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Cromatografia liquida

ad alta prestazione

La cromatografia liquida ad alta prestazione (high performance liquid chromatography,

HPLC) si sviluppò negli anni ‘60 al fine di analizzare molecole che non potevano essere

trattate dalla normale gas cromatografia.

L’HPLC è l’evoluzione strumentale ad alta efficienza della cromatografia liquida su colonna.

HPLC

Le principali caratteristiche dell’HPLC possono essere così riassunte:

diametro particelle impaccamento efficienza resistenza flusso percolazione

In conseguenza a ciò, è necessario aumentare la pressione per forzare il solvente attraverso

l’impaccamento costituito da particelle fini.

Effetto del diametro delle particelle

Diametro 10 µm Diametro 5 µm

Prestazioni in funzione del diametro delle particelle

Dimensioni delle

particelle dp (mm)

Tempo di

ritenzione (min)

Numero piatti

teorici (N)

Pressione

necessaria (bar)

5,0 30 25 000 19

3,0 18 42 000 87

1,5 9 83 000 700

1,0 6 125 000 2300

Schema di un cromatografo HPLC

Fase mobilePompe

Autocampionatore

Iniettore

Colonna

Detector

Computer

Cromatografo HPLC

Fase mobile

Pompe

Iniezione

Detector

Peso molecolare e metodica cromatografica

1° metodo di classificazione (basato sulle fasi mobile e stazionaria):

cromatografia normale o a fase diretta (fase stazionaria idrofila, fase mobile lipofila);

cromatografia a fase inversa (fase stazionaria lipofila, fase mobile idrofila).

Classificazione delle tecniche HPLC1

Interazione del naproxene con la superficie del gel di silice (sinistra) e del gel di silice ODS

(funzionalizzato con catene C18, destra).

2° metodo di classificazione (basato sul meccanismo di separazione):

cromatografia di adsorbimento liquido-solido;

cromatografia di ripartizione liquido-liquido;

cromatografia di esclusione;

cromatografia di scambio ionico;

cromatografia di affinità.

Classificazione delle tecniche HPLC2

Il supporto più comune per la fase stazionaria è costituito da particelle microporose

di silice di forma sferica:

La fase stazionaria1

Attenzione:

La silice non può essere usata per pH > 12 in quanto si scioglie. Infatti, per 8 < pH <

12 si usano matrici polimeriche come il polistirene.

gruppi silanolici liberi: mediamente acidi. A pH 2-3

sono completamente protonati; a pH > 3 si

dissociano a gruppi Si-O-;

gruppi silanolici geminiali: non acidi

gruppi silanolici vicinali: non acidi

La fase stazionaria2

Gruppi silanolici vicinali con legame d’idrogeno

Legami silossanici

Gruppi silanolici

geminali

Gruppi silanolici

isolati

Le particelle di gel di silice possono

costituire la fase stazionaria per la

cromatografia a fase normale di

adsorbimento oppure la base per le

fasi legate.

Funzionalizzazione della silice1

1) -Si-OH + R-OH -Si-O-R + H2O

2) -Si-OH + SOCl2 -Si-Cl + SO2 + HCl

-Si-Cl + R-NH2 -Si-NH-R + HCl

3) -Si-OH + Cl-Si(CH3)2-R -Si-O-Si(CH3)2-R + HCl

150-180° C

3-8 h

Ambiente

anidro

La silice esterificata (1) è suscettibile all’idrolisi e pertanto non si può usare per fasi

acquose o alcoli. Le fasi stazionarie più stabili sono quelle con formula Si-O-Si-R e

cioè con un legame silossanico (3).


4) -Si-OH + Cl – Si – Cl -Si-O – Si – Cl + HClAmbiente

anidro

R

|

|

R

R

|

|

R

-Si-O – Si – OH + HCl

R

|

|

R

H2O

-Si-O – Si – OH + Cl – Si – Cl -Si-O – Si – O – Si – O – H

R

|

|

R

R

|

|

R

R

|

|

R

R

|

|

R n

H2O

Dialchilsilil dicloruro


Gruppo Formula Gruppo Formula

Triacontil -(CH2)29CH3 Amino -NH2

Docosil -(CH2)21CH3 Nitro -NO2

Octadecil -(CH2)17CH3 Nitrile -CN

Octil -(CH2)7CH3 Ossipropionitrile -OCH2CH2CN

Exil -(CH2)5CH3 Diolo vicinale -CH(OH)CH2OH

Trimetil -Si(CH3)3 Fluoro alchile -(CF2)nCF3

Alchilcarbammato -COCONH-(CH2)n-CH3

Cicloesil -C6H11 Policaprolattame

(poliammide, nylon)-[NH(CH2)5C=O]n-

Fenil -C6H5

Difenil (-C6H5)2

Dimetilammino -N(CH3)2

La silice può essere funzionalizzata con

diversi gruppi adatti per cromatografia a

scambio ionico, ripartizione, ecc.

Fasi mobili acide (pH < 2) tendono ad idrolizzare i legami silossanici della fase

stazionaria:

R-Si-O-Si-R’ R-Si-OH + HO-Si-R’

Il problema si risolve inserendo sostituenti ingombranti come l’isobutile.

Fase stazionaria e pH

Idrolisi acida

Gruppi funzionali

ingombranti

La scelta della fase mobile dipende dalla fase stazionaria (fase mobile lipofila in

cromatografia normale e polare-mediamente polare in fase inversa). I requisiti

fondamentali che una fase mobile per HPLC deve avere sono:

La fase mobile1

bassa viscosità;

immiscibilità con la fase stazionaria;

capacità di solubilizzare il campione;

compatibilità con il rivelatore;

bassa corrosività;

bassa volatilità;

basso costo;

elevata purezza.

La forza (°) è il parametro

che definisce la forza di

eluizione del solvente

quando usato come fase

mobile sul gel di silice.

La viscosità deve essere

inferiore a 1.

La fase mobile2

SolventeForza

0

Viscosità

(mPa s)

Indice di

rifrattività

n20D

UV

cutoff

(nm)

Teb

(°C)

Dipolo

p

Acidità

a

Basicità

b

Fluoroalcano FC78 -0,19 0,4 1,267 210 50

n-Pentano 0,00 0,23 1,3575 195 36

n-Esano 0,00 0,33 1,3749 190 69

Isottano 0,01 0,50 1,3914 200 99

Cicloesano 0,03 1,00 1,4262 200 81

Ciclopentano 0,04 0,47 1,4064 200 49

Tetracloruro di carbonio 0,14 0,97 1,4652 265 77

p-Xilene 0,20 0,62 1,4958 290 138 0,81 0,00 0,19

Etere diisopropilico 0,22 0,37 1,3681 220 68 0,36 0,00 0,64

Toluene 0,22 0,59 1,4969 285 111 0,83 0,00 0,17

Clorobenzene 0,23 0,80 1,5248 290 132 0,91 0,00 0,09

Benzene 0,25 0,65 1,5011 280 80 0,86 0,00 0,14

Erere dietilico 0,29 0,24 1,3524 205 34,5 0,36 0,00 0,64

Diclorometano 0,30 0,44 1,4242 230 40 0,73 0,27 0,00

Cloroformio 0,31 0,57 1,4457 245 61 0,57 0,43 0,00

1,2-Dicloroetano 0,38 0,79 1,4448 230 83 1,00 0,00 0,00

La fase mobile3

SolventeForza

0

Viscosità

(mPa

s)

Indice di

rifrattività

n20D

UV

cutoff

(nm)

Teb

(°C)

Dipolo

p

Acidità

a

Basicità

b

Trietilammina 0,42 0,38 1,4010 230 89 0,16 0,00 0,84

Acetone 0,43 0,32 1,3587 330 56 0,56 0,06 0,38

Diossano 0,43 1,54 1,4224 220 101 0,60 0,00 0,40

Acetato di metile 0,46 0,37 1,3614 260 56 0,55 0,05 0,40

Tetraidrofurano 0,48 0,46 1,4072 220 66 0,51 0,00 0,49

t-butilmetil etere 0,48 0,35 1,3689 220 53 0,36 0,00 0,64

Acetato d’etile 0,48 0,45 1,3724 260 77 0,55 0,00 0,45

Dimetilsolfossido 0,48 2,24 1,4783 270 189 0,57 0,00 0,43

Nitrometano 0,49 0,67 1,3819 380 101 0,64 0,17 0,19

Acetonitrile 0,50 0,37 1,3441 190 82 0,60 0,15 0,25

Piridina 0,55 0,94 1,5102 305 115 0,58 0,00 0,42

Isopropanolo 0,60 2,3 1,3772 210 82 0,22 0,35 0,43

Etanolo 0,68 1,20 1,3614 210 78 0,25 0,39 0,36

Metanolo 0,73 0,60 1,3284 205 65 0,28 0,43 0,29

Acido acetico High 1,26 1,3719 260 118 0,31 0,54 0,15

Acqua Higher 1,00 1,3330 <190 100 0,39 0,43 0,18

Soluzioni saline, tamponi Highest

La fase mobile può essere costituita da un unico solvente o da una miscela di solventi e la

composizione può essere costante nel tempo (eluizione isocratica) o variabile (eluizione in

gradiente).

Fase mobile costituita da una miscela

Miscela di solventi

incompatibili

Eluizione con miscela di solventi1

Si supponga di aver effettuato

diverse analisi HPLC in condizioni

isocratiche con una fase mobile

composta da due solventi (A e B) in

differenti rapporti A/B: 10/90, 20/80,

30/70, 40/60, 50/50, 40/60, 30/70 e

35/65.

Eluizione con miscela di solventi2

Eluizione in gradiente

B = CH3CN - acetonitrile

Eluizione di composti neutri:

il tempo di eluizione di un composto neutro è determinato dal bilancio tra la sua polarità e la

sua lipofilia, mentre il pH della fase mobile non esercita alcun effetto. Nel caso della

cromatografia a fase inversa, quanto più il composto è lipofilo, tanto più è trattenuto dalla fase

stazionaria, mentre la situazione si inverte nel caso della cromatografia a fase diretta.

Fattori strumentali1

Eluizione di composti ionizzabili:

è necessaria una fase mobile tamponata per ottenere gli analiti nella forma completamente

indissociata (cromatografia di ripartizione) o dissociata (es. cromatografia scambio ionico). Nel

caso di analiti acidi, il pH deve essere almeno di due unità inferiori al pKa per avere l’analita in

forma completamente indissociata, mentre, nel caso di composti basici, il pH deve essere

maggiore di due unità rispetto alla pKa.

Fattori strumentali2

Scelta della modalità di separazione1

Massa molecolare < 2000

Solubile in solventi organici

Solubile in solventi

apolari o debolmente

polari

(da esano a CHCl3)

Solubile in solventi

moderatamente

polari

(da CHCl3 a CH3OH)

Cromatografia a

fase inversa legata

C18, C8, C4, C2, C1,

fenile, ciano

Solubile in

CHCl3

Cromatografia di

adsorbimento

Silice

Solubile in alcol,

acetonitrile o acetato

d’etile

Cromatografia in

fase inversa legata

Ciano, ammino,

diolo

Solubile in acqua

Composto non

ionico o coppia

ionica

Composto ionico

Cromatografia in

fase normale

Ciano, ammino

Cromatografia

ionica o a scambio

ionico

Scelta della modalità di separazione2

Massa molecolare > 2000

Solubile in solventi organici

Dimensione della

molecola < 30 nm

Dimensione della

molecola 30-400 nm

Cromatografia a

fase inversa legata

C18, C8, C4

Cromatografia per

esclusione

molecolare

Solubile in acqua

Composto non

ionico o coppia

ionica

Composto ionico

Cromatografia in

fase inversa legata

o per interazione

idrofobica

C18, C8, C4 o resina

polifenolica o

poliestere

Cromatografia

ionica o a scambio

ionico

Dimensione della

molecola < 30 nm

Dimensione della

molecola 30-400 nm

Cromatografia per

esclusione

molecolare

Valvola d’iniezione

Sistema di pompaggio (pompa alternativa)

La pompa è costituita da un pistone in zaffiro traslato avanti e indietro da un motore elettrico

connesso ad un manovellismo. Quando il pistone è traslato verso sinistra, la depressione fa

aprire la valvola a sfera inferiore consentendo l’aspirazione del solvente. Quando, invece, il

pistone è traslato verso destra, la sovrapressione fa chiudere la valvola inferiore ed aprire

quella superiore, spingendo il liquido in colonna. Lo smorzatore di impulsi compensa la

discontinuità del flusso e di pressione dovuto al movimento oscillante del pistone.

Sistema di smorzamento

Lo smorzatore di impulsi compensa la discontinuità del flusso e di pressione dovuto

al movimento oscillante del pistone. Può essere di diverso tipo:

Tempo

Pre

ssio

ne

Pulsazioni non smorzate

Pulsazioni smorzate

sistema spirale: ad ogni colpo del pistone la spirale aumenta il diametro

assorbendo l’energia della pulsazione;

smorzamento a membrana: una membrana separa la fase mobile da un liquido

parzialmente comprimibile.

Pompa alternativa a doppia testata

Nella pompa alternativa a doppia testata, i

due pistoni lavorano in opposizione,

ovverosia quando uno comprime, l’altro

aspira e viceversa. L’onda di pressione

risultante di una pompa è sfasata di 180

gradi rispetto all’altra. Come risultato, si

ha una pressione maggiormente costante.

Tempo

Pre

ssio

ne

Pompa A

Pompa B

Smorzato

Miscelazione dei solventi

Miscelazione ad alta pressione Miscelazione a bassa pressione

Tipologie di rivelatori

Rivelatore HPLCDisponibile in

commercio

LOD in massa

(tipico)

Intervallo

lineare (decadi)

Assorbanza Si 10 pg 3-4

Fluorescenza Si 10 fg 5

Elettrochimico Si 100 pg 4-5

Indice di rifrazione Si 1 ng 3

Conducibilità Si 100 pg-1 ng 5

Spettrometria di massa Si < l pg 5

FTIR Si 1µg 3

A dispersione di luce Si 1µg 5

Ad attività ottica No 1 ng 4

Selettivo per l'elemento No 1 ng 4-5

Fotoionizzazione No < 1 pg 4

Rivelatore UV

Analisi quantitativa

in HPLC

Metodo dello standard esterno.

Metodo dello standard interno.

Metodo delle aggiunte standard.

Normalizzazione.

Metodi di analisi quantitativa in HPLC

I metodi di analisi quantitativa in HPLC possono essere così riassunti:

preparare le soluzioni di riferimento contenenti lo standard di analita (a purezza

certificata) mediante il metodo della diluizione progressiva;

analizzare le soluzioni standard separatamente dal campione;

riportare le aree relative ai picchi delle soluzioni di riferimento in un grafico

rispetto alle relative concentrazioni;

calcolare la retta di calibrazione col metodo dei minimi quadrati;

analizzare il campione e, dal valore di area del picco (valore y) e dall’equazione

della retta di calibrazione, determinare la concentrazione (valore di x).

Metodo dello standard esterno

Per utilizzare il metodo dello standard esterno si deve:

In alternativa, se è nota una risposta lineare in un determinato intervallo di

concentrazioni, si può eseguire una calibrazione ad un solo punto con una sola

soluzione standard.

nella provetta A, mettere 1 ml di

soluzione di partenza e aggiungere 9 ml

di solvente (diluizione 1:10);

nella provetta B, mettere 1 ml di

soluzione A e aggiungere 9 ml di

solvente (diluizione 1:10 rispetto ad A e

1:100 rispetto alla soluzione di partenza);

nella provetta C, mettere 1 ml di

soluzione B e aggiungere 9 ml di

solvente (diluizione 1:10 rispetto ad B e

1:1000 rispetto alla soluzione di

partenza);

ecc.

Diluizioni progressive

La diluizione progressiva o seriale è un procedimento ripetuto per ottenere una

diluizione geometrica o progressiva della soluzione originale.

Dal punto di vista pratico, nel caso di una diluizione seriale decimale, si parte da

una soluzione a concentrazione nota:

Si allestisce la curva di calibrazione utilizzando lo standard certificato dell’analita

A alle seguenti concentrazioni: 100, 150, 200 e 250 ng/ml. L’analisi HPLC

fornisce le seguenti aree riferite ai picchi cromatografici:

Esempio dell’uso del metodo dello std. esterno1

Si supponga di voler determinare il contenuto dell’analita A presumendo che la sua

concentrazione sia compresa in un intervallo fra 100 e 250 ng/ml.

Conc. sol. std.

(ng/ml)Area picco

100 110952

150 159143

200 221645

250 270045


Si calcola equazione della curva di calibrazione:

y = 1079,6x + 1522,9

R2 = 0,9972

0

50000

100000

150000

200000

250000

300000

0 50 100 150 200 250 300

Concentrazione (ng/ml)

Are

a d

el

pic

co

Il campione viene quindi analizzato nelle stesse condizioni della soluzione

standard e l’area del picco risulta di 175432.


La concentrazione del campione incognito si calcola sulla base dell’equazione

della retta:

y = 1080 x + 1523

sostituendo:

175432 = 1080 x + 1523

x = (175432 - 1523) / 1080= 161,0

La concentrazione del campione incognito risulta pertanto di 161 ng/ml.

Standard esterno con calibrazione ad un punto1

Una soluzione standard è preparata sciogliendo 103,5 mg di uno composto di

riferimento in 500 ml di solvente.

Un’aliquota pari a 25 µl è iniettata in una colonna HPLC e l’area del picco risulta

pari a 153885.

99,6 mg del campione da analizzare sono sciolti in 500 ml, 25 µl dei quali sono

stati iniettati nella colonna.

l’aera del picco risultante è stata di 147906.

La concentrazione incognita si determina dalla seguente proporzione:

As / Ar = Cs / Cr

dove: As e Cs sono l’area del picco e la concentrazione dello standard, mentre Ar e

Cr sono l’area del picco e la concentrazione dell’analita. Da cui deriva:

Cr = Cs . Ar / As

La concentrazione dello standard di riferimento è:

103,5 mg / 500 mg/ml = 0,21 mg/ml

La concentrazione di Cr è:

Cr = Cs . Ar / As = 0,21 x 147906 / 153885 = 0,19 mg/ml

La quantità del campione nella soluzione incognita risulta:

0,19 mg/ml . 500 ml = 95,0 mg

Purezza = 95 mg / 99,6 mg . 100 = 95,4 %

Standard esterno con calibrazione ad un punto2

Metodo dello standard interno

Il metodo dello standard interno permette di compensare gli errori analitici legati

alla preparazione del campione e all’analisi strumentale (es. variabili legate alla

quantità di campione iniettato).

Rispetto al metodo dello standard esterno, prevede l’aggiunta di un composto

chiamato standard interno a concentrazione nota, sia alle soluzioni di riferimento

(bianchi) per ottenere la curva di calibrazione, sia al campione da determinare.

Nell’allestimento della curva di calibrazione, si considera il rapporto delle aree tra

analita/standard interno.

Qualora non si utilizzi uno spettrometro di massa come analizzatore, lo standard

interno deve essere un analogo dell’analita e, in particolare, deve:

• essere separato dall’analita e dagli altri componenti il campione;

• avere proprietà chimico-fisiche analoghe al campione;

• avere una risposta al detector simile all’analita;

• essere presente in una concentrazione dello stesso ordine di grandezza

dell’analita incognito.

Esempio dell’uso del metodo dello std. interno1

Si supponga di voler determinare il contenuto dell’analita A, presupponendo che la

sua concentrazione sia in un intervallo fra 100 e 250 ng/ml.

Si allestisce la curva di calibrazione utilizzando uno standard certificato

dell’analita A a concentrazioni di 100, 150, 200 e 250 ng/ml. A tali soluzioni si

aggiunge lo standard interno alla concentrazione di 150 ng/ml.

L’analisi HPLC fornisce le seguenti aree riferite ai picchi cromatografici dello

standard interno e dello standard dell’analita:

Conc. std

(ng/ml)Area std Area std interno Rapporto aree

100 110952 164302 0,675293

150 159143 163997 0,970402

200 221645 164204 1,34988

250 270045 164289 1,64371

Si calcola l’equazione della curva di calibrazione:


y = 0,0066x + 0,0102

R2 = 0,9973

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

1,8

0 50 100 150 200 250 300


Rap

po

rto

are

e

Lo standard interno viene quindi aggiunto in quantità nota (150 ng/l) all’analita

dalla cui analisi è stata determinata l’area del picco sia dello standard interno

(164105) sia quella dell’analita (175432). Il cui rapporto delle aree è pari a

1,069023.


La concentrazione del campione incognito si calcola sulla base dell’equazione

della retta:

y = 0,0066 x + 0,0102

sostituendo:

1,069023 = 0,0066 x + 0,0102

x = (1,069023 - 0,0102) / 0,0066 = 160,4

La concentrazione del campione incognito risulta pertanto di 160,4 ng/ml.

Metodo delle aggiunte standard

Il metodo delle aggiunte standard è utilizzato quando si vuole determinare la

concentrazione di un analita sciolto in una matrice che contiene sostanze che

possono interferire con la risposta dell’analita al detector.

Si aggiungono quantità note e crescenti di standard a volumi noti e costanti della

soluzione del campione incognito.

Esempio dell’uso del metodo delle aggiunte std.1

A volumi di 5 ml della soluzione incognita si aggiungono 0,25, 0,50 e 0,75 ml di

una soluzione di riferimento avente una concentrazione pari a 10 ng/ml. Il volume

di ogni soluzione è portato a un volume finale di 10 ml con il solvente.

Per ogni campione si determina l’area del picco, dovuta al campione incognito e

allo standard aggiunto:

SoluzioneConc. analita

(ng/ml)Area

S1 x 99151

S2 x + 0,25 149987

S3 x + 0,50 200132

S4 x + 0,75 249889


Si calcola l’equazione della curva di calibrazione:

y = 200944x + 99436

R2 = 1

0

50000

100000

150000

200000

250000

300000

0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8


Are

a


La concentrazione del campione incognito (S1) si calcola sulla base

dell’equazione della retta:

y = 200944 x + 99436

ponendo y = 0:

0 = 200944 x + 99436

x = 99436 / 200944 = 0,495

Dato che S1 è diluito da 5 a 10 ml (diluizione 1:2), la concentrazione effettiva è

pari a:

x = 0,495 . 2 = 0,99

La concentrazione del campione incognito risulta pertanto di 0,99 ng/ml.

Metodo della normalizzazione

E’ un’analisi semiquantitativa che fornisce il contenuto % di un analita.

Si può applicare quando i componenti della miscela forniscono una risposta

simile al detector.

Il risultato quantitativo è espresso calcolando l’area del picco dell’analita rispetto

alla somme delle aree dei componenti la miscela:

dove A è l’area dell’analita A.

100Area

AreaA(%)

n

1i i

A

Applicazione del metodo della normalizzazione

Una miscela di 10 componenti è separata mediante analisi HPLC. La somma

delle aree dei 10 componenti è pari a 12533495 e l’area del picco A è pari a

957512. La % di A nella miscela risulta:

A(%) = (957512 / 12533495) x 100 = 7,64 %

Applicazioni dell’HPLC

Ampicillinum anhydricum

C16H19N3O4S

Mr 349.4

DEFINITION

Anhydrous ampicillin contains not less than 96.0 per cent and not more than the

equivalent of 100.5 per cent of (2S,5R,6R)-6-[[(2R)-2-amino-2-phenylacetyl]amino]-

3,3-dimethyl-7-oxo-4-thia-1-azabicyclo[3.2.0]heptane-2-carboxylic acid, calculated

with reference to the anhydrous substance.

ASSAY

Examine by liquid chromatography (2.2.29).

Test solution (a). Dissolve 27.0 mg of the substance to be examined in mobile

phase A and dilute to 50.0 ml with the same solvent.

Ampicillin, anhydrous1

Test solution (b). Dissolve 27.0 mg of the substance to be examined in mobile


Reference solution (a). Dissolve 27.0 mg of anhydrous ampicillin CRS in mobile


Reference solution (b). Dissolve 2.0 mg of cefradine CRS in mobile phase A and

dilute to 50 ml with the same solvent. To 5.0 ml of this solution add 5.0 ml of

reference solution (a).

Reference solution (c). Dilute 1.0 ml of reference solution (a) to 20.0 ml with mobile

phase A.

Reference solution (d). Dilute 1.0 ml of reference solution (c) to 25.0 ml with mobile

phase A.


The chromatographic procedure may be carried out using:

— a column 0.25 m long and 4.6 mm in internal diameter packed with octadecylsilyl

silica gel for chromatography R (5 µm),

— as mobile phase at a flow rate of 1.0 ml/min:

Mobile phase A. A mixture of 0.5 ml of dilute acetic acid R, 50 ml of 0.2 M potassium

dihydrogen phosphate R and 50 ml of acetonitrile R, diluted to 1000 ml with

water R,

Mobile phase B. A mixture of 0.5 ml of dilute acetic acid R, 50 ml of 0.2 M potassium

dihydrogen phosphate R and 400 ml of acetonitrile R, diluted to 1000 ml with

water R,

— as detector a spectrophotometer set at 254 nm,

— a 50 µl loop injector.


Equilibrate the column with a mobile phase with ratio A:B of 85:15. Inject reference

solution (b). The test is not valid unless the resolution between the two principal

peaks is at least 3.0. If necessary, adjust the ratio A:B of the mobile phase. The

mass distribution ratio for the first peak (ampicillin) is 2.0 to 2.5. Inject reference

solution (d). Adjust the system to obtain a peak with a signal-to-noise ratio of at

least 3. Inject reference solution (a) 6 times. The test is not valid unless the relative

standard deviation for the area of the principal peak is at most 1.0 per cent. Inject

alternately test solution (a) and reference solution (a).

Calculate the percentage content of ampicillin.


Related substances.

Examine by liquid chromatography (2.2.29) as described under Assay. Inject reference

solution (c) and elute isocratically. Inject freshly prepared test solution (b) and start the elution

isocratically. Immediately after elution of the ampicillin peak start the following linear gradient.

If the mobile phase composition has been adjusted to achieve the required resolution, the

adjusted composition will apply at time zero in the gradient.


Time

(min)

Mobile phase A

(per cent V/V)

Mobile phase B

(per cent V/V)

0 85 15

30 0 100

45 0 100

Equilibrate the column with the originally chosen mobile phase for 15 min. Inject mobile

phase A and use the same elution gradient to obtain a blank. In the chromatogram obtained

with test solution (b), the area of any peak, apart from the principal peak and any peak

observed in the blank chromatogram, is not greater than the area of the principal peak in the

chromatogram obtained with reference solution (c) (1.0 per cent).

Liquiritiae radix

DEFINITION

Liquorice root consists of the dried unpeeled or peeled, whole or cut root and stolons of

Glycyrrhiza glabra L. and/or of Glycyrrhiza inflata Bat. and/or Glycyrrhiza uralensis Fisch. It

contains not less than 4.0 per cent of glycyrrhizic acid (C42H62O16; Mr 823), calculated with

reference to the dried drug.

ASSAY


Test solution. Place 1.000 g of the powdered drug (180) in a 150 ml ground glass conical flask.

Add 100.0 ml of an 8 g/l solution of ammonia R and treat in a ultrasonic bath for 30 min.

Centrifuge a part of the supernatant layer and dilute 1.0 ml to 5.0 ml with an 8 g/l solution of

ammonia R. Filter the solution through a filter (0.45 µm) and use the filtrate as the test

solution.

Solution A. Dissolve 0.130 g of monoammonium glycyrrhizate CRS in an 8 g/l solution of

ammonia R and dilute to 100.0 ml with the same solvent.

Reference solution (a). Dilute 5.0 ml of solution A to 100.0 ml with an 8 g/l solution of

ammonia R.

Reference solution (b). Dilute 10.0 ml of solution A to 100.0 ml with an 8 g/l solution of

ammonia R.

Reference solution (c). Dilute 15.0 ml of solution A to 100.0 ml with an 8 g/l solution of

ammonia R.

Liquorice root1


— a stainless steel column 0.10 m long and 4 mm in internal diameter packed with

octadecylsilyl silica gel for chromatography R (5 µm),

— as mobile phase at a flow rate of 1.5 ml/min a mixture of 6 volumes of glacial

acetic acid R, 30 volumes of acetonitrile R and 64 volumes of water R,

— as detector a spectrophotometer set at 254 nm,

— a 10 µl loop injector.

Inject reference solution (c). Adjust the sensitivity of the system so that the height of

the peaks are at least 50 per cent of the full scale of the recorder. Inject each

reference solution and determine the peak areas.

Establish a calibration curve with the concentration of the reference solutions

(g/100 ml) as the abscissa and the corresponding areas as the ordinate.

Inject the test solution. Using the retention time and the peak area determined from

the chromatograms obtained with the reference solutions, locate and integrate the

peak due to glycyrrhizic acid in the chromatogram obtained with the test solution.

Liquorice root2

Calculate the percentage content of glycyrrhizic acid from the following expression:

Liquorice root3

840

822B

m

5AConc

A = concentration of monoammonium glycyrrhizate in the test solution

determined from the calibration curve, in g/100 ml;

B = declared percentage content of monoammonium glycyrrhizate CRS;

m = mass of the drug, in grams;

822 = molecular weight of glycyrrhizic acid;

840 = molecular weight of the monoammonium glycyrrhizate (without any water

of crystallisation).

Fluoxetini hydrochloridum

C17H19CIF3NO

Mr 345.8

DEFINITION

Fluoxetine hydrochloride contains not less than 98.0 per cent and not more than the

equivalent of 102.0 per cent of (3RS)-N-methyl-3-phenyl-3-[4-

trifluoromethyl)phenoxy]propan-1-amine hydrochloride, calculated with reference to

the anhydrous, acetonitrile-free substance.

Fluoxetine hydrochloride1

ASSAY


Test solution. Dissolve 55.0 mg of the substance to be examined in the mobile phase and

dilute to 50.0 ml with the mobile phase. Dilute 10.0 ml of the solution to 100.0 ml with the

mobile phase.

Reference solution. Dissolve 55.0 mg of fluoxetine hydrochloride CRS in the mobile phase and

dilute to 50.0 ml with the mobile phase. Dilute 10.0 ml of the solution to 100.0 ml with the

mobile phase.


— a stainless steel column 0.25 m long and 4.6 mm in internal diameter packed with octylsilyl

silica gel for chromatography R (5 µm),

— as mobile phase at a flow rate at 1 ml/min a mixture of 8 volumes of methanol R,

30 volumes of tetrahydrofuran R and 62 volumes of a solution of triethylamine R prepared as

follows: to 10 ml of triethylamine R, add 980 ml of water R, mix and adjust to pH 6.0 with

phosphoric acid R (about 4.5 ml) and dilute to 1000 ml with water R,

— as detector a spectrophotometer set at 227 nm.


When using a recorder, adjust the sensitivity of the system so that the height of the

principal peak in the chromatogram obtained with reference solution is at least

50 per cent of the full scale of the recorder.

Adjust the volumes of methanol and the solution of triethylamine in the mobile

phase so that the retention time of fluoxetine is between 10 min and 18 min.

The assay is not valid unless the symmetry factor calculated at 10 per cent of the

height of the peak due to fluoxetine is at most 2.0.

Inject 10 µl of the test solution and 10 µl of the reference solution.

Calculate the content of fluoxetine hydrochloride (C17H19CIF3NO) from the area of

the peaks in the chromatograms obtained with the test solution and the reference

solution using the stated content of C17H19CIF3NO in fluoxetine hydrochloride CRS

and correcting for the content of water and of acetonitrile in the substance to be

examined.


Antazolina e nafazolina soluzione oftalmica

Il collirio di antazolina e nafazolina soddisfa anche ai requisiti definiti nella

monografia Preparazioni oftalmiche (1163).

DEFINIZIONE

Il collirio di antazolina e nafazolina ha la seguente composizione:

Antazolina solfato 0,50 g

Nafazolina nitrato 0,025 g

Sodio cloruro 0,80 g

Benzalconio cloruro 0,010 g

Acqua depurata q.b. a 100 ml

Contenuto di antazolina solfato ((C17H19N3)2.H2SO4): non meno del 90,0 per cento e

non più del 110,0 per cento della quantità indicata in etichetta.

Contenuto di nafazolina nitrato (C14H14N2.HNO3): non meno del 90,0 per cento e

non più del 110,0 per cento della quantità indicata in etichetta.

Antazolina e nafazolina collirio soluzione1

DETERMINAZIONE QUANTITATIVA

Esaminare mediante cromatografia liquida (2.229).

Soluzione in esame. Diluire un volume di preparazione in esame, esattamente

misurato e corrispondente a circa 0,25 mg di nafazolina nitrato, a 20,0 ml con la

fase mobile.

Soluzione di riferimento. Disciogliere 0,5 g di antazolina solfato SCR e 25 mg di

nafazolina nitrato SCR nella fase mobile e diluire a 100 ml con la fase mobile.

Prelevare 1 ml e diluire a 20 ml sempre con la fase mobile.

Il procedimento cromatografico può essere eseguito usando:

- una colonna di acciaio inossidabile lunga 0,30 m e con diametro interno di 3,9 mm

impaccata con gel di silice ottadecilsililato per cromatografia R (10 mm),

- come fase mobile, ad una velocità di flusso di 1,0 ml per minuto, una miscela di 45

volumi di metanolo R e 55 volumi di una soluzione allo 0,3 per cento di ammonio

fosfato dibasico R (aggiustata a pH 4,0 con acido fosforico R),


- come rivelatore uno spettrofotometro regolato a 280 nm,

- un iniettore a volume fisso.

Iniettare, per 6 volte, 20 ml della soluzione di riferimento e registrare il

cromatogramma. La determinazione quantitativa è valida solo se la deviazione

standard relativa delle aree ottenute per l'antazolina solfato è al massimo dell'1,5

per cento e se la risoluzione fra i picchi della antazolina solfato e nafazolina nitrato

è almeno 7,0; se necessario aggiustare le concenrazioni dei componenti della fase

mobile in modo da ottenere la risoluzione richiesta. Iniettare 20 ml della soluzione di

riferimento e registrare il cromatogramma. Iniettare 20 ml della soluzione in esame e

registrare il cromatogramma alla stessa maniera. Calcolare il contenuto di

(C17H19N3)2.H2SO4 e C14H14N2.HNO3 dalle aree dei picchi ottenuti con la soluzione

in esame e la soluzione di riferimento.


Iodio-iodurato unguento

L’unguento di iodio soddisfa anche i requisiti definiti nella monografia Preparazioni

semisolide per applicazione cutanea (0132).

Potassio ioduro. Esaminare mediante cromatografia liquida (2.2.29) a scambio

ionico.

Soluzione in esame. Trasferire 0,100 g di preparazione, esattamente pesati, in un

becher da 150 ml. Aggiungere 100,0 ml di acqua R, scaldare alcuni minuti a b.m.

agitando efficacemente sino a dispersione completa dell'unguento nella fase

acquosa, raffreddare e filtrare. Utilizzare la soluzione ottenuta.

Soluzione di riferimento. Disciogliere 100 mg di potassio ioduro R in acqua R, diluire

a 100,0 ml con lo stesso solvente e mescolare. Diluire 10,0 ml della soluzione

ottenuta a 100,0 ml con acqua R.


- una colonna di acciaio inossidabile lunga 3 cm e con diametro interno di 4,6 mm,

impaccata con base metacrilato ed ammina quaternaria alcanolica (7 mm);

Iodio unguento1

usare una precolonna lunga 7,5 mm e con diametro interno di 4,6 mm impaccata

con Io stesso riempimento della colonna non soppressore di anioni,

- come fase mobile una miscela di una soluzione (142,8 g/I) di sodio bicarbonato R

e una soluzione (190,8 g/1) di sodio carbonato R ad una velocità di flusso di 0,50

ml/min,

- come rivelatore un conduttimetro regolato a una sensibilità di 10 mS, con una

temperatura di cella fissata a 35°C e con polarità positiva.

Equilibrare la colonna non la fase mobile per almeno 1 h. Iniettare 20 ml della

soluzione di riferimento e della soluzione in esame. Determinare la quantità di

potassio ioduro nella soluzione in esame in base alle aree dei picchi ottenuti

rispettivame e per la soluzione di riferimento e per la soluzione in esame.

Iodio unguento2

Matricariae extractum hydroalcoolicum siccum, normatum

DEFINIZIONE

L'estratto secco idroalcoolico di camomilla si ottiene dalla Camomilla comune fiore (0404).

Contiene non meno dell’1,2 per cento di apigenina totale derivante dalla somma di apigenina

libera e apigenina contenuta nell'apigenina-7-glucoside e nell'apigenina-7-(6acetil)-glucoside.

DETERMINAZIONE QUANTITATIVA

Esaminare mediante cromatografia liquida (2.2.29).

Soluzione in esame. Disciogliere 250 mg in 25 ml di alcool al 30 per cento V/V R.

Soluzione di riferimento (a). Disciogliere 10,0 mg di apigenina R in 100 ml di una miscela di 1

volume di acqua R, 1 volume di metanolo R e 1 volume di diossano R.

Soluzione di riferimento (b). Disciogliere 2 mg di apigenina-7-glucoside R, 2 mg di apigenina-

7-(6-acetil)glucoside R e 2 mg di apigenina R in 100 ml di una miscela di 1 volume di acqua R,

1 volume di metanolo R e 1 volume di diossano R.


- una colonna A acciaio inossidabile lunga 0,22 m e con diametro interno di 4,6 mm

impaccata con gel di silice ottilsililato per cromatagrafia R o con gel di silice ottadecilsililato

per cromatagrafia R (5-10 mm).

Camomilla estratto idroalcoolico secco titolato1

- come fase mobilie acetonitrile R in percentuale variante, con gradiente lineare dal

10 per cento al 50 per cento in tampone citrato-fosfato soluzione a pH 2,4 R con

tempo di programmazione uguale a 100 min,

- come rivelatore uno spettrofotometro regolato a 335 nm,

- un registratore integratore avente la possibilità di programmare nel tempo le

funzioni di integrazione,

- un sistema di pompaggio idoneo ad assicurare un flusso di 1,0 ml per minuto.

Iniettare 10 ml di ciascuna soluzione. Preparare almeno 2 soluzioni di riferimento ed

analizzare per almeno 3 volte. Preparare almeno 3 soluzioni in esame ed analizzare

per almeno 3 volte.

Calcolare il contenuto di apigenina totale come somma di apigenina, apigenina-7-

glucoside e apigenina-7-(6-acetil)glucoside, tutti espressi come apigenina tenendo

conto dei rispettivi pesi molecolari.

Camomilla estratto idroalcoolico secco titolato2

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