CULTIVO DE TEJIDOS VEGETALES

I.- INTRODUCCIÓN:

La facilidad de usar la técnica de cultivo de tejidos vegetales para la multiplicación masiva produce material vegetal in vitro por la iniciación de brotes adventicios, bulbos, tubérculos, embriones asexuales o por crecimiento de brotes de yemas axilares y producción masiva de plántulas a partir de meristemos.

Los propagadores comerciales ya tienen estandarizado el método de mantenimiento de un lote comercial de material madre in vitro, en donde, además de tener la ventaja de mantener este material, se considera el gran número que se puede mantener en un espacio reducido con las condiciones ambientales requeridas y la calidad y sanidad deseables. Esto es debido al potencial morfogenético que tienen los meristemos y otros tejidos de la planta en la producción de brotes.

Existen muchos géneros vegetales que se propagan por cultivo de tejidos para la obtención de grandes cantidades de plantas de importancia comercial, como son Anturium andreanum, Dieffenbachia amoena Snow, D. picta Perfection, Philodendron oxycurdium, Scindapsus aureus, Syngonium podophyllum, Chrysanthemum morifolium, Gerbera jamesonni, Begonia spp, Saxifraga sarmontosa Tricolo, etc.

II.-CONCEPTOS:

Micropropagación:

Micropropagar es el proceso de multiplicar pantas in vitro.

A través de la micropropagación, a partir de un fragmento (explanto) de una planta madre, se obtiene una descedencia uniforme en condiciones de asepsia. Este proceso incluye varias fases:

Explante

Con el término explante se describe un fragmento cortado de un tejido o de un órgano utilizado para iniciar un cultivo.   Como explante puede ser utilizado casi cualquier órgano o tejido, pero para la micropropagación es más conveniente partir de una yema o ápice meristemático que garantize la estabilidad genética de sus células.

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III.- METODOLOGIA:

FASES DE LA MICROPROPAGACIÓN

La selección de la planta madre es muy importante, ya que las plantas que van a obtener son idénticas al progenitor (propagación asexual). Si la planta madre se encuentra enferma, sería deseable conocer el virus especifico presente, pues así las condiciones de cultivo varían, aplicándose termoterapia o simplemente cultivo de meristemos.

El tamaño del inóculo también es importante, pues se tienen meristemos que miden de 0.01 a 0.1 mm de diámetro, y ápices de tallo que miden de 0.1 a 0.3 mm de diámetro; generalmente el número de plántulas libres de virus producidas es inversamente proporcional al tamaño del meristemo o ápice cultivado (Walkey, 1978).

Por último, es importante señalar que el medio de cultivo es un factor esencial, ya que en él juegan un papel vital los requerimientos nutricionales, hormonales y ambientales, específicos de la especie que estemos cultivando; éstos deben de ser semejantes a los que se tienen en condiciones naturales.

El proceso de cultivo in vitro incluye varias etapas, que son:

Etapa 0 : Elección de la planta madre. Etapa I. : IntroducciónEtapa II : Micropropagación.Etapa III. : Enraizamiento. Etapa IV : Aclimatación.

PREPARACIÓN DEL MEDIO DE CULTIVO

El medio MS, o de Murashige y Skoog (1962), es muy usado, particularmente si el objetivo es regenerar plantas; existen numerosas variaciones comerciales de este medio. El medio B5 o de Gamborg et al. (1968), o sus varios derivados, ha sido de un gran valor en el cultivo de células y protoplastos, y también es utilizado eficazmente en regeneración de plantas. La diferencia principal entre los medios MS y B5 es la menor concentración de nitratos en B5. El medio WPM (1980) de baja concentración de sales está especialmente indicado para especies leñosas.

Los requerimientos nutritivos para un crecimiento in vitro óptimo varían con la especie, e incluso son específicos de acuerdo a la parte de la planta que se esté cultivando y a la respuesta que se desea obtener. Debido a estas necesidades específicas se han desarrollado muchas formulaciones diferentes para los medios de cultivo. 

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Una vez escogida la formulación del medio de cultivo, se procede a su preparación.

Se podrían pesar las cantidades necesarias de todos y cada uno de los componentes del medio. Ello, no obstante, sería una operación larga y tediosa, además de muy imprecisa puesto que obligaría a pesar algunas cantidades muy pequeñas. Por todas esas razones, acostumbra a ser una práctica habitual en todos los laboratorios preparar soluciones stock concentradas de los distintos componentes, agrupados de forma que no se produzcan fenómenos de precipitación. Es habitual trabajar con una solución stock de macronutrientes, una de micronutrientes, una de hierro con un agente quelante, otra de vitaminas y mio-inositol, así como con soluciones específicas para los demás componentes del medio (reguladores, ...).

Proceder de esa forma simplifica la preparación del medio: un medio como el MS, que contiene un total de 20 substancias diferentes, requeriría otras tantas pesadas, mientras que a partir de soluciones stock su preparación se reduciría a cuatro medidas de volumen y una pesada (sacarosa). Las soluciones stock pueden mantenerse durante un cierto tiempo en la nevera o en el congelador. Una vez obtenido el volumen de medio deseado se procede a ajustar su pH al valor prefijado mediante la adición de OHNa y/o HCl 0.1-1 N. A continuación, dependiendo de que se vaya a preparar un medio sólido o líquido, se añadirá en el primer caso el agente solidificante, se fundirá por calentamiento breve para, finalmente, ser dosificado en los contenedores adecuados. En el caso de tratarse de un medio líquido se procederá a dosificar directamente en los contenedores escogidos. Tanto si es un medio sólido como líquido se procederá a continuación a autoclavar los contenedores con el medio (generalmente a 121 0C durante 20 minutos).

Conviene tener en cuenta que algunos de los componentes del medio de cultivo pueden ser termolábiles (algunas vitaminas, algunos reguladores,...). En este caso, la esterilización de la solución que contienen la substancia termolábil debe hacerse por filtración y añadirse una vez esterilizada al medio de cultivo previamente esterilizado y parcialmente (en medios sólidos) o totalmente (en medios líquidos) enfriado.

Diagrama de flujo del proceso de preparación de un medio de cultivo a partir de soluciones stock.

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Necesidades nutricionales y hormonales de los cultivos de órganos y tejidos vegetales

Agua

Sustancias orgánicasMacro Micro

elementos

Azúcares AminoácidosAuxinasCitoquininasGiberelinasAcido abcísico

NPKCaMgS

FeZnBMnCuNiCoAlMoI

Mezclas de sustancias poco definidas:Extracto de levaduraLeche de cocoExtractos vegetalesHidrolizados de caseínaPeptona y triptona

Fig. 1y 2 Preparación de medio de cultivo

Fig. 3 y 4 Preparación de medio de cultivo

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FASE 0: ELECCION DE LA PLANTA MADRE

Para poder establecer el cultivo en condiciones de asepsia, se deben obtener explantos con un nivel nutricional y un grado de desarrollo adecuado.

Para obtener estos explantos es recomendable mantener a las plantas madre un período de tiempo que puede oscilar entre unas semanas o varios meses, en un invernadero, en que se va a intentar cultivar la planta en condiciones sanitarias óptimas y con un control de la nutrición, del fotoperíodo y de la irradiancia recibida.

Fig 5 La violeta africana (Saintpaulina ionantha)

FASE I: INTRODUCCION

Una vez escogida la planta madre, se extraerán los fragmentos a partir de los cuales se obtendrán los explantos.

Antes de extraer los explantos se hará una desinfección de los fragmentos de planta madre para eliminar los contaminantes externos. Una vez desinfectado el material vegetal, se debe mantener en condiciones de asepsia.

Se debe realizar un previo desinfectado con fungicida a 1000 PPM. Lavar en agua. Luego lavar con alcohol 70 º de 3 a 5 minutos. enjuagar con agua. Luego colocar en lejía al 20% por 10 a 15 minutos. Enjuagar con agua destilada estéril.

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Fig 6, 7 y 8 Realizando la desinfección.

FASE II: MICROPROPAGACION

Durante esta fase se espera que los explantos que sobrevivieron de la FASE I originen brotes (de procedencia axilar o adventicia) con varios entrenudos.

Periódicamente estos nuevos brotes se deben subcultivar en un nuevo medio mediante divisiones y resiembras en tubos de cultivo u otros recipientes adecuados. Estas operaciones se realizan en la cámara de flujo laminar.

Fig. 6 Etapa de Micropropagación

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Fig. 9 y 10 Propagando

Fig. 11 y 12 Propagando

Fig. 13 y 14 Medios con tomillo.

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Figura 15. Cámara de cultivo tipo cubículo

FASE III: ENRAIZAMIENTO

Para enraizar los explantos se utilizan principalmente dos métodos:

ENRAIZAMIENTO IN VITRO

Se transfieren los brotes obtenidos durante la fase de multiplicación a un medio libre de reguladores de crecimiento o que solo contenga auxinas. Esta operación se realiza en la cámara de flujo laminar. Este método permite ser mas flexible a la hora de escoger los brotes, ya que éstos obtienen del medio la fuente de energía para enraizar, y por tanto no es necesario que tengan las hojas muy bien desarrolladas para realizar la fotosíntesis.

ENRAIZAMIENTO EX VITRO

Los explantos se deben transferir a un sustrato limpio, aunque no necesariamente estéril, que puede ser una mezcla de turba con perlita o vermiculita.Con este método es necesario que el medio de enraizamiento esté libre de organismos patógenos y que los brotes tengan las hojas bien desarrolladas, ya que deben realizar fotosíntesis para que la planta tenga una fuente de energía para enraizar y desarrollarse.Los explantos deben de plantarse en contenedores cubiertos por un plástico, para mantener la humedad relativa elevada, y hacerlos enraizar

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en el laboratorio, o ponerlos en 'multipots' dentro de un invernadero en un área sombreada con "fog-system" o "mist-system".

FASE IV: ACLIMATACIÓN DE LOS EXPLANTOS ENRAIZADOS

Los explantos recién enraizados son muy sensibles a los cambios ambientales, de manera que el éxito o el fracaso de todo el proceso depende de la aclimatación.

Tanto si los explantos fueron enraizados in vitro como ex vitro, en el momento en que se extraen los explantos de los recipientes de enraizamiento están poco adaptados a crecer en un invernadero, ya que estos explantos han enraizado y crecido en ambientes con una humedad relativa muy elevada y generalmente tienen estomas perezosos para responder al descenso de la humedad relativa, demasiado lentos para para evitar la desecación del explanto. Por otra parte crecer en ambientes tan húmedos también suele implicar la falta de una cutícula cérea bien desarrollada, la barrera para evitar la perdida de agua a lo largo de toda la superficie de la planta.

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Los explantos deben ser aclimatados a las condiciones de humedad del invernadero disminuyendo progresivamente la humedad relativa e incrementando progresivamente la intensidad de luz.

LA CÁMARA DE FLUJO LAMINAR

Buena parte de las manipulaciones propias del cultivo in vitro deben realizarse en condiciones de esterilidad total para evitar la contaminación de los cultivos. Para disponer de una superficie de trabajo estéril que no ponga en peligro la esterilidad de los cultivos se usan las cámaras de flujo laminar.

Una cámara de flujo laminar es un receptáculo en forma generalmente prismática con una única cara libre (la frontal) que da acceso al interior, donde se localiza la superficie de trabajo. La esterilidad de la zona de trabajo se consigue porque se hace circular a través del interior de la cámara una corriente de aire que previamente ha sido microfiltrada para eliminar toda partícula extraña. Para evitar que el aire del exterior pueda entrar en la cámara de flujo sin pasar previamente por los filtros se procura que la presión interior sea ligeramente superior a la presion exterior, con lo cual el aire siempre circula de dentro hacia fuera y nunca al revés.

Según el grado de sofisticación de la cámara, puede disponer de elementos accesorios como son: fuente de luz, lampara de esterilización por U.V., pilotos indicadores de funcionamiento diversos, contador de horas de funcionamiento, indicador de presión interior, etc.

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Existen dos tipos de cámaras de flujo laminar según sea la forma en la que se hace circular el aire: cámaras de flujo horizontal y cámaras de flujo vertical. En las primeras el flujo se produce desde el fondo de la cámara hasta el frente, de forma que las partículas se mueven horizontalmente a la superficie de trabajo. En las segundas, el flujo se produce desde el techo hacia la superficie de trabajo de forma que las partículas se mueven perpendicularmente a ella.

EJEMPLO. MICROPROPGACIÓN DE VIOLETAS AFRICANAS VERSUS PROPAGACIÓN POR ESQUEJE.

La violeta africana (Saintpaulina ionantha) fue descubierta por el barón Walter von Saint Paul St Claire en las montañas de Usambara, en la provincia del Cabo (Suráfrica), a finales de siglo pasado. Cultivada por primera vez como planta de interior hará unos cincuenta años, hoy es una de las plantas de flor de interior más populares. Inicialmente se reproducía por semilla o, sobre todo, por esqueje foliar. Hoy la forma más habitual de reproducirla es el cultivo in vitro de secciones de peciolo.

ESQUEMA DEL TRABAJO

CONCLUSIONES:

Se pudo realizar cultivos vegetales. Se logró apreciar todas las etapas de la micropropagación.

BIBLIOGRAFÍA:

HURTADO M. Daniel V / MERINO M. María Eugenia. Editorial Trillas.

Tercera Edición. Agosto de 1994. México. Pp. 233. Pg. 136 – 148. 

http://www.monografias.com/trabajos12/aplicult/aplicult.shtml

http://www.unizar.es/departamentos/bioquimica_biologia/docencia/FMBvirtual/Micropropa/Micvegetal.htm

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