Cours Sur Microbiologie-Industrielle Goudjal

7/25/2019 Cours Sur Microbiologie-Industrielle Goudjal

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Ministre de lenseignement suprieur et de la rechercher scientifique

Universit Telidji Amar LaghouatFacult des sciences et de lingnieur

Dpartement de biologie

Complment des cours de microbiologie industrielle destin aux

tudiants de la cinquime anne gnie biologique

Introduction la microbiologie industrielle

Par M. Y. Goudjal

2005 / 2006


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Cours de Microbiologie industrielle ralis par Y. Goudjal - 1 -

MICROBIOLOGIE INDUSTRIELLE.

Gnralits.

Les microorganismes au service de l'homme : Des ouvriers qualifis mis enuvre selon des processus gnimicrobiologiques, en lchelle industrielle, afindassurer une biosynthse et/ou une bioconversion.

Domaines dactivit de la microbiologie industrielle

agro-alimentaire (agents de saveurs, mulsifiants, fermentations alcoolique,lactique) production d'nergie (thanol, mthane, hydrogne,) production de solvants (actone, butanol,) environnement (bioremdiation des sols pollus, puration biologique de'eau, forage ptrolier, extraction de minerais ou biolixiviation,) agriculture, horticulture(vecteur pour la production dOGM, herbicides,insecticides, hormone vgtales - gibbrellines ) biologie molculaire (production d'enzymes de restriction,) industrie pharmaceutique (antibiotiques, vitamines, acides amins,insuline, hormone de croissance, hydrocortisone, interfron beta-1b,et denombreux autres produits du groupes des antitumoraux, immunosuppresseurs,anti-inflammatoires,)

Intrts de lutilisation des microorganismes

Cot plus faible que les procds par voie chimique : catalyse enzymatique,

Faisabilit synthse et biotransformations (ex : prostaglandines, strodes) decertaines molcules ne peuvent se faire que par voie microbienne spcificit de la raction strospcificit

Scurit accrue absence de virus (sida, hpatite B) ou prion ex : cas de transmission de

la maladie de Creutzfeldt Jacob par hormones de croissance extraites

de lhypophyse de cadavres contamins.


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Cellule bactrienne : produits microbien dintrt industriel

Une fois le micro-organisme recherch obtenu, la formation des produitsdsirs dpend de la mise en culture du microorganisme.

L'utilisation des micro-organismes en biotechnologie moderne est donc basesur les principes de la culture en masse. Implique alors :

la gestion des procds de culture microbienne la connaissance des facteurs limitants la croissance microbienne.

Fig. 01 Reprsentation schmatique des produits microbiens dintrtindustriel.


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1 Croissance microbienne.

1.1 Modlisation de la croissance.

> croissance des populations microbiennes = augmentation de la populationmicrobienne.> Accroissement du nombre de cellules selon une progression gomtriqued'ordre 2

X = biomasse

G = temps de gnration moyen d'une population.n = nombre de gnrationt= temps de culture

- Expression mathmatique de la croissance microbienne


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= 1/X dX/dt

correspond donc la vitesse de croissance rapporte l'unit debiomasse soit = rxt/Xt

rxt = vitesse de croissance au temps t. [unit de biomasse h-1 unit debiomasse -1] (h-1) est un paramtre de la culture, il est fonction de la souchebactrienne et des conditions de culture. En dehors de la phase exponentielle, la vitesse spcifique de croissancevarie, traduisant des tats physiologiques diffrents. Le phnomne decroissance cellulaire comporte en effet plusieurs phases.

1.2 La courbe de croissance microbienne

Fig. 02 Courbe de croissance des microorganismes en milieu non renouvel.

Un milieu de culture est ensemenc par une suspension microbienne, lavariation de la biomasse (X) est suivie en fonction du temps.

1.3. Effet de la concentration en substrat Au cours de la phase exponentielle de croissance, bien que la composition dumilieu de culture varie normment, le taux de croissance reste constant.


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Effet de la concentration en substrat sur la croissance ()

est fonction de la concentration en nutriment limitant seulement dans unegamme de concentration trs faible. S = substrat limitant (celui qui rgle la vitesse des synthses et le rythmedes divisions).

La connaissance de ces paramtres est indispensable pour menercorrectement une culture bactrienne prdire les cintiques de production de biomasse (=masse de l'ensemble descellules bactriennes) connatre les concentrations minimales en substrat ncessaires unecroissance maximale, ncessiter parfois de faire travailler les cellules des spcifiques de lamolcule produire.


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2 Besoins nutritifs.

2.1 Elments de constitution.

C, O, H, N, P et S lments majeurs

lments de constitution des molcules biologiques (protines, glucides,acides nucliques, ) lis entre eux par des liaisons covalentes. formule chimique de la biomasse bactrienne : C5H7O2NP0,03 ou encore (C5H7O2N0,75P0,05S0,025) Besoins nutritifs essentiels en C, N et P = 3 lments essentiels etncessaire en grande quantit pour les cellules afin dassurer la formation denouvelles structurescellulaires

- Formes assimilables des lments majeurs : C, N, P, S( Les besoins en O et H sont satisfaits en gnral avec la source de carbone(ex : glucose = C6H12O6 ), par l eau ou la source d azote).

Carbone :

Le carbone = besoin fondamental, constituant de base de toute structureorganique Environ 50% de la masse cellulaire sche = carbone. Organismes htrotrophes: besoin en carbone organique : Glucose, Acides

amins, actate, fructose, lipides, protines,polysaccharides, glycrol,(autotrophes: carbone inorganique : CO2, HCO3-)

Azote :Principalement incorpor sous trois formes: NH4+ (ammonium) : Forme principale d assimilation de l azote. Peut aussiltre sous forme d acides amins. Toutes les bactries sont en principecapables d assimiler lazote sous cette forme. Mais attention aux effetsrpresseurs des formes facilement assimilables sur la synthsedantibiotiques, denzymes NO3-, NO2- (nitrate, nitrite) : Concerne un nombre plus restreint demicroorganismes. Forme + oxyde donc plus coteuse assimiler ( ncessiteune dpense d lectrons pour rduire cette forme en ammonium). Toxicitdes nitrites.

NO3-+ 8e-> NH4+ N2 (azote molculaire) : Assimilation exclusivement connue chez lesbactries. Source inpuisable d azote mais trs coteuse en nergie.Concerne des groupes trs spcifiques de micro-organismes ( Rhizobium,).

1/2N2+ 4e-> NH4+Demande une nergie d activation trs leve.


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- Besoins en N : environ 14% de la masse cellulaire sche = azote

Phosphore : essentiellement sous forme de phosphates (PO43-; HPO42 ;H2PO4-; H3PO4) ou polyphosphates.

Besoins en P : 1 - 3% de la masse cellulaire sche = phosphore.

Soufre : Sous forme rduite, SH ou S apport par les AA soufrs(cystine etmthionine) et les vitamines soufrs (biotine) = source prfrentielledassimilation du soufre. H2S, dans les environnements rducteurs (milieux anarobies). SO4-, sulfates. Forme coteuse en nergie mais la plus abondante. Besoins en S: < 1% de la masse cellulaire sche = soufre

Elments mineurs et oligolments Essentiellement des cations, ne sont pas lis aux autres molcules par desliaisons covalentes (l. lectrostatiques,). K+ (principal cation, cofacteur), Fe2+ (cytochromes), Ca2+ et Mg2+(thermorsistance, cofacteurs, stabilit membranaire,), Mn2+, Co2+ (pourvitamine B12), Zn2+, Cu2+, Mo2+, Ni+, besoins: classiquement du ng au mg / L mais les besoins peuvent tre spcifiques pour

la synthse dantibiotiques (10 100 fois les besoins en Fe et Mn et Zn requispour la croissance)

Facteurs de croissance> Constituants indispensables la croissance en trs faible dose (0,1 - 1mg/L). Souvent les microorganismes possdent les voies mtaboliquespermettant leur synthse = prototrophes ( ex : Escherichia coli). Acides amins essentiels (Glu, Lys, Arg, Trp, Tyr) Bases puriques et pyrimidiques

Vitamines (en gnral : cofacteur ou prcurseur de cofacteursenzymatiques).> Leur prsence dans le milieu facilite la croissance des microorganismesprototrophes, elles est indispensable pour les auxotrophes.


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2.2. Besoins nergtiques

Htroorganotrophes : composs organiques = source de carbone et dnergie

- Utilisation de l'nergie cellulaire nergie ncessaire la croissance et aux divisions cellulaires nergie d'entretien ou de maintenance : nergie utilise pour d'autres voiesque la production de biomasse. En principe, reprsente une constante. mobilit cellulaire assimilation, transport des nutriments rparation nergie ncessaire la synthse des protines recombinantes = nergiedtourne, dissocie de la croissance.

- Conversions nergtiques Principe des conversions nergtiques: dgradation des molcules hautpotentiel nergtique couple avec la production d'adnosine triphosphate(ATP) = catabolisme. Deux mcanismes de base de production de l'ATP : phosphorylation au niveau du substrat> fermentation phosphorylation oxydative> respiration


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2.2.1 phosphorylation au niveau du substrat et fermentation

- Schma des fermentations (cellule bactrienne)

Mtabolisme anarobie (ex : fermentation alcoolique Saccharomyces.cerevisiae)


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Cours de Microbiologie industrielle ralis par Y. Goudjal - 10

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Mtabolisme anarobie (fermentation) et nergie de maintenance

2.2.2. Phosphorylation oxydative et respiration

Respiration = processus gnrant de l'ATP qui implique le transfert

d'lectrons au travers d'un systme de transport d'lectrons et de protons.


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Fig. Schma de la respiration cellulaire.

- Mtabolisme respiratoire (arobie)(ex : E. colisur glucose)


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- Mtabolisme arobie.

- Respirations et fermentations

Rendement ATP: fermentations


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- Matires brutes couramment utilises :

Sources de carbone et d'nergie:

mlasses grains de crales

petit lait dchets agricoles, Sources d'azote

farine de soja vinasses dchets d'abattoir ammoniaque et sels d'ammoniaque,

Vitamines

prparations brutes de produits vgtaux et animaux,

Fer et oligolments

drivs chimiques inorganiques bruts, Antimousses

alcools suprieurs esters naturels silicones saindoux et huiles vgtales,

Tampons de pH

craie, carbonates bruts phosphates pour engrais

2.4. Environnement physique

Contrle prcis : de l'agitation de l'oxygnation

critique en culture arobie, tenir compte des coefficients de transfertsgaz, liquide, de la viscosit du milieu (milieu visqueux souvent observ encroissance myclienne,) croissance floconneuse des myctes qui modifie l'efficacit du transfert

de la temprature du pH


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3. Production des mtabolites et molcules dintrt

3.1. Mtabolites primaires et mtabolites secondaires.

Les produits microbiens qui intressent l'industrie sont :

des mtabolites primaires : associs la synthse des cellules microbiennes.Ils sont impliqus dans la phase de croissance (AA, nuclotides, produits defermentation, enzymes,). Les voies de biosynthse sont en gnral simples.

des mtabolites secondaires : ne sont pas indispensables au dveloppementde lorganisme. Synthtiss dans des conditions particulires, s'accumulentpendant la priode suivant la phase de croissance active et n'ont pas derelation directe avec la synthse des matires cellulaires et la croissancenormale (antibiotiques et toxines). Voies de biosynthse complexes et longues.Spcifique une espce voire une souche microbienne.

- Production des mtabolites primaires et secondaires au cours de lacroissance

Fig. production de mtabolites primaires et secondaires au cours de lacroissance.

Les phases de la croissance doivent donc tre parfaitement matrises pouroptimiser la production des mtabolites d'intrt.

3.2. Stratgie globale de production

Produits associs la production dnergie :

Conditions optimales : celles qui vont conduire la production maximale duproduit recherch associ une production faible de biomasse = conversion

optimale de la source de carbone en produit.Ex : produits de fermentation.


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Produits associs la biomasse : rechercher les conditions de productionmaximale de cellules.

Produits inductibles (protines recombinantes) : leur production estdpendante de linduction du gne correspondant (fusionn avec un promoteur

inductible : tac, Trp,).

3. Principales familles de produits en microbiologie industrielle.

3.1. Mtabolites primaires

3.1.1. Acides amines : laide de mutants drguls

Cas gnral : produits par perturbation des systmes de production :accumulation intracellulaire. L'intrt de production par voie bactrienne estla strospcificit de l'AA obtenu (on obtient uniquement des acides aminsL). Acide glutamique : form par amination de lacide. ctoglutarique (KG) (ducycle de Krebs) avec utilisation de C. glutamicum, fermentation en prsenced'un excs de NH3, la souche a perdu la capacit former le succinate partir de lKG ; en outre, carence en biotine et ajout d'AG permettentd'augmenter la permabilit membranaire. Synthse ou bioconversion dAA essentiels ou non : Asp, Ala, Arg, Citrulline,Cys, DOPA (dihydrophnylalanine, par Erwinia herbocola), Gln, His, ornithine,

Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Val, Tyr, Ile, Leu.3.1.2. Vitamines : Produits souvent intracellulaires.

Vitamine B12 (cyanocobalamine), seule source de production par culturemicrobienne (Streptomyces olivaceus, Propionobacterium shermanii, P.denitrificans).

Vitamine B2 (riboflavine) par Ashbya gossypii & Eremothecium ashbyi).

-carotneprcurseur vitamine A, par Blakeslea trispora,

Ergosterol, a-tocophrol (vit. A), acide ascorbique (vit. C)3.1.3. Polysaccharides

Production spcifique par des microorganismes dont le polymre est extrait.Peut ncessiter la culture en conditions spcifiques (induction de la synthsepar carence dun lment, par culture anarobie, en phase stationnaire,).

Xanthane, alginate, PHB polyhydroxybutyrate (dans les plastiquesbiodgradables), caraghnanes et agar (algues rouges), cellulose, chitosane,

dextrane, gellane, pullulane,


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3.1.4.Divers

Acides organiques : ac. Acetiques (anaerobie, Clostridium thermoaceticum:35 g/L, fed-batch), ac. Citrique ( Aspergillus niger,), ac. Lactique, ac.Gluconique,

Alcools et solvants : actone ( Clostridium acetobutylicum),dihydroxyactone, polyols, butanol, thanol,

Carburant : thanol (80% de la production mondiale est produite parfermentation, partir de cellulose, glucose, amidon), mthane (pardcomposition anarobie de la matire organique) et dautres hydrocarbures.

Lipides (sphingolipides: cosmtologie,)

3.2. Mtabolites secondaires

3.2.1. Antibiotiques

Produits en particulier par les actinomyctes ( Streptomyces) et par desmyctes filamenteux.

Avec souvent des souches amliores par mutation ou gnie gntique(transfert du gne de rsistance l'AB permettant une hyperproduction sansinhibition).

La production a lieu au cours de la phase stationnaire de croissance, except

pour les ttracyclines. + concentrations en sels minraux (Fe, Mn, Zn) 10 100 X suprieures celles requises pour la croissance.

point crucial : contrle du milieu.

Les conditions optimales requises pour la production des antibiotiques nesont pas ncessairement identiques celles permettant une bonnecroissance !

Exemple de la pnicilline : La production de pnicilline par Penicillumchrysogenumncessite un ajustement soigneux de la composition du milieu, delair et de lagitation. En prsence de lactose ou damidon et avec limitation enazote, la pnicilline s'accumule.Le maintien du pH proche de la neutralit assure plus de stabilit l'antibiotique. Une source facilement assimilable de carbone exerce une actionngative sur la biosynthse. Avec le glucose les rendements en antibiotiquessont faibles. C'est nanmoins possible en racteur de type fed-batch avec uncontrle fin de la concentration en glucose.


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3.2.2. Produits pharmacologiquement actifs, pesticides, Alcalodes Analgsiques Anti-inflammatoires

Antitumoraux Immunodpresseurs Toxines (toxine botulique,) Pesticides : nmaticides, fongicides, insecticides (protoxine par Bacillusthuringiensis),

3.3. Enzymes

Endo ou exocellulaires. Les exoenzymes seront plus faciles extraire Leur synthse est souvent inductible par le substrat, sensible au pH, lessources de carbone et/ou dazote peuvent influer sur leur synthse. Une bonne connaissance des conditions de production est donc ncessairepour une production optimale. Recherche des souches ou production de mutants permettant une productionmaximale de lenzyme recherche (absence de rpression dans leursynthse,), associe une production minimale de sous produits (toxines,antibiotiques, pigments, protases,). Applications : analyses, agro-alimentaire, synthses, gnie gntique,industries diverses, domaine de la santEx : catalase

3.4. Biotransformations

= raction chimique catalyse par une enzyme (la raction correspondantepar voie abiotique est souvent impossible ou difficile). Concerne la synthse dacides amins, dantibiotiques, de vitamines,dhormones (strodes), de prostaglandines.

Trs souvent il s'agit de simple bioconversion partir d'un compos naturelou obtenu par synthse chimique.Ex: biotransformation de bases purique et de thymidine en ribothymine (5-mthyluridine), procd lorigine de lAZT (3azido-3 dsoxythimidine) parErwinia carotovora.

4. Production de molcules trangres par des cellules transformes

Lutilisation de micro-organismes transforms permet de produire dessubstances thrapeutiques jusqualors impossibles synthtiser : hormone de croissance humaine ou bovine par E. coli


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Insuline humaine par E. coli Interfrons humains par E. coliet B. subtilis Stroides : hydrocortisone rcemment obtenu par utilisation d'un panel desouches de levures transformes (Mnard Szczebara, Chandelier et al. , 2003,

Nature Biotechnol.) et partir de glucose. Leptine (hormone protique associe lobsit) par E. coli

4.1. Cellules transformes

Principe gnral : clonage dun gne dune protine dsire dans un plasmidemulticopies sous contrle dun promoteur fortement inductible (ex promoteurde lopron lactose, trp,).

Objectifs :

Produire une grande quantit de protines, Pouvoir dclencher la synthse au moment voulu (ex. : selon la phase decroissance, temprature donne,).

Fig. Etapes dobtention de cellules transformes


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Contraintes:- Extraction/Scrtion : les protines se trouvent gnralement sous formede corps dinclusion (agrgat de protines). Forcer la scrtion en greffantune squence signale spcifique de protine extracellulaire.- Protolyse : greffer une squence protique reconnue par la cellule pourviter la protolyse par le systme de reconnaissance de la cellule.- Purification

- Pas de modification post-traductionnelles (pas de maturation de l'ARNm),- Solubilisation, renaturation.

La production dune grande quantit de protines est possible. Mais elle estgnralement associe une faible croissance, le stress provoqu conduittrs rapidement un arrt de lacroissanceUne croissance sous forme filamenteuse des cellules peut alors se produire,traduisant une inhibition de la segmentation. Cette absence de segmentationest lie une sous-expression des gnes impliqus dans la division cellulaire.Exemple : E. colitransforme pour produire lIGF-I (insuline like)


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5 Conduite des bioracteurs

5.1. Bioracteurs - Dfinition : un bioracteur est une enceintespermettant la culture de tout type de cellules (animale, vgtale, levures,moisissure, bactries) et rpondant des critres de conception permettant

d'influer efficacement sur la culture, de contrler et piloter les paramtresphysiques et chimiques (TC, aration, pH, substrats,). Ils doiventpermettrent une strilisation facile et un maintien de l'asepsie pendant toutela dure de la culture. Et tre caractriss par une rsistance mcanique etchimique aux contraintes lies la culture de microorganismes : surpression,corrosion, Matriel en verre (vol.


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5.2.Culture discontinue ("batch") ou ferm

Inoculum + milieu et on laisse se drouler la culture dans un fermenteurparfaitement mlang.

Le volume reste donc constant. La biomasse augmente selon la courbe de croissance microbienne. Le substrat S est consomm et le produit P attendu apparat.

Tous les composs se trouvent dans le milieu de culture au dpart, onn'intervient plus sur la compositiondumilieu.

Fig. Paramtres dun bioracteur.

- Fermentation discontinue ("batch")L'volution de la biomasse suit la relation :

Rx= vitesse de croissance cellulaire

Productivit souvent faible (quantit de produit L-1 h-1), elle dpend surtoutde la taille de l'inoculum, qui souvent est faible, et conduit des phases delatence longues. Le dmarrage de la culture, associ au temps ncessaire laremise en service du racteur (lavage, strilisation,) est donc souvent lefacteur limitant.


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5.3. Fermentation discontinue alimente ("fed batch")

La fermentation est initie dans un plus faible volume (pied de cuve). Doncpour une mme taille d'inoculum, la fermentation va dmarrer plus vite.

Lorsque la culture est en phase exponentielle de croissance, le milieu strileest introduit dans la cuve. Le dbit est rgl de sorte ce que, par exemple,[X] ou [S] soit constant dans la cuve

Fig. Reprsentation schmatique dun fermenteur aliment discontinu (fed

batch)

Lorsque la cuve est remplie, on coupe l'alimentation, la culture volue alorsconformment la courbe de croissance discontinue. Technique trs utilise en pratique:

gain de temps et de productivit possibilit de travailler max.

possibilit de modifier la composition du milieu durant l'opration.- Permet d'orienter si ncessaire le mtabolisme de la souche et destimuler la production de mtabolites aprs avoir favoris la croissance. possibilit d'augmenter la concentration en substrat des valeurs quiseraient inhibitrices si on devait les appliquer en batch en dbut decroissance. ex; utilisation de glucose pour la production de pnicilline thoriquementinhibiteur de fortes concentrations).


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5.4. Fermentation continue (en racteur parfaitement mlang) La suspension microbienne est homogne en tout point de la cuve. Initiation par une phase de croissance discontinue. Ouverture des pompes,

Lorsque le systme est l'quilibre, tous les paramtres sont constants. Le dbit Q, dont dpend D, dtermine et X (densit bactrienne) selon lesrelations qui relient S et X.

Fig. Reprsentation schmatique dun fermenteur en continu.

D = taux de dilution, soit le taux auquel est ajout le milieu par unit de temps= Q/V (t-1).

- Modlisation mathmatique de la croissance en chmostat (racteurcontinu) :

A l'tat stable (quilibre), dX/dt = 0 et donc = D.Qt de cellules produites = qt de cellules perduesSi > D > XSi < D > XLe chmostat ne peut pas fonctionner pour D > max.


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A l'quilibre, quel est l'effet d'une augmentation du dbit (Q) sur et sur labiomasse [X] ?

Fig. Effet de laugmentation du dbit sur la biomasse.

Le taux de perte en biomasse entrane un ajustement du taux de croissancepour retourner un quilibre.

- Variations de S et X en fonction de D


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5.4. Fermentation continue

Productivit en biomasse est plus leve qu'en discontinue ou semidiscontinu(volume utile de la cuve mieux utilis, cuve n'est pas vide, nettoye,strilis)

Problmes de contamination d'un tel systme difficile maintenir, biofilms,mutations, Outil intressant pour l'tude des cintiques microbiennes

calcul de max et des Ks. effet de la modification du milieu sur la physiologie et sur la suspensionbactrienne. possibilit de maintenir la culture un donn le dbit et la concentration en nutriments fixent la vitesse spcifiquede croissance.

5.5. Autres systmes :

Racteur flux piston Culture avec recyclage Systmes immobiliss,

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