Cuaderno de Practicas 2007-08

CUADERNO DE PRÁCTICAS

BIOLOGÍA – CIENCIAS AMBIENTALES

UNED

CURSO 2007-08 FRANCISCO JAVIER SANCHEZ CRUZ

Prácticas de Biología (CC Ambientales) 2007-2008

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ACIDOS NUCLEICOS A.- Describir los fundamentos de la extracción de ADN, indicando la función de cada uno de los componentes del tampón de

extracción así como de los pasos del protocolo. La extracción del ADN genómico consta de tres pasos principalmente :

1. Homogeneización . Mediante acción mecánica y detergentes se rompen las membranas de la célula y se libera el ADN.

2. Filtración del homogeneizado. Se produce la eliminación de grandes fragmentos y se recupera el ADN y las proteínas en solución acuosa.

3. Precipitación del ADN por medio del etanol. Para la homogeneización se prepara una disolución de lisis con:

A) Un detergente SDS cuya función es romper las bicapas lípidicas de las membranas y unirse a las cargas positivas de las proteínas.

B) Acido etilendiaminotetraacético(EDTA) recoge los cationes de mg 2+ que las encimas que degradan el ADN necesitan para su actividad.

C) Cloruro sódico(ClNa). Mantiene la doble hélice y actúa sobre los histonas liberándolas del ADN

En nuestro caso para preparar la disolución de lisis se toman 80 ml de agua y se añaden 0,9 de naCl, 0.3 gr de EDTA y 1 ml de una disolución al 10% deSDS, con lo cual se preparan 100 ml. En nuestra práctica se toman 25 gr de guisantes congelados y se añade 50 ml de la disolución de lisis. La homogeneización se hace con una batidora a máxima velocidad durante cinco segundos. La filtración se realiza colocando un embudo con una triple capa de gasa. En la precipitación , en nuestro caso, se añade una capa de etanol sobre la disolución acuosa que contiene el ADN. En la interfase entre ambas soluciones la mezclar se produce la precipitación del ADN en el etanol. De esta forma se puede recoger con una pipeta pasteur( largas hebras).

B.- El ADN obtenido se puede emplear en diversas técnicas de laboratorio. Indicar dos de ellas comentando en que consisten y

que información nos pueden proporcionar. La Biotecnología es la rama de la biología moderna que se encarga de la manipulación del ADN y de sus aplicaciones. Dentro de la manipulación en la agricultura vamos a ver dos aplicaciones. 1. Plantas que producen sus propios insecticidas. Las plagas de insectos herbívoros es uno de los mayores problemas para la agricultura. Este problema ha sido atacado a través de la fumigación de productos tóxicos para estas plagas. Existen bacterias, como la bacillus thuringiensis que produce su propia proteína tóxica para el insecto específico que se alimenta de ella. La toxicidad de esta bacteria es 80.000 veces mayor que los insecticidas habitualmente utilizados en la agricultura. Se han vendido preparados secos de esta bacteria como productos biodegradables, pero esto tiene sus límites, dada la reiterada utilización. Una solución al problema sería que la propia planta produjera sus propias toxinas y eso es lo que se trata de hacer. Se han aislado y clonado genes de la bacteria en cuestión. Se les han añadido promotores y finalizadotes, señales poli A. codones y elementos reguladores del DNA de las plantas. Estos genes modificados han sido introducidos en las células vegetales en el laboratorio usando el vector plásmido Ti y se han cultivado. La evaluación en su resistencia a los insectos ha sido positiva. Los tomates transgénico, el maíz, la papa y el algodón tienen una considerable resistencia a los insectos depredadores. 2. Granos que han mejorado las características nutricionales para el ser humano. Cerca de 400 millones de personas en el mundo tienen la deficiencia de la vitamina A, lo que se traduce en ceguera e infecciones. El problema radica en que consumen granos que no contienen Beta-caroteno, sino, una molécula precursora para él.


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Hay organismos como la bacteria Erwinia y la plantas del narciso que poseen encimas que convierten el precursor en Beta-caroteno. Los científicos aislaron los genes para la vía del Beta-caroteno de la bacteria y los otros dos de las plantas del narciso. En el grano de arroz en desarrollo agregaron señales de promotor y agregaron cada gen a las plantas de arroz utilizando el vector de agrobacterium tumefaciens. El resultado fue la obtención de un grano de arroz de color amarillo que contiene Beta-caroteno suficiente para que una persona tenga sus necesidades cubiertas con 300 gramos de arror cocido. Actualmente esta cepa transgénica se cruza con cepas mejor adaptadas en distintas localizaciones y es de esperar que la dieta de millones de personas mejore de una manera considerable.


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ENZIMAS Y ACTIVIDAD ENZIMÁTICA A.- Indicar el resultado obtenido en cada parte de la práctica. El número de símbolos (+) indica mayor actividad, en el caso de

no observar actividad se indica con un símbolo (-).

REACCIÓN ENZIMÁTICA Tubo Extracto Catecol (gotas) Agua destilada (gotas) Reacción=color (- , + , ++) 1 1 ml 0 1 ml -- 2 0 1 ml 1 ml + 3 1 ml 1 ml 0 ++ 4 250 µl 1 ml 750 µl +

INHIBICIÓN DE LA REACCIÓN POR DESNATURALIZACIÓN DE LA ENZIMA

Tubo Extracto hervido Catecol (gotas) Agua destilada Reacción=color (- , + , ++) 5 1 ml 1 ml 0 --

ESTUDIO DEL EFECTO DEL pH EN LA REACCIÓN

Tubo Extracto Catecol (gotas) Buffer Reacción=color (- , + , ++) 6 1 ml 1 ml 2 ml pH 9,2 ++

7 1 ml 1 ml 2 ml pH 7,1 +

8 1 ml 1 ml 2 ml pH 2,5 +

INHIBICIÓN DE LA REACCIÓN POR UN INHIBIDOR QUÍMICO ESPECÍFICO

Tubo Extracto Catecol (gotas) PTU (gotas) Reacción=color (- , + , ++) 9 1 ml 1 ml 1 ml --

B.- En la práctica se ha realizado un experimento de inhibición de la enzima. ¿Qué diferencia hay entre la inhibición por calor y la inhibición por medio de feniltiourea?.

1. La inhibición por hervido provoca su inactivación, ya que , se desnaturaliza. Se desestructura. 2. La inhibiclión por un inhibidor químico – PTU - . En este caso la catecolasa, que contiene cobre, es inhibida por el agente que atrae el cobre y deja de ser cofactor en la reacción.

C.- Razonar el resultado obtenido en los tubos 6, 7 y 8. Contrastar los resultados con los obtenidos en la siguiente figura:

El mayor cambio de color se ha producido en el pH mas alto.

Según ha ido disminuyendo el pH la reacción ha sido menor. Las

Encimas tienen una velocidad de reacción óptima en estos gráficos.

En el primero la Vo esta so pH neutros(6-7), en el segundo, la

encontramos en pH mas bilen ácidos(4-5). En nuestro caso la

cotecalasa tiene su velocidad optima en pH básicos( 9-10).


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CICLO CELULAR

Estimación del índice mitótico y duración relativa de las fases del ciclo celular. Contar el número de células en las fotos que se suministran, indicando la fase en la que se encuentra cada una.

FASE Foto 1 Foto 2 Foto 3 Foto 4 Total

Interfase 71 85 55 47 258

Profase 4 6 4 4 18

Metafase 2 3 3 1 9

Anafase 0 1 1 0 2

Telofase 2 3 2 1 8

Total 79 98 65 53 295

a. Calcular el porcentaje de células en cada una de estas fases y a partir de estos datos obtendremos el índice mitótico (IM) de la población

Interfase Profase Metafase Anafase Telofase TOTAL nº de células 258 18 9 2 8 295 % de células 87,4 6,1 3,05 0,67 2,7 100%

Con estos datos calcular el IM: 12,55

% IM = nº de células en mitosis (P+M+A+T) / nº total de células x 100

Interfase MITOSIS TOTAL nº de células 258 37 295 % de células 87,45 12,55 100%

b. Estimar la duración relativa de la interfase y de la mitosis.¿Cuál es la fase más larga o que más tiempo dura de la mitosis?

De 60 minutos 7 minutos y medio duraría la mitosis. La fase más larga de la mitosis es la profase

c. ¿Cuál es la fase más corta de la mitosis?

La fase mas corta es la anafase

d. Asumiendo que la duración total del ciclo en estas condiciones, a una temperatura ambiente de aproximadamente 22º C, es decir el tiempo que pasa desde que una célula se forma por división de otra hasta que ella misma se divide para dar dos nuevas células, es de 15 horas; estimar la duración real en minutos de cada una de estas fases.

tiempo min. fase = nº células fase / nº células total x 15 x 60

Interfase Profase Metafase Anafase Telofase TOTAL % de células 87,4 6,1 3 0,67 2,7 100%

tiempo 13,11 0,91 0,45 0,10 0,4 15h


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CROMOSOMAS

A.- Estudio del cariotipo humano normal y con mutaciones cromosómicas

A partir de una fotografía que corresponde a una imagen real de los cromosomas de una célula humana se van a recortar los cromosomas y organizar el cariotipo. Esto permitirá deducir si corresponde a un varón o a una mujer, y si se trata de un individuo normal o presenta alguna anomalía cromosómica. CARIOTIPO 1 corresponde a: Hombre Normal XCCX

Mujer X XXX Anomalía cromosómica

CARIOTIPO 2 corresponde a:

Hombre Normal

Mujer X XX Anomalía cromosómica X X

Aneuploidia que afecta a un cromosoma sexual, monosomía del cromosoma x(45,x)

CARIOTIPO 3 corresponde a:

Hombre X X X Normal

Mujer Anomalía cromosómica X X

TRISOMIA DEL CROMOSOMA 21. VARON(47,CY). PRODUCE SINDROME DE DOWN.

CARIOTIPO 1

X

c


8

1 2 3 4 5

6 7 8 9 10 11 12

13 1814 15 1716

19 20 21 22 X Y

1 2 3 4 5

6 7 8 9 10 11 12

13 1814 15 1716

19 20 21 22 X Y

1 2 3 4 5

6 7 8 9 10 11 12

13 1814 15 1716

19 20 21 22 X Y


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Cariotipo

2

1 2 3 4 5

6 7 8 9 10 11 12

13 1814 15 1716

19 20 21 22 X Y

1 2 3 4 5

6 7 8 9 10 11 12

13 1814 15 1716

19 20 21 22 X Y

1 2 3 4 5

6 7 8 9 10 11 12

13 1814 15 1716

19 20 21 22 X Y


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CARIOTIPO 3 Modelo de los cromosomas

1 2 3 4 5

6 7 8 9 10 11 12

13 1814 15 1716

19 20 21 22 X Y

1 2 3 4 5

6 7 8 9 10 11 12

13 1814 15 1716

19 20 21 22 X Y

1 2 3 4 5

6 7 8 9 10 11 12

13 1814 15 1716

19 20 21 22 X Y


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CARIOTIPO 1


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CARIOTIPO 2


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CARIOTIPO 3


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B.- Localización de genes específicos en los cromosomas humanos

Se van a utilizar las bases de datos sobre el GENOMA HUMANO, que son públicas y se encuentran disponibles en Internet, para buscar algunos genes en los cromosomas humanos, identificar en qué cromosoma se encuentran y localizar su posición exacta dentro del cromosoma.

The Human Genome. Interactive Centre. organizado y mantenido por The Wellcome Trust.

http://genome.wellcome.ac.uk/node30086.html

Buscar la localización de los genes que se relacionan a continuación indicando el cromosoma dónde se encuentran y el locus.

Gen Cromosoma Locus

HPC1 1 1q24-q25

RHD 1 1p36

H1,H2A,H2B,H3,H4 6 6p21,6p22

CFTR 7 7q31

HR 8 8p21

ABO 9 9q34

BRCA2 13 13q12

FECH 18 18q21

APOE 19 19q13

ADA 20 20q12-q13

MB 22 22q13

F8,F9 x

SRY y Yp11


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ANATOMÍA EXTERNA E INTERNA DE ANIMALES

1.- DISECCIÓN DE UN INVERTEBRADO

A.- Dibujar la anatomía externa del animal a diseccionar indicando las estructuras más relevantes.


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B.- Dibujar la anatomía interna del animal diseccionado indicando las estructuras más relevantes.


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2.- DISECCIÓN DE UN VERTEBRADO C.- Dibujar la anatomía externa del animal a diseccionar indicando las estructuras más relevantes.


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D.- Dibujar la anatomía interna del animal diseccionado indicando las estructuras más relevantes.


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FOTOSÍNTESIS CARACTERIZACIÓN DE PIGMENTOS DE CLOROPLASTOS

A.- Explicar brevemente el fundamento de la separación de los pigmentos mediante cromatografía.

En esta práctica hemos realizado una cromatografía en papel, es un método de separación de moléculas, esta es debida a las propiedades físicas y químicas de las sustancias a separar. Todas tienen un fase fija y una fase móvil que son las que hacen que debido a las propiedades de cada sustancia se separen entre una u otra fase. El movimiento de cada molécula es el resultado de un equilibrio entre el movimiento de la fase móvil y las fuerzas que tienden a frenar ese desplazamiento. Aquí, por un lado se realiza la cromatografía de reparto , basada en que al centrarse dos fases en contacto la muestra se distribuirá entre ambas fase, y la cromatografía de adsorción en la cual la muestra pasa a través de una fase estacionaria sólida , con la que interacciona, es mas lento el movimiento en esta fase cuanto mas firme es la interacción de la molécula con el compuesto de la fase estacionaria. De esta forma y como conclusión las moléculas se separan según la capacidad de absorción , teniendo distinto retraso a lo largo de la columna.

B.- Pegar o dibujar la cromatografía señalando en ella los distintos pigmentos. Indicar la estructura de cada uno de ellos.


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BIOINFORMÁTICA

A.- Realizar una búsqueda de información en la base de datos PubMed sobre los temas siguientes:

“biomarker” (biomarcador) “apoptosis” “biotechnology” (biotecnología) “ecology” (ecología) “environment” (medio ambiente)

Término Número de artículos 2002-2007 Número de revisiones 2002-2007

biomarker 162030 18540

apoptosis 88498 1384

biotechnology 18121 2932

ecology 7509 1492

environment 249852 22345

B.- Descargar un artículo que este disponible on-line de manera gratuita con el término “ECOLOGY”. Indicar la referencia (autores, título, revista, número, páginas y año).

Laterality and flight: Concurrent tests of Side-Bias an Optimality in flying tree swallows. Autores: James t. Maridel, John M. Ratclifle, David J. Cerasale, David N. winkler Editor: Andrew iwaniuk, Smithsonian institution, USA Número de páginas: 5 Fecha de publicación: 12 de Marzo de 2008

C.- Descargar una revisión (review) que este disponible on-line de manera gratuita con el término “ECOLOGY”. Indicar la referencia (autores, título, revista, número, páginas y año).

Pristionchus Pacificus Autores: Ralf J. Sommer. Editor: Macx-Plank Institut für Entwicklungsbiologie, Abteilung Evolutionsbiologie, D-72076 Tübingen, Germany Número de páginas: 8. Públicado el 12 de agosto(la revisión) en Word book D. Buscar en la base de datos de libros los términos que se detallan a continuación. Escribir los cinco primeros resultados que se han obtenido indicando la información que se solicita:

TÉRMINO LIBRO NÚMERO DE “ITEMS” EDITORIAL

GENE REVIEWS 1045 PAGON, ROBERTA A.

EUREKAH BIOSCIENCIE COLLECTION 461 LANDES BIOCIENCIE

INTRODUCTION TO GENETIC ANALYSIS 386 W. H. FREEMAN

CANCER MEDICINE 6TH.ED 363 BC DECKER INC

CHROMOSOME

HUMAN MOLECULAR GENETICS 309 GARLAND SCIENCE


GENE GENE REVIEWS 16816 PAGON, ROBERTA A.


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EUREKAH BIOSCIENCIE COLLECTION 2277 LANDES BIOSCIENCIE

CANCER MEDICINE 836 BC DECKER INC

HUMAN MOLECULAR GENETICS 738 WORM BOOK

MOLECULAR BIOLOGY OF DE CELL 696 GARLAND SCIENCIE


HEALTH SERVICE TECHOLOGY 6427 NATIONAL LIBRARY OF MEDICINE

CANCER MEDICINE 6087 BC DECKER INC

EUREKAH BIOSCIENCE COLLETION 884 LANDES BIOSCIENCIE


CANCER

PATIENT DRUG INFOMATION 413 AMERICAN SOCIETY OF HEALTH


EUREKAH BIOSCIENCE COLLETION 1655 LANDES BIOSCIENCIE



MOLECULAR CELL BIOLOGY 723 W. H. FREEMAN

DNA

HUMAN MOLECULAR GENETICS 643 GARLAND SCIENCIE


BIOCHEMISTRY 95 W. H. FREEMAN


BASIC NEUROCHEMISTRY 24 LIPPINCOTT. WILLIANS Y WILKINS

MOLECULAR CELL BIOLOGY 18 W. H. FREEMAN

GLYCOLYSIS

EUREKAH BIOSCIENCE COLLECTION 18 LANDES BIOSCIENCIE


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E.- Realizar un resumen de 250 palabras con los datos obtenidos con el término “DNA” a partir de dos libros distintos de la base de datos. Indicar los libros empleados.

ADN: Alternativa Conformación y Biología. Libro Eurekah . Item número 4 La estructura local común de la transición de B-ADN de conformación en otras formas de ADN puede ser funcionalmente importante. En este capítulo se describen las estructuras de las formas de ADN llamado ADN conformations alternativas que son distintas de la canónica B-hélice de ADN. También se analiza lo requisitos para la formación de estructuras alternativas del ADN, así como sus posibles funciones biológicas. La formación de la no-B-ADN dentro de ciertos elementos de la secuencia de ADN puede ser inducida por cambios en las condiciones ambientales, y la unión a proteínas superhelical tensión. Varias lineas de evidencia indican que existen estructuras alternativas del ADN en células eucarióticas y procarióticas. Los datos sobre su participación en la replicación, la expresión de genes, la recombinación y mutagénesis sigue acumulandose. Replicación, Mantenimiento , y reordenamientos del ADN genómico. Libro The Cell A. Molecular Approach .item número 8. La reproducción requiere la exacta transmisión de la información genética de padres a hijos. Cuando una célula se divide es imprescindible que la totalidad de su genoma sea duplicado exactamente. Las células han desarrollado mecanismos correctores de errores que a veces se producen durante la replicación del ADN. El no reparar el daño puede acarrear consecuencias desastrosas para el organismo, por ejemplo, el desarrollo del cáncer. La replicación del ADN lejos de ser un proceso estático, en orden de la evolución de las especies, es imprescindible el reordenamiento del genoma a través de mutaciones necesarias para mantener la variación genética entre los individuos. La recombinación de los cromosomas durante la meiosis desempeña un papel importante en este proceso al permitir que los genes de sus padres se reordenen en nuevas combinaciones en la próxima generación. También se cree que estos reordenamientos de las secuencias de ADN contribuyen a la creación evolutiva de combinaciones nuevas de la información genética. Algunos reordenamientos del ADN están programados para regular la expresión de los genes durante la diferenciación y el desarrollo de las distintas células y organismos. Un ejemplo en humanos es la reordenación de los genes durante el desarrollo de anticuerpos del sistema inmunológico. Un cuidadoso equilibrio entre el mantenimiento y la variación de la información genética es, pues, fundamental para el desarrollo de los distintos organismos, así como a la evolución de las especies.


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BIBLIOGRAFÍA

A.- El alumno ha recibido dos artículos científicos. Realizar un comentario sobre los temas tratados en cada uno de ellos de entre 500 y 800 palabras. Un resumen del artículo NO es un comentario. El objetivo de esta práctica es que el alumno lea y comprenda el artículo, sacando conclusiones propias sobre la información que aportan los artículos. Estás conclusiones pueden ser en relación a la metodología (¿son los métodos aplicados correctos?, ¿hay algún fallo en el diseño experimental?, ¿existen errores en la obtención de resultados?, ...), los resultados obtenidos (¿son claros?, ¿existen dudas en cuanto a su fiabilidad?, ...) o las conclusiones de los autores (¿son adecuadas con los datos obtenidos?, ¿se exceden en sus conclusiones a partir de los datos que tienen?, ¿son excesivamente prudentes?, ¿se pueden extraer otras conclusiones?, ...).

1. Evaluación y optimización de la extracción de ADN y de depuración de los procedimientos de muestras de suelos y

sedimentos. En este artículo se compara y evalúa estadísticamente la efectividad de nueve procedimientos de extracción de ADN mediante el uso de muestras congeladas y secas de dos suelos, limo greda y un humedal de limo greda con diferentes contenidos de materia orgánica. En este caso se utilizan cuatro extractantes químicos a saber: dodecil sulfato de sodio(SDS), Cloroformo, fenol, chelex 100 y guanadinium isotiocianato. También se utilizaron métodos de perturbación física, la homogeneización mediante molino de grano, la congelación-deshielo de lisis, junto a la lisozima digestión fueron evaluados basándose en el rendimiento molecular y en el tamaño del ADN recuperado. Se encontró que el mejor método era la homogeneización de abalorios en un molino de lisis mezcla que contiene cloroformo, SDS, NaCl, y tris-buffer fosfato(pH 8) cuando el rendimiento y la eficiencia de lisis celular se utilizaron como criterios. También resultaron óptimos para la velocidad y la duración. Se comprobó que la recuperación de ADN de mayor peso molecular se produce con la utilización de una menor velocidad, y un periodo de tiempo entre 30 y 120 segundos. Se evaluaron cuatro métodos diferentes para la purificación del ADN a saber: Sílice vinculante, electroforesis en gel de agarosa, acetato de amonio precipitado y el Sephadex G-200 de filtración en gel. Sephadex G-200 spin columna resultó ser el mejor método para eliminar las sustancias que inhiben la PCR-DNA y reducir la mínimo las pérdidas durante la purificación. Como conclusión se comprueba que para la recuperación óptima de ADN para este tipo de muestras requiere una baja velocidad de la homogeneización mediante molino de grano, una presencia de un fosfato de búffer SDS-mezcla de cloroformo , seguido de sephadex G-200 como columna de purificación. La extracción de ADN en general, consta de bastantes métodos diferentes dependiendo del tipo de material orgánico que tengamos que evaluar y extraer. La extracción mediante compuestos químicos de diferente índole y composición y su mezcla en diferentes lisis son los artífices de la mayor o menor optimización en cuanto al rendimiento y la eficacia. Esto en cuanto a la homogeneizacíon. En cuanto a la purificación para una recuperación óptima existen varios productos que se utilizan en esta labor, en nuestro artículo llegan a la conclusión que es el Sephadex G-200 de filtración de gel el mas apropiado para este tipo de muestras de suelos y sedimentos. 2. El quimérico eukaryote: origen del núcleo de la karyomastigont en amitochondriate protists. En este artículo se presenta un modelo , teóricamente comprobable, para la determinación del origen del núcleo, orgánulo delimitado por una membrana que define a la células eucariotas. Supone que una célula quimérica evoluciona a partir de la simbiogénesis entre un archaebacterium y un eurobacterium. La quimera surgió como respuesta a la amenaza y a la escasez de oxigeno de los compuestos de carbono y aceptores de electrones. Los descendientes de esta quimera es lo que hoy se conoce como un amitochondriate protists. El archaebacterium, un thermoacidophil semejante a la Thermoplasma ya existente, genera sulfuro de hidrógeno y tiende a proteger a la eurobacterium, un nadador heterótrofo comparable a Spirochaeta , que oxida el sulfuro de azufre. Se genera el eurobacterial-archaebacterial, la quimera, un amitochondriate heterótrofo evolucionado. En esta primera ramificación se genera el núcleo como un componente de la karyomastigont, un complejo intercelular que asegura la continuidad genérica de la exsimbiosis. Consta de un solo núcleo , una sola proteína kinetosome y un conector. Este modelo de syntrophic quimérico de fusión puede ser demostrado por la comparación de secuencias de dominios funcionales de las proteínas aisladas. En este tipo de modelos evolutivos de la vida , como en la teoría de la evolución clásica, unas especies evolucionan por su adaptación al medio en el que se desenvuelven y se transforman mediante mutaciones que realizan esa función de máxima adaptación al medio. Esta teoría, como cualquier otra de este tipo, tendrá seguidores , los que mas, y tendrá detractores, supongo que pocos, dada la cantidad de información favorable a este modelo evolutivo. Sobre todo lo referente a las secuencias de ADN de las proteínas aisladas, que son prácticamente iguales. Puede que nunca pueda ser demostrable al cien por cien, pero seguramente nos ayudará mas a comprender la materia, la materia orgánica, los organismos primitivos y los organismos mas evolucionados.

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