producción

mundial:

Producción de

frutas artificiales y

comidas

semiartificiales

Espesante de

helados, sopas y

aderezos

MICROALGAS: APLICACIONES

Biomasa para

alimentación

Productos químicos de

alto valor agregado

CULTIVO MASIVO DE MICROALGAS

Recipientes-Bolsas de polietileno (20 l)

Estanques en serie/ Fotobiorreactores (150 a 1000 l)

Estanques (5, 10, 50 T) Canales de alta velocidad Fotobiorreactores

Cultivos al

interior

Cultivos al

exterior

Escalas de cultivo



Cultivos al interior

Iluminación: lámparas 40 W

Temperatura: 20-25 ºC



Aireación: funciones

Homogeneización de nutrientes

Movimiento hacia superficie

Aporte de CO2

FOTOBIORREACTORES

Ventajas

Ocupan espacio reducido

Reducen las pérdidas por evaporación (sistema cerrado)

Mantienen condiciones axènicas

Optimizan el proceso de cosecha y reutilizan el medio

de cultivo



FOTOBIORREACTORES

Fotobioreactor

tubular

Ventajas:

-Mejor control de

la transferencia de

gases

- Mayor relación

superficie volumen



FOTOBIORREACTORES



FOTOBIORREACTORES

Columna Anular

Tredici, Universidad de Florencia (Italia)

Dos cilindros (40 y 50 cm de diámetro) de

2 m de alto; capacidad 120 l

Mayor productividad total por área que

fotobiorreactores horizontales

Ubicación de las unidades tiene fuerte

incidencia en la productividad



Cultivos al exterior

Utilización de luz solar Condiciones no controladas

(variaciones en iluminación, temperatura, etc.)

Canales de alta velocidad



Cultivos al exterior

Canales de alta velocidad

Cultivo abierto:

económico y

fácil operación

Para

sustancias de

bajo valor

agregado

Agitación y

aireación:

motobombas

o paletas

Adición

de CO2

(control de

pH)



Cultivos al exterior : Fotobiorreactores

Ventajas:

Esterilización del sistema

Mejor control de la transferencia de

gases

Iluminación efectiva

Mayor relación volumen: superficie

Productividad elevada


Producción de biomasa con fines de

alimentación animal y humana

Suplemento alimentario (fuente de proteína)

(Spirulina, Chrorella, Scenedesmus)

Acuicultura (Dunaliella)

Altos costos (10-300 є/kg) y mercado reducido (10-50 kTn/año)

(Fernández et al. 2012)

Obtención de moléculas de importancia económica


Ficobiliproteínas

Clasificadas según su espectro de

absorción: ficocianina,

aloficocianina y ficoeritrina. Se

ensamblan formando ficobilisomas.

Función: almacenar energía

lumínica.

Aplicaciones: Marcadores fluorescente

Colorantes naturales (ficocianina)

Obtención de moléculas de importancia económica


Carotenoides

Pigmentos liposolubles: Amarillo,

naranja o rojo. 2 tipos:

Carotenos: sin oxígeno (b-caroteno)

Xantofilas: con oxígeno

(fucoxantina)

Función: Pigmentos accesorios

colectores y fotoprotectores

b- caroteno: Aplicaciones: Antioxidante lipídico

Colorante natural

Acuicultura (pigmentación peces y crustáceos)


Obtención de moléculas

de importancia

económica

Carotenoides

Purificación de aguas

residuales (Chrorella,

Scenedesmus)

Acondicionadores del suelo

(Nostoc)


Biodiesel

Transesterificación de

un triglicérido con un

alcohol, utilizando

hidróxido de sodio

como catalizador.


Las algas presentan

mayores rendimientos de

aceite por hectárea que las

plantas

Etapas para la

producción de

biodiesel a partir de

microalgas

Biodiesel

MICROALGAS:

APLICACIONES

Biodiesel


Sin embargo la producción de

biodiesel a partir de microalgas

es económicamente prohibitiva

(valor aceptable: 0,01-0,50 є/kg) Cepas con alto contenido de aceite

Estrategias:

- Acoplar la producción de

biodiesel al tratamiento de

efluentes (Lundquist et al.

2010)

- Mejoramiento genético y

metabólico de cepas

- Diseño de nuevos

sistemas de cultivo

Biodiesel


ACIDOS GRASOS

POLIINSATURADOS

OMEGA 3

Ácidos grasos con cadenas de más de 18 C y dos o más dobles enlaces

clasificación

omega 3 (3 o n-3)

primer doble enlace en la posición 3

desde extremo metilo

omega 6 (6 o n-6)

primer doble enlace en la posición 6

desde extremo metilo

18: 3 (9,12, 15) ác. -linolénico

20: 5 (5,8,11,14,17) ác. eicosapentaenoico

22: 6 (4,7, 10, 13, 16, 19) docosahexaenoico

18: 2 (9,11) ác. linoleico

18:3 (6,9 11) ác.g linoleico

20: 4 (5,8,11,14) ác. araquidónico

22:5 (4,7,10,13,16) ác. docosapentaenoico

ÁCIDOS GRASOS POLIINSATURADOS (PUFAs)

►Efectos benéficos de los PUFAs sobre la salud humana

MERCADO DE LOS PUFAS

Son componentes esenciales de membranas celulares

Controlan la expresión de ciertos genes

Son precursores de prostaglandinas, leucotrienos y tromboxanos

Reducción de riesgo de enfermedades cardiovasculares

Efectos positivos en hipertensión, artritis, arteriosclorosis y trombosis

Esencial para el desarrollo de cerebro y retina en niños

Demanda mundial de PUFAS (especialmente DHA) aumenta rápidamente

Las principales consultoras nutricionales y de la salud

recomiendan la utilización de DHA y ARA como

suplemento dietario, incluso en fórmulas infantiles

►Aplicaciones en acuicultura

Table 1: Milestone advisories related to use of DHA, EPA and ARA as dietary supplements (Ward, O. P. & Singh, A., 2005)

FAO and WHO recommend that infant formula should mimic breast milk 1975

Menhaden oil has Generally Recognized as Safe (GRAS) status from US FDA

as a source of PUFAs for use in certain adult foods 1987

European Society of Pediatric Gastroenterology recommends that infant formula,

both pre-term and term, should include ARA and DHA 1991

The British Nutrition Foundation recommends that infant formula, both pre-term

and term, should include ARA and DHA 1992

A joint expert committee of FAO and WHO recommends that infant formula,

both pre-term and term, should include ARA and DHA 1993

A successful regulatory review was completed in by the Ministry of Health in

Holland which allowed infant formula makers to use specific commercial

supplements of DHA and ARA in infant formulae 1995

An independent panel of experts in the US concluded that specific ARA and DHA

supplements could be considered as GRAS for use in pre-term and term infant

formulas by adults 1995

An independent panel of experts in the US concluded that a specific DHA oil could be

considered as GRAS for use by adults, including pregnant and nursing women 1996

A meeting sponsored by the NIH and the International Society for the Study of Fatty

Acids and Lipids in Washington DC recommended that infant formula be supplemented

with DHA and ARA 1999

A Child Health Foundation panel recommended in Acta Paediatrica that infant formula

contain both DHA and ARA 2001

The Canadian Government’s Health Canada completed a favourable review of a submission

supporting use of DHASCO and ARASCO oils in infant formulas in Canada

* Las principales consultoras nutricionales y de la salud recomiendan la utilización

de DHA, EPA y ARA como suplemento dietario, incluso en fórmulas infantiles.

* FDA (Food and Drug Administration, USA) ha conferido el estatus de GRAS

(Generally Regarded as Safe) a numerosos productos que contiene PUFAs

VÍA METABÓLICA DE SÍNTESIS DE PUFAs

Vía biosintética de ácidos grasos

en la mayoría de los

microorganismos oleaginosos es

la misma que en las especies no

oleaginosas

Desarrollo de SCO requiere el entendimiento de las vías de síntesis y

acumulación de ácidos grasos.

1) Síntesis de ácidos grasos de 16C

o 18C mediante el complejo FAS

(Fatty acid synthasa)

2) Secuencia de desaturasas y

elongasas

En Thraustochytriales, la síntesis

de PUFAs parece seguir otra vía

(PKS, poliketide synthasa)

VÍA METABÓLICA DE SÍNTESIS DE PUFAs

Hombre

Acidos grasos omega 3 y 6 no son

interconvertibles una vez ingeridos

La dieta primaria consiste en 18:2n-6

principalmente y 18:2n-3

Los precursores de 18 C pueden ser

elongados y desaturados a otros miembros

de sus familias: 22:4n-6 y 22:6n-3

Microorganismos oleaginosos

Habilidad para proveer contínuamente

acetil-CoA directamente en el citosol

Habilidad para proveer suficiente NADPH

(1 mol de 18-C requiere 16 moles de

NADPH)

FUENTES DE PUFAs

Fuente tradicional: pescado problemas: variaciones en la calidad,

contaminación, olor y gusto desagradable, compleja purificación

Fuente alternativa: Microorganismos

Microorganismos oleaginosos marinos (algas, hongos “inferiores” y bacterias)

serían los principales productores de PUFAs 3 en la cadena alimentaria marina

FUENTES MICROBIANAS DE PUFAs (Single Cell Oil – SCO)

* Producción de aceites con

mayor % de PUFAs, en gral, de

un tipo en particular y no una

mezcla.

* Mayor estabilidad oxidativa

(almacenamiento)

* Producción a partir de

materiales sustentables

* Nuevas posibilidades:

desarrollo de nuevos sistemas de

producción

* Producción bajo condiciones

controladas (fermentación)

Mercado para SCO

Table 7: Partial list of companies reported to be researching,

developing, manufacturing or marketing SCO PUFAs or

PUFA-containing products (Ward, O. P. & Singh, A., 2005)

Aventis S.A.

BASF A.G.

Friesland Brands A.G.

Gist-brocades

Heinz-Wattie’s

Hoffmann-LaRoche A.G.

Jamieson

Laboratorios Ordesa

Maarbarot

Martek Inc.

Mead Johnson Nutritionals

Nagase and Co.

Nestle S.A.

Novartis

Nutricia

Nutrinova Celanese A.G.

Pronova

Ross Products (Div of Abbott)

Suntory Ltd.

Walmart

Wyeth

Ventajas

Costo elevado ( no competitivo) Actualmente

involucra a varias empresas, dedicadas a

productos de alto valor agregado

Su desarrollo requiere la selección de microorganismos apropiados y la

optimización de las técnicas de cultivo

A) Algas

Isochrysis galbana

(Haptophyta)

Cultivos masivos fototróficos

presentan muchas desventajas:

*lagunas abiertas (dependencia

del clima, contaminación, auto

somberado, alto costo de

cosecha)

*fotobiorreactores (altos

costos)

PRODUCCIÓN DE DHA UTILIZANDO MICROORGANISMOS MARINOS

Crypthecodinium

cohnii

Thraustochytrium

Schizochytrium

B) Algas heterotróficas

(Dinoflagelado)

C) Thraustochytriales

DCW dry cell weight, S Shake-flask cultivation, B bioreactor

*** Glucosa 9% o Glicerol 12%, CSL, biorreactor 3l por 5 dias.

Strain

De

vic

e

Carbon

source

Cell concentration

(g DCW l–1)

DHA

concentration

(g l–1)

DHA productivity

(mg l–1 h–1) Reference

C. cohnii B Glucose 27.7 1.4 19 de Swaaf et al.

(1999)

C. cohnii B Acetic

acid 109.0 19.0 48

de Swaaf et al.

(2003a)

C. cohnii B Ethanol 83.0 11.7 53 de Swaaf et al.

(2003b)

Thraustochytrium

strain G13 B Glucose 14.0 1.6 38

Bowles et al.

(1999)

Schizochytrium sp. S Glucose 13.3 2.8 53 Fan et al.

(2001)

Schizochytrium sp.

SR21 S Glucose 36.0 4.2 35

Yokochi et al.

(1998)

Schizochytrium sp.

SR21*** B Glucose 48.1 13.3 138

Yaguchi et al.

(1997)

Capacidad de algunas cepas de Thraustochytriales (Schizochytrium) para

producir altos niveles de biomasa en cultivo, con una alta proporción de

lípidos/biomasa y de PUFAs/lípidos → aplicación actual en el mercado SCO

Productividades de DHA utilizando microorganismos marinos (Extraído de Sijtsma

L. & Swaaf, M. E., 2004. Appl Microbiol Biotechnol 64: 146-153)

Diseño de un bioproceso para la optimizacion de la producción por

fermentación de DHA utilizado la cepa A. limacinum SR21

Cepa modelo Aurantiochytrium limacinum SR21

Condiciones de cultivo para acumulación de PUFAs

Fuente de C (Glucosa, Glicerol), Fuente de N y vitaminas (CSL,

YE), Sal de mar, Agitación, Temperatura (25 -28 ºC)

0

5

10

15

20

25

10:1 50:1 100:1 150:1

Relación C:N del medio

Pro

teín

as (

g

) y

(g

)

ll

-1-1

Líp

ido

s

1) Optimización de la

producción de biomasa

2) Optimización de la

acumulación de ácidos

grasos, a partir del

material obtenido en la

primera.

Bioproceso en dos etapas

Determinación de las condiciones óptimas de crecimiento

aplicando metodologías estadísticas (DOEs, ANNs y GA)

Ensayo Nivel del factor * Peso

seco Glucosa

(X1)

pH

(X2)

CSL

(X3)

SW

(X4)

1 +1 9,0 +1 7,0 1 1,1 1 0,35 6,30

2 +1 9,0 +1 7,0 +1 11,0 1 3,50 38,36

3 1 2,0 +1 7,0 1 1,1 1 0,35 5,34

4 0 5,5 0 5,7 0 6,0 0 1,92 21,66

5 1 2,0 +1 7,0 +1 11,0 1 0,35 6,40

6 +1 9,0 +1 7,0 +1 11,0 +1 3,50 38,56

7 1 2,0 1 4,5 +1 11,0 +1 3,50 9,20

8 +1 9,0 1 4,5 +1 11,0 1 0,35 32,40

9 +1 9,0 1 4.5 1 1,1 1 0,35 5,16

10 1 2,0 +1 7,0 +1 11,0 +1 3,50 8,28

11 1 2,0 1 4,5 1 1,1 1 0,35 5,04

12 1 2,0 1 4,5 1 1,1 +1 3,50 4,14

13 +1 9,0 1 4,5 +1 11,0 +1 3,50 32,28

14 0 5,5 0 5,7 0 6,0 0 1,92 20,70

15 +1 9,0 1 4,5 1 1,1 +1 3,50 8,94

16 1 2,0 1 4,5 +1 11,0 1 0,35 6,12

17 1 2,0 +1 7,0 1 1,1 +1 3,50 4,18

18 0 5,5 0 5,7 0 6,0 0 1,92 21,44

19 +1 9,0 +1 7,0 1 1,1 +1 3,50 9,10

1) Diseños de selección:

Estudiar en forma numérica

los factores del medio de

cultivo que tienen influencia

sobre el crecimiento para

descartar los menos

significativos

Diseño Factorial Fraccional

Diseño Plackett-Burman

2) Diseños de optimización

Diseños Estadísticos

Experimentales (DOEs)

FFr1

Diseños Estadísticos Experimentales (DOEs)

Análisis estadístico 1) Diseños de selección:

Término Coeficiente de

Regresión

Valor de P

Intercepto 14,926 0,00255 **

Glucosa 7,650 0,02149 *

pH 0,827 0,66518

CSL 7,712 0,02102 *

SW 0,597 0,75266

Glucosa: pH 0,865 0,65151

Glucosa: CSL 6,300 0,03572 *

pH: CSL 0,622 0,74287

Glucosa: SW 0,235 0,90057

pH: SW -0,132 0,94378

CSL: SW 0,032 0,98619

* P<0,05; ** P<0,005; R2: 0,9472

Parámetro estimativo:

pendiente de la recta

que conecta la media de

la respuesta de los 2

extremos (el valor

absoluto indica el

impacto)

FFr1

Variables del medio de

fermentación no significativas

para la producción de biomasa:

pH, SW, YE y KH2PO4

Variables residuales: fuentes

carbonada y nitrogenada (Glucosa

y CSL), tamaño del inóculo,

interacción entre Glucosa y CSL

Resultados de 2 FFr y 3 PB

Agrupamiento de datos de los distintos experimentos: verificación de la

validez combinando el algoritmo de K-medias y el análisis de varianza

Análisis de datos para el proceso de optimización

El conjunto de datos experimentales se dividió en dos subconjuntos, uno de

entrenamiento y otro de validación. Se ajustaron dos regresiones (una lineal y

otra cuadrática) y un modelo de Redes Neuronales Artificiales con el primer

subconjunto y a partir de ellos se realizaron predicciones sobre el segundo

Se utilizó un Algoritmo Genético (GA) acoplado a

la ANN entrenada para encontrar la combinación de

los componentes críticos del medio que rindieran un

máximo valor de biomasa

Suma media de los

cuadrados de los

errores (mse)

5.8 modelo lineal

4.2 modelo cuadrático

2.6 ANN

log (tamaño del inoculo)

5,2 5,4 5,6 5,8 6,0

80

85

90

95

100

Glu

cosa

(g

)l

-1Gráfico de contorno producido a partir de 336

predicciones. El círculo blanco muestra el punto

máximo de biomasa determinado por el GA, y el

círculo negro representa el punto operativo elegido

Predicción: 8% (m/v) glucosa, 12% (v/v) CSL y

inóculo de 4 x 10 5 cells ml1 para obtener 38g l-1

de biomasa seca

Validación

Perfil de crecimiento de A. limacinum SR21 en

Medio Optimizado de Crecimiento (MOC)

m máx = 0,12 h -1

T duplicación = 6 h

Entrada en fase

estacionaria = 40 h

Glucosa (), amonio (NH4) (), biomasa () y lipidos ()

32 69 108 168

0

20

40

60

80

0

20

40

60

80

100

120

140

Glu

cose

(gl-1

),D

CW

(gl-1

)and

Lipi

ds(g

l-1)

Time (h)

NH

4(m

gl-1

)

Tiempo (h)

Am

on

io (

mg

)l

-1

Bio

mas

a (

g

), L

ípid

os

y G

luc

osa

(g

)

l-1

l-1

(g

)l

-1

Bio

ma

sa

, lí

pid

os

y g

luc

osa

(g

l-1

)

Am

on

io (

mg

l-1

)

El valor de biomasa obtenido (40,3 g de peso celular seco l-1) empleando las

condiciones optimizadas coincidió con el predicho por el modelo

Optimización de la producción de DHA (segunda etapa) a partir

de cultivos propagados en medio de crecimiento (primera etapa)

Relación C:N Edad del

inóculo (d)

Peso seco (g l-1

) Lípidos (g l-1

) DHA(g l-1

)

10:1 2,0 5,20 ± 0,01 1,10 ± 0,42 0,14 ± 0,01

10:1 5,0 9,65 ± 0,49 0,75 ± 0,21 0,29 ± 0,03

55:1 3,5 45,8 ± 0,85 29,25 ± 2,47 7,00 ± 0,50

100:1 2,0 42,05 ± 0,92 29,40 ± 0,71 5,00 ± 0,50

100:1 5,0 44,05 ± 1,20 28,50 ± 0,75 6,50 ± 0,50

Efecto de la edad del inóculo y de la relación molar C:N del medio de

producción sobre la producción de biomasa (peso seco), lípidos y DHA

Tratamiento anterior a la

transferencia a MP

Centrifugación Lavados

Peso seco

(g l-1

)

Lípidos

(g l-1

)

DHA

(g l-1

)

Transferencia completa (100%)

Si Si 43,70 ± 0,28 26,60 ± 0,71 9,50 ± 1,00

Si No 44,95

± 0,78

26,90

± 0,42

9,75 ± 1,00

Transferencia parcial (10%)

No No 37,80 ± 0,01 25,65 ± 0,07 7,75 ± 1,00

Efecto del tratamiento y del tamaño del cultivo en MOC antes de la

transferencia a MP sobre la producción de biomasa (peso seco), lípidos y DHA

Reproducción de las condiciones óptimas en un fermentador

Perfil de crecimiento de A. limacinum SR21 en un

biorreactor de 3.5 l con Medio de Producción (MP)

0 20 40 60 80 100

0

10

20

30

40

50

60

-20

0

20

40

60

80

100

120

140

DC

W(g

l-1)

and

Lip

ids

(gl-1

)

Time (h)

Glu

cose

(gl-1

)

Tiempo (h)

Bio

masa

(g

)

y L

ípid

os

l-1

(g

)l

-1

Glu

co

sa

(g

)l

-1

Bio

ma

sa

y l

ípid

os

(g

l-1

)

Glu

co

sa

(g

l-1

)

Glucosa (), biomasa (), lipidos () y DHA (x).

Bioproceso optimizado:

Primera etapa: 8% (m/v)

glucosa, 12% (v/v) CSL

y inóculo de 4 x 105 cel

ml-1, 3,5 días

Segunda etapa: tamaño

de inóculo de 10% (v/v)

obtenido en la primera

etapa optimizada y

relación molar C:N del

medio de producción de

55:1 (10% m/v glucosa,

acetato de amonio)

Productividad de DHA de 3,7 g l-1 d-1

CULTIVO Y APLICACIONES DE LAS ALGAS

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