ESTAPHILOCOCCUS

MICROBIOLOGIA

ESTAPHILOCOCCUS

INTRODUCCIÓN

Stapylococus: género de bacterias perteneciente a la familia de las

Micrococcaceae, gram positivos, no esporulados, aerobios facultativos,

inmóviles. Su nombre, que en griego significa racimo de granos, deriva del

hecho de que este germen tiende a agruparse en masas desordenadas que

recuerdan los racimos de uva, si bien también se pueden encontrar como

elementos únicos o en pares, en grupos de cuatro o en cadenas cortas de tres

o cuatro células. Se han identificado unos 30 serotipos. Presentan una gran

variedad de enzimas, toxinas, hemolisinas y componentes celulares. Entre los

factores de virulencia de estas bacterias está su actividad coagulasa, siendo

mayor la virulencia cuanta mayor actividad coagulasa tenga. Casi todas las

inflamaciones del cuerpo están asociadas con este germen. Cerca del 80% son

resistentes a la penicilina. Este género de bacterias comprende numerosas

especies: albus, anaerobius, aureus, epidermis, etc.

Se hará un sembrado de Stapylococus en un medio selectivo sólido Baird

Parker y medio Chapman para ello utilizaremos muestras, yema de huevo y

queso fresco comprados del mercado del Callao “Santa Rosa” las muestras se

preparan mediante las diluciones decimales el procedimiento del sembrado y

conteo de colonias se explicara en transcurso del desarrollo del presente

trabajo.

I.-OBJETIVOS

MICROBIOLOGIA

ESTAPHILOCOCCUS

GENERALES:

Determinar si existe la presencia de estafilococos en una muestra de

queso fresco y en la yema de huevo

ESPECIFICOS:

Mediante el método de diluciones decimales se analizará la muestra

El conteo de bacterias se realizará mediante un método indirecto

Recuento de viables en placa

Se utilizará medios de cultivos selectivos; Chapman y Agar Baird Parker

II.-GENERALIDADES TEÓRICAS

TAXONOMIA

División II: Firmicutes

Clase I: Firmibacteria

Familia: Micrococcaceae

Género: Staphylococcus

GÉNERO Staphylococcus

El género Staphylococcus comprende microorganismos que están presentes

en la mucosa y en la piel de los humanos y de otros mamíferos y aves,

incluyendo a 32 especies y 15 subespecies, muchas de las cuales se

encuentran en los humanos. Las especies que se asocian con más frecuencia

a las enfermedades en humanos son Staphylococcus aureus (el miembro más

virulento y conocido del género), Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus

saprophticus, Staphylococcus capitis, "Staphylococcus afarensis" y

Staphylococcus haemolyticus.

Según Manual Bergey: 1957 y se clasifican en estafilococos coagulasa

positivos (ECP) y estafilococos coagulasa negativos (ECN) Estafilococo

coagulasa variable. Mencionaremos a los más representativos

Estafilococos coagulasa positivos (ECP)

o S.aureus

o S.intermedius

MICROBIOLOGIA

ESTAPHILOCOCCUS

o S.delphini

o S.schleiferi subsp coagulans

Estafilococo coagulasa variable

o S.hyicus

Estafilococos coagulasa negativos (ECN)

o S. epidermidis,

o S. warneri

o S. simulans)

CARACTERÍSTICAS GENERALES

Los estafilococos crecen fácilmente sobre casi todos los medios

bacteriológicos, en condiciones aeróbicas se da el mejor crecimiento. Su mayor

velocidad de crecimiento es a 5 - 25 ºC; pero también se puede ver en activa

fisión binaria entre 30 y 27 ºC. Además, producen catalasa, lo que los

diferencia de los estreptococos. Tiene importancia médica principalmente el S.

aureus, y en humanos además de éste, el S. saprophiticus y el S. epidermidis.

sus características mas comunes son:

Células esféricas de 0,5 – 1,5 µm de diámetro, solos, de apares,

tétradas o grupos irregulares.

Gram positivos, Inmóviles, no forman esporos.

Pared celular contiene péptidoglicano y ácido teicoico.

Anaerobios facultativos.

Catalasa positivas.

Metabolismo: RESPIRATORIO/FERMENTATIVO.

La mayoría de las cepas crecen en presencia de 10 % ClNa, y entre 18 y

40 °C. Óptimo 37 °C/24 horas/atmósfera normal.

Nutricionalmente, no exigentes. Desarrollan en medios comunes.

En general presentan pigmentos carotenoides

Hábitat

Comensal de la piel y mucosas (digestiva y rinofaringe)

Distribución mundial. Microorganismo más extendido en la naturaleza.

Patógenos oportunistas para animales y humanos.

MICROBIOLOGIA

ESTAPHILOCOCCUS

Pueden aislarse de productos de origen animal (carne, leche, queso) y

ambiental (suelo, polvo, aire)

Tipo de

alimento

Recuent

o

estafiloc

ocos / g

Ensalada

de pollo 1,7 * 106

Macarron

es 2,6 * 107

Hamburg

uesa 2 * 102

Tarta de

chocolate 7,3 * 102

Helado Negativo

<100/g

Características culturales de Staphylococcus

Crecimiento en medio líquido

Turbidez homogénea con abundante depósito en el fondo del tubo.

Crecimiento en forma de anillo en la superficie

Crecimiento en medio sólido:

MICROBIOLOGIA

ESTAPHILOCOCCUS

Colonias redondas de 1 a 2 mm, bordes netos, superficie lisa, opacas o

mucoides.

Medios de cultivos selectivos y diferenciales para aislamiento de

estafilococos

Agar Manitol Salado (manitol, rojo de fenol)

Agar Staphylo 110

Agar Baird Parker (yema de huevo, telurito de

MEDIDA DEL NÚMERO DE INDIVIDUOS (conteo de las bacterias)

MÉTODOS DIRECTOS

1) Cámara de recuento de Petroff-Hauser: Consiste en un portaobjetos

especial con una graduación en superficie y unas medidas muy concretas:

Excavación con 0.02 mm de profundidad.

Área de 1 mm2, dividida en un retículo de 25 cuadrados grandes.

Cada cuadrado grande está subdividido a su vez en 4x4 = 16

cuadrados pequeños.

sea, la muestra se distribuye en 16 x 25 = 400 celdillas (cuadros

pequeños).

La muestra, una vez dispensada entre el porta y el cubre, se deja reposar

sobre la plataforma del microscopio durante unos minutos, y se cuenta el

número de células en varias celdillas (normalmente en 16, equivalentes a uno

MICROBIOLOGIA

ESTAPHILOCOCCUS

de los cuadros grandes). Se anota el número n de células observadas en esas

16 celdillas. Entonces, la concentración celular es fácil de establecer:

n x 25 x 50 x 1000 = concentración en células/ml.

Ventajas: es un método muy rápido.

Inconvenientes: sólo sirve para suspensiones relativamente concentradas

(>10x106 céls./ml). Por debajo de este valor el número de células vistas en el

campo del microscopio es muy pequeño y poco significativo estadísticamente.

En bacterias móviles, hay que inmovilizarlas previamente, con una mezcla de

alcohol y agua.

2) Contadores electrónicos de partículas (tipo Coulter): Se hace pasar una

suspensión microbiana por un tubo capilar, entre los dos polos de una corriente

eléctrica. Cada vez que por un orificio (30 mm diámetro) pasa una partícula (p.

ej., bacteria) se interrumpe la corriente, lo cual es recogido por un dispositivo

de registro electrónico, que detecta el número y el tamaño de las partículas que

van pasando. (El tamaño detectado es función de la intensidad del pulso de

voltaje al paso de la partícula).

Comentarios: hay que usar suspensiones absolutamente libres de partículas

extrañas (las pequeñas serían contabilizadas erróneamente como bacterias, y

las mayores pueden obturar el orificio del aparato).

MICROBIOLOGIA

ESTAPHILOCOCCUS

MÉTODOS INDIRECTOS

1) Recuento de viables en placa

Los métodos de recuento de número de células que hemos visto hasta

ahora (los directos) no distinguen entre células vivas y muertas. En muchos

casos conviene contar las células vivas, y esto en laboratorio se suele hacer

mediante el recuento de viables. (Una célula se define como viable cuando,

colacada en un medio adecuado, es capaz de dividirse y dar descendencia).

El método habitual de lograr esto es sembrar pequeñas alícuotas de

diluciones adecuadas de un cultivo original sobre placas de Petri con medio

sólido (con agar). Cada célula viable dará origen a una colonia visible

después del tiempo adecuado de incubación. Contando las colonias

visibles, teniendo en cuenta la dilución de la que proceden y el volumen de

alícuota utilizado, es fácil deducir el número de células viables en la

suspensión original. (Para esto, mira el ejemplo de la diapositiva, y sobre

todo, estate atento a la práctica correspondiente, que se suele realizar en la

3ª tanda).

Mientras tanto, y para luego repasar esa práctica, puedes realizar un

experimento on-line sobre crecimiento bacteriano

Precauciones:

o Para minimizar los errores estadísticos de muestreo, se recomienda

sembrar 5 placas de cada dilución;

o Hay que usar pipetas nuevas en cada dilución;

o Contar las placas donde existan entre 50 y 300 colonias.

o Como no podemos garantizar que cada colonia no proceda de más

de un indiviudo (y esto es especialmente cierto para bacterias que

forman agrupaciones de 2 o más células), el recuento se refiere no a

“células viables reales” sino a “unidades formadoras de colonia”

(UFC). Por lo tanto, una UFC corresponde, como mínimo, a una

bacteria, pero sobre todo en bacterias con agrupaciones, la medida

por siembr en placa infravalora el número real de individuos, porque

MICROBIOLOGIA

ESTAPHILOCOCCUS

cada UFC puede corresponder a dos o más individuos que estaban

juntos al ser sembrados en la placa.

Recuento de viables por siembra en placas petri

2) Recuento sobre filtros: Se usa para suspensiones diluidas de bacterias. Se

hace pasar un gran volumen de suspensión a través de una membrana de

nitrocelulosa o de nylon estériles (con un diámetro de poro que retiene las

bacterias pero permite el tránsito de sustancias). Posteriormente, el filtro se

deposita sobre la superficie de un medio de cultivo sólido. Las colonias se

forman sobre el filtro a partir de las células retenidas. Dichas colonias se

cuentan, deduciéndose la concentración original de viables en función del

volumen de suspensión que se hizo pasar por el filtro.

III.-PROCEDIMIENTO ESPERIMENTAL

MICROBIOLOGIA

ESTAPHILOCOCCUS

MATERIALES

Pipetas de 1 estériles

Estufa de cultivo

Asa de vidrio estéril

Asa de cultivo

Placas de Petri de 90 mm de diámetro

Medios de cultivo y reactivos

Medio sólido selectivo Baird Parker (B P)

Medio sólido selectivo Champman

Muestras

Yema de huevo 10ml

Queso fresco 10g

PREPARACIÓN DEL MEDIO DE CULTIVO BAIRD PARKER

Composición:

Triptona 10 g

Extracto de carne 5 g

Extracto de levadura 1 g

Piruvato sódico 10 g

Glicina 12 g

Cloruro de litio 5 g

Agar 20 g

Agua destilada 1.000 mL

Disolver por calentamiento y agitación. Ajustar el pH a 6,9 ± 0,2. Esterilizar en

autoclave a 121 ºC durante 20 minutos. Enfriar a 50ºC y añadir 50g de

MICROBIOLOGIA

ESTAPHILOCOCCUS

emulsión estéril yema de huevo-telurito (apartado siguiente). Mezclar

uniformemente y preparar placas de Petri.

Emulsión de yema de huevo-telurito

Composición

Emulsión de yema de huevo 50 g

Telurito potásico 3,5 por 100

Sulfametazina 0,2 por 100

Agua destilada 1.000 mL

La yema de huevo se prepara partiendo de huevos frescos de gallina, bien

lavados y que hayan permanecido en alcohol al 70 por 100, entre 2-3 horas. Se

ex-trae e] huevo asépticamente, y, de la misma forma, se separan las claras de

las yemas. La emulsión se obtiene mezclando 50 mL de yema de huevo con la

misma cantidad de solución salina estéril. La mezcla se homogeneiza en

homogeneizador estéril.

La solución de telurito potásico al 3,5 por 100 se esteriliza por filtración.

Para preparar la solución de sulfametazina, se disuelven 0,5 g del producto

puro en 25 mL de hidróxido sódico Ni] O, completando hasta 250 mL con agua

destilada.

► El cloruro de litio y el telurito potásico que forman parte del medio inhiben el

desarrollo de la flora competitiva; el piruvato sódico y la glicocola favorecen el

crecimiento de los estafilococos.

PREPARACIÓN DEL MEDIO CHAPMAN

Composición (en gramos por litro)

Extracto de carne 1.00

Poliptepona 13.00

D-Manitol 10.00

MICROBIOLOGIA

ESTAPHILOCOCCUS

Cloruro de sodio 75.00

Rojo fenol 0.025

Agar 13.00

- pH final 7,4 +/- 0,2

► Es selectivo para el aislamiento de estafilococos. La mayoría de las

bacterias que no sean estafilococos, son inhibidas por la alta concentración de

cloruro de sodio. Por lo general los estafilococos coagulasa positiva fermentan

el manitol de éste medio haciéndolo virar al amarillo. Se trata de un medio

altamente selectivo debido a su alta concentración salina. Los estafilococos

coagulasa negativos, presentan colonias rodeadas de una zona roja.

PREPARACIÓN DE LA MUESTRA

Paso 1

Asépticamente se pesan 10 g de muestra (queso) y se mide 10ml de yema de

huevo. El queso se triturará en un vaso con una espátula y el huevo se batirá

ligeramente en un vaso.

Paso2

Luego se diluyen en 90 mL de agua peptonada o destilada ambas muestras

MICROBIOLOGIA

ESTAPHILOCOCCUS

Paso3

Homogenizar la mezcla en el Stomacher durante 1 a 4 minutos (el tiempo varía

segun el tipo de alimento) (defectivamente realizarlo por trituración en un vaso

esterilizado de una trituradora de cuchillas -tipo batidora- a  una velocidad

aproximada de 14.000 rpm y en un tiempo medio de 60-90 segundos), pero en

nuestro caso utilizaremos un agitador magnético.

PREPARACIÓN DE LAS DILUCIONES DECIMALES

Paso1

Según el número de microorganismos esperado y sobre la base de la dilución

inicial de 10 g en 90 mL (dilución 10-1), preparar diluciones decimales de 10-2,

10-3, etc., usando pipetas o puntas estériles para cada dilución, tomando 1 mL

de la solución anterior en 9 mL de agua peptonada, y evitando que se forme

espuma

MICROBIOLOGIA

ESTAPHILOCOCCUS

Paso2

Mezclar mecánicamente cada dilución en un agitador mecánico tipo vortex ( o

manualmente agitándo el tubo 25 veces en 7 segundos con movimientos

ascendentes y descendentes formando un ángulo de abertura aproximado de

60º entre brazo y antebrazo).

SIEMBRA POR EXTENSIÓN EN SUPERFICIE 

A partir de la "serie de diluciones decimales" , se siembra con la ayuda del asa

de khole de cada dilución sobre la superficie bien seca de agar Baird-Parker y

MICROBIOLOGIA

ESTAPHILOCOCCUS

en el medio CHAPMAN contenido en placas de Petri, se podria sembrar de las

siguentes formas.

Incubación de las placas

Invertir las placas de Petri e incubarlas en estufa a 37 ºC durante 48 horas, con

lectura a las 24 horas.

Lectura de las placas y recuentos de colonias

Seleccionar para el recuento las placas inoculadas con la dilución que

contengan entre 20 y 200 colonias típicas.

MICROBIOLOGIA

ESTAPHILOCOCCUS

CÁLCULOS Y EXPRESIÓN DE LOS RESULTADOS

En las placas que se ha efectuado el recuento, multiplicar por el inverso de la

dilución y expresar el resultado como Unidades Formadoras de Colonias por g

de alimento (UFC/ml).

N = C x D

Donde: 

N= Unidades formadoras de colonia por gramo de muestra (UFC/g o UFC/mL).

   C= Media del número de colonias en las dos placas.

   D= Factor o inverso de la dilución.

RESULTADOS EXPERIMENTALES

Se sembraron las muestras de dilución 10-5, 10-6, 10-7, en sendas placas petri.

MICROBIOLOGIA

ESTAPHILOCOCCUS

10-6, 10-7, 10-5, 10-7 respectivamente

HACIENDO UN RECUENTO DE COLONIAS

Recuento de viables en placa:

MICROBIOLOGIA

ESTAPHILOCOCCUS

en la placa de dilución 10-5, se contaron 150 colonias

en la placa de dilución de 10-6, se contaron 25 colonias

en la placa de dilución de 10-7, se contaron 10 colonias

Aplicando la formula para hallar la Unidades Formadoras de Colonias por g de

alimento (UFC/ml).

N = C x D

N=150x105=15x106 UFC/ml

N=25x106=25x106 UFC/ml

N=10x107=100x106 UFC/ml

CONCLUSIONES

MICROBIOLOGIA

ESTAPHILOCOCCUS

se concluye que en la muestra de queso fresco existe gran cantidad de

estafilococos esto se puede reconocer porque la coloración del agra

Chapman que inicialmente es rojo se tiñe de amarillo porque el

estafilococos fermenta el manitol produciendo acido.

Se sembró en una placa la mitad una muestra de queso y la otra mitad

de yema de huevo y se observo que hay más estafilococos en la

muestra de queso.

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

http://www.fcv.unlp.edu.ar/sitios-catedras/97/material/Teorico%20Apo

%20I%20estafilococo.pdf

http://www.pncq.org.br/biblioteca/actualidades2005_11.pdf

http://www.higiene.edu.uy/cefa/Libro2002/Cap%2019.pdf

http://enlinea.zaragoza.unam.mx/didacta/biologia/micorrizas/

Microbiol.pdf

http://www.analizacalidad.com/anmic.pdf

http://www.brizuela-lab.com.ar/producto.htm

(http://virus.usal.es/web/demo_microali/Saureus/SaureusPlaca.html)

©2005 Laboratorio de Tecnología Educativa. Departamento de

Microbiología y Genética. Universidad de Salamanca.

http://es.wikipedia.org/wiki/Staphylococcus

Material profesora

MICROBIOLOGIA

ESTAPHILOCOCCUS

Radiación_rangos

Radiación

MICROBIOLOGIA