Solving  structures:  phasing  diffrac5on  data  and  refining  models  

Marc  Delarue  Ins5tut  Pasteur  

The  phase  problem:  defini5on  We  measure  |F(h)|,    However,  we  need    F(h)=|F(h)|exp(iφ(h))  

Phasing  

•  If  you  have  a  (plausible)  PDB  Model:  Molecular  Replacement  (one  na5ve  data  set)  

•  If  you  don’t:  Isomorphous  Replacement  or  SAD  or  MAD  (one  heavy-­‐atom  deriva5ve  and  datasets  of  the  same  sample  at  different  λ)  

•  Improve  the  phases  by  imposing  physical  constraints  on  the  electron  density  

•  Direct  methods  work  if  you  have  very  high  Resolu5on  data  (about  1  Å)  -­‐>  2  Å?  

0.  PaUerson  func5ons  •  Instead  of  the  usual  Fourier  synthesis  we  can  calculate  Fourier  map  with  Amplitudes  squared  and  zero  phase.  This  gives  a  peak  for  every  interatomic  distance  

•  For  small  molecules,  it  is  possible  to  solve  the  phase  problem  using  PaUerson  methods  only  

1.  Molecular  replacement  

hUp://www.phaser.cimr.cam.ac.uk/index.php/Phaser_Crystallographic_So\ware  

Needs  a  model  with  >30%  sequence  iden5ty,  but  not  necessarily  complete  

Molecular  Replacement  

•  6-­‐D  Problem:  you  need  to  find  the  orienta5on  and  posi5on  of  the  model  in  the  a.u.  

•  PaUerson-­‐based  methods  •  Usually  broken  down  into  two  successive  3D  searches:  – Rota5on  func5on  – Transla5on  Func5on  

•  Usually  the  R-­‐factor  is  very  high  even  for  the  true  solu5on:  needs  a  lot  of  reconstruc5on  

Rota5on  func5on  

Fast  rota5on  func5on  (R.A.  Crowther)    =>  Accessible  to  FFT  (rapid)  

Low  Signal-­‐to-­‐noise  output:    submit  every  peak  above  3  σ  to  TF  

Parameters:  Resolu5on  of  P(u)  and    integra5on  radii  (in  Å).  Rossmann  and  Blow,  1962  

Transla5on  func5on  

Use  PaUerson  vectors  from  symmetry-­‐related  molecules  (Crowther  and  Blow,  1967)  

Molecular  Replacement:  ques5ons  

•  Play  with  the  Model  (truncate  side-­‐chains?)  •  How  many  molecules  in  the  a.u.?  •  Which  Program:  Phaser,  MolRep?  •  Parameters  of  the  program:  which  resolu5on?  •  How  do  I  know  I  have  found  the  solu5on?  •  How  do  I  know  I  am  not  missing  another  molecule  in  the  a.u.?  

Molecular  Replacement:  answers  

•  The  Model  (truncate  side-­‐chains  to  Ala  or  Ser)  •  Try  Phaser  first  (in  CCP4)  •  Phaser  gives  an  es5mate  of  the  number  of  molecules  in  the  a.u.,  with  a  probability  

•  Resolu5on:  12-­‐4  Å  •  Z-­‐scores  in  the  TF  should  be  high  (>8  sigmas)  •  Phaser  looks  for  other  molecules  in  the  a.u.,  if  appropriate  

Molecular  Replacement:  variants  

•  How  to  place  a  model  in  a  poorly  phased  map?  Phased  rota5on  func5on  

•  Best  recipe:  scan  all  the  rota5ons  and  perform  TF  

•  Be  careful  to  the  a.u.  of  the  rota5on  space  group  

•  Very  powerful  method,  equivalent  to  CC  in  real  space  

Molecular  Replacement:  References  

•  T.  Blundell  and  L.  Johnson,  Protein  Crystallography    •  J.  Drenth,  Principles  of  Protein  Crystallography  •  M.  Rossmann,  Acta  Cryst,  Self-­‐Rota5on  func5on  •   M.  Rossmann  and  D.  Blow,  Acta  Cryst,  1962.  •  R.A.  Crowther  and  D.  Blow,  Acta  Cryst,  1967.  •  R.  Read,  Phaser,  Log-­‐likelihood,  Acta  Cryst,  2007  •  A.  Vagin,  Molrep  (CCP4)  •  J.  Navaza,  Amore  (CCP4)  •  Almn,  TFsgen  (CCP4)  •  M.  Delarue  in  Macromolecular  Crystallography,  M.  Sanderson  and  J.  Skelly,  Editors,  OUP,  2007.  

2.  Experimental  Phasing:  Principle  

•  FPH=FP+FH  •  FPH’=FP+FH’  •  …   FH  

 

FP  

FPH  

Experimental  Phasing:  what  kind  of  heavy  atoms?    

•  So\  heavy  atoms  complexes:  Ir,  Pt,  Au,  Hg  •  Lanthanides:  Eu,  Gd,  Dy,  Sm,  Ho,  Tb,  Yb  •  Organic  complexes  of  lanthanides  (Gd+++)  •  Transi5on  metal  ions:  Mn++,  Co++,  Zn++  (AS)  •  Hard  divalent  ca5ons:  Ba++,  Sr++  •  Heavy  monovalent  ions:  Rb+,  Cs+  •  Heavy  monovalent  anions:  Br-­‐  (AS),  I-­‐  •  Web  site:  hUp://skuld.bmsc.washington.edu/scaUer/  

Experimental  Phasing:  how  many  heavy  atoms?  

•  You  need  at  least  one  heavy  atom  •  In  principle  you  need  actually  two,  with  good  isomorphism  

•  Or  you  need  several  data  sets  of  the  same  deriva5ve  at  different  wavelengths  

•  BeUer  if  you  can  tune  the  x-­‐ray  wavelength  to  reach  the  absorp5on  edge  (synchrotron)  

•  Try  soaking  (different  5melapse,  or  co-­‐xtals)  

Exp.  Phasing:  Anomalous  signal  

•  FPH(+)=FP(+)+FH(+)  •  FPH(-­‐)=FP(-­‐)+FH(-­‐)  •  FH(-­‐)  depends  on  lambda  (Å)  

FP(-­‐)  

Experimental  Phasing:  the  normal  route  

•  Do  a  fluorescence  spectrum  of  your  crystals:  find  out  if  there  is  any  unusual  metal  ion  

•  If  no:  set  out  to  produce  Se-­‐Met  deriva5zed  protein  – How  many  Met?  1/100?  –  Put  some  more  by  site-­‐directed  mutagenesis?  – Will  they  all  be  fixed?  

•  Will  the  new  protein  be  soluble?  Give  crystals?  •  Collect  data  at  several  wavelengths  (do  a  fluorescence  spectrum  on  synchrotron  site)  

Isomorphous  Replacement  

•  Principle  •  Data  •  Programs    

–  SHARP  (G.  Bricogne,  Global  Phasing)  –  Solve/Resolve  (T.  Terwilliger,  now  in  Phenix)  

•  Find  the  heavy  atoms  sites  (PaUerson  searches)  •  Check  the  coherence  of  the  sites  of  the  different  data  sets  (common  origin,  Cross  Fourier  Differences)  

•  Figures  to  monitor  the  progress  of  the  phasing:  •  Figure-­‐of-­‐merit,  phasing  power  and  all  that  

Monitoring  progress  during  phasing  

•  How  many  sites?    •  What  is  their  occupa5on?  B-­‐factors?  •  Do  they  “find”  themselves  in  cross  FFT?  •  Global  quality  indicator:  

•  FOM=<cos  Δϕ>=∑H  ∫dϕH  cos  ΔϕH  P(ϕH)  >  0.33?  •  For  each  deriva5ve:    •  Phasing  power=<FH>/rmsH>  1.0?  

MIRAS,  SIRAS,  MAD,  SAD  and  all  that…  

•  MIRAS:  same  as  MIR  but  with  anomalous  scaUering  informa5on  

•  SIRAS:  single  heavy  atom,  but  with  anomalous  scaUering  informa5on  

•  MAD,  same  as  above,  but  with  several  wavelengths  (no  lack-­‐of-­‐isomorphism  pb)  

•  SAD,  same  as  above  but  with  only  one  wavelength  (+  solvent  flaUening)  

3.  DM:  Gewng  beUer  phases  

•  Solvent  flaUening  •  Non-­‐crystallographic  symmetry  averaging  •  Histogram  matching  •  All  methods  can  be  expressed  both  on  direct  space  (x,y,z)  or  in  reciprocal  space  (h,k,l)  

4.  Direct  methods  •  Imposing  (known)  physical  constraints  on  the  electron  density  – Posi5vity:  rho(r)>0  – Atomicity:  rho2(r)=rho(r)  

•  Probabilis5c  methods  try  to  get  the  most  out  of  these  constraints  (triplet  rela5onships…)    (ShelX,  George  Sheldrick)  

•  New  methods  try  to  find  small  fragments  of  protein-­‐like  structures  and  proceed  from  there  (Arcimboldo,  Isabel  Uson)  

Direct  Methods  

•  Normally,  the  limit  is  1000  atoms,  1.2  Å  data  •  ShelX:  ShelX,  ShelXD,  ShelXE:  •  hUp://shelx.uni-­‐ac.gwdg.de/SHELX/  •  Arcimboldo  limit  is  now  2.1  Å,  400  aa:  •  hUp://chango.ibmb.csic.es/ARCIMBOLDO  •  Uses  PHASER  and  SHELXE,  massive  parallel  computers,  and  fragments  representa5ve  of  proteins  

Phasing  References  

•  M.  Perutz,  J.C.  Kendrew:  the  original  MIR  method  •  D.  Blow  and  F.  Crick,  Acta  Cryst,  1959:  the  sta5s5cal  treatment  of  errors  

•  T.  Blundell  and  L.  Johnson,  Protein  Xtallography,  1976  •  J.  Drenth,  Principles  of  Protein  Xtallography,  1999  •  W.A.  Hendrickson  (MAD  Phasing)  •  G.  Bricogne  (Sharp,  Maximum  Likelihood,  NCS…)  •  T.  Terwilliger  (Phasing,  DM,  Solve,  Phenix)  •  A.T.  Brunger  (MR,  R-­‐free,  Simulated  Annealing…)  

Model  Building  and  refinement  

•  Effect  of  resolu5on  •  Automa5c  building  •  Manual  building  •  Refinement    •  Valida5on    

Model  Building:  Maps  •  Maps:  mix  measured  structure  Factors  and  experimental  phases  

•  Influence  of  Resolu5on  

•  No  Model:          m  Fobs  exp(iφbest)  •  With  Model        (2  Fobs-­‐Fcalc)  exp(iφcalc)  

What  kind  of  maps  can  one  get?  

Effect  of  resolu5on  

Effect  of  resolu5on  

Model  Building:  Automa5c  methods  

•  Programs  that  find  the  trace  of  CA  (Alwyn  Jones)  •  Edit  the  trace  to  get  the  longest  possible  polypep5de:  –  Solve/Resolve  (Phenix)  –  Kevin  Cowtan  (Buccaneer)  –  Lamzin,  Perrakis  and  coll.  (ARP/wARP)  

•  Itera5ve  density  modifica5on  •  Calculate  2Fo  –  Fc  maps  with  model  phases  •  Phase  combina5on  •  Highly  Itera5ve  process  

First  C-­‐alpha  trace  

C-­‐alpha  trace:  manual  interven5on  

Alpha-­‐helices    

Beta  sheets  

Side-­‐chain  fiwng:  use  rotamers  

Water  molecules  and  all  that  

Phase  combina5on  

•  Combine  different  sorts  of  informa5on:  calculated  (from  current  model)  and  experimental  phases  

•  Refine  Model  against  which  Energy?  •  E_xray=  ∑H  |F(H)model  -­‐  F(H)calc|/  ∑H  |F(H)calc|  •  E_tot=E_geom  +  E_xray  •  Bayes  theorem  •  When  does  one  get  rid  of  the  experimental  phases?  •  When  does  one  start  reconstruc5ng  manually?    

Manual  reconstruc5on    

•  O  (Alwyn  Jones),  now  Coot  (Paul  Emsley)  •  Add  pep5des  bonds  •  Add  sidechains,  Mutate,  scan  rotamers…  •  Stereochemically  correct  deforma5ons  of  parts  of  the  model  to  fit  the  electron  density  

•  Rebuild  loops  •  Mul5ple  conforma5ons  •  B-­‐factors  

Coot:  manual  reconstruc5on  

Model  Refinement  •  We  can  describe  fit  of  the  model  to  the  data,  in  reciprocal  space  (R-­‐factor)  

•  R  =  ∑H  |F(H)model  -­‐  F(H)calc|/  ∑H  |F(H)calc|  •  Possible  to  get  gradient  (forces)  and  apply  minimisa5on  algorithms  =>  new  model,  new  phases,  new  maps  

•  Problem:  lots  of  mul5ple  minima  •  Possible  solu5on:  Simulated  annealing  •  Or  use  less  variables  (dihedral  angles,  CNS)  •  Log-­‐likelihood  should  be  used  (Buster,  Refmac5)  •  Defini5on  of  R-­‐free  (CNS,  Refmac5)  

Simulated  Annealing  •  Explore  Energy  Landscape  most  effec5vely  •  Sta5s5cal  Physics  (Sherrington  &  Kirkpatrick)  •  Gradient  descent  minimisa5on  can  be  stuck  •  P=exp(-­‐E/T)  •  Begin  at  high  T:  accept  even  unfavourable  E  •  Protocol:  Gradually  decrease  T…  •  Un5l  T=0  where  the  system  is  frozen  

The  R-­‐free  concept  

•  Minimizing  the  R  factor  is  not  a  guarantee  for  finding  the  true  op5mum  

•  Use  sta5s5cal  analysis  concepts  to  validate  the  refinement  

•  Select  a  random  set  of  10%  of  the  reflec5ons  and  leave  them  out  of  R-­‐factor  minimisa5on  

•  This  gives  R-­‐work  •  Calculate  R-­‐free  on  this  set  of  flagged  Refl.  •  R-­‐work  and  R-­‐free  should  both  go  down  during  a  well  conducted  refinement  and  remain  close…  

Increase  data/param.  ra5o  

•  Reduce  the  number  of  parameters  – Dihedral  angles  instead  of  posi5ons  – B-­‐factors  given  by  TLS  server  – Collec5ve  degrees-­‐of-­‐freedom  (Normal  Modes)  

•  Or  collect  new  data  sets  at  higher  resolu5on  (high  pressure,  another  crystal  form…)  

Model  Building  and  Refinement:  References  

•  Paul  Emsley  (Coot)  •  T.  Terwilliger  (Solve/Resolve:  Phenix)  •  Kevin  Cowtan  (Buccaneer)  •  Lamzin  and  coll.  (ARP/wARP)  •  Phase  combina5on  (Sim  weigh5ng  scheme)  •  R-­‐free  concept  (CNS,  A.  Brünger)  •  Log-­‐likelihood  (Buster,  G.  Bricogne;  Phaser,  R.  Read)  •  K.  Karplus  and  K.  Diederichs  (CC1/2):  get  the  most  of  your  data  (define  maximul  usable  resolu5on)  

Valida5on  of  the  final  model  

•  Procheck  (J.  Thornton,  EBI)  •  Whatcheck  (G.  Vriend)  •  Ramachandran  outliers  •  Rotamers  outliers  •  PDB  deposi5on  (including  the  data  sets)  •  PDB_Redo  (Perrakis  and  Vriend,  JMB,  2016)  

Table  of  Refinement  sta5s5cs    

Analysis  of  structures  

•  Sequence  analysis  from  mul5alignement  (Muscle,  MAFFT…)  

•  Project  sequence  conserva5on  onto  the  surface  (Consurf)  

•  Phylogeny:  rate  of  divergence  posi5on-­‐by-­‐posi5on  mapped  onto  the  structure  (Diverge)  

•  Electrosta5cs  (D.  Baker,  APBS):  solve  Poisson-­‐Boltzmann  equa5on  (assign  charges…)  

The  interpreta5on  of  structures  

•  Collect  other  data  sets    – At  different  temperatures  –  In  different  crystal  forms  – With  different  substrates  – Mutants  of  known  func5on  

•  Any  exis5ng  structure  related  to  the  “new”  one?  – Use  DALI  server  –  Visit  EBI,  UK  –  hUp://ekhidna.biocenter.helsinki.fi/dali_server/start  

Mul5ple  alignments:  Consurf  hUp://consurf.tau.ac.il/2016/  

Phylogeny  and  Structure  •  Project  rates  of  divergence  posi5on-­‐by  posi5on  onto  the  3D  structure  

Electrosta5cs  (APBS,  D.  Baker)  

•  hUp://www.poissonboltzmann.org/  

Some  usefuls  links  

•  Lorentz.dynstr.pasteur.fr:  this  presenta5on  •  Lorentz.dynstr.pasteur.fr/website/index.html  •  Structural  Medicine  on-­‐line  course  (R.  Read,  Cambridge,  UK):  hUp://www-­‐structmed.cimr.cam.ac.uk/course.html  

•  Bernhard  Rupp  web  site:  hUp://www.ruppweb.org/Xray/101index.html