63. ヒトがんウイルスＥＢＶ増殖機構の解析とＥＢＶを利用したがん抗原特異的ＣＴＬ増幅法の開発

鶴見　達也

Key words：EB ウイルス，複製蛋白質，三次元構造，　組換えウイルス，CTL

愛知県がんセンター研究所 腫瘍ウイルス学部

緒　言

　Epstein-Barr virus (EBV) はヒトヘルペスウイルスに属するヒト癌ウイルスである．本研究ではEBVの増殖機構の解明とEBV を利用した CTL (cytotoxic T lymphocyte) 増幅法の開発を目的とした．EBV増殖機構については，がん抑制遺伝子産物である p53 が EBV 増殖に関与すること 1,2)，EBV がコードする BZLF1 蛋白質のスモ化が再活性化を抑制すること 3)，BMRF1 蛋白質の構造と機能の関係 4)を明らかにした．本報告ではその中で特に BMRF1 蛋白質の構造と機能について報告する．EBV産生感染において７種のウイルス複製蛋白質が発現しウイルスゲノムは数百倍に増幅複製され，ウイルス粒子が産生される．EBV DNA ポリメラーゼ付随蛋白質 BMRF1 はウイルス DNA ポリメラーゼ (BALF5) のポリメラーゼの Processivityを上げる機能を持つが，BMRF1 は BALF5 とヘテロダイマーを形成して働く．BMRF1 は大量に産生され，核に局在する．他の機能としてBMRF1 は dsDNA結合能をもち，ウイルス転写因子BZLF1 のコファクターとして転写促進に関与する．また複製されたウイルス DNA に結合してヌクレアーゼの攻撃やヒストンのアッセンブリーからウイルス DNA を保護していると考えられている（図１）．我々は結晶解析から BMRF1 の三次元構造を明らかにし，その構造から推定される機能との相関関係，ウイルス増殖に及ぼす影響を検討した．　次に EBV を利用したがん抗原特異的 CTL 増幅法の開発では，WT1 (ウィルムス腫瘍原因遺伝子) を組み込んだ組換えEBV を作成し，ヒト B リンパ球に感染させ WT1 を発現させ，B リンパ球上に抗原提示させることにより，WT1 特異的CTL を誘導するシステムの構築を試みた．

方　法

１．BMRF1 蛋白質の結晶化と構造解析　セレノメチオニン標識 BMRF １(1-314 a.a.）を無細胞発現系で発現させ精製し，1.25M Li2SO4, 0.5M (NH4)2SO4, 8%PEG400, 275 mM 2,6-dimethyl-4-heptyl-β-D-maltopyranoside, 0.1M HEPES buffer (pH 8.0) 存在化でhanging drop vapor diffusion 法で結晶化した．X-ray diffraction data は beamline BL44B2 of SPring-8(Harima, Japan) で解析した．BMRF1 の３次元構造は the multiple anomalous dispersion method (MAD) (2.9 Åresolution) で決定した．(理化学研究所横山茂之博士，東北大学村山和隆博士との共同研究）　２．変異BMRF1 の精製と生化学的解析　構造から推定される機能に重要な影響を与えると考えられる部位に変異を導入した変異BMRF１蛋白質は無細胞系で発現させ精製し，DNA 結合活性は filter binding assay で，polymerase processivity は primed M13 ssDNA を鋳型として解析した．　３．各種変異ウイルスの作成　それぞれの点変異 BMRF1 を含む EBV BAC ベクター (Hygr) を作製し，Lipofectamin2000 (Invitrogen) を用いてHEK293 細胞に導入し，hygromycin 耐性細胞を選別した．Electroporation によって BZLF 発現プラスミドを導入して，ウ

　上原記念生命科学財団研究報告集, 25 (2011)

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イルス産生感染を誘導した．ウイルスDNA合成量はリアルタイム PCRで解析した．ウイルス産生量はAkata(-) 細胞への感染効率によって検討した．Replication Compartment (RC) の形成は，それぞれのウイルス産生感染細胞を0.5%TritonX-100 と150 mM NaCl を含む溶解液で処理した後，BMRF1 抗体で免疫染色し，共焦点顕微鏡 (Zeiss) で観察した．　４．組換え EBV を用いたWT1 発現 LCL の樹立　 EBV BACベクターにWT1 遺伝子を組み込んだウイルス DNA を作成し 293 細胞に導入し変異ウイルス潜伏感染細胞を樹立した．ウイルス産生感染を誘導し，WT1 遺伝子組込み EBV を採取し，末梢血リンパ球（PBMC）に感染させ,　 B リンパ芽球（LCL）を樹立した．　５．WT1 特異的 CTL の誘導　 PBMC と WT1 発現 LCL と２週間共培養し，HLA A2402 特異的 WT1 テトラマーを用いてテトラマーと反応する CD8 陽性 T細胞を FACS 解析した．

結　果

　

　図 1． EBV replication compartments および複製フォークにおける BMRF1.

EBV ゲノムの複製は核の局在した部位（Replication compartments) でおき，BMRF1 はウイルス複製フォークでEBV DNA ポリメラーゼの付随因子として働き，ポリメラーゼの processivity を上げるが，ゲノム合成後にはウイルスゲノムと結合し，ゲノムを保護していると考えられる．

　

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１．EBV BMRF1 蛋白質の構造　結晶構造解析から，BMRF1 単量体は他のポリメラーゼ Processivity Factor である HSV UL42, HCMV UL44, や PCNAの単量体と似た三次元構造を採り，水溶液中では主に C-shaped head-to-head の 2 量体構造をとると考えられ，一部はさらにその dimer が tail-to-tail で結合した 4 量体リング構造を形成し，リングの内部は正の電荷を帯びていることがわかった（図２）．　

　図 2． BMRF1 蛋白質(1-314)の３次元構造.

４量体でリング構造をとる．　２．BMRF1 変異蛋白質の機能解析　 BMRF1 リングの内部に位置する 5 つの正電荷をもつアミノ酸 (アルギニン，リジン) を，負電荷をもつアミノ酸 (グルタミン酸) にそれぞれ変換した変異蛋白質 5 種 (K29E, K99E, R256E, R87E, K19E) を作成し，精製した．これらの変異蛋白質はwild type と同様 2量体あるいは 4 量体構造をとるが，K29E, K99E, R256E, K19Eでは各々１アミノ酸の置換だけでdsDNA 結合能を著しく低下させた．しかし，EBVDNA ポリメラーゼの processivity を上げる能力は K29E, R87E, R256Eで著しい低下がみられたが，K99E, K19EではDNA結合能は消失したにもかかわらず，processivity 能は保持された．転写促進能は R256E でのみ低下がみられた．head-to-head 結合を阻害した C95E 蛋白質は in vitro では単量体として存在し，DNA結合能はかなり減弱するが，Polymerase Processivity 能は保たれること，一方 tail-to-tail 結合を阻害する C206E蛋白質は機能的に野生株と同じ機能を有していた．　３．BMRF1 変異組換えウイルスを用いた解析　我々はさらに head-to-head 結合を阻害した変異 C95E 及び tail-to-tail 結合を阻害した変異 C206E を持つ変異ウイルスを作成し，これら変異株のウイルスゲノム複製とウイルス産生に及ぼす影響について解析した．in vitro 解析の結果とは異なり，C95E は増殖能，ゲノム合成において野生株とほぼ同じであった．一方，C206E では，ウイルスゲノム複製とウイルス産生に著しい減少をみせた．この実験結果から BMRF1 がリングを形成することがウイルス増殖に重要な意味を持つこと，構造から見ると head to head の接触面は広く，一方 tail to tail の接触面は非常に狭いことから，C95E の変異は in vivo では headto head の接触にそれほどの影響はなく，一方 C206E の変異は tail to tail の接触に大きく影響し，リング形成を阻害したと考えられる．以上，BMRF1 蛋白質のリング形成がウイルスゲノム合成に重要であることがわかった（図３）．

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　図 3． 変異 BMRF1 の機能解析と変異ウイルスのゲノム合成とウイルス産生.

tail-to-tail 結合を阻害した変異C206E BMRF1 蛋白質は in vitro の生化学解析では野生株と全く機能に変化がなかったが，C206E 変異ウイルスはウイルスゲノム複製とウイルス産生に著しい減少をみせた．

　４．組換え EBV を用いたWT1 発現 LCL の樹立　 EBV BAC ベクターに WT1 遺伝子を組込んだウイルス DNA を大腸菌内で作成し，その組換え DNA を HEK293 細胞に導入し，変異ウイルス潜伏感染細胞を樹立した．ウイルス産生感染を誘導し，WT1 遺伝子組込み EBV を産生させ，その組換えウイルスを末梢血リンパ球（PBMC）に感染させ WT1 発現 B リンパ芽球（LCL）を樹立した．WT1 を発現していることは蛍光免疫染色及びウエスタンブロットで確認した（図４）．

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　図 4． 組換え EB ウイルスを用いたWT1 発現 LCL の樹立:免疫染色とウエスタンブロット.

（左図）赤：WT1 蛋白質に対する蛍光免疫染色：WT1 の発現量は細胞間でヘテロである．これはエピゾーマルな EBウイルスゲノム上に組み込んだWT1 遺伝子から発現させているためである．（右図）WT1 のウエスタンブロット.

　５．WT1 特異的 CTL (cytotoxic T lymphocyte) の誘導　 PBMC と WT1 発現 LCL と２週間共培養し，HLA (human leukocyte antigen) A2402 特異的 WT1 テトラマーを用いてテトラマーと反応する CD8 陽性 T細胞を FACS 解析を行い，CD8陽性 T細胞の誘導が確認された（図５）．　

　図 5． WT1 CTL の誘導：テトラマー法による解析.

HLA A2402 特異的 CTL の量を FACS で解析し，0.13% CD8 陽性 T細胞の誘導が確認された．他のエピトープに対する CTL も誘導できた可能性がある．

　

考　察

　 EBV BMRF1 蛋白質の構造解析によりその３次元構造が決定され，変異蛋白質及び変異ウイルスを用いた機能解析からBMRF1 はリング構造をとることがウイルスゲノム合成において重要であることがわかった．in vitro の実験では BMRF1 は単量体でもウイルス DNA ポリメラーゼの processivity を上げる機能を持つことから，なぜリング構造をとることが重要であるのかの答

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えは出ていない．ウイルスゲノム合成後に BMRF1 によって保護されることが更なるウイルスゲノム合成，プロセッシングに必要なのかもしれない．　組換えEBV を利用した WT1 癌抗原を患者の LCL に発現させ，抗原提示されることを確認し，WT1 特異的なCTL を誘導させることに成功した．WT1 蛋白質は，白血病や多くの固形腫瘍において広く高発現しているがん抗原であり，このシステムによりポリクローナルな CTL誘導が可能となり，免疫治療の標的抗原として有望と考えられる．

共同研究者

本研究の共同研究者は　理化学研究所横山茂之博士および東北大学村山和隆博士である．本研究をご支援いただきました上原記念生命科学財団に深く感謝申し上げます．

文　献

1） Sato, Y. & Tsurumi, T. : Noise cancellation: Viral fine tuning of the cellular environment for itsown genome replication. PLoS Pathog. 6：e1001158, 2010.

2） Sato, Y., Shirata, N., Murata, T., Nakasu, S., Kudoh, A., Iwahori, S., Nakayama, S., Chiba, S., Isomura,H., Kanda, T. & Tsurumi, T.：Transient increases in p53-responsible gene expression at early stagesof Epstein-Barr virus productive replication. Cell Cycle, 9：807-814,　 2010.

3） Murata, T., Hotta, N., Toyama, S., Nakayama, S., Chiba, S., Isomura, H., Ohshima, T., Kanda, T. &Tsurumi, T.：Transcriptional repression by sumoylation of Epstein-Barr virus BZLF1 proteincorrelates with association of histone deacetylase. J. Biol. Chem., 285：23925-23935, 2010.

4） Nakayama, S., Murata, T., Yasui, Y., Murayama, K., Isomura, H., Kanda, T. & Tsurumi, T.：Tetramericring formation of EBV polymerase processivity factor is crucial for viral replication. J. Virol., 84：12589-12598, 2010.

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