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CRISPR/Cas9: passo-a-passo do desenho do gRNA
Irene Yan
LABORATÓRIO DE EMBRIOLOGIA MOLECULAR DE VERTEBRADOSDept Biologia Celular e do Desenvolvimeneto ICB USP
Afinal, o que é CRISPR?Para ler papers
Quero usar mas não faço BiomolReagentes prêt-à-porter
Vou desenhar meus próprios gRNAs!Benchling
1.O que é o sistema CRISPR e como ele funciona
2.Variações da enzima Cas9 e suas aplicações
3.Os elementos necessários para experimento CRISPR/Cas9• Deleção • Recombinação
4.Desenho experimental
Genscript
CRISPR significa “Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats” e originalmente foi identificado como parte do sistema de defesa bacteriano
https://sciencebasedmedicine.org/the-promise-of-crispr/
É um sistema simples que permite a identificação e edição de alvos genômicos através de um gRNA (guide RNA)
Non-homologous End Joining Homology Directed Repair
https://www.ucl.ac.uk/cancer/research/scientific-facilities-and-services/cancer-genomics-engineering-facility/crispr
O SISTEMA CRISPR/Cas9 NECESSITA DE:
•Nuclease Cas9•crRNAde 20nt- complementar ao sítio a ser clivado e determinado pelo usuário•trcRNA- RNA estrutural que encaixa o crRNA na nuclease
Tamanho do genoma humano: 3.0 ×109 bpProbabilidade de uma sequência de 20bp: 1 em 1012
gRNA
gRNA
Existem outras nucleases que podem alterar o genoma em alvos-específicos, mas CRISPR é o mais popular.
siRNA ou CRISPR? Depende do seu objetivo
Boettcher, M. and McManus, M. T. (2015). Choosing the Right Tool for the Job: RNAi, TALEN, or CRISPR. Mol. Cell 58, 575–585.
Front. Genet., 24 September 2015 | https://doi.org/10.3389/fgene.2015.00300
Targets different splice forms Transfection is easier
siRNA ou CRISPR? Depende do seu objetivo
Doesn t́Transfection is harder
1.O que é o sistema CRISPR e como ele funciona
2.Variações da enzima Cas9 e suas aplicações
3.Os elementos necessários para experimento CRISPR/Cas9
As diversas aplicações do sistema Cas9/CRISPR são variações da utilização da capacidade “achar”.
As diversas aplicações do sistema Cas9/CRISPR são variações da utilização da capacidade “achar”.
Indel
Inserção ou substituição
Deleção ou rearranjo
Ativação gênica
Modificação Epigenômica
Microscopia
Nat Biotechnol. 2014 April ; 32(4): 347–355
As diversas aplicações que surgem do Cas9 e seus variantes:
SCIENCE
SCIENCE
1.O que é o sistema CRISPR e como ele funciona
2.Variações da enzima Cas9 e suas aplicações
3.Os elementos necessários para experimento CRISPR/Cas9• Deleção • Recombinação
4.Desenho experimental
https://sciencebasedmedicine.org/the-promise-of-crispr/
É um sistema simples que permite a identificação e edição de alvos genômicos através de um gRNA (guide RNA)
Development 2018 145: dev160333
Cada evento de edição gera produtos distintos que variam de deleções a substutições.
https://www.ucl.ac.uk/cancer/research/scientific-facilities-and-services/cancer-genomics-engineering-facility/crispr
O SISTEMA CRISPR/Cas9 NECESSITA DE:
•Nuclease Cas9•crRNAde 20nt- complementar ao sítio a ser clivado e determinado pelo usuário•trcRNA- RNA estrutural que encaixa o crRNA na nuclease
Tamanho do genoma humano: 3.0 ×109 bpProbabilidade de uma sequência de 20bp: 1 em 1012
gRNA
gRNA
https://www.ucl.ac.uk/cancer/research/scientific-facilities-and-services/cancer-genomics-engineering-facility/crispr
Condições para elaboração do crRNA de 20nt:
1. Estar próximo de um sítio PAM (Protospacer Adjacent Motif): NGG2. Ter um baixa probabilidade de reconhecimento off-target*
Tamanho do genoma humano: 3.0 ×109 bpProbabilidade de uma sequência de 20bp: 1 em 1012
CONHECENDO SEU PLASMÍDEO
Produz:1mRNA que codifica: Cas9-(peptídeo 2A)-GFP1gRNA
GFP
Produz:1) gRNA2) Cas9-(peptídeo 2A)-GFP
E este? Tem tudo?
PROBLEMA :Não há sequência PAM perto da região que quero editar.
E, caso não haja um PAM tradicional, existem variantes de Cas9 que usam PAM alternativos
www.addgene.org
1.O que é o sistema CRISPR e como ele funciona
2.Variações da enzima Cas9 e suas aplicações
3.Os elementos necessários para experimento CRISPR/Cas9• Deleção • Recombinação
4.Desenho experimental
https://sciencebasedmedicine.org/the-promise-of-crispr/
Recombinação homólogaPode ser usada para:• Adicionar epítopos (FLAG, HA)• Mutação pontual
Para adição de dominios/proteínas ao genoma, a RECOMBINAÇÃO HOMÓLOGA deve ocorrer depois da ação de Cas9
Ineficiente1%-10%(maior na fase S)
Eficiente >50%
O HDR pode ser usado para mutações pontuais ou fusão de epítopos
Precisa do:
gRNA
Inserto* (e.g. troca de bases, FLAG, GFP)
Braços de homologia
10-100pb do sítio da quebraComprimento de 40-800pb (depende do tamanho do inserto a se incorporado
2. Recombinação
1. Corte
Transfecção
• Cotransfecção de:• Plasmídeo de corte (Cas9 + gRNA)• Plasmídeo de recombinação (braços de
homologia e elemento a ser inserido)
Verificar transfecção
• GFP• RFP
Seleção da recombinação
• Puromicina
• Mais eficaz quando usa 2 gRNA• Edição de tamanho controlado• Mais específico (menos off-targets)• Melhor para recombinações
Schaeffer, S.M., & Nakata, P.A. (2015). Plant science : an
international journal of experimental plant biology, 240, 130-42.
O uso da Cas9 nickase (Cas9 D10A)
Ran, F. A.et al. (2013)Cell 154, 1380–1389.
O uso da Cas9D10A em conjunto com diversas gRNAs aumenta a eficácia e espeficidade da HDR
Cas9 para ativação e inativação de transcrição
Neste caso, o gRNA reconhece a região promotora
1.O que é o sistema CRISPR e como ele funciona
2.Variações da enzima Cas9 e suas aplicações
3.Os elementos necessários para experimento CRISPR/Cas9• Deleção • Recombinação
4.Desenho experimental
• Transfecção e• Seleção
• Clones únicos• Genotipagem
• qPCR para marcadores
www.genecopeia.com
a b
CRISPR com corte duplo/ double nickase
No sítio genômico do Scrt2
Estratégia de remoção de SCRATCH2 do genoma de células-tronco: Edição dupla
QUE REGIÃO PROTEICA EDITAR?Alinhamento de proteínas
A REGIÃO GENÔMICA É EXCLUSIVA?BLAST de exons
Desenho do gRNA
Desenho dos primers para validação
Tatiane Kanno
O plasmídeo pX330-eGFP contém :•FLAG-Cas9/CRISPR, •GFP e •sítio de clonagem do gRNA•Resistência a Puromicina
O desenho dos gRNAs foram feitos pelo crispr.mit.edu
As sugestões de gRNAs são classificadas de acordo com o índice de off-target (fora-de-alvo)
a b
No sítio genômico do Scrt2
Estratégia de remoção de SCRATCH2 do genoma de células-tronco: edição dupla
a
b
http://crispr.mit.edu/
Foram transfectados 2 plasmídeos, cada um contendo um gRNA distinto (a e b)
O plasmídeo pX330-eGFP contém o Cas9/CRISPR, GFP e sítio de clonagem do gRNA
GF
PF
LA
G-C
as9
Thiago M. Sanches
Pool
A deleção de SCRATCH2 (150pb) foi confirmada por PCR genômico
Tatianne Kano
… e qPCR
Tatianne Kano
SCRATCH EXON 2 HOMOLOGY ARM
EXON 2 HOMOLOGY ARM
SCRATCH EXON 2 HOMOLOGY ARM
Sequência genômica
Sequência doadora no pFETCH
Genoma modificado
O Cas9 nesta situação é usado para gerar uma quebra na região em que a recombinação deve ocorrer.
SCRATCH- Neomycin Resistance
Financeiro:
Para um laboratório que já faz Biologia Molecular e transfecção celular: • BbsI: USD 172• gRNA (dois oligos) : R$300• Plasmídeo peX330: USD 65• Midiprep• Enzimas de restrição• Método de delivery (transfecção)
Tempo:
•Clonagem (1-2 semana)• PCR de colônia (primers U6 e gRNA)e Sequenciamento (1 semana)
•Transfecção e seleção de clones (2-3 semanas)•Ampliação das colônias (variável)•Validação (1-2 semanas)
QUAL O CUSTO DO PROCEDIMENTO?
http://www.sbg.org.br/livraria-sbg
www.addgene.org
www.GenScript.com