51:1559

<原 著>

Crossed immuno-affino-electrophoresisに よ る

α-フ ェ ト プ ロ テ イ ン の レ ク チ ン 親 和 性 の 分 析

宮崎 純 遠藤 康夫 織 田 敏 次*

要 旨:肝 硬変,肝 細胞 癌,消 化 管 癌 の さい産 生 され るそ れ ぞ れ の α-フ ェ トプ ロテ イ ン(AFP)

に質 的 差 異 が存 在 す るか否 か を検 討 す るた め,AFP糖 鎖 の レ クチ ン親 和 性 をcrossed immuno-

affino-electrophoresisを 用 い て分 析 した .コ ン カナバ リンA (con A)と の 親 和 性 で はAFPは

2つ の 亜分 画 に 区分 され た(con A非 結 合 お よび 結 合AFP) .肝 細 胞 癌 患 者AFPで はcon A

非 結合 分 画 は わず か に認 め られ た のみ で あ った が,消 化 管 癌 患 者AFPで は 約50%がcon A非 結

合 分 画 で あ った.こ の差 異 は 両疾 患 鑑 別 上 右 用 と考 え られ る.一 方,レ ソズ豆 レクチ ン(LcH)

との親 和 性 で はAFPは3つ の亜 分 画 に区 分 され た(LcH非 結 合,弱 結合 お よび 強 結合AFP) .

肝 硬 変 患 者AFPは 大部 分 がLcH非 結 合分 画 で あ った のに対 し,腫 瘍 産生AFPで はLcH非

結 合 分 画 が5%か ら100%ま で広 く分 布 し一 定 の傾 向 を み とめ な か った.こ の こ と は 肝 硬変 と肝

細 胞癌 の産 生す るAFPを あ る程 度 鑑別 し うる ことを示 す.

索 引 用 語:α-フ ェ トプ ロ テイ ン 糖 鎖 コ ンカナパ リンAレ ンズ豆 レクチ ン

肝 細 胞 癌

緒 言

肝細胞癌の免疫生化学的診 断法 と して現在 もっとも有

用な ものは 血 中 α-フェ トプ ロテイン(AFP)の 測定で

ある1).AFPは4%前 後 の糖を含む分 子量 約7万 の糖蛋

白であ り2),胎 生期に肝お よびyolk sacで 産生 され る3)

胎児血清中の主要蛋 白で あるが,正 常成人血清 中には殆

ん ど認 め られ ない.肝 細胞癌お よびyolk sac腫 瘍患者

の血清 中に著 明に増加す るため,そ れ ら疾患の診断に用

いられ る1,4).し か しなが らradioimmunoassay法 の よう

な高感度の測定法が用 い られ る ようにな ると,肝 炎,肝

硬変な どの良性肝疾患 で もしば しば陽性例が認 め られ る

ことが明 らか となった5).ま た肝細胞癌以外 の消化管癌

(特に肝転移例)で もAFPは 高値 となることがあ り6),

AFP測 定 に よる肝細胞癌 の診断の面 での 特異性は失わ

れ た.し か しなが らこれ ら疾患の さいに産生 され るそれ

ぞれ のAFPに 何 らか の質的差異が見出され るな らば,

このAFPの 分析は肝細胞癌の診 断,特 に早期診断にき

わ め て 有 用 で あ る と考 え られ る.

AFPのmicroheterogeneityに 関 して は,分 子量,荷

電,レ クチ ン親 和 性 の 差 な ど多 くの報 告 がみ られ る7).

これ らはAFPのestrogen結 合 能 や 免疫 抑 制 能 と関 連

して 注 目を 集 め て きた が,臨 床 応 用 上 は有 用 な も の とは

い え なか った.1978年Ruoslahtiら は 胎 児肝 お よびyolk

sac由 来 のAFP間 に 糖 鎖 の 差 異 を 見 出 し,AFPの

microheterogeneityの 分 析 を 臨床 応 用 す る 道 を ひ らい

た8).彼 等 は 糖 親 和 性 を 有 す る コン カ ナバ リンA (con

A)を 結 合 させ たcon A-セ フ ァ ロー ス ・ク ロマ トグ ラ

フィ ーに よるAFPの 溶 出パ タ ー ンの違 いか ら,AFPの

糖 鎖 のmicroheterogeneityを 示 した.そ れ 以 来,AFP

の糖 鎖 の分 析 お よび そ の レ クチ ン結 合 能 の 問 題 は,AFP

産 生 の基 礎 的 研 究 の 立場 お よび 臨 床 診 断 の 立場 か ら大

きな 注 目を集 め て き て い る8～10).臨 床 的 に は す でに 羊 水

中 のAFPのcon A親 和 性 の 分 析 か ら,neural tube

defectな どの先 天性 奇 形 が 出 生 前 に診 断 され る よ うに な

っ て きて い る9).し か しな が らAFPの レ クチ ン結 合 性

をAFP産 生 肝 疾 患 の診 断 に 応 用 す る 試み に 関 して は ま

だ 報 告 が な い.今 回 わ れ われ は肝 硬 変,肝 細 胞 癌,消 化

* 東京大学 医学部第1内 科

<受 付 日56年6月12日>

52:1560 肝 臓 22巻11号 (1981)

管 癌 患 者 血 清AFPをcon Aお よび レン ズ豆 レクチ ン

(LcH)の2つ の レ クチ ンと の親 和 性 の 点 か ら検 討 し,

そ の パ タ ー ンを 〓 帯血AFPお よびyolk sac腫 瘍患 者

血 清 中AFPと 比較 した.分 析 方 法 と して は,従 来 よ り

レ クチ ン結合 セ フ ァ ロー ス ・ク ロマ トグラ フ ィーが 多 く

用 い られ て い る が,今 回は,Bφg-Hansenら に よ り開 発

され たcrossed immuno-affino-electrophoresis11)を 用 い

た.

実 験 材 料 お よ び 方 法

試 料:分 析 に 用 い た 血 清 は 以下 に 示 す よ うな 患 者 に 由

来 した もの で,血 中AFP値 を()内 に 示 した.肝 細

胞 癌 患 者11例(AFP 5～400μg/ml),肝 硬 変 症 患 者7例

(50～250ng/ml),消 化 管 癌 患 者3例(胃 癌2例,膵 癌

1例,い ず れ も肝 転 移 例.6～10μg/ml), yolk sac腫 瘍

患 者2例(6, 24μg/ml)で あ り,他 に〓 帯血7例(AFP

20～80μg/ml)に つ い て も分 析 を試 み た.

試 薬:抗AFP抗 体 はDAKO社 製,コ ン カ ナバ リン

A (con A)お よび レン ズ 豆 レクチ ン(LcH)はPhar-

macia社 製,ア ガ ロー スはLitex社 製Type HSAを

そ れ ぞ れ 用 い た.

crossed immuno-affino-electrophoresis: 10×10

cmの ガ ラス 平 板 上 に 形 成 した一 定 量 の レク チ ンを含

む1%ア ガ ロ ース ゲル の 陰 極 側 か ら2cmに 試 料 孔 を つ

く り,5μlの 血 清 を 添 加 す る.一 次 元 目 の 電 気 泳動 を

15V/cmの 定 電 圧 で,ブ ロモ フ ェ ノル ・ブ ル ー ・アル ブ

ミソが5.5cm移 動 す る ま で 行 う(約1時 間),泳 動 の

終 了 した ゲル を分 離 し別 の ガ ラ ス板 上 に 移 し,残 りの ガ

ラス板 上 に試 料 中 のAFP濃 度 に 応 じた 抗AFP抗 体 を

含 む1%ア ガ ロ ース ゲル を 作 成す る.一 次 元 目の 電気 泳

動 と直 角 方 向 に,3V/cmの 定 電 圧 で一 晩,二 次 元 目の 電

気 泳 動 を 行 う.以 上 の操 作 に よ り,試 料 中 の糖 蛋 白 は一

次 元 目の 電 気 泳 動 に お い て,レ クチ ン結 合 能 の 程 度 に応

じて,レ クチ ンを 含 まな い場 合 に くらべ て 移 動 度 が 減少

す る の で,そ の 移動 度 の減 少 を,2次 元 電 気 泳 動 中に ゲ

ル 中 の 特 異 抗体 に よ り形 成 され る沈 降 線 に よ り検 出 同定

す る.沈 降線 はcoomassie brlliant blue R-250を 用 い て

染 色 した.本 法 の概 略 をFig. 1に 示 した.肝 硬 変 患 者

試 料 の場 合 は血 清 中AFP濃 度 が 低 く,沈 降線 が 検 出不

能 の た め,一 次 元 目の電 気 泳 動 後,ゲ ル を 細切 溶 出 した

の ち,各 ゲ ル溶 出液 中 のAFP濃 度 を測 定 す る こ とに よ

りパ タ ー ン を 求 め た.AFP濃 度 の 測 定 は カイ ノ ス社 製

enzyme-immuno-assayキ ッ トを 用 い た.対 照 と して は

一 次 元 ゲル 中 に レクチ ンを 含 ま な いcrossed immuno-

electrophoresisを 行 っ た.

成 績

1) crossed immuno-affino-electrophoresisの

基 礎 的 検 討

全 血 清 のcrossed immuno-electrophoresis像 お よ び 一

Fig. 1 Schematic demonstration of the method

for crossed immuno-affino-electrophoresis.

Fig. 2 Crossed immuno-electrophoretic (A) andcrossed immuno-affino-electrophoretic (B) pattern

of serum proteins. Arrow indicates "affino-preci-

pitate" produced by concanavalin A and glycopro-tems.

Crossed immuno-affino-electrophoresisに よ る α-フ ェ トブ ロ テ イ ン の レ ク チ ン 親 和 性 の 分 析 53:1561

Fig. 3 Crossed immuno-electrophoretic (A) and

crossed immuno-affino-electrophoretic (B) patternwith concanavalin A of alpha-fetoprotein. (case

of hepatocellular carcinoma)

次 元 ゲル 中 にcon Aを100μg/cmcm2含 む 条 件 で のcrossed

immuno-affino-electrophoresis像 をFig. 2に 示 した.

アル ブ ミンの 移 動 度 は 全 く変 化 して いな い が,い くつ

か の 糖蛋 白 は 大 き く移 動 度 が 減 少 して お り,特 にcon

Aと 親 和 性 の 強 い 糖 蛋 白 は,一 次 元 泳 動 中 に"affino-

precipitate"を 形 成 し(図 中矢 印),2次 元 ゲル 中 にあ

らわれ な い.

抗 全 血 清 抗 体 の 代 りに 抗AFP抗 体 を 用 いた場 合 の肝

細 胞 癌 患 者 血 清AFPの 泳 動 像 をFig. 3に 示 す.一 次

元 電 気 泳 動 の ゲル 中 にcon Aを 含 まな い条 件 で はAFP

は 単 一 の ピ ー クを 形 成 した.こ れ に 対 し,con Aを 含

む 条 件 下 で はAFPは2つ の ピー クを形 成 した.陽 極 側

の ピー クは レ クチ ンを 含 まな い場 合 と同 一 の 移動 度 であ

り,con Aと 親 和 性 を もた な いAFPで あ る と考 え られ

る.一 方,陰 極 側 の ピ ー クは一 次 元 ゲル 中 のcon Aと

の親 和 性 の た めに 移 動 度 が 減 少 した もの と考 え られ,

con A親 和 性AFPと 考 え られ る.こ の よ うに 同一 患

者 にお い て産 生 され るAFPもcon A親 和 性 の点 か ら

み る と単 一 で は な くmicroheterogeneityが 存 在 す る こ

Fig. 4 Crossed immuno-affino-electrophoretic pat-

tern of alpha-fetoprotein with concanavalin A.

A: Serum from a patient with hepatocellular

carcinoma

B: Alpha-fetoprotein purified from ascites fluid

of the same patient

とが 明 らか であ る.本 法 は 全 血 清 を 用 い て 分 析 してお

り,血 清 中に 多 量 に 存 在 す るAFP以 外 の 他 の糖 蛋 白

が,こ こで得 られ た 結果 に 何 らか の影 響 を あ た えて い る

可能 性 は 否 定 で きな い12).ま た"affino-precipitate"中

にAFPが 存 在 して い る可 能 性 もあ る12).そ の点 を 検 討

す る た め以 下 の 実験 を行 った.

a) 精製AFPに つ いて のimmuno-affino-electrophoresis

肝 細 胞癌 患 者 腹 水 か ら 精 製 したAFPと,そ の 患 者

の血 清 お よび 腹 水 中 のAFPはcrossed immuno-affino-

electrophoresis上 同一 の パ ター ンであ った(Fig. 4).し

たが って 相 の実 験 で 得 られ たimmuno-affino-electro-

phoresis上 の パ タ ー ンはAFP以 外 の他 の 糖蛋 白 の 影 響

は うけ て い な い と考 え られ,AFP自 体 のcon A親 和性

そ の もの を反 映 して い る と考 え られ た.

b) 125 I-AFPに つ い て のaffino-electrophoresis

125 I -AFPをcon Aを 含 む ゲル 中で 泳 動 した あ と,ゲ

ルを 細 切 し,各 ゲル 中 の 放 射 活 性 を測 定 した(Fig. 5).

こ こで 得 られ た 結 果 は全 血 清 中AFPお よび 精 製AFP

を 用 い て 得 られ た結 果 と 同 一 で あ っ た.ま た 原 点 近 く

に放 射 活 性 が 認 め られ なか った 点 を 考 え る と,"affino-

precipitate"中 にAFPは 存 在 しな い もの と考 え られ た.

c) con A濃 度 の 差 に よるimmuno-affino-electropho-

resisパ タ ー ンの変 化

一 次 元 ゲル 中 のcon A濃 度 を100, 75, 50μg/cmcm2と

減 少 させ た 時 の パ タ ー ンの 変 化 をFig. 6に 示 した.い

54:1562 肝 臓 22巻11号 (1981)

Fig.5 Affino-electrophoretic pattern of 125 I-alpha-

fetoprotein purified from the ascites fluid of a

patients with hepatocellular carcinoma.

Fig.6 Crossed immuno-affino-electrophoretic pat-

tern of alpha-fetoprotein on different concana-

valin A concentration (case of hepatocellular car-

cinoma)

A: 100μg concanavalin A/cmcm2

B: 75μg concanavalin A/cmcm2

C: 50μg concanavalin A/cmcm2

ずれ の場合 に も2つ の ピークが形成 され,そ の ピークの

大 きさには 変化がみとめ られ なか ったが,con A濃 度

が減少す るにつれ,陰 極側 の ピークは しだいに陽極側の

ピー クに近 づ く傾 向を示 した.50μg/cmcm2の 濃度で は,

明瞭に分 離 した2つ の ピー クとして は分別 されない.

以上 の結果 より,本 法に よ り得 られ た結果 は他 の糖蛋

白の影響 を うけず,AFP自 体 の 性質 を反映 してお り,

かつ100μg/cmcm2のcon A濃 度を用 いた 場合各 ピーク

が明瞭 に区分 しうる.そ して得 られた ピークの面積か ら

各亜分 画の比率を算定 し うると考 えられ る.以 上の点を

考 慮 し,以 下 の 実験はすべて100μg/cmcm2のcon A濃

度 を用 いて行 った.

2) AFPのcon Aへ の親 和 性 の 検 討

〓 帯血 お よび 肝 細 胞癌,消 化 管 癌,yolk sac腫 瘍患

者 血 清 中AFPのcrossed immuno-affino-electrophoresis

豫 をFig. 7に 示 した.肝 細 胞 癌患 者 血 清 中AFPで

は 全例 に ご くわ ず か のcon A非 結 合 分 画 を み とめ た

Fig. 7 Crossed immuno-affino-electrophoretic pat-

ern of alpha-fetoprotein with concanavalin A.

A: case of hepatocellular carcinomaB: case of metastatic liver cancer (gastric can-

cer)C: cord serumD: case of yolk sac tumor

が,大 部 分 のAFPはcon A結 合 性 で あ った.こ れ に

対 し,消 化管 癌 患老 血 清 中AFPは これ とは 全 く異 な り

全AFPの 約50%がcon A非 結合 分 画に よ って しめ ら

れ て い た.す な わ ち肝 細 胞 癌 に よ り産 生 され るAFPと

消 化 管 癌 に よ り産 生 され るAFPで は 著 し くglycosyla-

tionが 異 な る 可 能 性 が 推 定 され た.胎 児 肝 に よ り産生

され るAFPを 反 映 す る と考 え られ る〓 帯血AFPで は

全AFPがcon A結 合AFPに よ り占め られ て い た.

ま たyolk sac腫 瘍 患 者血 清AFPは 消化 管 癌AFPと

同様 約50%のAFPがcon A非 結 合AFPで あ った.

肝 硬 変 症 に お い て は,血 中AFP濃 度 が 低 いた め,

crossed immuno-affino-electrophoresis上 は 明 瞭な 像 と し

て現 わ す こ とが 困難 で あ る.し た が って 一 次 元 目の電 気

泳 動 後,ゲ ル を 細 切 溶 出 した の ち,各 ゲル 溶 出液 中 の

Crossed immuno-affino-electrophoresisに よ る α-フ ェ トブ ロ テ イ ン の レ ク チ ン 親 和 性 の 分 析 55:1563

Fig. 8 Affino-electrophoretic pattern of alpha-

fetoprotein with and without concanavalin A.

(case of liver cirrhosis)

Fig. 9 Concanavalin A-nonbound alpha-fetoprotein

/total alpha-fetoprotein ratio.

AFP濃 度をEIA法 で 測定することに よ りハター ンを

もとめた.Fig. 8に 示 す ごとく,そ のパターンはほぼ

肝細胞癌の場合 と同様 であった.

以上con Aと の 結合性 か らみた 場合,con A非 結

合AFPは,〓 帯血AFPで は全 く認め られず,肝 細胞

癌お よび肝硬変症AFPで はわずかに認め られ るのに対

し,消 化管癌お よびyolk sac腫 瘍患者血清中AFPで

は全AFPの 約50%が 非結合AFPか ら構成 されて いる

ことが明 らか となった.各 ピー ク面積 か ら 計算 した全

AFPに 対す るcon A非 結合AFPの 割合をFig. 9に

示 した.

3) AFPの レンズ豆 レクチ ンヘの親和性の検討

Con Aと 同 じくグル コースお よび マンノースに 親和

性を もつ レクチ ンで ある レンズ豆 レクチ ン(LcH)に 対

す る各血清中AFPの 親和性を,con Aの 場合 と同様,

一次元電気泳動 ゲル中に100μg/cmcm2の 割合にLcHを

含む条件で,crossed immuno-affino-electrophoresisに よ

り検討 した.こ の方法に よりAFPは3つ の亜分画に 区

分され た.一 つはLcHと 親和性を もたないLcH非 結

合分 画であ り,他 の2つ はLcHと 親和性 をもつ が,親

和性の程度が異なるため,異 な った移動度の減 少を示す

分画 と考え られ る(LcH弱 結合 および強結合分画).弱

結合AFPが 全AFPの なかで しめる割合は,い ずれ の

試料 において も極 くわずかであ り,し たが って 非結合

AFPと 強結合AFPの 比率か らLcHと の親和性 を 類

推す ることが可能である.con Aの 場合 と同様に,精 製

AFPに ついてLcHと の親和性パ ターンを検 討す ると,

精製AFPの パターン は 全血 清中 のAFPと 同一のパ

ターンであ り,得 られた結果は他の糖蛋 白の存在 に より

修飾を うけた ものではな く,AFP自 体の性質 を 反映 し

ていると考え られ た.

肝細胞癌患者血清 中AFPと 〓 帯血AFPのLcHへ

Fig. 10 Crossed immuno-affino-electrophoretic

pattern of alpha-fetoprotein with lentil lectin.

A: cord sera

B: serum from patients with hepatocellular car-

Cinoma

56:1564 肝 臓 22巻11号 (1981)

Fig. 11 Affino-electrophoretic pattern with lentillectin of alpha-fetoprotein. (case of liver cirrhosis)

Fig. 12 Lentil lectin-nonbound alpha-fetoprotein/

total alpha-fetoprotein ratio. Abbrevations usedare same as Fig. 9.

Table 1. Lectin affinity of alpha-fetoprotein.

lectin-nonbound AFP/total AFP ratio (%)

の親和性 パターンをFig. 10に 示 した.こ こで 明らかな

ように肝細胞癌AFPで は,そ の親和性 パター ンには一

定 の 傾 向 がみ とめ られなか った.こ れに 対 し,〓 帯血

AFPで はLcH親 和性パ ターンがほぼ一定 してお り,

AFPの 大部分 がLcH非 結合分 画であった.消 化管癌

AFPとyolk sac腫 瘍患者血清中AFPも 肝細胞癌の

場 合 と同様一定 の傾 向をみ とめなか ったが,傾 向 として

は結合分 画が多い.肝 硬変症患者のAFPで はその血 中

濃度が低いため,con Aの 場 合 と 同様,一 次元泳動後

ゲル中のAFP濃 度を測定するこ とに よりパターンを求

めた.Fig. 11に示す よ うに肝 硬変症患者血清 中AFPの

親和性パター ンはほぼ〓帯血中AFPの 場合 と同様であ

り,大 部分 のAFPがLcH非 結合分画で あった.こ の

よ うにLcHに 対す る親和性か ら見 た場合,〓 帯血お よ

び肝硬変症AFPは 比較的安定 した親和性を示 し,大 部

分がLcH非 結合AFPで あった のに対 し,肝 細胞癌患

老血清中AFPで は一定の親和性傾 向がみ とめ られず,

非結合AFPは 全AFPの10%か ら100%ま での広い分

布を示 した.各 疾患におけ る全AFPに 対す るLcH非

結合分画の比率をFig. 12に 示 した.ま たcon Aお よ

びLcHを 用いて得 られた結果をTable 1にまとめた.

考 察

AFP研 究の初期 の 段階においては,AFPのcon A

親和性は,精 製の観点か ら注 目された13).体 液中に大量

にこ含 まれAFPと 類似の構造 をもつ アル ブ ミンを通常 の

精製法でAFPか ら完全に除去す ることは難 しいため,

アル ブ ミンがcon Aと 親和性を もたない点を利用す る

ものであ る.試 料をcon Aセ フ ァロース ・クロマ トグ

ラフィーにかけ,非 吸着部分 にアル ブ ミンを,吸 着部分

にAFPを 回収す ることに よりアル ブ ミンを除去 しよう

とい うものである.こ の ことか ら明らかな よ うに,当 初

AFPは ほぼ完全にcon A親 和性 であ ると考 え られて

いた13,14)が,その後 の 研究に より非親和性部分 の 存在

す ることが明 らか とな ってきている7).1978年Ruoslahti

らはcon Aセ ファ ロース ・クロマ トグラフィーの溶 出

パターンの違 いか ら,胎 児肝 に より産生 されるAFPと

yolk sacに よ り産生 され るAFPを 分別 し うる ことを

示 した8).す なわち,胎 児肝 由来AFPは 大部分 がcon

Aカ ラムに吸着され るのに対 し,yolk sac由 来AFPは

かな りの部分がcon Aカ ラムに吸着され ない.こ のこ

とは2つ のAFPが 抗原性の うえか らは区別 しえないも

のの,糖 鎖構造上はかな りの違いがある ことを示唆する

ものであ る.羊 水 についてAFPのcon A親 和性を分

析す ることに よ り奇形な どの先天異常を出生前に診断す

る試 みがすでに臨床 的 に 実用化され は じめてい る9).し

か しながらAFPの 糖鎖 の分析を肝疾患診 断に応用す る

試みについて は現在の ところ報告がない.今 回われわれ

はAFP増 加 のみ られる各種肝疾患において,2つ の レ

クチ ン(con AとLcH)へ のAFPの 親和性をcrossed

immuno-affino-electrophoresisを 用い分析 した.

Crossed immuno-affino-electropboresisに よ る α-フ ェ ト プ ロ テ イ ン の レ ク チ ン 親 和 性 の 分 析 57:1565

AFPのcon A親 和 性 に 関 し て は,肝 細胞癌産生

AFPと 消化管癌産生AFPの 間に大 きな 差 異がみ られ

た.こ の ことは,消 化管癌におけ るAFPの 産生機序を

考え る うえで も,AFP産 生消化管癌 と肝 細胞癌 の鑑別

の うえか らも,極 めて興味あ る知見 といえる.消 化 管癌

が時に高AFP血 症 を呈す る ことは以前か ら報告 されて

いる6)が,AFPが 種瘍 自体 に よ り産生され るか,肝 転

移に より影響を うけた周囲の肝組織(宿 主肝)に より産

生され るのかについては定 説がない.今 回われわれが得

た成績 は消化管癌患者血清中に認 め られ るAFPは 宿主

肝に より産生 され るのではな く,腫 瘍 自体に より産生さ

れ ている可能性 を 示唆 している.胎 児の腸管 が 徴量 の

AFPを 産生 していることは す でに 報告 がある3).最 近

Mackiewiczら は胎児臓器中のAFPの レクチ ン親 和性

をradio-crossed immuno-affino-electrophoresisを 用いて

分析 し,胎 児肝と胎児腸管の産生す るAFPがcon A親

和性においてい ち じるしく異 なることを示 した15).胎 児

肝由来AFPは 大部分がcon A親 和性であ るのに対 し,

胎児腸由来AFPで は逆に大部分がcon A非 結合性で

あ る.Mackiewiczら の成 績と今回のわれわれの成績 を

あわせて考え ると,消 化管癌患者血清中AFPは 腫瘍 自

体に より産生 された ものであ り,そ のAFPは 腫瘍の発

生母地であ る腸管の胎生期のAFPの 性質を反映 してい

る可能 性が 高い.

一方,臨 床的 にみ る と,消 化管癌 のAFP陽 性例は肝

転移例に多 く,そ のため しば しば肝細胞癌 との鑑別が問

題 とな る.そ の ような場合,AFPのcon A親 和性を検

討す ることは丙疾患鑑 別のための有力な手段 とな りうる

もの と考え られ る.

AFPに よる肝細胞癌 の 早期診断 にお いて,最 も重要

と考 え られ るのは,AFP増 加 を示 す 肝硬変症 と肝細 胞

癌 の鑑 別で ある.し か しなが らcon A親 和性の うえか

らは丙者には殆ん ど差異をみ とめず,con A親 和性の検

討を両 者の鑑別に用い ることは不可能 と考え られ た.こ

れに対 し,AFPのLcH親 和性 の 検討は丙者 の鑑別に

ある程度和用可能である と考 え られ た.肝 硬変AFPで

は分析 した全例でLcH非 親和性分画が優性であ ったの

に対 し,肝 細胞癌産生AFPで は一定の傾 向をみ とめな

か ったもののLcH親 和性分画が優 性の症例が多かった

ことか ら,肝 硬変 において 増 加 した血中AFPがLcH

親和性分画に富む症例は肝細胞癌 を合併 している可能性

が 高い.肝 細胞癌で も肝硬 変と同様 のバターンを とる も

の もある ことか ら,す べての症例を鑑別す ることは出来

ないが,少 くとも一部の症例 では鑑別 しうる可能性 を有

す る.

Con AとLcHは と もに マンノースお よび グルコース

に親 和性を もつ レクチ ンであ り,そ の糖親 和性は極めて

類似 して いると考 え られてい る.そ れ に もかかわ らず,

今回 の 検討 において,〓 帯血AFPに おいては2つ の

レクチ ンに対す る親和 性が全 く異な ってお り,肝 細胞癌

AFPに おいてはcon Aへ の親和性が一定 していたのに

対 し,LcHへ の親和性に一定の傾向をみとめなか った.

Con AとLcHは ほぼ等 しい糖親和性 を もつ とはい え,

con Aに くらべLcHの 方が糖親和性が低いとされてい

る.Con Aア ガ ロースとLcHア ガロース ・カラム ・ク

ロマ トグラフ ィーを用 いた 検討 では,con Aカ ラムに

完全 に 吸 着され るが,LcHカ ラムには全 く吸 着されな

い糖蛋 白と して トランスフ ェリン,ハ プ トグロビン,α1

アンチ トリブシンな どが知 られてい る16).AFPも これに

近い性質を有 している ものと 考 え られ る.Mackiewicz

ら15)も胎児臓器AFPのcon AとLcHに 対す る親 和

性において,わ れおれ と同様 の成績を得ている.

最近,Yoshimaら に よりヒ ト肝細胞癌由来AFPの 糖

鎖の全構造が示 され た17).そ れに よれ ばAFPは1分 子

あた り1本 の糖鎖を もち,そ れはつ ぎの構造 を もつとい

う.

()は 存在 しない こともあることを示 す.

一方,レ クチンと糖蛋 白糖鎖の反応は,レ クチ ンが糖

鎖末端 の単糖を認識す るといった単純 な ものではな く,

ンクチ ンは糖鎖内部の一連の構造を認識するとされ てい

る.

Debrayら18)に よれば,con Aが 最 もよ く親和性を示

す糖鎖構造は以下 の ような ものであ り,

この構遥にさ らに ガラ ク トースや シアル酸が付加 され

るにつれcon Aと の 親和性 は 低 くなるとい う.ま た

LcHが 最 もよく親和性を示すのは以下 の 構造 であ ると

い う.

Yoshimaの 示 した 糖構這 に したがえば,ヒ ト肝細胞

58:1566 肝 臓 22巻11号 (1981)

癌 由来AFPは すべて(ロ)式 の糖部分 を含むが,糖 鎖

末端がすべて シアル酸化 された場合のみ(ハ)式 の糖構

造を示す ことにな る.し たが って胎児肝 由来AFPは 末

端が シアル酸化 されてお らず,そ のためcon Aと の親

和性が極 めて強 く,か っLCHと の親和性が低 く,一 方

肝細胞癌 由来AFPで は末端の シアル酸化程度が症例毎

に異な るためLcHへ の親和性は症例毎に異 な り,ま た

con Aへ の親和性が少 し低 くな っている とす ると今回の

成績を もっとも説明 しやすい.し か しなが ら,今 回デ ー

タを示 さなか ったが,neuraminidaseを 用 いて 非還元末

端の シアル酸 を消化 した前後 においてAFPのLcH親

和性には変化 がみ られ なか った.し たが って,肝 細胞癌

由来AFPのLcH親 和性 の差異 が非還元末端の シアル

酸 の有 無のみに より左 右され てい るとは考え られ ず,上

記 の仮説 のみで今回 の成績を説明す ることは難 しいと考

え られ た.

AFPのcon A結 合,非 結合各分画 の 糖組成 の違 い

については ラ ットAFPに ついてのデータが知 られてい

る19).そ れに よれば,con Aに 結合性を もつと考 えられ

るマンノースお よびN-ア セチル グル コサ ミ ンの 和 と,

Con Aに 親和性を もたない ガラク トース,お よび シアル

酸の和の比率は,con A結 合性AFPの 方 がcon A非 結

合性AFPに くらべて3倍 高い.こ の点か らも,両 分画

のcon A親 和性の差が シアル酸 の有無のみに よる とは

考 えに くい.ヒ トAFPに おいて(イ)式 以外 のAFP

糖鎖 も存 在 している可能性 もあ り,ま た,レ クチ ンと糖

を含む物質 との親和性 は,物 質 の立体構造に も影響 され

る ことが知 られ ている20).こ れ らを考える と,レ クチン

親和 性か ら直接糖鎖 の一次構造を推定する ことは困難で

あ る.以 上の ように,AFPの レクチン親和性 の 基礎に

関 しては,い まだ 充分 な解釈 は えられ ていない.し か

し,各 疾患において増加す るAFP相 互の間に レクチ ン

親和性 の 差がみ られ たことか ら,AFPの レクチ ン親和

性 の分析 は,AFP増 加 のみ られ る 疾患の鑑別診断上は

極 めて有意 義と考 えられ る.

Crossed immuno-affino-electrophoresisはBφg-Hansen

らに より開発 された糖蛋 白と レクチ ンとの親和性を分析

す るため の方法であ る11).従 来AFPと レクチンとの親

和性は主 として レクチ ン結合 セ ファロースを用いて分 析

されて きた.し か しその さいに得られ る結果は,用 いる

カラムのサ イズ,用 いる レジ ンのメーカーの違 いな どに

よ り大 き く左右 され ることが知 られてお り,ま た流速に

よっても 大 き く影響 され る(宮 崎純:未 発表 データ).

こ の方 法 の 代 りにcrossed immuno-affino-electroPhoresis

を 用 い る 利 点 と して は,比 較 的 短時 間 で,少 量 の 試 料

で,radioimmunoassayの よ うな特 別 の 測 定 法 を 用 い る

こ とな く,再 現 性 の 良 い デ ー タが得 られ る こ とな どが 挙

げ られ る.両 方 法 を 比 較 す る と,con Aを レクチ ン と し

て 用 い た 場合,レ ク チ ン結 合 セ フ ァ ロー ス法 の 方 が 電気

泳 動 法 に よる場 合 よ り,非 結合 分 画 が つ ね に や や 多 く得

られ る 傾 向 をみ とめ る(宮 崎純:未 発 表 デ ー タ).そ の

原 因 は不 明で あ るが,レ クチ ン結 合 セ フ ァ ロー ス の場 合

と異 な り,crossed immuno-affino-electrophoresisで は レ

クチ ンが フ リーな 形 で ゲル 中に 存 在 して い る こ とが 関 係

して い る可 能 性 が 考 え られ る.一 方,crossed immuno-

affino-electroPhoresisを 用 いた 場 合 の 欠 点 と して は,原

則 と して 検 出 をLaurellら のRocket法 に よって い るた

め,検 出感 度 が 低 く,低 濃 度 試 料 の分 析 が 不 可 能 な 点 が

挙 げ られ る.こ の点 を 改 善 す る こと は肝 硬 変 症 の よ うに

AFP濃 度 の 低 い試 料 を 検討 す る ため に 不 可 欠 で あ る.

そ のた め,Peroxidaseラ ベ ルAFPな どを用 い る組 織 化

学 的 検 出 法や,オ ー トラジ オ グ ラ フ ィ ーに よる方 法 な ど

を 応用 す る こ とに よる 感 度 の鋭 敏 化 を 現 在検 討 中で あ

る.

謝 辞:AFP高 値 消化 管 癌 患 者 血 清 を 提 供 して い ただ

い た筑 波 大 学 臨床 医学 系 三 田 村圭 二 博士 に,ま た 〓 帯 血

お よびyolk sac腫 瘍 患 者 血 清 を提 供 し て いた だ い た 東

大 医 学 部 産 婦 人科 川 名 尚博 士 に 深謝 い た し ます.

本 論 文 の 要 旨 は第31回 電 気 泳動 学 会 総 会,第39回 日本

癌 学 会総 会 お よ び第17回 日本 肝 臓 学 会 総 会 にお い て 発表

した.

本 研 究 の 一部 は文 部 省 科学 研 究費 に よ った.

文 献

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Lectin affinities of alpha-fetoprotein in liver cirrhosis,

hepatocellular carcinoma and metastatic liver tumor

Jun MIYAZAKI, Yasuo ENDO and Toshitsugu ODA*

Sugar moiety of alpha-fetoprotein (AFP) synthesized by the tissues of cirrhotic liver,

hepatocellular carcinoma and metastatic liver tumor was analyzed using crossed immuno-affino-

electrophoresis with concanavalin A and lentil lectin. With concanavalin A, AFP was devided into

two subfractions (concanavalin A-reactive and-non-reactive fractions). AFP appeared in

hepatocellular carcinoma was composed mainly of concanavalin A-reactive fraction, whereas about

50% of AFP in metastatic liver tumor was non-reactive. With lentil lectin, AFP was devided into

three subfractions (lentil lectin-strongly-reactive, weakly-reactive and -non-reactive fractions). Much

of AFP in liver cirrhosis was non-reactive with lentil lectin, whereas affinity profiles of AFP with lentil

lectin in malignant tumors differed case by case. Lentil lectin-non-reactive fraction of AFP in

hepatocellular carcinoma ranged from 15 to 100%. These differences of AFP in the affinity analysis

with lectins may serve as one of the tools in differential diagnosis of liver diseases with increased

serum AFP.

* First Department of Medicine , Faculty of Medicine, University of Tokyo