CROMATOGRAFIA A SCAMBIO IONICO

• SI BASA SULLA INTERAZIONE ELETTROSTATICA FRA MOLECOLE

CON CARICA DI SEGNO OPPOSTO

• SFRUTTA LE DIVERSE PROPRIETA’ ACIDO-BASE DELLE

PROTEINE E QUINDI IL LORO DIVERSO STATO DI IONIZZAZIONE

AL VARIARE DEL pH

FASI STAZIONARIE: sono resine scambiatrici di IONI

PRINCIPALI FASI STAZIONARIE USATE IN CROMATOGRAFIA A SCAMBIO IONICO

MATRICE GRUPPO FUNZIONALE

Scambiatore CATIONICO DEBOLE4<pKa <6

AgarosioCellulosaDestranoPoliacrilato

CARBOSSILE -COO-

CARBOSSIMETILE -CH2COO-

Scambiatore CATIONICO FORTEpKa < 1

CellulosaDestranoPolistirene

SULFONATO -SO3-

SULFOMETILE -CH2SO3-

SULFOPROPILE -CH2CH2CH2SO3-

Scambiatore ANIONICO DEBOLE8 <pKa <10

AgarosioCellulosaDestranoPolistirene

AMMINOETILE -(CH2)2 NH3+

DIETILAMMINOETILE -(CH2)2 NH(CH2 CH3)2 +

Scambiatore ANIONICO FORTEpKa > 13

CellulosaDestranoPolistirene

TRIMETILAMMINOMETILE -CH2N+(CH3)3

TRIETILAMMINOETILE -CH2CH2N+(CH2CH3)3

Scambiatori DEBOLI: sono ionizzati in un intervallo ristretto di pH (dipende dal pKa dei gruppi dissociabili)Scambiatori FORTI: sono ionizzati in un ampio intervallo di pH (sono utilizzabili praticamente a qualunque pH)

Per separare e purificare proteine stabili in un ampio intervallo di pH:

potrò usare entrambi gli scambiatori (anionico o cationico)

Che tipo di cromatografia a scambio ionico utilizzare dipende soprattutto da:1) pI delle proteine da separare2) stabilità delle proteine d’interesse, in genere stabili in

un ristretto range di pH

Per separare e purificare proteine stabili a pH superiori al loro pI:Scambio anionico

• A pH > del pI (almeno una unità) la proteina è carica negativamente e legala resina scambiatrice di anioni.

• L’eluizione avviene per COMPETIZIONE con [Cl-] crescente

o abbassando il pH AL DI SOTTO DEL pI (più difficile da controllare).

Per separare e purificare proteine stabili a pH inferiori al loro pI:Scambio cationico

• A pH < del pI (almeno una unità) la proteina è carica positivamente e legala resina scambiatrice di cationi.

• L’eluizione avviene per COMPETIZIONE con [Na+] crescente

o aumentando il pH AL DI SOPRA DEL pI.

CROMATOGRAFIA a SCAMBIO ANIONICO (RESINA CARICA POSITIVAMENTE)

Proteina cariche positivamente

Proteina cariche negativamente e Na+

Proteina cariche positivamente (non

interagiscono)

Proteina cariche negativamente

++

+

+

++--

-

--

+

+

+

+-

-

--

-

+ H +

-9.0

Gruppo TRIMETILAMMINOMETILICO

-CH2N+(CH3)3

SCAMBIATORI DI ANIONI

-(CH2)2 NH(CH2 CH3)2 +

Gruppo DIETILAMMINOETILICO (DEAE)

Resina ionizzata positivamente sino a pH 8-9

Cromatografia a scambio anionico con SCAMBIATORE FORTE

Le proteine cariche negativamente scambieranno con il loro controione e silegheranno alla fase stazionaria con una forza direttamente proporzionale alla lorointensità di carica.

Le proteine cariche positivamente invece non interagiscono con la resina esaranno eluite per prime al tempo (o volume) morto di eluizione.

Gruppo TRIMETILAMMINOMETILICO

-CH2N+(CH3)3Cellulosa

Fase mobile = deve avere un pH > pI della maggior parte delle proteine presenti in miscela. Inizialmente la fase mobile avrà BASSA FORZA IONICA

Resina = Trimetilamminoetil

-cellulosa

Il campione = miscela di proteine da separare solubilizzate nello stesso tamponeutilizzato per equilibrare la fase stazionaria.

Resina ionizzata positivamente sino a pH 13Utile a qualunque pH si voglia lavorare

ELUIZIONE A STEP O A GRADIENTE

Soluzioni eluenti a concentrazione

crescente di NaCl

Variazione continua e lineare della

concentrazione del controione

Eluizione NON ISOCRATICA (a step o in gradiente):• Diminuzione pH → le proteine iniziano a protonarsi, si caricano positivamente e si staccano dalla fase stazionaria e eluiscono.• Aumento forza ionica → scambio per azione di massa p.es con un aumento della concentrazione di Na+Cl- (si modifica la concetrazione del controione Cl- che compete con le proteine negative)

Cromatografia a SCAMBIO ANIONICO DEBOLE: ad esempio DEAE-cellulosa

Eluizione (a step o in gradiente) =•Aumento forza ionica → i controioni Cl- si scambiano con le proteine per azione di massa e favoriscono la loro eluizione.•Diminuzione pH → la DEAE-cellulosa rimane carica positivamente, le proteine che erano negative si protonano via via che il pH diminuisce.

Resina = Dietil aminoetil-cellulosa:In quali condizioni la Fase stazionaria ha carica NETTA +?

pH = pKa = pH 9.0 → 50% gruppi protonati50% gruppi deprotonati

pKa = 9.0

pH = pKa -1 → 90% dei gruppi funzionali è protonatopH = pKa -2 → 99% dei gruppi funzionali è protonato

FASE MOBILE = DEVE ESSERE UN TAMPONE CON UN pH ≤ 8.0

pH 8.0 = è un buon compromesso: a pH 8.0 un buon numero di proteine sonocariche negativamente e la DEAE-cellulosa ha un buon grado di protonazione.Posso provare a separare proteine presenti in miscela anche non conoscendo iloro pI.

https://www.youtube.com/watch?v=q3fMqgT1do8

https://www.youtube.com/watch?v=lp40a7mtc4E

https://www.youtube.com/watch?v=i4U4ndf2ayg

SCAMBIO CATIONICO FORTE

FASE MOBILE = soluzione tampone a bassa forza ionica

con un pH < pI della maggior parte delle proteine (se

conosco i loro pI) presenti in miscela nel campione,altrimenti uso un pH di compromesso (tra 5 e 6 per es.)

Sempre ionizzata a qualunque valore di pH. Ho una grandelibertà nella scelta del pH della fase mobile, dipende solodalla stabilità delle mie proteine d’interesse.

Lega proteine cariche positivamente

Gruppo SULFONICO

-SO3-Cellulosa

Eluizione NON ISOCRATICA (a step o in gradiente):• AUMENTO del pH → le proteine si deprotonano, raggiungono il loro pI o diventano cariche negativamente. Si staccano dalla fase stazionaria e eluiscono.• Aumento forza ionica → l’aumento di concentrazione dei controioni Na+ consentono il distacco delle proteine legate per effetto di competizione

- ----

-- --

-

-

-

-- -

- --

++

++++

++

-

SCAMBIO CATIONICO DEBOLE

Resina = CM-cellulosa: carbossimetil cellulosa

pKa ≈ 5.0A quali valori di pH il gruppo carbossilicoè ionizzato?

Se pH = pKa= 5.0 50% gruppi sono protonati50% dei gruppi deprotonati

-COOH -COO- + H+

pH = pKa +1 = 6.0 →% deprotonaz = 90%pH = pKa + 2 = 7.0 →% deprotonaz = 99%

FASE MOBILE = DEVE ESSERE UN TAMPONE CON UN pH ≥ 6.0

pH 6.0 = è un buon compromesso. A pH 6.0 un buon numero di proteine sonocariche positivamente e la CM-cellulosa ha un buon grado di deprotonazione

Eluizione NON ISOCRATICA (a step o in gradiente):• AUMENTO del pH → le proteine si deprotonano, raggiungono il loro pI o sicaricano negativamente. Si staccano dalla fase stazionaria e eluiscono.• Aumento forza ionica → l’aumento di concentrazione dei controioni Na+

consentono il distacco delle proteine legate grazie ad un effetto di competizione

Pianificare la separazione delle seguenti proteine utilizzando una colonna cromatografica contenente lo scambiatore di cationi CM-cellulosa.

A quale valore di pH dobbiamo equilibrare la FS? ……………………

Stabilire la carica di ciascuna proteina nelle condizioni prescelte

pI carica

Emoglobina 7,1

Citocromo c 10,6

Fibrinogeno 5,8

Ribonucleasi 7,8

Lisozima 11,0

In quali condizioni sperimentali possiamo eluire le proteine? ………….

Ipotizzare il grafico di eluizione corrispondente

+ (pH < pI)+ (pH < pI)

0/- (pH ≈ pI)+ (pH < pI)+ (pH < pI)

Scegliere le condizioni sperimentali più opportune per purificare le seguenti proteine a partire da una miscela contenente:

pI PM (kDa)Emoglobina 7.1 64Albumina 4.9 69Ribonucleasi 7.8 13.7Lisozima 11.0 14.0Insulina 5.4 6.5Citocromo c 10.6 14.0

Quale tipo o tipi di cromatografia si possono utilizzare?

In quali condizioni sperimentali si deve lavorare? Indicare le condizioni iniziali e quelle di eluizione

Ipotizzare il grafico di eluizione corrispondente