Cristal.lografia de Proteïnes per RX
description
Transcript of Cristal.lografia de Proteïnes per RX
Cristal.lografia de Proteïnes per RX
Marta Costa Guillem Galofré Meritxell Pellicer
Biologia Estructural UPF, 2004
INTRODUCCIÓ
DIFRACCIÓ
FUNCIÓ DE DISPERSIÓ
PROBLEMA DE LES FASES
MÈTODES PER RESOLDRE EL PROBLEMA DE LES FASES
REFINAMENT
SUMARI
INTRODUCCIÓ
DIFRACCIÓ
FUNCIÓ DE DISPERSIÓ
PROBLEMA DE LES FASES
MÈTODES PER RESOLDRE EL PROBLEMA DE LES FASES
REFINAMENT
SUMARI
Procés pel qual a través de la incidència de Raig X sobre un cristall de proteïna podem obtenir un mapa de densitat electrònica i a partir d’aquest trobar l’estructura de la proteïna.
Què és la Cristal·lografia de Proteïnes?
La determinació del mapa de densitat electrònica de la molècula s’obté de l’anàlisi del patró de difracció que experimenta un feix de Raigs X al atravessar el cristall.
INTRODUCCIÓ
Per què cristalls?
El cristall és una xarxa de molècules ordenades en la mateixa orientació repetida, això fa que les ones difractades es sumin i assoleixin prou intensitat.Al ser irradiats produeixen un efecte de difracció que depèn de les distàncies entre els àtoms.El patró de difracció està relacionat amb l’estructura de la proteïna.
INTRODUCCIÓ
Per què Raigs X?Poden atravessar la matèria.La seva longitud d’ona és tan petita com les distàncies interatòmiques, cosa que permet diferenciar i identificar els àtoms de la molècula.
INTRODUCCIÓ
Un sincrotró és un accelerador de partícules circular, que permet escollir la longitud d’ona de la radiació. Augmenta l’energia cinètica dels electrons mantenint-los en trajectoria circular s’obtenen 2 components de l’acceleració:- V- canvi de direcció del moviment emissió de radiació electromag.
Radiació de Sincrotró
I rradiació del cristall
El SincrotróINTRODUCCIÓ
INTRODUCCIÓ
DIFRACCIÓ
FUNCIÓ DE DISPERSIÓ
PROBLEMA DE LES FASES
MÈTODES PER RESOLDRE EL PROBLEMA DE LES FASES
REFINAMENT
SUMARI
Condició: sortir en fase!
Suma d’amplituds
S’ha d’amplificar la senyal de la radiació dispersada per a la seva detecció
Interacció amb e- !!!
DIFRACCIÓ
= longitud d’ona distància
1 cicle complert angle 2
2 / (quantitat d’angle / distància recorreguda)
xd
/ xPer regla de tres... = x . (2 / )
DIFRACCIÓ
•Tenint... = x . (2 / ) ...i... x = d . sin
n *(n ha de ser nº sencer!)
n2 = (d . sin. 2) / n = d . sin
xd
/ x•Perque surti en fase... = 2
= (d . sin. 2) /
DIFRACCIÓ
Condicions de Laue
n = d. sinperò cristall no és només 1 D...
h = a . ΔSk = b . ΔS LAUE!l = c . ΔS
Nombres sencers!
Incident So
Difractat S
0S ss
n = r12.(S-S0)3d
DIFRACCIÓ
a = (a,0,0) b = (0,b,0) c = (0,0,c)
r
Gràcies a les Condicions de Laue,definim la forma i dimensió de la cel.la que permetrà la difracció!
...per tant, qualsevol punt en l’espai de la cel.la podrà ser definit per un vector posició r:r = x a + y b + z c...i recordant a Laue...r.ΔS = x h + y k + z l (...que són nombres sencers i més endavant veurem que ens serveix en les fórmules...)
DIFRACCIÓ
Mapa de Dispersió
Espai Recíproc i Esfera d’Ewald
A nivell experimental, el que nosaltres observem és l’espai recíproc i no el directe:
DIFRACCIÓ
L’esfera d’Ewald com a model matemàtic, ens ajuda a entendre-ho...
(a*,b*,c*) és l’espai recíproc de (a,b,c), siguent:
a*= 1/ab*= 1/b c*= 1/c
DIFRACCIÓ
, , ...*http://www-structmed.cimr.cam.ac.uk/Course/Basic_diffraction/data_animation.html
1 2 3
Funció de Dispersió!
DIFRACCIÓ
INTRODUCCIÓ
DIFRACCIÓ
FUNCIÓ DE DISPERSIÓ
PROBLEMA DE LES FASES
MÈTODES PER RESOLDRE EL PROBLEMA DE LES FASES
REFINAMENT
SUMARI
Entrem a la dimensió desconeguda...
? ?
? ? ?The Twilight Zone...
n = d. sinn = d. sinn = d. sinn = d. sinn = d. sinn = d. sin
n = d. sin
n = d. sin
lzkyhx2
1,0
lzkyhx2
Sr2
lk,h,1zy,x,
dxdydz zy,x,lk,h,
dVr
i
h k l
i
Celda
i
eFV
eV)F(
eS)F(
-La suma de totes les dispersons de tots els e- ...
...per cada un dels punts en l’espai de la cel.la ...
-...per la funció d’ona.
A nosaltres el que ens interessa és la densitat electrònica!!!
...per tant, necessitarem l’ajuda de...
FUNCIÓ DE DISPERSIÓ
Laue!!!
dx
dt
itx
itx
exFtf
etfxF
)()(
)()(
La Transformada de Fourier ens permet passar de l’espai “matemàtic” Fourier, a l’espai real, i viceversa. (En termes més senzills i pràctics; ens permet passar elements de la funció d’un costat a l’altre...)
La Transformada de Fourier
FUNCIÓ DE DISPERSIÓ
FUNCIÓ DE DISPERSIÓ
Transformada de Fourier
lzkyhx2
1,0
lzkyhx2
Sr2
lk,h,1zy,x,
dxdydz zy,x,lk,h,
dVr
i
h k l
i
Celda
i
eFV
eV)F(
eS)F(...així:
lk,h,i lk,h,lk,h, eFFComplex(a funció)
Part real(el que observem –mòdul-)
descomposem
+ Part imaginària
FUNCIÓ DE DISPERSIÓ
INTRODUCCIÓ
DIFRACCIÓ
FUNCIÓ DE DISPERSIÓ
PROBLEMA DE LES FASES
MÈTODES PER RESOLDRE EL PROBLEMA DE LES FASES
REFINAMENT
SUMARI
lk,h,lzkyhx lk,h,zy,x, iαi
h k leF
V 21
Per tant, apliquem a l’equació anterior, i...
és un angle de desfase adicional... Que no coneixem!!!Ens trobem amb el Problema de les Fases!!!
PROBLEMA DE LES FASES
lk,h,i lk,h,lk,h, eFFComplex(a funció)
Part real(el que observem –mòdul-)
+ Part imaginària
COM RESOLDRE’L...?
“El problema de les fases pot comparar-se a una orquestra en la que cada músic només rep la part de partitura que li toca interpretar. Un violoncel·lista sap quines notes tocar i amb quin ritme, però per coordinar el moment en què cada intèrpret ha de començar, existeix el mestre. Si aquest falta, no hi haurà coordinació i el resultat serà desastrós. D’aquesta manera, en les dades que el detector recull en la cristal·lografia falta saber “l’hora” en la que cada un entra, perquè la suma de les ones sigui el resultat real. És a dir, que la determinació de les fases de les ones informa de quan considerar cada una, i així sumar els pics i les valls.”
PROBLEMA DE LES FASES
HI HA SOLUCIONS!
PROBLEMA DE LES FASES
INTRODUCCIÓ
DIFRACCIÓ
FUNCIÓ DE DISPERSIÓ
PROBLEMA DE LES FASES
MÈTODES PER RESOLDRE EL PROBLEMA DE LES FASES
REFINAMENT
SUMARI
MÈTODES PER RESOLDRE EL PROBLEMA DE LES FASES
1. Determinació directa2. Multiple Isomorphus Replacement (MIR)3. Multiwavelenght Anomalous Diffraction (MAD)4. Molecular Replacement (MR)
Però abans cal conèixer...
Slk,h,hkl
uF
VuP 21 2 cos)()(
dVurruPr
)(
2022
3
lk,h,e2
FImcV
VIcelda
cr
...l’empenta que ens dóna la Funció de Patterson:
Ens ajuda, doncs ens dóna un valor real per F (F2 , relacionat amb la intensitat de les radiacions difractades captades) sense introduir-nos una fase desconeguda, eliminant així el problema de les fases. Obtenim:
Fent la Transformada de Fourier, aïllarem la part de dins de l’equació que fa referència a la densitat electrònica!!!... Però no és la densitat electrònica, sinó una Funció de Correlació, que ens estarà dient la distància entre dos centres electrònics.És un bon començament per aproximar-nos-hi...
MÈTODES PER RESOLDRE EL PROBLEMA DE LES FASES
Mapa de Patterson bidimensional
Mapa de Patterson. És un mapa de vectors de les distàncies entre els centre electrònics.
dVurruPr
)(
S’utilitza com a complement d’altres mètodes per resoldre les estructures protèiques.APLICACIONS
...Per tant, buscarem situar algun/s centre electrònic i, sabent la correlació de distàncies, ja podrem saber la posició de la resta, o sigui, el mapa de Densitat electrònica!
MÈTODES PER RESOLDRE EL PROBLEMA DE LES FASES
1. Determinació directaMètode directe que utilitza les relacions estadístiques entre els sistemes dels factors de dispersió per deduir els possibles valors de les fases.
hkl
calcobs FF 2 lk,h,lk,h, lk,h,
F OBSERVAT EXPERIMENTALMENT
F HIPOTÈTIC
- molècules petites ( < 200 àtoms)- sub-estructures de macromolècules- últims desenvolupaments ( ~ 2000 àtoms)
APLICACIONS
MÈTODES PER RESOLDRE EL PROBLEMA DE LES FASES
AVANTATGES
INCONVENIENTS
No necessiten derivats isomòrfs No necessiten dispersors anòmals No necessiten un model semblant Poden completar tots els altres mètodes
X Difraccions a molt alta resolució (1.2 Å o més) X A mesura que augmenta el nombre d’àtoms funcionen pitjor
MÈTODES PER RESOLDRE EL PROBLEMA DE LES FASES
2. REEMPLAÇAMENT ISOMÒRFIC MÚLTIPLE (MIR)
Cristalls derivats de la proteïna a la qual se li han introduït alguns àtoms de metalls pesats.
Patró de difracció de RX del cristall de la proteïna nativa i dels derivats.
Aplicació de la funció de Patterson per determinar les coordenades dels àtoms pesats.
Refinament dels paràmetres dels àtoms pesats i càlcul de les fases dels angles.
Càlcul de la densitat electrònica de la proteïna nativa (aplicació de la transformada de Fourier un cop ja tenim les fases)
MÈTODES PER RESOLDRE EL PROBLEMA DE LES FASES
La introducció d’un àtom pesat canvia significativament el mapa de dispersió.
La contribució dels àtoms lleugers tendeix a anul·lar-se ja que dispersen en fases diferents; en canvi, els electrons d’un àtom pesat solen dispersar en la mateixa fase.
Com a resultat, el canvi en la intensitat degut a l’addició d’un àtom pesat a la proteïna serà fàcilment mesurable.
Com que la quantitat d’àtoms de metalls és reduïda podem obtenir el mapa de Patterson i per mètodes directes trobar les coordenades d’aquests metalls.
MÈTODES PER RESOLDRE EL PROBLEMA DE LES FASES
Per poder solucionar el problema, la dispersió dels àtoms en la proteïna nativa no ha de variar per l’addició dels àtoms pesats, llavors les diferències en els patrons es deuran només a la incorporació dels nous àtoms.
FPH = FP + FH
Coneixem el mòdul i orientació d’un costat: FH; i el mòdul dels altres dos (FPH i FP).
Com veiem hi ha dos possibles triangles, d’acord amb les dues possibles fases de FP.
MÈTODES PER RESOLDRE EL PROBLEMA DE LES FASES
Construcció de Harker
1. Dibuixem un cercle de radi igual al mòdul de FP, centrat a l’origen; aquest cercle indica tots els vectors que es poden obtenir en totes les fases de FP (blau)
2. Dibuixem un altre cercle de radi FPHcentrat a -FH (rosa)
3. Les interseccions entre els dos cercle són possibles valors de FP que satisfan l’equació FPH = FP + FH i estan en consonància amb els mòduls mesurats i amb el model de l’àtom pesat.
MÈTODES PER RESOLDRE EL PROBLEMA DE LES FASES
Llavors, si tracem un altre cercle a partir dels valors obtinguts amb un altre cristall derivat només una opció serà concordant amb totes les observacions.
Cal tenir en compte que en els segon cristall derivat canvies el metall però els has de situar en la mateixa posició.
Si la proteïna ja conté metalls es poden aprofitar i no n’has d’afegir tants.
Ja que es necessita més d’un cristall derivat, el mètode és anomenat Reemplaçament Isomòrfic Múltiple.
És el mètode més usat quan no tenim cap informació sobre l’estructura.
MÈTODES PER RESOLDRE EL PROBLEMA DE LES FASES
3. Multiwavelenght Anomalous Diffraction (MAD)
Variant del reemplaçament isomòrfic múltiple.Es basa en l’existència de metalls que al ser irradiats amb diverses longituds d’ona presenten un comportament diferent i, per tant, diferents Fs.
D’aquesta manera ens estalviem haver de fer un segon derivat.
MÈTODES PER RESOLDRE EL PROBLEMA DE LES FASES
- Es basa en el coneixement previ de l’estructura tridimensional d’una altra proteïna homòloga cristal·litzada.
- El model ha de posseir d’un 30 a un 50% de la seva seqüència d’aminoàcids idèntica a la que s’està analitzant.
- Bancs de dades cristal·logràfiques PDB.
- S’utilitza quan es disposa d’un bon model conegut que es correlaciona amb una fracció raonable de l’estructura del cristall de la proteïna problema.
4. Molecular Replacement (MR)
MÈTODES PER RESOLDRE EL PROBLEMA DE LES FASES
METODOLOGIA
1- S’empra la estructura homòloga i es genera un mapa de densitat teòric. 2- Es produeix la superposició del mapa de densitat teòric amb l’observat. 3- Es minimitza la funció R-factor (funció de resolució), fent ús d’ una funció de rotació i translació.
hkl
hkl
obsF
calcFkobsFR
)(
)()(
Model
Mapa densitats
F
F’
Mapa de densitats’
Rotació i translació
Model’
...
MÈTODES PER RESOLDRE EL PROBLEMA DE LES FASES
INTRODUCCIÓ
DIFRACCIÓ
FUNCIÓ DE DISPERSIÓ
PROBLEMA DE LES FASES
MÈTODES PER RESOLDRE EL PROBLEMA DE LES FASES
REFINAMENT
SUMARI
Segueix un procés igual que el Reemplaçament molecular.
Un cop s’obté el mapa de densitats de la proteïna problema, s’apliquen les funcions de rotació i de translació per tal de millorar-lo i ajustar-lo el màxim possible.
Per ajustar-lo el màxim possible H2O
Fcalc nova
R menor
REFINAMENT
REFINAMENT
El model 3D al que s’arriba, pot deixar alguna part d’un aminoàcid fora de la densitat electrònica, i això exigeix un refinament.
REFINAMENT
CONCLUSIONS
Resumint...
Irradiem Cristall
Funció de Correlació (Mapa de Patterson)
Mapa de Dispersió
Obtenim Cristall
Aïllem la Proteïna
Transformada de Fourier (amb la funció de Patterson)
Mètodes + Refinament
Funció de Dispersió
X Grans quantitats de proteïna per purificar
X Cristalls de molt bona qualitat
X Possibles artefactes cristal·lins
X Resultats a mitjà-llarg plaç
Permet determinar estructura 3D de compostos biològics
Alta exactitud i resolució estructural a nivell atòmic
No hi ha límit en la mida de la molècula
AVANTATGES INCONVENIENTS
CONCLUSIONS
•CANTOR, CR., 1998 Biophysical chemistry. Part II: Thecniques for the study of biological structure and function, New YorkCantor,WH Freeman and Co.
•DRENTH, J., 1994, Principles of protein X ray crystallography, Nueva York, Springer-Verlag.
•http://www-structmed.cimr.cam.ac.uk/course.html
•http://www-structure.llnl.gov/Xray/101index.html
•http://www.ciencia-hoy.retina.ar/hoy60/luz.htm
•http://www.xtal.iqfr.csic.es/Cristalografia/parte_01.html •http:// info.main.conacyt.mx/secobi/bancos/cyd/pdf/133-38.pdf
BIBLIOGRAFIA
PEMs
1- Quina de les següents afirmacions sobre la Cristal·lografia de proteïnes és correcta:
a). La longitud d’ona dels raigs X utilitzats és més gran que les distàncies interatòmiques.
b). Aquesta tècnica és la més emprada després de la Ressonància Magnètica Nuclear.
c). Una de les avantatges del sincrotró és que permet escollir la longitud d’ona amb la que s’irradia el cristall.
d). Perquè hi hagi difracció, a cada cel·la unitària només hi pot haver una molècula de la nostra proteïna.
e). Totes les anteriors són falses.
2- Pel que fa a la Cristal·lografia de proteïnes, quina de les següents afirmacions és correcta:
a). Perquè es produeixi el fenòmen de la difracció no és necessari que les ones es dispersin en fase.
b). En la següent expressió : n = d · sin , n pot ser qualsevol nombre real.
c). El vector S0 fa referència a la radiació dispersada.
d). Gràcies a les condicions de Laue, definim la forma i dimensió de la cel·la que permetrà la difracció.
e). En les condicions de Laue no es té en compte la longitud d’ona de la radiació emprada.
PEMs
3-Referent a la cristal·lografia de proteïnes per raigs X, quines de les següents afirmacions són falses :
1). A nivell experimental, les dades obtingudes fan referència a l’espai recíproc.
2). Aplicant la Transformada de Fourier a la Funció de Dispersió ja podem conéixer la densitat electrònica.
3). Per obtenir els diferents Mapes de Dispersió canviem l’angle d’incidència de la radiació respecte el cristall.
4). L’esfera d’Ewald és l’espai real que delimita el cristall.
a). 1,2,3
b). 1,3
c). 2,4
d). 4
e). 1,2,3,4
4-Què és el mapa de Patterson?
a). És la representació en l’espai de la densitat electrònica de la nostra proteïna.
b). S’utilitza en el procés de refinament.
c). Les dues anteriors són correctes
d). És un mapa de vectors de les distàncies entre els centres electrònics.
e). Totes són correctes.
PEMs
5-Quin dels següents no és un dels mètodes per resoldre el problema de les fases?
a). Multiwavelenght Anomalous Diffraction (MAD)
b). Molecular Replacement (MR)
c). Multiple Isomorphus Replacement (MIR)
d). Molecular Multiwavelenght Replacement (MMR)
e). Determinació directa
6-Quina o quines de les següents afirmacions sobre el Multiple Isomorphus Replacement (MIR) és falsa?
1). Requereix l’ús de metalls pesats.
2). Com a mínim cal l’obtenció de dos cristalls derivats diferents.
3). A l’inici, del factor d’estructura (vector) de la nostra proteïna i del derivat, només en coneixem el mòdul
4). Aquest mètode només es fa servir quan disposem d’informació sobre l’estructura de la proteïna.
a). 1,2,3
b). 1,3
c). 2,4
d). 4
e). 1,2,3,4
PEMs
7-Referent als mètodes per resoldre el problema de les fases:
a). En el Multiwavelenght Anomalous Diffraction (MAD) s’utilitzen metalls que donen lloc a patrons de difracció diferents depenent de la longitud d’ona amb la que han estat irradiats.
b). En el Molecular Replacement (MR) es busca maximitzar el valor de R mitjançant les funcions de rotació i translació.
c). Les dues anteriors són falses.
d). En el Multiwavelenght Anomalous Diffraction (MAD), com a mínim cal l’obtenció de dos cristalls derivats diferents.
e). Totes les respostes són falses.
8-Pel que fa al procés de refinament, quins recursos podem utilitzar per millorar el model?
a). Afegir molècules d’aigua.
b). Fer una dinàmica restringida a la densitat electrònica.
c). Les dues anteriors són correctes.
d). Aplicar les funcions de rotació i translació.
e). Totes les anteriors són correctes.
PEMs
9-Quin o quins són els passos més problemàtics en el procés de determinació de l’estructura tridimensional d’una proteïna per cristal·lografia per raigs X?
a). Determinació de la fase
b). Formació del cristall
c). Les dues anteriors són correctes
d). Obtenir la funció de dispersió
e). Totes són correctes
10-Quina o quines de les següents afirmacions sobre la Cristal·lografia de proteïnes és correcta:
1). S’obté un alt grau de resolució estructural a nivell atòmic.
2). Es necessiten cristalls de molt bona qualitat.
3). Cal una gran quantitat de proteïna purificada.
4). S’obtenen resultats a mitjà-llarg plaç.
a). 1,2,3
b). 1,3
c). 2,4
d). 4
e). 1,2,3,4