Cover Laporan Praktikum Asf1
-
Upload
mia-riswani -
Category
Documents
-
view
266 -
download
0
description
Transcript of Cover Laporan Praktikum Asf1
TUGAS
BIOTEKNOLOGI
DISUSUN OLEH
Anggota 1 NANDA SURYANING ROHMA 122210101032
2 YASMIN 122210101034
3 MIA RISWANI 122210101042
4 GALUH SINOARSIH 122210101050
Dosen Evi Umayah Ulfa SSi MSi Apt
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS JEMBER
2014
SOAL
1 Sebutkan macam-macam vektor
2 Gambarkan 1 macam contoh vektor dan beri penjelasannya
3 Bagaimana cara memasukkan vektor dan DNA sisipan yang sudah bersatu kedalam inang
4 Bagaimana cara seleksi
5 Bagaimana cara deteksi
JAWABAN
1 Vektor adalah Media untuk dan memperbanyak dan mentransformasi fragmen DNA
Persyaratan suatu vektor yaitu
Replikasi autonom dalam inang
Berpenanda untuk seleksi
Berposisi kloning tunggal
Berberat molekul kecil
Memiliki beberapa kopi pada setiap sel
Tidak berkonjugasi
Contoh dari vektor yaitu
a PLASMID
Plasmid adalah dna ekstrakromosomal berbentuk sirkular tertutup berpita ganda
Karakteristik plasmid yaitu
Replikasi (autonom)
Ekstra kromosom
Stabil
Ukuran 1-300 kb
Jenis-jenis plasmid yaitu
o F-plasmid F adalah singkatan dari fertility Plasmid ini mengandung perangkat gen-
gen tra (fertilitasrarrkonjugasi)
o R-plasmid R adalah singkatan dari resistance (resistensirarrantibiotika)
o Col-plasmid adalah plasmid yang mengandung gen yang mengkode produksi
senyawa bakteriosin (ColE1 dari Ecoli)
o Degradative plasmid plasmid yang dapat mencerna beberapa senyawa yang tidak
umum seperti toluene atau asam salisilat (TOL dari Pseudomonas putida)
o Virulence plasmid adalah plasmid yang dapat menyebabkan (Ti plasmid Tumour
inducing plasmide)
b FAGE
Fage (bakteriofage) merupakan virus yang menginfeksi bakteri tersusun atas molekul
DNA yang membawa beberapa gen dan kapsid (molekul protein yang membungkus)
- Fage λ
Bentuk kepala dan ekor
Siklus hidup (1) lisis (2) lisogeni
Ukuran genom 49 kb utas ganda
Kedua ujung situs cosrarr(1) sirkuler (2) situs pemotongan
- Fage M13
Bentuk batangfilamen
Ukuran genom 6407 kb linier
Perbanyakan tanpa lisis sel inang
c COSMID
Cosmid merupakan vektor yang dikembangkan dari plasmid dilengkapi dengan sekuen
Cos Selain memiliki gen Cos juga memiliki gen Ori yang memungkinkan untuk bisa
bereplikasi didalam E coli Istilah cosmid diperkenalkan pertama kali oleh Collins dan
Hohn (1978)
Karakteristik cosmid yaitu
Sekuen cos berasal dari phage λ yang merupakan sekuen berpita tunggal
Adanya sekuen cos memungkinkan cosmid untuk masuk kedalam struktur
bakteriophage sehingga dapat dimasukkan kedalam sel bakteri
Vektor cosmid biasanya banyak dipergunakan dalam penyusunan pustaka DNA
dengan ukuran 37 sampai 57 kb
Fragmen cosmid itu sendiri hanya 4-9 kb
d YAC (Yeast Artificial Chromosome)
- Kromosom buatan dari khamir
- Butuh kloning dengan kapasitas besar
Gen faktor VIII pada manusia yang mengkode faktor defisiensi koagulasi
(pembekuan) darah pada jenis hemopilia A memiliki ukuran 190 kb
sifat bithorax pada Drosophila yang berfungsi dalam regulasi perkembangan pola
segmentasi dada membentang sepanjang 320 kb
- Dikembangkan oleh Burke et al (1987)
- Karakteristik penting plasmid YAC yaitu
Dikembangkan dari plasmid pBR322
Memiliki komponen gen yeast SUP4 7RP1 HIS3 dan URA3
Kloning pada sisi gen SUP4 (supressor untuk pengendali gen tRNA tyrosin)
Host (inang) yang digunakan untuk transformasi adalah spheroplast sel yeast
e BAC (Bacterial Artificial Chromosome)
- Kromosom buatan dari bakteri
- Plasmid yang dilengkapi dengan faktor F
- Mengandung
oriS repE ndash F replikasi dan pengaturan jumlah salinan plasmid di dalam sel
inang
parA and parB pembagian plasmid F kedalam sel anak dan menjamin stabilitas
insersi
- Kisaran kapasitas kloning vektor BAC adalah 150 sampai 350 kb (bisa capai 700 kb)
- Dapat membawa sisipan DNA berukuran besar
- Konstruksi pustaka genom
2 Vektor Pengklonan pGEM-T Easy Plasmid pGEM-T Easy (Gambar3) merupakan
plasmid sirkular terbuka memiliki dua buah origin of replication dan gen ketahanan
terhadap ampisilin (Amp) Plasmid ini mengandung multy cloning site Karena memiliki
kelebihan timin yang menggantung di ujung terbuka plasmid ( T overhang) plasmid ini
sering dipakai sebagai vektor untuk produk PCR yang selalu memiliki kelebihan adenin
pada ujungnya tanpa memerlukan tahapan pemotongan terlebih dahulu Plasmid pGEM-T
Easy juga termasuk plasmid high copy number yang cocok untuk menyimpan gen insert
dalam suatu inang (Kendrew amp Lawrence 1994)
Selain itu pGEM-T Easy merupakan vektor yang berukuran kecil yaitu 3015 bp Ukuran
tersebut relatif kecil sehingga vektor dapat membawa DNA target cukup banyak dan
memudahkan preparasi DNA sisipan dalam jumlah besar Vektor berukuran kecil lebih
mudah dimasukkan ke dalam sel inang dan lebih mudah dimurnikan karena cenderung
tidak rapuh dibandingkan dengan vektor berukuran besar ( Sambrook et al 1991)
Gambar 3 Profil vektor pengklonan pGEM-T Easy
Vektor Ekspresi pCAMBIA 1303
DNA vektor adalah molekul DNA yang dapat bereplikasi secara mandiri dan dapat
digunakan sebagai pembawa molekul DNA lain yang tidak memiliki kemampuan
bereplikasi sendiri di dalam sel DNA yang sering digunakan adalah plasmid bakteri
Plasmid adalah bahan genetik ekstrakromosom yang diwariskan secara tetap Ciri-ciri
plasmid antara lain berukuran kecil dan hanya mengandung beberapa gen membawa
informasi genetik terlepas dari DNA kromosom atau kadang-kadang dapat berintegrasi
dengan DNA kromosom dan dapat diisolasi dengan mudah dari sel bakteri Ciri lain
plasmid adalah mempunyai situs untuk memulai replikasi yang disebut ORI (origin of
replication) (Nicholl 1994)
Plasmid pCAMBIA 1303 merupakan plasmid yang dikonstruksi sebagai vektor DNA
dalam metode transformasi langsung dan menggunakan Agrobacterium tumefaciens
Plasmid pCAMBIA 1303 mengandung promotor CaMV 35S (cauliflower mosaic virus)
Promotor ini berhubungan dengan urutan yang terpoliadenilasi pada T-DNA plasmid Hal
ini memungkinkan pembuatan klon langsung ke dalam T-DNA plasmid Tersedianya
promotor aktif yang kuat sangat diperlukan untuk ekspresi suatu gen pada tanaman baik
monokotil maupun dikotil Beberapa hasil penelitian menyatakan bahwa CaMV35S adalah
promotor konstitutif yang aktif pada sel tanaman monokotil akan tetapi kekuatannya
sedikit menurun pada sel tumbuhan dikotil dan tidak aktif pada beberapa tipe sel seperti
pollen (Tzfira amp Citovsky 2002) Selain itu pCAMBIA 1303 mempunyai gen gusA Gen
gusA (1049109-glucuronidase) dalam plasmid pCAMBIA 1303 berfungsi sebagai gen reporter
untuk memonitor proses transformasi dan introduksi gen yang direkayasa (Tzfira amp
Citovsky 2002)
Peta restriksi pCAMBIA 1303
3 Cara memasukkan materigenetik kedalam sel inang yaitu
Transformasi ialah pemindahan sebagian materi genetik atau DNA atau hanya satu
gen bakteri ke bakteri lain dengan proses fisiologi yang kompleks Proses ini pertama
ditemukan Frederick Griffith tahun 1982 Contoh Streptococcus pnemoniaeu
Haemophillus Bacillus Diguga transformasi ini merupakan cara bakteri menularkan
sifatnya ke bakteri lain Misalnya bakteri patogen yang semula tidak kebal antibiotik
dapat berubah menjadi kebal antibiotik karena transformasi
Transduksi pemindahan materi genetik dengan perantara virus Virus dapat
menyambungkan materi genetiknya ke DNA bakteri dan membentuk profag Ketika
terbentuk virus baru di dalam DNA virus sering terbawa sepenggal DNA bakteri yang
diinfeksinya Virus yang terbentuk memiliki dua macam DNA yang dikenal partikel
transduksi (transducing particle) Cara ini dikemukakan oleh Norton Zinder dan
Jashua Lederberg
Konjugasi merupakan pemindahan sebagian materi genetika dari satu bakteri ke
bakteri lain melalui suatu kontak langsung Artinya terjadi transfer DNA dari sel
bakteri donor ke sel bakteri penerima melalui ujung pilus Ujung pilus akan melekat
pada sel peneima dan DNA dipindahkan melalui pilus tersebut Kemampuan sel donor
memindahkan DNA dikontrol oleh faktor pemindahan ( transfer faktor = faktor F )
4 Salah satu seleksi yaitu Seleksi biru putih atau blue-white screening adalah salah satu
metode untuk mengidentifikasi keberhasilan kloning dan transformasi Metode ini
merupakan salah satu metode seleksi sel hasil kloning dan termasuk metode seleksi
berdasarkan warna Untuk proses seleksi ini digunakan enzim β-galaktosidase β-
galaktosidase adalah enzim yang dihasilkan dari ekspresi gen lacZ Gen ini diatur
ekspresinya oleh operon lac Aktivator untuk ekspresi gen ini adalah molekul laktosa yang
dalam jumlah tertentu dapat menginduksi terekspresinya gen lacZ
Mekanisme
Proses seleksi ini memanfaatkan sifat dari enzim β-galaktosidase yaitu enzim yang terdiri
dari 2 subunit yaitu peptida α dan peptida ω Untuk menjadi suatu enzim yang fungsional
enzim ini memerlukan kedua peptidanya untuk berikatan dan membentuk enzim yang
dapat memecah substrat laktosa atau X-gal Gen penyandi peptida ω biasanya terdapat
pada kromosom sedangkan gen penyandi peptida α terdapat pada plasmid Bila hanya
ada peptida ω yang diekspresikan oleh gen pada kromosom maka tidak akan ada
pemecahan laktosa atau X-gal Namun bila terjadi komplementasi oleh peptida α
maka laktosa atau X-gal dapat dipecah oleh enzim β-galaktosidase yang terbentuk
sempurna Oleh karena itu komplementasi α dapat membantu untuk proses seleksi biru-
putih sebagai indikator keberhasilan kloning atau transformasi Pada MCS terdapat gen
lacZ mengkode galaktosidase DNA sisipan akan merusak gen lacZ sehingga galaktosidase
tidak diproduksi dan X-gal tidak diuraika berwarna putih
X- GALrarr biru
X ndashGAL rarr tidak diuraikan putih
5 Deteksi Keberadaan DNA sisipan antara lain
Elektroforesis gel (analisis migrasi analisis restriksi PCR) dan penentuan urutan DNA
Seleksi sel rekombinan yang membawa fragmen yang diinginkan dilakukan dengan
mencari fragmen tersebut menggunakan fragmen pelacak (probe) yang pembuatannya
dilakukan secara in vitro menggunakan teknik reaksi polimerisasi berantai atau polymerase
chain reactin (PCR) Pelacakan fragmen yang diinginkan antara lain dapat dilakukan
melalui cara hibridisasi koloni Koloni-koloni sel rekombinan ditransfer ke membrane
nilon di lisis agar isi selnya keluar dibersihkan protein dan remukan sel lainnya hingga
tinggal tersisa DNAnya saja Selanjutnya dilakukan fiksasi DNA dan perendaman di
dalam larutan pelacak Posisi-posisi DNA yang terhibridisasi oleh fragmen pelacak
dikocokkan dengan posisi koloni pada kultur awal (master plate) Dengan demikian kita
bisa menentukan koloni-koloni sel rekombinan yang membawa fragmen yang diinginkan
REFERENSI
Gupta PK 2008 Molecular Biology and Genetic Engineering New Delhi Rastogi
Nicholl DST 1994 An Introduction to Genetic Engineering New York Cambridge
University Press
Kendrew SJ Lawrence E 1994 The Encyclopedia of Molecular Biology Cambridge
Blackwell Science
Sambbrook J Russell DW 2001 Molecular Cloning A Laboratory Manual Ed ke-3 New
York Cold Spring Harbor Laboratory
Tzfira T Citovsky V 2002 Partners-ininfection host proteins involved in the transformation
of plant cells by Agrobacterium Trends in Cell Biology 12 121ndash130
- Mekanisme
- Proses seleksi ini memanfaatkan sifat dari enzim β-galaktosidase yaitu enzim yang terdiri dari 2 subunit yaitu peptida α dan peptida ω Untuk menjadi suatu enzim yang fungsional enzim ini memerlukan kedua peptidanya untuk berikatan dan membentuk enzim yang dapat memecah substrat laktosa atau X-gal Gen penyandi peptida ω biasanya terdapat pada kromosom sedangkan gen penyandi peptida α terdapat pada plasmid Bila hanya ada peptida ω yang diekspresikan oleh gen pada kromosom maka tidak akan ada pemecahan laktosa atau X-gal Namun bila terjadi komplementasi oleh peptida α maka laktosa atau X-gal dapat dipecah oleh enzim β-galaktosidase yang terbentuk sempurna Oleh karena itu komplementasi α dapat membantu untuk proses seleksi biru-putih sebagai indikator keberhasilan kloning atau transformasi Pada MCS terdapat gen lacZ mengkode galaktosidase DNA sisipan akan merusak gen lacZ sehingga galaktosidase tidak diproduksi dan X-gal tidak diuraika berwarna putih
- X- GALrarr biru
- X ndashGAL rarr tidak diuraikan putih
-
SOAL
1 Sebutkan macam-macam vektor
2 Gambarkan 1 macam contoh vektor dan beri penjelasannya
3 Bagaimana cara memasukkan vektor dan DNA sisipan yang sudah bersatu kedalam inang
4 Bagaimana cara seleksi
5 Bagaimana cara deteksi
JAWABAN
1 Vektor adalah Media untuk dan memperbanyak dan mentransformasi fragmen DNA
Persyaratan suatu vektor yaitu
Replikasi autonom dalam inang
Berpenanda untuk seleksi
Berposisi kloning tunggal
Berberat molekul kecil
Memiliki beberapa kopi pada setiap sel
Tidak berkonjugasi
Contoh dari vektor yaitu
a PLASMID
Plasmid adalah dna ekstrakromosomal berbentuk sirkular tertutup berpita ganda
Karakteristik plasmid yaitu
Replikasi (autonom)
Ekstra kromosom
Stabil
Ukuran 1-300 kb
Jenis-jenis plasmid yaitu
o F-plasmid F adalah singkatan dari fertility Plasmid ini mengandung perangkat gen-
gen tra (fertilitasrarrkonjugasi)
o R-plasmid R adalah singkatan dari resistance (resistensirarrantibiotika)
o Col-plasmid adalah plasmid yang mengandung gen yang mengkode produksi
senyawa bakteriosin (ColE1 dari Ecoli)
o Degradative plasmid plasmid yang dapat mencerna beberapa senyawa yang tidak
umum seperti toluene atau asam salisilat (TOL dari Pseudomonas putida)
o Virulence plasmid adalah plasmid yang dapat menyebabkan (Ti plasmid Tumour
inducing plasmide)
b FAGE
Fage (bakteriofage) merupakan virus yang menginfeksi bakteri tersusun atas molekul
DNA yang membawa beberapa gen dan kapsid (molekul protein yang membungkus)
- Fage λ
Bentuk kepala dan ekor
Siklus hidup (1) lisis (2) lisogeni
Ukuran genom 49 kb utas ganda
Kedua ujung situs cosrarr(1) sirkuler (2) situs pemotongan
- Fage M13
Bentuk batangfilamen
Ukuran genom 6407 kb linier
Perbanyakan tanpa lisis sel inang
c COSMID
Cosmid merupakan vektor yang dikembangkan dari plasmid dilengkapi dengan sekuen
Cos Selain memiliki gen Cos juga memiliki gen Ori yang memungkinkan untuk bisa
bereplikasi didalam E coli Istilah cosmid diperkenalkan pertama kali oleh Collins dan
Hohn (1978)
Karakteristik cosmid yaitu
Sekuen cos berasal dari phage λ yang merupakan sekuen berpita tunggal
Adanya sekuen cos memungkinkan cosmid untuk masuk kedalam struktur
bakteriophage sehingga dapat dimasukkan kedalam sel bakteri
Vektor cosmid biasanya banyak dipergunakan dalam penyusunan pustaka DNA
dengan ukuran 37 sampai 57 kb
Fragmen cosmid itu sendiri hanya 4-9 kb
d YAC (Yeast Artificial Chromosome)
- Kromosom buatan dari khamir
- Butuh kloning dengan kapasitas besar
Gen faktor VIII pada manusia yang mengkode faktor defisiensi koagulasi
(pembekuan) darah pada jenis hemopilia A memiliki ukuran 190 kb
sifat bithorax pada Drosophila yang berfungsi dalam regulasi perkembangan pola
segmentasi dada membentang sepanjang 320 kb
- Dikembangkan oleh Burke et al (1987)
- Karakteristik penting plasmid YAC yaitu
Dikembangkan dari plasmid pBR322
Memiliki komponen gen yeast SUP4 7RP1 HIS3 dan URA3
Kloning pada sisi gen SUP4 (supressor untuk pengendali gen tRNA tyrosin)
Host (inang) yang digunakan untuk transformasi adalah spheroplast sel yeast
e BAC (Bacterial Artificial Chromosome)
- Kromosom buatan dari bakteri
- Plasmid yang dilengkapi dengan faktor F
- Mengandung
oriS repE ndash F replikasi dan pengaturan jumlah salinan plasmid di dalam sel
inang
parA and parB pembagian plasmid F kedalam sel anak dan menjamin stabilitas
insersi
- Kisaran kapasitas kloning vektor BAC adalah 150 sampai 350 kb (bisa capai 700 kb)
- Dapat membawa sisipan DNA berukuran besar
- Konstruksi pustaka genom
2 Vektor Pengklonan pGEM-T Easy Plasmid pGEM-T Easy (Gambar3) merupakan
plasmid sirkular terbuka memiliki dua buah origin of replication dan gen ketahanan
terhadap ampisilin (Amp) Plasmid ini mengandung multy cloning site Karena memiliki
kelebihan timin yang menggantung di ujung terbuka plasmid ( T overhang) plasmid ini
sering dipakai sebagai vektor untuk produk PCR yang selalu memiliki kelebihan adenin
pada ujungnya tanpa memerlukan tahapan pemotongan terlebih dahulu Plasmid pGEM-T
Easy juga termasuk plasmid high copy number yang cocok untuk menyimpan gen insert
dalam suatu inang (Kendrew amp Lawrence 1994)
Selain itu pGEM-T Easy merupakan vektor yang berukuran kecil yaitu 3015 bp Ukuran
tersebut relatif kecil sehingga vektor dapat membawa DNA target cukup banyak dan
memudahkan preparasi DNA sisipan dalam jumlah besar Vektor berukuran kecil lebih
mudah dimasukkan ke dalam sel inang dan lebih mudah dimurnikan karena cenderung
tidak rapuh dibandingkan dengan vektor berukuran besar ( Sambrook et al 1991)
Gambar 3 Profil vektor pengklonan pGEM-T Easy
Vektor Ekspresi pCAMBIA 1303
DNA vektor adalah molekul DNA yang dapat bereplikasi secara mandiri dan dapat
digunakan sebagai pembawa molekul DNA lain yang tidak memiliki kemampuan
bereplikasi sendiri di dalam sel DNA yang sering digunakan adalah plasmid bakteri
Plasmid adalah bahan genetik ekstrakromosom yang diwariskan secara tetap Ciri-ciri
plasmid antara lain berukuran kecil dan hanya mengandung beberapa gen membawa
informasi genetik terlepas dari DNA kromosom atau kadang-kadang dapat berintegrasi
dengan DNA kromosom dan dapat diisolasi dengan mudah dari sel bakteri Ciri lain
plasmid adalah mempunyai situs untuk memulai replikasi yang disebut ORI (origin of
replication) (Nicholl 1994)
Plasmid pCAMBIA 1303 merupakan plasmid yang dikonstruksi sebagai vektor DNA
dalam metode transformasi langsung dan menggunakan Agrobacterium tumefaciens
Plasmid pCAMBIA 1303 mengandung promotor CaMV 35S (cauliflower mosaic virus)
Promotor ini berhubungan dengan urutan yang terpoliadenilasi pada T-DNA plasmid Hal
ini memungkinkan pembuatan klon langsung ke dalam T-DNA plasmid Tersedianya
promotor aktif yang kuat sangat diperlukan untuk ekspresi suatu gen pada tanaman baik
monokotil maupun dikotil Beberapa hasil penelitian menyatakan bahwa CaMV35S adalah
promotor konstitutif yang aktif pada sel tanaman monokotil akan tetapi kekuatannya
sedikit menurun pada sel tumbuhan dikotil dan tidak aktif pada beberapa tipe sel seperti
pollen (Tzfira amp Citovsky 2002) Selain itu pCAMBIA 1303 mempunyai gen gusA Gen
gusA (1049109-glucuronidase) dalam plasmid pCAMBIA 1303 berfungsi sebagai gen reporter
untuk memonitor proses transformasi dan introduksi gen yang direkayasa (Tzfira amp
Citovsky 2002)
Peta restriksi pCAMBIA 1303
3 Cara memasukkan materigenetik kedalam sel inang yaitu
Transformasi ialah pemindahan sebagian materi genetik atau DNA atau hanya satu
gen bakteri ke bakteri lain dengan proses fisiologi yang kompleks Proses ini pertama
ditemukan Frederick Griffith tahun 1982 Contoh Streptococcus pnemoniaeu
Haemophillus Bacillus Diguga transformasi ini merupakan cara bakteri menularkan
sifatnya ke bakteri lain Misalnya bakteri patogen yang semula tidak kebal antibiotik
dapat berubah menjadi kebal antibiotik karena transformasi
Transduksi pemindahan materi genetik dengan perantara virus Virus dapat
menyambungkan materi genetiknya ke DNA bakteri dan membentuk profag Ketika
terbentuk virus baru di dalam DNA virus sering terbawa sepenggal DNA bakteri yang
diinfeksinya Virus yang terbentuk memiliki dua macam DNA yang dikenal partikel
transduksi (transducing particle) Cara ini dikemukakan oleh Norton Zinder dan
Jashua Lederberg
Konjugasi merupakan pemindahan sebagian materi genetika dari satu bakteri ke
bakteri lain melalui suatu kontak langsung Artinya terjadi transfer DNA dari sel
bakteri donor ke sel bakteri penerima melalui ujung pilus Ujung pilus akan melekat
pada sel peneima dan DNA dipindahkan melalui pilus tersebut Kemampuan sel donor
memindahkan DNA dikontrol oleh faktor pemindahan ( transfer faktor = faktor F )
4 Salah satu seleksi yaitu Seleksi biru putih atau blue-white screening adalah salah satu
metode untuk mengidentifikasi keberhasilan kloning dan transformasi Metode ini
merupakan salah satu metode seleksi sel hasil kloning dan termasuk metode seleksi
berdasarkan warna Untuk proses seleksi ini digunakan enzim β-galaktosidase β-
galaktosidase adalah enzim yang dihasilkan dari ekspresi gen lacZ Gen ini diatur
ekspresinya oleh operon lac Aktivator untuk ekspresi gen ini adalah molekul laktosa yang
dalam jumlah tertentu dapat menginduksi terekspresinya gen lacZ
Mekanisme
Proses seleksi ini memanfaatkan sifat dari enzim β-galaktosidase yaitu enzim yang terdiri
dari 2 subunit yaitu peptida α dan peptida ω Untuk menjadi suatu enzim yang fungsional
enzim ini memerlukan kedua peptidanya untuk berikatan dan membentuk enzim yang
dapat memecah substrat laktosa atau X-gal Gen penyandi peptida ω biasanya terdapat
pada kromosom sedangkan gen penyandi peptida α terdapat pada plasmid Bila hanya
ada peptida ω yang diekspresikan oleh gen pada kromosom maka tidak akan ada
pemecahan laktosa atau X-gal Namun bila terjadi komplementasi oleh peptida α
maka laktosa atau X-gal dapat dipecah oleh enzim β-galaktosidase yang terbentuk
sempurna Oleh karena itu komplementasi α dapat membantu untuk proses seleksi biru-
putih sebagai indikator keberhasilan kloning atau transformasi Pada MCS terdapat gen
lacZ mengkode galaktosidase DNA sisipan akan merusak gen lacZ sehingga galaktosidase
tidak diproduksi dan X-gal tidak diuraika berwarna putih
X- GALrarr biru
X ndashGAL rarr tidak diuraikan putih
5 Deteksi Keberadaan DNA sisipan antara lain
Elektroforesis gel (analisis migrasi analisis restriksi PCR) dan penentuan urutan DNA
Seleksi sel rekombinan yang membawa fragmen yang diinginkan dilakukan dengan
mencari fragmen tersebut menggunakan fragmen pelacak (probe) yang pembuatannya
dilakukan secara in vitro menggunakan teknik reaksi polimerisasi berantai atau polymerase
chain reactin (PCR) Pelacakan fragmen yang diinginkan antara lain dapat dilakukan
melalui cara hibridisasi koloni Koloni-koloni sel rekombinan ditransfer ke membrane
nilon di lisis agar isi selnya keluar dibersihkan protein dan remukan sel lainnya hingga
tinggal tersisa DNAnya saja Selanjutnya dilakukan fiksasi DNA dan perendaman di
dalam larutan pelacak Posisi-posisi DNA yang terhibridisasi oleh fragmen pelacak
dikocokkan dengan posisi koloni pada kultur awal (master plate) Dengan demikian kita
bisa menentukan koloni-koloni sel rekombinan yang membawa fragmen yang diinginkan
REFERENSI
Gupta PK 2008 Molecular Biology and Genetic Engineering New Delhi Rastogi
Nicholl DST 1994 An Introduction to Genetic Engineering New York Cambridge
University Press
Kendrew SJ Lawrence E 1994 The Encyclopedia of Molecular Biology Cambridge
Blackwell Science
Sambbrook J Russell DW 2001 Molecular Cloning A Laboratory Manual Ed ke-3 New
York Cold Spring Harbor Laboratory
Tzfira T Citovsky V 2002 Partners-ininfection host proteins involved in the transformation
of plant cells by Agrobacterium Trends in Cell Biology 12 121ndash130
- Mekanisme
- Proses seleksi ini memanfaatkan sifat dari enzim β-galaktosidase yaitu enzim yang terdiri dari 2 subunit yaitu peptida α dan peptida ω Untuk menjadi suatu enzim yang fungsional enzim ini memerlukan kedua peptidanya untuk berikatan dan membentuk enzim yang dapat memecah substrat laktosa atau X-gal Gen penyandi peptida ω biasanya terdapat pada kromosom sedangkan gen penyandi peptida α terdapat pada plasmid Bila hanya ada peptida ω yang diekspresikan oleh gen pada kromosom maka tidak akan ada pemecahan laktosa atau X-gal Namun bila terjadi komplementasi oleh peptida α maka laktosa atau X-gal dapat dipecah oleh enzim β-galaktosidase yang terbentuk sempurna Oleh karena itu komplementasi α dapat membantu untuk proses seleksi biru-putih sebagai indikator keberhasilan kloning atau transformasi Pada MCS terdapat gen lacZ mengkode galaktosidase DNA sisipan akan merusak gen lacZ sehingga galaktosidase tidak diproduksi dan X-gal tidak diuraika berwarna putih
- X- GALrarr biru
- X ndashGAL rarr tidak diuraikan putih
-
o Degradative plasmid plasmid yang dapat mencerna beberapa senyawa yang tidak
umum seperti toluene atau asam salisilat (TOL dari Pseudomonas putida)
o Virulence plasmid adalah plasmid yang dapat menyebabkan (Ti plasmid Tumour
inducing plasmide)
b FAGE
Fage (bakteriofage) merupakan virus yang menginfeksi bakteri tersusun atas molekul
DNA yang membawa beberapa gen dan kapsid (molekul protein yang membungkus)
- Fage λ
Bentuk kepala dan ekor
Siklus hidup (1) lisis (2) lisogeni
Ukuran genom 49 kb utas ganda
Kedua ujung situs cosrarr(1) sirkuler (2) situs pemotongan
- Fage M13
Bentuk batangfilamen
Ukuran genom 6407 kb linier
Perbanyakan tanpa lisis sel inang
c COSMID
Cosmid merupakan vektor yang dikembangkan dari plasmid dilengkapi dengan sekuen
Cos Selain memiliki gen Cos juga memiliki gen Ori yang memungkinkan untuk bisa
bereplikasi didalam E coli Istilah cosmid diperkenalkan pertama kali oleh Collins dan
Hohn (1978)
Karakteristik cosmid yaitu
Sekuen cos berasal dari phage λ yang merupakan sekuen berpita tunggal
Adanya sekuen cos memungkinkan cosmid untuk masuk kedalam struktur
bakteriophage sehingga dapat dimasukkan kedalam sel bakteri
Vektor cosmid biasanya banyak dipergunakan dalam penyusunan pustaka DNA
dengan ukuran 37 sampai 57 kb
Fragmen cosmid itu sendiri hanya 4-9 kb
d YAC (Yeast Artificial Chromosome)
- Kromosom buatan dari khamir
- Butuh kloning dengan kapasitas besar
Gen faktor VIII pada manusia yang mengkode faktor defisiensi koagulasi
(pembekuan) darah pada jenis hemopilia A memiliki ukuran 190 kb
sifat bithorax pada Drosophila yang berfungsi dalam regulasi perkembangan pola
segmentasi dada membentang sepanjang 320 kb
- Dikembangkan oleh Burke et al (1987)
- Karakteristik penting plasmid YAC yaitu
Dikembangkan dari plasmid pBR322
Memiliki komponen gen yeast SUP4 7RP1 HIS3 dan URA3
Kloning pada sisi gen SUP4 (supressor untuk pengendali gen tRNA tyrosin)
Host (inang) yang digunakan untuk transformasi adalah spheroplast sel yeast
e BAC (Bacterial Artificial Chromosome)
- Kromosom buatan dari bakteri
- Plasmid yang dilengkapi dengan faktor F
- Mengandung
oriS repE ndash F replikasi dan pengaturan jumlah salinan plasmid di dalam sel
inang
parA and parB pembagian plasmid F kedalam sel anak dan menjamin stabilitas
insersi
- Kisaran kapasitas kloning vektor BAC adalah 150 sampai 350 kb (bisa capai 700 kb)
- Dapat membawa sisipan DNA berukuran besar
- Konstruksi pustaka genom
2 Vektor Pengklonan pGEM-T Easy Plasmid pGEM-T Easy (Gambar3) merupakan
plasmid sirkular terbuka memiliki dua buah origin of replication dan gen ketahanan
terhadap ampisilin (Amp) Plasmid ini mengandung multy cloning site Karena memiliki
kelebihan timin yang menggantung di ujung terbuka plasmid ( T overhang) plasmid ini
sering dipakai sebagai vektor untuk produk PCR yang selalu memiliki kelebihan adenin
pada ujungnya tanpa memerlukan tahapan pemotongan terlebih dahulu Plasmid pGEM-T
Easy juga termasuk plasmid high copy number yang cocok untuk menyimpan gen insert
dalam suatu inang (Kendrew amp Lawrence 1994)
Selain itu pGEM-T Easy merupakan vektor yang berukuran kecil yaitu 3015 bp Ukuran
tersebut relatif kecil sehingga vektor dapat membawa DNA target cukup banyak dan
memudahkan preparasi DNA sisipan dalam jumlah besar Vektor berukuran kecil lebih
mudah dimasukkan ke dalam sel inang dan lebih mudah dimurnikan karena cenderung
tidak rapuh dibandingkan dengan vektor berukuran besar ( Sambrook et al 1991)
Gambar 3 Profil vektor pengklonan pGEM-T Easy
Vektor Ekspresi pCAMBIA 1303
DNA vektor adalah molekul DNA yang dapat bereplikasi secara mandiri dan dapat
digunakan sebagai pembawa molekul DNA lain yang tidak memiliki kemampuan
bereplikasi sendiri di dalam sel DNA yang sering digunakan adalah plasmid bakteri
Plasmid adalah bahan genetik ekstrakromosom yang diwariskan secara tetap Ciri-ciri
plasmid antara lain berukuran kecil dan hanya mengandung beberapa gen membawa
informasi genetik terlepas dari DNA kromosom atau kadang-kadang dapat berintegrasi
dengan DNA kromosom dan dapat diisolasi dengan mudah dari sel bakteri Ciri lain
plasmid adalah mempunyai situs untuk memulai replikasi yang disebut ORI (origin of
replication) (Nicholl 1994)
Plasmid pCAMBIA 1303 merupakan plasmid yang dikonstruksi sebagai vektor DNA
dalam metode transformasi langsung dan menggunakan Agrobacterium tumefaciens
Plasmid pCAMBIA 1303 mengandung promotor CaMV 35S (cauliflower mosaic virus)
Promotor ini berhubungan dengan urutan yang terpoliadenilasi pada T-DNA plasmid Hal
ini memungkinkan pembuatan klon langsung ke dalam T-DNA plasmid Tersedianya
promotor aktif yang kuat sangat diperlukan untuk ekspresi suatu gen pada tanaman baik
monokotil maupun dikotil Beberapa hasil penelitian menyatakan bahwa CaMV35S adalah
promotor konstitutif yang aktif pada sel tanaman monokotil akan tetapi kekuatannya
sedikit menurun pada sel tumbuhan dikotil dan tidak aktif pada beberapa tipe sel seperti
pollen (Tzfira amp Citovsky 2002) Selain itu pCAMBIA 1303 mempunyai gen gusA Gen
gusA (1049109-glucuronidase) dalam plasmid pCAMBIA 1303 berfungsi sebagai gen reporter
untuk memonitor proses transformasi dan introduksi gen yang direkayasa (Tzfira amp
Citovsky 2002)
Peta restriksi pCAMBIA 1303
3 Cara memasukkan materigenetik kedalam sel inang yaitu
Transformasi ialah pemindahan sebagian materi genetik atau DNA atau hanya satu
gen bakteri ke bakteri lain dengan proses fisiologi yang kompleks Proses ini pertama
ditemukan Frederick Griffith tahun 1982 Contoh Streptococcus pnemoniaeu
Haemophillus Bacillus Diguga transformasi ini merupakan cara bakteri menularkan
sifatnya ke bakteri lain Misalnya bakteri patogen yang semula tidak kebal antibiotik
dapat berubah menjadi kebal antibiotik karena transformasi
Transduksi pemindahan materi genetik dengan perantara virus Virus dapat
menyambungkan materi genetiknya ke DNA bakteri dan membentuk profag Ketika
terbentuk virus baru di dalam DNA virus sering terbawa sepenggal DNA bakteri yang
diinfeksinya Virus yang terbentuk memiliki dua macam DNA yang dikenal partikel
transduksi (transducing particle) Cara ini dikemukakan oleh Norton Zinder dan
Jashua Lederberg
Konjugasi merupakan pemindahan sebagian materi genetika dari satu bakteri ke
bakteri lain melalui suatu kontak langsung Artinya terjadi transfer DNA dari sel
bakteri donor ke sel bakteri penerima melalui ujung pilus Ujung pilus akan melekat
pada sel peneima dan DNA dipindahkan melalui pilus tersebut Kemampuan sel donor
memindahkan DNA dikontrol oleh faktor pemindahan ( transfer faktor = faktor F )
4 Salah satu seleksi yaitu Seleksi biru putih atau blue-white screening adalah salah satu
metode untuk mengidentifikasi keberhasilan kloning dan transformasi Metode ini
merupakan salah satu metode seleksi sel hasil kloning dan termasuk metode seleksi
berdasarkan warna Untuk proses seleksi ini digunakan enzim β-galaktosidase β-
galaktosidase adalah enzim yang dihasilkan dari ekspresi gen lacZ Gen ini diatur
ekspresinya oleh operon lac Aktivator untuk ekspresi gen ini adalah molekul laktosa yang
dalam jumlah tertentu dapat menginduksi terekspresinya gen lacZ
Mekanisme
Proses seleksi ini memanfaatkan sifat dari enzim β-galaktosidase yaitu enzim yang terdiri
dari 2 subunit yaitu peptida α dan peptida ω Untuk menjadi suatu enzim yang fungsional
enzim ini memerlukan kedua peptidanya untuk berikatan dan membentuk enzim yang
dapat memecah substrat laktosa atau X-gal Gen penyandi peptida ω biasanya terdapat
pada kromosom sedangkan gen penyandi peptida α terdapat pada plasmid Bila hanya
ada peptida ω yang diekspresikan oleh gen pada kromosom maka tidak akan ada
pemecahan laktosa atau X-gal Namun bila terjadi komplementasi oleh peptida α
maka laktosa atau X-gal dapat dipecah oleh enzim β-galaktosidase yang terbentuk
sempurna Oleh karena itu komplementasi α dapat membantu untuk proses seleksi biru-
putih sebagai indikator keberhasilan kloning atau transformasi Pada MCS terdapat gen
lacZ mengkode galaktosidase DNA sisipan akan merusak gen lacZ sehingga galaktosidase
tidak diproduksi dan X-gal tidak diuraika berwarna putih
X- GALrarr biru
X ndashGAL rarr tidak diuraikan putih
5 Deteksi Keberadaan DNA sisipan antara lain
Elektroforesis gel (analisis migrasi analisis restriksi PCR) dan penentuan urutan DNA
Seleksi sel rekombinan yang membawa fragmen yang diinginkan dilakukan dengan
mencari fragmen tersebut menggunakan fragmen pelacak (probe) yang pembuatannya
dilakukan secara in vitro menggunakan teknik reaksi polimerisasi berantai atau polymerase
chain reactin (PCR) Pelacakan fragmen yang diinginkan antara lain dapat dilakukan
melalui cara hibridisasi koloni Koloni-koloni sel rekombinan ditransfer ke membrane
nilon di lisis agar isi selnya keluar dibersihkan protein dan remukan sel lainnya hingga
tinggal tersisa DNAnya saja Selanjutnya dilakukan fiksasi DNA dan perendaman di
dalam larutan pelacak Posisi-posisi DNA yang terhibridisasi oleh fragmen pelacak
dikocokkan dengan posisi koloni pada kultur awal (master plate) Dengan demikian kita
bisa menentukan koloni-koloni sel rekombinan yang membawa fragmen yang diinginkan
REFERENSI
Gupta PK 2008 Molecular Biology and Genetic Engineering New Delhi Rastogi
Nicholl DST 1994 An Introduction to Genetic Engineering New York Cambridge
University Press
Kendrew SJ Lawrence E 1994 The Encyclopedia of Molecular Biology Cambridge
Blackwell Science
Sambbrook J Russell DW 2001 Molecular Cloning A Laboratory Manual Ed ke-3 New
York Cold Spring Harbor Laboratory
Tzfira T Citovsky V 2002 Partners-ininfection host proteins involved in the transformation
of plant cells by Agrobacterium Trends in Cell Biology 12 121ndash130
- Mekanisme
- Proses seleksi ini memanfaatkan sifat dari enzim β-galaktosidase yaitu enzim yang terdiri dari 2 subunit yaitu peptida α dan peptida ω Untuk menjadi suatu enzim yang fungsional enzim ini memerlukan kedua peptidanya untuk berikatan dan membentuk enzim yang dapat memecah substrat laktosa atau X-gal Gen penyandi peptida ω biasanya terdapat pada kromosom sedangkan gen penyandi peptida α terdapat pada plasmid Bila hanya ada peptida ω yang diekspresikan oleh gen pada kromosom maka tidak akan ada pemecahan laktosa atau X-gal Namun bila terjadi komplementasi oleh peptida α maka laktosa atau X-gal dapat dipecah oleh enzim β-galaktosidase yang terbentuk sempurna Oleh karena itu komplementasi α dapat membantu untuk proses seleksi biru-putih sebagai indikator keberhasilan kloning atau transformasi Pada MCS terdapat gen lacZ mengkode galaktosidase DNA sisipan akan merusak gen lacZ sehingga galaktosidase tidak diproduksi dan X-gal tidak diuraika berwarna putih
- X- GALrarr biru
- X ndashGAL rarr tidak diuraikan putih
-
sifat bithorax pada Drosophila yang berfungsi dalam regulasi perkembangan pola
segmentasi dada membentang sepanjang 320 kb
- Dikembangkan oleh Burke et al (1987)
- Karakteristik penting plasmid YAC yaitu
Dikembangkan dari plasmid pBR322
Memiliki komponen gen yeast SUP4 7RP1 HIS3 dan URA3
Kloning pada sisi gen SUP4 (supressor untuk pengendali gen tRNA tyrosin)
Host (inang) yang digunakan untuk transformasi adalah spheroplast sel yeast
e BAC (Bacterial Artificial Chromosome)
- Kromosom buatan dari bakteri
- Plasmid yang dilengkapi dengan faktor F
- Mengandung
oriS repE ndash F replikasi dan pengaturan jumlah salinan plasmid di dalam sel
inang
parA and parB pembagian plasmid F kedalam sel anak dan menjamin stabilitas
insersi
- Kisaran kapasitas kloning vektor BAC adalah 150 sampai 350 kb (bisa capai 700 kb)
- Dapat membawa sisipan DNA berukuran besar
- Konstruksi pustaka genom
2 Vektor Pengklonan pGEM-T Easy Plasmid pGEM-T Easy (Gambar3) merupakan
plasmid sirkular terbuka memiliki dua buah origin of replication dan gen ketahanan
terhadap ampisilin (Amp) Plasmid ini mengandung multy cloning site Karena memiliki
kelebihan timin yang menggantung di ujung terbuka plasmid ( T overhang) plasmid ini
sering dipakai sebagai vektor untuk produk PCR yang selalu memiliki kelebihan adenin
pada ujungnya tanpa memerlukan tahapan pemotongan terlebih dahulu Plasmid pGEM-T
Easy juga termasuk plasmid high copy number yang cocok untuk menyimpan gen insert
dalam suatu inang (Kendrew amp Lawrence 1994)
Selain itu pGEM-T Easy merupakan vektor yang berukuran kecil yaitu 3015 bp Ukuran
tersebut relatif kecil sehingga vektor dapat membawa DNA target cukup banyak dan
memudahkan preparasi DNA sisipan dalam jumlah besar Vektor berukuran kecil lebih
mudah dimasukkan ke dalam sel inang dan lebih mudah dimurnikan karena cenderung
tidak rapuh dibandingkan dengan vektor berukuran besar ( Sambrook et al 1991)
Gambar 3 Profil vektor pengklonan pGEM-T Easy
Vektor Ekspresi pCAMBIA 1303
DNA vektor adalah molekul DNA yang dapat bereplikasi secara mandiri dan dapat
digunakan sebagai pembawa molekul DNA lain yang tidak memiliki kemampuan
bereplikasi sendiri di dalam sel DNA yang sering digunakan adalah plasmid bakteri
Plasmid adalah bahan genetik ekstrakromosom yang diwariskan secara tetap Ciri-ciri
plasmid antara lain berukuran kecil dan hanya mengandung beberapa gen membawa
informasi genetik terlepas dari DNA kromosom atau kadang-kadang dapat berintegrasi
dengan DNA kromosom dan dapat diisolasi dengan mudah dari sel bakteri Ciri lain
plasmid adalah mempunyai situs untuk memulai replikasi yang disebut ORI (origin of
replication) (Nicholl 1994)
Plasmid pCAMBIA 1303 merupakan plasmid yang dikonstruksi sebagai vektor DNA
dalam metode transformasi langsung dan menggunakan Agrobacterium tumefaciens
Plasmid pCAMBIA 1303 mengandung promotor CaMV 35S (cauliflower mosaic virus)
Promotor ini berhubungan dengan urutan yang terpoliadenilasi pada T-DNA plasmid Hal
ini memungkinkan pembuatan klon langsung ke dalam T-DNA plasmid Tersedianya
promotor aktif yang kuat sangat diperlukan untuk ekspresi suatu gen pada tanaman baik
monokotil maupun dikotil Beberapa hasil penelitian menyatakan bahwa CaMV35S adalah
promotor konstitutif yang aktif pada sel tanaman monokotil akan tetapi kekuatannya
sedikit menurun pada sel tumbuhan dikotil dan tidak aktif pada beberapa tipe sel seperti
pollen (Tzfira amp Citovsky 2002) Selain itu pCAMBIA 1303 mempunyai gen gusA Gen
gusA (1049109-glucuronidase) dalam plasmid pCAMBIA 1303 berfungsi sebagai gen reporter
untuk memonitor proses transformasi dan introduksi gen yang direkayasa (Tzfira amp
Citovsky 2002)
Peta restriksi pCAMBIA 1303
3 Cara memasukkan materigenetik kedalam sel inang yaitu
Transformasi ialah pemindahan sebagian materi genetik atau DNA atau hanya satu
gen bakteri ke bakteri lain dengan proses fisiologi yang kompleks Proses ini pertama
ditemukan Frederick Griffith tahun 1982 Contoh Streptococcus pnemoniaeu
Haemophillus Bacillus Diguga transformasi ini merupakan cara bakteri menularkan
sifatnya ke bakteri lain Misalnya bakteri patogen yang semula tidak kebal antibiotik
dapat berubah menjadi kebal antibiotik karena transformasi
Transduksi pemindahan materi genetik dengan perantara virus Virus dapat
menyambungkan materi genetiknya ke DNA bakteri dan membentuk profag Ketika
terbentuk virus baru di dalam DNA virus sering terbawa sepenggal DNA bakteri yang
diinfeksinya Virus yang terbentuk memiliki dua macam DNA yang dikenal partikel
transduksi (transducing particle) Cara ini dikemukakan oleh Norton Zinder dan
Jashua Lederberg
Konjugasi merupakan pemindahan sebagian materi genetika dari satu bakteri ke
bakteri lain melalui suatu kontak langsung Artinya terjadi transfer DNA dari sel
bakteri donor ke sel bakteri penerima melalui ujung pilus Ujung pilus akan melekat
pada sel peneima dan DNA dipindahkan melalui pilus tersebut Kemampuan sel donor
memindahkan DNA dikontrol oleh faktor pemindahan ( transfer faktor = faktor F )
4 Salah satu seleksi yaitu Seleksi biru putih atau blue-white screening adalah salah satu
metode untuk mengidentifikasi keberhasilan kloning dan transformasi Metode ini
merupakan salah satu metode seleksi sel hasil kloning dan termasuk metode seleksi
berdasarkan warna Untuk proses seleksi ini digunakan enzim β-galaktosidase β-
galaktosidase adalah enzim yang dihasilkan dari ekspresi gen lacZ Gen ini diatur
ekspresinya oleh operon lac Aktivator untuk ekspresi gen ini adalah molekul laktosa yang
dalam jumlah tertentu dapat menginduksi terekspresinya gen lacZ
Mekanisme
Proses seleksi ini memanfaatkan sifat dari enzim β-galaktosidase yaitu enzim yang terdiri
dari 2 subunit yaitu peptida α dan peptida ω Untuk menjadi suatu enzim yang fungsional
enzim ini memerlukan kedua peptidanya untuk berikatan dan membentuk enzim yang
dapat memecah substrat laktosa atau X-gal Gen penyandi peptida ω biasanya terdapat
pada kromosom sedangkan gen penyandi peptida α terdapat pada plasmid Bila hanya
ada peptida ω yang diekspresikan oleh gen pada kromosom maka tidak akan ada
pemecahan laktosa atau X-gal Namun bila terjadi komplementasi oleh peptida α
maka laktosa atau X-gal dapat dipecah oleh enzim β-galaktosidase yang terbentuk
sempurna Oleh karena itu komplementasi α dapat membantu untuk proses seleksi biru-
putih sebagai indikator keberhasilan kloning atau transformasi Pada MCS terdapat gen
lacZ mengkode galaktosidase DNA sisipan akan merusak gen lacZ sehingga galaktosidase
tidak diproduksi dan X-gal tidak diuraika berwarna putih
X- GALrarr biru
X ndashGAL rarr tidak diuraikan putih
5 Deteksi Keberadaan DNA sisipan antara lain
Elektroforesis gel (analisis migrasi analisis restriksi PCR) dan penentuan urutan DNA
Seleksi sel rekombinan yang membawa fragmen yang diinginkan dilakukan dengan
mencari fragmen tersebut menggunakan fragmen pelacak (probe) yang pembuatannya
dilakukan secara in vitro menggunakan teknik reaksi polimerisasi berantai atau polymerase
chain reactin (PCR) Pelacakan fragmen yang diinginkan antara lain dapat dilakukan
melalui cara hibridisasi koloni Koloni-koloni sel rekombinan ditransfer ke membrane
nilon di lisis agar isi selnya keluar dibersihkan protein dan remukan sel lainnya hingga
tinggal tersisa DNAnya saja Selanjutnya dilakukan fiksasi DNA dan perendaman di
dalam larutan pelacak Posisi-posisi DNA yang terhibridisasi oleh fragmen pelacak
dikocokkan dengan posisi koloni pada kultur awal (master plate) Dengan demikian kita
bisa menentukan koloni-koloni sel rekombinan yang membawa fragmen yang diinginkan
REFERENSI
Gupta PK 2008 Molecular Biology and Genetic Engineering New Delhi Rastogi
Nicholl DST 1994 An Introduction to Genetic Engineering New York Cambridge
University Press
Kendrew SJ Lawrence E 1994 The Encyclopedia of Molecular Biology Cambridge
Blackwell Science
Sambbrook J Russell DW 2001 Molecular Cloning A Laboratory Manual Ed ke-3 New
York Cold Spring Harbor Laboratory
Tzfira T Citovsky V 2002 Partners-ininfection host proteins involved in the transformation
of plant cells by Agrobacterium Trends in Cell Biology 12 121ndash130
- Mekanisme
- Proses seleksi ini memanfaatkan sifat dari enzim β-galaktosidase yaitu enzim yang terdiri dari 2 subunit yaitu peptida α dan peptida ω Untuk menjadi suatu enzim yang fungsional enzim ini memerlukan kedua peptidanya untuk berikatan dan membentuk enzim yang dapat memecah substrat laktosa atau X-gal Gen penyandi peptida ω biasanya terdapat pada kromosom sedangkan gen penyandi peptida α terdapat pada plasmid Bila hanya ada peptida ω yang diekspresikan oleh gen pada kromosom maka tidak akan ada pemecahan laktosa atau X-gal Namun bila terjadi komplementasi oleh peptida α maka laktosa atau X-gal dapat dipecah oleh enzim β-galaktosidase yang terbentuk sempurna Oleh karena itu komplementasi α dapat membantu untuk proses seleksi biru-putih sebagai indikator keberhasilan kloning atau transformasi Pada MCS terdapat gen lacZ mengkode galaktosidase DNA sisipan akan merusak gen lacZ sehingga galaktosidase tidak diproduksi dan X-gal tidak diuraika berwarna putih
- X- GALrarr biru
- X ndashGAL rarr tidak diuraikan putih
-
Gambar 3 Profil vektor pengklonan pGEM-T Easy
Vektor Ekspresi pCAMBIA 1303
DNA vektor adalah molekul DNA yang dapat bereplikasi secara mandiri dan dapat
digunakan sebagai pembawa molekul DNA lain yang tidak memiliki kemampuan
bereplikasi sendiri di dalam sel DNA yang sering digunakan adalah plasmid bakteri
Plasmid adalah bahan genetik ekstrakromosom yang diwariskan secara tetap Ciri-ciri
plasmid antara lain berukuran kecil dan hanya mengandung beberapa gen membawa
informasi genetik terlepas dari DNA kromosom atau kadang-kadang dapat berintegrasi
dengan DNA kromosom dan dapat diisolasi dengan mudah dari sel bakteri Ciri lain
plasmid adalah mempunyai situs untuk memulai replikasi yang disebut ORI (origin of
replication) (Nicholl 1994)
Plasmid pCAMBIA 1303 merupakan plasmid yang dikonstruksi sebagai vektor DNA
dalam metode transformasi langsung dan menggunakan Agrobacterium tumefaciens
Plasmid pCAMBIA 1303 mengandung promotor CaMV 35S (cauliflower mosaic virus)
Promotor ini berhubungan dengan urutan yang terpoliadenilasi pada T-DNA plasmid Hal
ini memungkinkan pembuatan klon langsung ke dalam T-DNA plasmid Tersedianya
promotor aktif yang kuat sangat diperlukan untuk ekspresi suatu gen pada tanaman baik
monokotil maupun dikotil Beberapa hasil penelitian menyatakan bahwa CaMV35S adalah
promotor konstitutif yang aktif pada sel tanaman monokotil akan tetapi kekuatannya
sedikit menurun pada sel tumbuhan dikotil dan tidak aktif pada beberapa tipe sel seperti
pollen (Tzfira amp Citovsky 2002) Selain itu pCAMBIA 1303 mempunyai gen gusA Gen
gusA (1049109-glucuronidase) dalam plasmid pCAMBIA 1303 berfungsi sebagai gen reporter
untuk memonitor proses transformasi dan introduksi gen yang direkayasa (Tzfira amp
Citovsky 2002)
Peta restriksi pCAMBIA 1303
3 Cara memasukkan materigenetik kedalam sel inang yaitu
Transformasi ialah pemindahan sebagian materi genetik atau DNA atau hanya satu
gen bakteri ke bakteri lain dengan proses fisiologi yang kompleks Proses ini pertama
ditemukan Frederick Griffith tahun 1982 Contoh Streptococcus pnemoniaeu
Haemophillus Bacillus Diguga transformasi ini merupakan cara bakteri menularkan
sifatnya ke bakteri lain Misalnya bakteri patogen yang semula tidak kebal antibiotik
dapat berubah menjadi kebal antibiotik karena transformasi
Transduksi pemindahan materi genetik dengan perantara virus Virus dapat
menyambungkan materi genetiknya ke DNA bakteri dan membentuk profag Ketika
terbentuk virus baru di dalam DNA virus sering terbawa sepenggal DNA bakteri yang
diinfeksinya Virus yang terbentuk memiliki dua macam DNA yang dikenal partikel
transduksi (transducing particle) Cara ini dikemukakan oleh Norton Zinder dan
Jashua Lederberg
Konjugasi merupakan pemindahan sebagian materi genetika dari satu bakteri ke
bakteri lain melalui suatu kontak langsung Artinya terjadi transfer DNA dari sel
bakteri donor ke sel bakteri penerima melalui ujung pilus Ujung pilus akan melekat
pada sel peneima dan DNA dipindahkan melalui pilus tersebut Kemampuan sel donor
memindahkan DNA dikontrol oleh faktor pemindahan ( transfer faktor = faktor F )
4 Salah satu seleksi yaitu Seleksi biru putih atau blue-white screening adalah salah satu
metode untuk mengidentifikasi keberhasilan kloning dan transformasi Metode ini
merupakan salah satu metode seleksi sel hasil kloning dan termasuk metode seleksi
berdasarkan warna Untuk proses seleksi ini digunakan enzim β-galaktosidase β-
galaktosidase adalah enzim yang dihasilkan dari ekspresi gen lacZ Gen ini diatur
ekspresinya oleh operon lac Aktivator untuk ekspresi gen ini adalah molekul laktosa yang
dalam jumlah tertentu dapat menginduksi terekspresinya gen lacZ
Mekanisme
Proses seleksi ini memanfaatkan sifat dari enzim β-galaktosidase yaitu enzim yang terdiri
dari 2 subunit yaitu peptida α dan peptida ω Untuk menjadi suatu enzim yang fungsional
enzim ini memerlukan kedua peptidanya untuk berikatan dan membentuk enzim yang
dapat memecah substrat laktosa atau X-gal Gen penyandi peptida ω biasanya terdapat
pada kromosom sedangkan gen penyandi peptida α terdapat pada plasmid Bila hanya
ada peptida ω yang diekspresikan oleh gen pada kromosom maka tidak akan ada
pemecahan laktosa atau X-gal Namun bila terjadi komplementasi oleh peptida α
maka laktosa atau X-gal dapat dipecah oleh enzim β-galaktosidase yang terbentuk
sempurna Oleh karena itu komplementasi α dapat membantu untuk proses seleksi biru-
putih sebagai indikator keberhasilan kloning atau transformasi Pada MCS terdapat gen
lacZ mengkode galaktosidase DNA sisipan akan merusak gen lacZ sehingga galaktosidase
tidak diproduksi dan X-gal tidak diuraika berwarna putih
X- GALrarr biru
X ndashGAL rarr tidak diuraikan putih
5 Deteksi Keberadaan DNA sisipan antara lain
Elektroforesis gel (analisis migrasi analisis restriksi PCR) dan penentuan urutan DNA
Seleksi sel rekombinan yang membawa fragmen yang diinginkan dilakukan dengan
mencari fragmen tersebut menggunakan fragmen pelacak (probe) yang pembuatannya
dilakukan secara in vitro menggunakan teknik reaksi polimerisasi berantai atau polymerase
chain reactin (PCR) Pelacakan fragmen yang diinginkan antara lain dapat dilakukan
melalui cara hibridisasi koloni Koloni-koloni sel rekombinan ditransfer ke membrane
nilon di lisis agar isi selnya keluar dibersihkan protein dan remukan sel lainnya hingga
tinggal tersisa DNAnya saja Selanjutnya dilakukan fiksasi DNA dan perendaman di
dalam larutan pelacak Posisi-posisi DNA yang terhibridisasi oleh fragmen pelacak
dikocokkan dengan posisi koloni pada kultur awal (master plate) Dengan demikian kita
bisa menentukan koloni-koloni sel rekombinan yang membawa fragmen yang diinginkan
REFERENSI
Gupta PK 2008 Molecular Biology and Genetic Engineering New Delhi Rastogi
Nicholl DST 1994 An Introduction to Genetic Engineering New York Cambridge
University Press
Kendrew SJ Lawrence E 1994 The Encyclopedia of Molecular Biology Cambridge
Blackwell Science
Sambbrook J Russell DW 2001 Molecular Cloning A Laboratory Manual Ed ke-3 New
York Cold Spring Harbor Laboratory
Tzfira T Citovsky V 2002 Partners-ininfection host proteins involved in the transformation
of plant cells by Agrobacterium Trends in Cell Biology 12 121ndash130
- Mekanisme
- Proses seleksi ini memanfaatkan sifat dari enzim β-galaktosidase yaitu enzim yang terdiri dari 2 subunit yaitu peptida α dan peptida ω Untuk menjadi suatu enzim yang fungsional enzim ini memerlukan kedua peptidanya untuk berikatan dan membentuk enzim yang dapat memecah substrat laktosa atau X-gal Gen penyandi peptida ω biasanya terdapat pada kromosom sedangkan gen penyandi peptida α terdapat pada plasmid Bila hanya ada peptida ω yang diekspresikan oleh gen pada kromosom maka tidak akan ada pemecahan laktosa atau X-gal Namun bila terjadi komplementasi oleh peptida α maka laktosa atau X-gal dapat dipecah oleh enzim β-galaktosidase yang terbentuk sempurna Oleh karena itu komplementasi α dapat membantu untuk proses seleksi biru-putih sebagai indikator keberhasilan kloning atau transformasi Pada MCS terdapat gen lacZ mengkode galaktosidase DNA sisipan akan merusak gen lacZ sehingga galaktosidase tidak diproduksi dan X-gal tidak diuraika berwarna putih
- X- GALrarr biru
- X ndashGAL rarr tidak diuraikan putih
-
ini memungkinkan pembuatan klon langsung ke dalam T-DNA plasmid Tersedianya
promotor aktif yang kuat sangat diperlukan untuk ekspresi suatu gen pada tanaman baik
monokotil maupun dikotil Beberapa hasil penelitian menyatakan bahwa CaMV35S adalah
promotor konstitutif yang aktif pada sel tanaman monokotil akan tetapi kekuatannya
sedikit menurun pada sel tumbuhan dikotil dan tidak aktif pada beberapa tipe sel seperti
pollen (Tzfira amp Citovsky 2002) Selain itu pCAMBIA 1303 mempunyai gen gusA Gen
gusA (1049109-glucuronidase) dalam plasmid pCAMBIA 1303 berfungsi sebagai gen reporter
untuk memonitor proses transformasi dan introduksi gen yang direkayasa (Tzfira amp
Citovsky 2002)
Peta restriksi pCAMBIA 1303
3 Cara memasukkan materigenetik kedalam sel inang yaitu
Transformasi ialah pemindahan sebagian materi genetik atau DNA atau hanya satu
gen bakteri ke bakteri lain dengan proses fisiologi yang kompleks Proses ini pertama
ditemukan Frederick Griffith tahun 1982 Contoh Streptococcus pnemoniaeu
Haemophillus Bacillus Diguga transformasi ini merupakan cara bakteri menularkan
sifatnya ke bakteri lain Misalnya bakteri patogen yang semula tidak kebal antibiotik
dapat berubah menjadi kebal antibiotik karena transformasi
Transduksi pemindahan materi genetik dengan perantara virus Virus dapat
menyambungkan materi genetiknya ke DNA bakteri dan membentuk profag Ketika
terbentuk virus baru di dalam DNA virus sering terbawa sepenggal DNA bakteri yang
diinfeksinya Virus yang terbentuk memiliki dua macam DNA yang dikenal partikel
transduksi (transducing particle) Cara ini dikemukakan oleh Norton Zinder dan
Jashua Lederberg
Konjugasi merupakan pemindahan sebagian materi genetika dari satu bakteri ke
bakteri lain melalui suatu kontak langsung Artinya terjadi transfer DNA dari sel
bakteri donor ke sel bakteri penerima melalui ujung pilus Ujung pilus akan melekat
pada sel peneima dan DNA dipindahkan melalui pilus tersebut Kemampuan sel donor
memindahkan DNA dikontrol oleh faktor pemindahan ( transfer faktor = faktor F )
4 Salah satu seleksi yaitu Seleksi biru putih atau blue-white screening adalah salah satu
metode untuk mengidentifikasi keberhasilan kloning dan transformasi Metode ini
merupakan salah satu metode seleksi sel hasil kloning dan termasuk metode seleksi
berdasarkan warna Untuk proses seleksi ini digunakan enzim β-galaktosidase β-
galaktosidase adalah enzim yang dihasilkan dari ekspresi gen lacZ Gen ini diatur
ekspresinya oleh operon lac Aktivator untuk ekspresi gen ini adalah molekul laktosa yang
dalam jumlah tertentu dapat menginduksi terekspresinya gen lacZ
Mekanisme
Proses seleksi ini memanfaatkan sifat dari enzim β-galaktosidase yaitu enzim yang terdiri
dari 2 subunit yaitu peptida α dan peptida ω Untuk menjadi suatu enzim yang fungsional
enzim ini memerlukan kedua peptidanya untuk berikatan dan membentuk enzim yang
dapat memecah substrat laktosa atau X-gal Gen penyandi peptida ω biasanya terdapat
pada kromosom sedangkan gen penyandi peptida α terdapat pada plasmid Bila hanya
ada peptida ω yang diekspresikan oleh gen pada kromosom maka tidak akan ada
pemecahan laktosa atau X-gal Namun bila terjadi komplementasi oleh peptida α
maka laktosa atau X-gal dapat dipecah oleh enzim β-galaktosidase yang terbentuk
sempurna Oleh karena itu komplementasi α dapat membantu untuk proses seleksi biru-
putih sebagai indikator keberhasilan kloning atau transformasi Pada MCS terdapat gen
lacZ mengkode galaktosidase DNA sisipan akan merusak gen lacZ sehingga galaktosidase
tidak diproduksi dan X-gal tidak diuraika berwarna putih
X- GALrarr biru
X ndashGAL rarr tidak diuraikan putih
5 Deteksi Keberadaan DNA sisipan antara lain
Elektroforesis gel (analisis migrasi analisis restriksi PCR) dan penentuan urutan DNA
Seleksi sel rekombinan yang membawa fragmen yang diinginkan dilakukan dengan
mencari fragmen tersebut menggunakan fragmen pelacak (probe) yang pembuatannya
dilakukan secara in vitro menggunakan teknik reaksi polimerisasi berantai atau polymerase
chain reactin (PCR) Pelacakan fragmen yang diinginkan antara lain dapat dilakukan
melalui cara hibridisasi koloni Koloni-koloni sel rekombinan ditransfer ke membrane
nilon di lisis agar isi selnya keluar dibersihkan protein dan remukan sel lainnya hingga
tinggal tersisa DNAnya saja Selanjutnya dilakukan fiksasi DNA dan perendaman di
dalam larutan pelacak Posisi-posisi DNA yang terhibridisasi oleh fragmen pelacak
dikocokkan dengan posisi koloni pada kultur awal (master plate) Dengan demikian kita
bisa menentukan koloni-koloni sel rekombinan yang membawa fragmen yang diinginkan
REFERENSI
Gupta PK 2008 Molecular Biology and Genetic Engineering New Delhi Rastogi
Nicholl DST 1994 An Introduction to Genetic Engineering New York Cambridge
University Press
Kendrew SJ Lawrence E 1994 The Encyclopedia of Molecular Biology Cambridge
Blackwell Science
Sambbrook J Russell DW 2001 Molecular Cloning A Laboratory Manual Ed ke-3 New
York Cold Spring Harbor Laboratory
Tzfira T Citovsky V 2002 Partners-ininfection host proteins involved in the transformation
of plant cells by Agrobacterium Trends in Cell Biology 12 121ndash130
- Mekanisme
- Proses seleksi ini memanfaatkan sifat dari enzim β-galaktosidase yaitu enzim yang terdiri dari 2 subunit yaitu peptida α dan peptida ω Untuk menjadi suatu enzim yang fungsional enzim ini memerlukan kedua peptidanya untuk berikatan dan membentuk enzim yang dapat memecah substrat laktosa atau X-gal Gen penyandi peptida ω biasanya terdapat pada kromosom sedangkan gen penyandi peptida α terdapat pada plasmid Bila hanya ada peptida ω yang diekspresikan oleh gen pada kromosom maka tidak akan ada pemecahan laktosa atau X-gal Namun bila terjadi komplementasi oleh peptida α maka laktosa atau X-gal dapat dipecah oleh enzim β-galaktosidase yang terbentuk sempurna Oleh karena itu komplementasi α dapat membantu untuk proses seleksi biru-putih sebagai indikator keberhasilan kloning atau transformasi Pada MCS terdapat gen lacZ mengkode galaktosidase DNA sisipan akan merusak gen lacZ sehingga galaktosidase tidak diproduksi dan X-gal tidak diuraika berwarna putih
- X- GALrarr biru
- X ndashGAL rarr tidak diuraikan putih
-
Transduksi pemindahan materi genetik dengan perantara virus Virus dapat
menyambungkan materi genetiknya ke DNA bakteri dan membentuk profag Ketika
terbentuk virus baru di dalam DNA virus sering terbawa sepenggal DNA bakteri yang
diinfeksinya Virus yang terbentuk memiliki dua macam DNA yang dikenal partikel
transduksi (transducing particle) Cara ini dikemukakan oleh Norton Zinder dan
Jashua Lederberg
Konjugasi merupakan pemindahan sebagian materi genetika dari satu bakteri ke
bakteri lain melalui suatu kontak langsung Artinya terjadi transfer DNA dari sel
bakteri donor ke sel bakteri penerima melalui ujung pilus Ujung pilus akan melekat
pada sel peneima dan DNA dipindahkan melalui pilus tersebut Kemampuan sel donor
memindahkan DNA dikontrol oleh faktor pemindahan ( transfer faktor = faktor F )
4 Salah satu seleksi yaitu Seleksi biru putih atau blue-white screening adalah salah satu
metode untuk mengidentifikasi keberhasilan kloning dan transformasi Metode ini
merupakan salah satu metode seleksi sel hasil kloning dan termasuk metode seleksi
berdasarkan warna Untuk proses seleksi ini digunakan enzim β-galaktosidase β-
galaktosidase adalah enzim yang dihasilkan dari ekspresi gen lacZ Gen ini diatur
ekspresinya oleh operon lac Aktivator untuk ekspresi gen ini adalah molekul laktosa yang
dalam jumlah tertentu dapat menginduksi terekspresinya gen lacZ
Mekanisme
Proses seleksi ini memanfaatkan sifat dari enzim β-galaktosidase yaitu enzim yang terdiri
dari 2 subunit yaitu peptida α dan peptida ω Untuk menjadi suatu enzim yang fungsional
enzim ini memerlukan kedua peptidanya untuk berikatan dan membentuk enzim yang
dapat memecah substrat laktosa atau X-gal Gen penyandi peptida ω biasanya terdapat
pada kromosom sedangkan gen penyandi peptida α terdapat pada plasmid Bila hanya
ada peptida ω yang diekspresikan oleh gen pada kromosom maka tidak akan ada
pemecahan laktosa atau X-gal Namun bila terjadi komplementasi oleh peptida α
maka laktosa atau X-gal dapat dipecah oleh enzim β-galaktosidase yang terbentuk
sempurna Oleh karena itu komplementasi α dapat membantu untuk proses seleksi biru-
putih sebagai indikator keberhasilan kloning atau transformasi Pada MCS terdapat gen
lacZ mengkode galaktosidase DNA sisipan akan merusak gen lacZ sehingga galaktosidase
tidak diproduksi dan X-gal tidak diuraika berwarna putih
X- GALrarr biru
X ndashGAL rarr tidak diuraikan putih
5 Deteksi Keberadaan DNA sisipan antara lain
Elektroforesis gel (analisis migrasi analisis restriksi PCR) dan penentuan urutan DNA
Seleksi sel rekombinan yang membawa fragmen yang diinginkan dilakukan dengan
mencari fragmen tersebut menggunakan fragmen pelacak (probe) yang pembuatannya
dilakukan secara in vitro menggunakan teknik reaksi polimerisasi berantai atau polymerase
chain reactin (PCR) Pelacakan fragmen yang diinginkan antara lain dapat dilakukan
melalui cara hibridisasi koloni Koloni-koloni sel rekombinan ditransfer ke membrane
nilon di lisis agar isi selnya keluar dibersihkan protein dan remukan sel lainnya hingga
tinggal tersisa DNAnya saja Selanjutnya dilakukan fiksasi DNA dan perendaman di
dalam larutan pelacak Posisi-posisi DNA yang terhibridisasi oleh fragmen pelacak
dikocokkan dengan posisi koloni pada kultur awal (master plate) Dengan demikian kita
bisa menentukan koloni-koloni sel rekombinan yang membawa fragmen yang diinginkan
REFERENSI
Gupta PK 2008 Molecular Biology and Genetic Engineering New Delhi Rastogi
Nicholl DST 1994 An Introduction to Genetic Engineering New York Cambridge
University Press
Kendrew SJ Lawrence E 1994 The Encyclopedia of Molecular Biology Cambridge
Blackwell Science
Sambbrook J Russell DW 2001 Molecular Cloning A Laboratory Manual Ed ke-3 New
York Cold Spring Harbor Laboratory
Tzfira T Citovsky V 2002 Partners-ininfection host proteins involved in the transformation
of plant cells by Agrobacterium Trends in Cell Biology 12 121ndash130
- Mekanisme
- Proses seleksi ini memanfaatkan sifat dari enzim β-galaktosidase yaitu enzim yang terdiri dari 2 subunit yaitu peptida α dan peptida ω Untuk menjadi suatu enzim yang fungsional enzim ini memerlukan kedua peptidanya untuk berikatan dan membentuk enzim yang dapat memecah substrat laktosa atau X-gal Gen penyandi peptida ω biasanya terdapat pada kromosom sedangkan gen penyandi peptida α terdapat pada plasmid Bila hanya ada peptida ω yang diekspresikan oleh gen pada kromosom maka tidak akan ada pemecahan laktosa atau X-gal Namun bila terjadi komplementasi oleh peptida α maka laktosa atau X-gal dapat dipecah oleh enzim β-galaktosidase yang terbentuk sempurna Oleh karena itu komplementasi α dapat membantu untuk proses seleksi biru-putih sebagai indikator keberhasilan kloning atau transformasi Pada MCS terdapat gen lacZ mengkode galaktosidase DNA sisipan akan merusak gen lacZ sehingga galaktosidase tidak diproduksi dan X-gal tidak diuraika berwarna putih
- X- GALrarr biru
- X ndashGAL rarr tidak diuraikan putih
-
X- GALrarr biru
X ndashGAL rarr tidak diuraikan putih
5 Deteksi Keberadaan DNA sisipan antara lain
Elektroforesis gel (analisis migrasi analisis restriksi PCR) dan penentuan urutan DNA
Seleksi sel rekombinan yang membawa fragmen yang diinginkan dilakukan dengan
mencari fragmen tersebut menggunakan fragmen pelacak (probe) yang pembuatannya
dilakukan secara in vitro menggunakan teknik reaksi polimerisasi berantai atau polymerase
chain reactin (PCR) Pelacakan fragmen yang diinginkan antara lain dapat dilakukan
melalui cara hibridisasi koloni Koloni-koloni sel rekombinan ditransfer ke membrane
nilon di lisis agar isi selnya keluar dibersihkan protein dan remukan sel lainnya hingga
tinggal tersisa DNAnya saja Selanjutnya dilakukan fiksasi DNA dan perendaman di
dalam larutan pelacak Posisi-posisi DNA yang terhibridisasi oleh fragmen pelacak
dikocokkan dengan posisi koloni pada kultur awal (master plate) Dengan demikian kita
bisa menentukan koloni-koloni sel rekombinan yang membawa fragmen yang diinginkan
REFERENSI
Gupta PK 2008 Molecular Biology and Genetic Engineering New Delhi Rastogi
Nicholl DST 1994 An Introduction to Genetic Engineering New York Cambridge
University Press
Kendrew SJ Lawrence E 1994 The Encyclopedia of Molecular Biology Cambridge
Blackwell Science
Sambbrook J Russell DW 2001 Molecular Cloning A Laboratory Manual Ed ke-3 New
York Cold Spring Harbor Laboratory
Tzfira T Citovsky V 2002 Partners-ininfection host proteins involved in the transformation
of plant cells by Agrobacterium Trends in Cell Biology 12 121ndash130
- Mekanisme
- Proses seleksi ini memanfaatkan sifat dari enzim β-galaktosidase yaitu enzim yang terdiri dari 2 subunit yaitu peptida α dan peptida ω Untuk menjadi suatu enzim yang fungsional enzim ini memerlukan kedua peptidanya untuk berikatan dan membentuk enzim yang dapat memecah substrat laktosa atau X-gal Gen penyandi peptida ω biasanya terdapat pada kromosom sedangkan gen penyandi peptida α terdapat pada plasmid Bila hanya ada peptida ω yang diekspresikan oleh gen pada kromosom maka tidak akan ada pemecahan laktosa atau X-gal Namun bila terjadi komplementasi oleh peptida α maka laktosa atau X-gal dapat dipecah oleh enzim β-galaktosidase yang terbentuk sempurna Oleh karena itu komplementasi α dapat membantu untuk proses seleksi biru-putih sebagai indikator keberhasilan kloning atau transformasi Pada MCS terdapat gen lacZ mengkode galaktosidase DNA sisipan akan merusak gen lacZ sehingga galaktosidase tidak diproduksi dan X-gal tidak diuraika berwarna putih
- X- GALrarr biru
- X ndashGAL rarr tidak diuraikan putih
-
REFERENSI
Gupta PK 2008 Molecular Biology and Genetic Engineering New Delhi Rastogi
Nicholl DST 1994 An Introduction to Genetic Engineering New York Cambridge
University Press
Kendrew SJ Lawrence E 1994 The Encyclopedia of Molecular Biology Cambridge
Blackwell Science
Sambbrook J Russell DW 2001 Molecular Cloning A Laboratory Manual Ed ke-3 New
York Cold Spring Harbor Laboratory
Tzfira T Citovsky V 2002 Partners-ininfection host proteins involved in the transformation
of plant cells by Agrobacterium Trends in Cell Biology 12 121ndash130
- Mekanisme
- Proses seleksi ini memanfaatkan sifat dari enzim β-galaktosidase yaitu enzim yang terdiri dari 2 subunit yaitu peptida α dan peptida ω Untuk menjadi suatu enzim yang fungsional enzim ini memerlukan kedua peptidanya untuk berikatan dan membentuk enzim yang dapat memecah substrat laktosa atau X-gal Gen penyandi peptida ω biasanya terdapat pada kromosom sedangkan gen penyandi peptida α terdapat pada plasmid Bila hanya ada peptida ω yang diekspresikan oleh gen pada kromosom maka tidak akan ada pemecahan laktosa atau X-gal Namun bila terjadi komplementasi oleh peptida α maka laktosa atau X-gal dapat dipecah oleh enzim β-galaktosidase yang terbentuk sempurna Oleh karena itu komplementasi α dapat membantu untuk proses seleksi biru-putih sebagai indikator keberhasilan kloning atau transformasi Pada MCS terdapat gen lacZ mengkode galaktosidase DNA sisipan akan merusak gen lacZ sehingga galaktosidase tidak diproduksi dan X-gal tidak diuraika berwarna putih
- X- GALrarr biru
- X ndashGAL rarr tidak diuraikan putih
-