Cours Genie Genetique L3 Partie1

7/24/2019 Cours Genie Genetique L3 Partie1

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Enseignant responsable de la matire : Pr, KITOUNI Mahmoud

Objectifs de lenseignement

Faire comprendre les multiples applications de ces techniques chez les

microorganismes et leurs applications biotechnologies. .

(anne universitaire 2014/2015)Gnie gntique


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Contenu de la matire

1. Introduction au Gnie Gntique

- transferts des gnes entre organismes

- profils de restriction modification et dcouverte des enzymes de restriction

- potentialits du gnie gntique


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2.1-. lments ncessaires au clonage

- lADN cloner

- les enzymes de restriction : leur dnomination et leurs proprits

- les vecteurs de clonage, leur construction et leurs caractristiques

(les vecteurs plasmidique, les vecteurs phagiques, les vecteurscosmidiques)

- les cellules hte : - mthodes de transformation et transfection

2. Principes gnraux du gnie gntique

2.2. Les tapes du clonage - construction du vecteur

- insertion de lADN cloner

- slection des recombinants

- mise en vidence des recombinants

- mise en vidence des gnes clons grce aux vecteurs plasmidiques

- mise en vidence des gnes clons grce aux vecteurs phagiques


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3.- Applications et potentialits du gnie gntique- production de protine par la bactrie E. coli. ,

- production par la levure Saccharomyces cerevisiae,

- production de linsuline sur E.coli trangnique


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Gnie gntique

I. DFINITION

Lexpressiongnie gntique ou la technologie de lADNrecombinant sapplique la

recombinaison de lADN in vitro, puis au transfert de lADN recombinant dans un

hte appropri qui en assure sa rplication, voir son expression.


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Le gnie gntique principalement trois buts :

II. OBJECTIFS

1- Obtenir de grande quantits dun ou plusieurs gnes pour en analyser la squence,

lorganisation,la rgulation, etc

2- Obtenir grande chelle lexpression dun gne dont le produit est particulirement

interessant (enzyme, hormone, antigne pour vaccin, etc.

Gnie gntique

3- Modifier le phnotype dunorganisme vivant (cellule, animal, vgtale, virus) en leur

insrant un gne provenant dunautre organisme.


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III. APPLICATIONS

Gnie gntique

- Production de vaccins vivants

- Production de plantes rsistantes des insectes ou des pesticides

- Production danimaux transgniques comme modles de maladies humaines

- Thrapie gnique


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III. METHODOLOGIE

Gnie gntique

Le clonage de gnes est la base du gnie gntique. Il implique :

- Lisolementet la fragmentation de la source de lADNet linsertion des fragments dADN

dans un vecteur (plasmides, ADN de phages ou de virus etc.)

- Lincorporationde lADNrecombinant dans une cellule hte capable dassurerla rplication

du vecteur

- La dtection et lisolement du clone cellulaire contenant le gne intressant


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Gnie gntiqueIsolement d'ADN

provenant dedeux sources

Les diffrentes tapes engnie gntique


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Gnie gntique

Les diffrentes tapes engnie gntique


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Gnie gntiqueDveloppement du gnie gntique

Le gnie gntique sestdvelopp grce aux progrs raliss dans les domaines

de la microbiologie et de lenzymologie

Conjugaison

Le mle dE. coli montre des pili, dont un pilus sexuel qui se joint une cellule femelle . Le pilus sexuel tubulaire tablit une jonction cytoplasmique traverslaquelle le mle transmettra de lADN la femelle .

Campbell, BiologieDeBoeck Universit (1995) p359


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Pont cytoplasmiquepermettant

lchange dematriel gntique

Conjugaison


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Le schma montre un transfert en cours : passage d'un monobrin avec rplication chez le donneuret l'accepteur. Il ne montre pas le rsultat final : la bactrie donatrice reste F+ et la receveusedevient F+ (le monobrin qui passe et se rplique est recircularis en plasmide F complet,fonctionnel).



de la microbiologie et de lenzymologieConjugaison

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK21942/#A1314

Chromosomebactrien

Bactrie donatrice

Bactrie rceptrice

Plasmide

Pilus

Pont deconjugaison
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK21942/#A1314http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK21942/#A1314


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Transduction

Figure 17.1

Virus injectant son ADN dans unebactrie. Ce schma reprsente la premiretape de lundes phnomne biologiques lesplus remarquables : lassujettissementgntique dune cellule par un Virus.Linfectiondbute lorsque le Virus injecte sonADN dans la cellule hte. Dans le casprsent ici, la cellule est la Bactrie E. coliet le Virus est un Bactriophage T4. Cestentudiant les Virus et les Bactries que lesbiologistes ont entrevenu pour la premirefois la subtilit des mcanismes molculairesde lhrdit.

Campbell, BiologieDeBoeck Universit 1995 p344


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de la microbiologie et de lenzymologieTransduction


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Le gnie gntique sestdvelopp grce aux progrs raliss dans les domainesde la microbiologie et de lenzymologie

Transduction

G


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Transformation

Binding

DNA

Uptake of DNA

RecA-mediated

homologousrecombination

(a) (b)

(c)(d)

G i i


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Gnie gntique

Dveloppement du gnie gntique


Enzymes agissant sur les acides nucliques

La polynuclotide kinase, la terminal transferase, la phosphatase alcaline, la DNApolymrases, la reverse transcriptase, la RNA polymrases, la poly(A) polymrase,la DNA ligases, la RNA ligase, la topoisomrase, les enzymes de restriction, lesribonuclases (A, T1, H), les dsoxyribonuclases, la protinase K, la -galactosidase.

G i ti


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ADN de lhtenon mthyl

5

3

3

5

G AA T T C

C T TAA G

Enzyme demthylation

EcoR1ADN trangernon mthyl

Enzyme derestriction

EcoR1

5

3

3

5

G A A T T C

C T T A A G

Hydrolyse

53 35

G AA T T C

C T TAA G

Enzyme derestriction

EcoR1

CH3

CH3

Lenzyme de restrictionEcoR1 ne peut pas cliver

lADN mthyl

Extrmit cohsives

53

35

A A T T C

C T T A A

G

G



(a) : Restriction (b) : Modification

G i ti


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Gnie gntique

Les enzymes de restriction

- Les endonuclases de restriction sont des enzymes bactriennes participant unmcanisme de dfense des bactries vis--vis des virus : systme de restriction-modification.

- Elles catalysent la coupure de lADNnon mthyl en des endroits caractriss parune squence spcifique de nuclotides (site de restriction). Les produits de cettedigestion sont les fragments de restriction, dont la longueur, toujours la mme pourun ADN donn, ne dpend que de la squence primaire de cet ADN.

G i ti


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Gnie gntiqueLes enzymes de restriction

Type 1 Type II Type III

Exemple EcoB EcoRI EcoPI

Site de reconnaissance TGAN8TGCT GAATTC AGACC

Site daction (clivage) Environ 1kb aprs le

site de reconnaissance

Entre G et A

(des deux brins)

24-26 pb 3 ausite

de reconnaissance

Site de mthylation

TGAN8TGCT

ACTN8 ACGA

GAATTC

CTTAAG

AGACC

Un seul brin

mthyl

Nuclase et mthylase sur lamme enzyme

Oui Non Oui

Besoin pour le clivage ATP, Mg2+, S-AdoMet Mg2+, Mn2+ Mg2+, S-AdoMet

Besoin pour la mthylation ATP, Mg2+, S-AdoMet S-AdoMet Mg2+, S-AdoMet

S-AdoMet : S-adnosyle-mthionine

Gnie gntique


Il existe trois types isols des bactries

G i ti


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- Lanalysede la longueur des fragments de restriction, la recherche de variationsindividuelles (polymorphismes de longueur des fragments de restriction = RFLP) estune des techniques danalyse de la squence primaire de lADN la recherchede substitutions, dinsertions ou de dltions qui modifient le nombre de sites derestriction et donc la longueur des fragments de restriction.

- Les extrmits des fragments de restriction peuvent tre formes de deux brinsdgale longueur (bouts francs) ou bien prsenter un brin plus long que lautre dequelques nuclotides (bouts collants).

Gnie gntique


- Le type II est le plus utilis car le site de reconnaissance est lui-mme le site decoupure,

G i ti


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bouts francs

bouts collants(cohsifs)


G i ti


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Nomenclature des enzymes de restriction


G i ti


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- Les enzymes de restriction sont des hydrolases (classe 3 de la E.C.) agissant sur desliaisons esters (sous-classe 3.1), cest--dire des estrases.

- Parmi les estrases on distingue celles qui hydrolysent un acide nuclique enfragments polynuclotidiques (endonuclases) et en particulier celles dont les produitsgardent leur phosphate 5initial (sous-sous-classe 3.1.21).

- Enfin en fonction des cofacteurs, les enzymes de restriction ne ncessitent que laprsence de lionMg++dans le milieu (3.1.21.4)

- Le nom de chaque enzyme est driv du nom despceou de varit de la Bactrie quila produit. On crit linitialedu nom du genre, les deux initiales du nom de lespce,1lettre ou 1 nombre pour dsigner la varit (ou souche) et aprs un espace un chiffreromain pour dsigner successivement les diffrentes enzymes de restriction obtenues partir de la mme souche.

Nomenclature des enzymes de restriction


Gnie gntiq e


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Restriction (raction gnrale)


- La raction gnrale catalyse par les enzymes de restriction implique la prsencedans le milieu ractionnel des facteurs suivants :

Enzyme Substrat : ADN double brin non digr Produit : ADN double brin digr Cofacteurs

Substrat

(ADN)

Produit

(ADN digr)

- En gnral, seul le Mg++est indispensable. Quelques endonuclases font appel

dautrescofacteurs. Les enzymes de mthylation ont pour coenzyme la S-Adnosyl-Mthionine (S-AdoMet).

- Des facteurs physiques contrlent aussi ces ractions : pH, potentieldoxydorduction, force ionique. Lnergie libre dgage par lhydrolyse estsuffisamment importante pour que la raction ne soit pratiquement pasrversible dans les conditions habituelles.

Gnie gntique


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Tampons dincubation (restriction)

- Diffrents tampons sont utiliss pour les enzymes de restriction permettantloptimisationdes ractions de multiples enzymes avec le mme tampon.

- Toutes les enzymes de restriction ncessitent la prsence de lionMg++

- Le pH (7,0 - 7,9), le potentiel doxydo-rduction (dithiothritol 1 mM), la forceionique (NaCl ou CH3COOK de 0 100 mM) varient duntampon lautre.

- De rares enzymes ncessitent des conditions spciales prcises par leur modedemploi.

Gnie gntique


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10 mM Tris propane-HCl(pH 7,0 25 C)10 mM MgCl2

(1 mM DTT)

10 mM Tris-HCl(pH 7,9 25 C)10 mM MgCl2

50 mM NaCl(1 mM DTT)

10 mM Tris-HCl(pH 7,9 25 C)10 mM MgCl2100 mM NaCl(1 mM DTT)

20 mM Tris-CH3COOH(pH 7,9 25 C)10 mM Mg(CH

3

COO)250 mM CH3COOK

(1 mM DTT)


Tampons dincubation (restriction)

Gnie gntique


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Exemples denzymes de restriction

EcoR I

NNNNGAATTCNNNN

NNNNCTTAAGNNNN

NNNNG

NNNNCTTAA

AATTCNNNN

GNNNN

+

2H2O Mg++

ADN double brin ADN digr

- EcoR Iest une enzyme de restriction produite par Escherichia coli, souche R.

- Le site de liaison lADNest form de six paires de nuclotides :

5 GAATTC 33 CTTAAG 5

Gnie gntique


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- Les sites de restriction sont souvent de type palindrome, cest dire quils sontidentiques sur les deux brins de lADN (mais antiparallles sur lautre brin).Lorsque lhydrolysedes liaisons phosphodiester se fait loin du centre de symtrie

du palindrome certaines paires de nuclotides restent non apparies : lesfragments qui en rsultent sont dits bouts collants .

- La mthylation des adnines ou de la cytosine du site dhydrolyse inhibent lareconnaissance du site par EcoR I. LADNde la bactrie ainsi mthyl nestpashydrolys alors que lADNparasite qui nestpas mthyl sera hydrolys.

5 GAATTC 33 CTTAAG 5



EcoR I

Gnie gntique


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EcoR V


NNNNGATATCNNNN

NNNNCTATAGNNNN

NNNNGAT

NNNNCTA

ATCNNNN

TAGNNNN+

2H2O Mg++

Mthylation (-)

- EcoR Vest une enzyme de restriction produite par Escherichia coli, souche R.


5 GATATC 33 CTATAG 5

Gnie gntique


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EcoR V

- Les sites de restriction sont souvent de type palindrome, cest dire quils sontidentiques sur les deux brins de lADN (mais antiparallles sur lautre brin).Lorsque lhydrolysedes liaisons phosphodiester se fait au centre de symtriedu

palindrome toutes les paires de nuclotides restent apparies : les fragments quien rsultent sont dits bouts francs .

- La mthylation des adnines du site dhydrolyseinhibent la reconnaissance du sitepar EcoR V. LADNde la bactrie ainsi mthyl nestpas hydrolys alors que lADNparasite qui nestpas mthyl sera hydrolys.

5 GATATC 33 CTATAG 5

Gnie gntique


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Pvu II

NNNNCAGCTGNNNN

NNNNGTCGACNNNN

NNNNCAG

NNNNGTC

CTGNNNN

GACNNNN+

2H2O Mg++

Mthylation (-)


- Pvu II est une enzyme de restriction produite par Proteus vulgaris.


5 CAGCTG 33 GTCGAC 5

Gnie gntique


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- Les sites de restriction sont souvent de type palindrome, cest dire quils sontidentiques sur les deux brins de lADN (mais antiparallles sur lautre brin).Lorsque lhydrolysedes liaisons phosphodiester se fait au centre de symtrie du


- La mthylation des cytosines au niveau du site dhydrolyse inhibe lareconnaissance du site par Pvu II. LADNde la bactrie ainsi mthyl nestpashydrolys alors que lADNparasite qui nestpas mthyl sera hydrolys.

5 CAGCTG 33 GTCGAC 5



Pvu II

Gnie gntique


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Hae III

NNNNGGCCNNNN

NNNNCCGGNNN

NNNNNGG

NNNNNCC

CCNNNNN

GGNNNNN+

2H2O Mg++

Mthylation (-)


- Hae IIIest une enzyme de restriction produite par Haemophilus aegypticus.

- Le site de liaison lADNest form de quatre paires de nuclotides :

5 GGCC 33 CCGG 5

Gnie gntique


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- Les sites de restriction sont souvent de type palindrome, cest dire quils sontidentiques sur les deux brins de lADN (mais antiparallles sur lautre brin).Lorsque lhydrolysedes liaisons phosphodiester se fait au centre de symtriedu


- La mthylation de la cytosine immdiatement en aval du site dhydrolyseinhibe lareconnaissance du site par Hae III. LADNde la bactrie ainsi mthyl nestpashydrolys alors que lADNparasite qui nestpas mthyl sera hydrolys.

5 GGCC 33 CCGG 5



Hae III

Gnie gntique


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Pvu I


NNNNCGATCGNNNN

NNNNGCTAGCNNNN

NNNNCGAT

NNNNGC

CGNNNN

TAGCNNNN+

2H2O Mg++

Mthylation (-)

- Pvu Iest une enzyme de restriction produite par Proteus vulgaris.


5 CGATCG 33 GCTAGC 5

Gnie gntique


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- Les sites de restriction sont souvent de type palindrome, cest dire quils sontidentiques sur les deux brins de lADN (mais antiparallles sur lautre brin).Lorsque lhydrolysedes liaisons phosphodiester se fait loin du centre de symtrie


- La mthylation de la deuxime cytosine proche du site dhydrolyse inhibe lareconnaissance du site par Pvu I. LADN de la bactrie ainsi mthyl nest pashydrolys alors que lADNparasite qui nestpas mthyl sera hydrolys.



Pvu I

5 CGATCG 33 GCTAGC 5

Gnie gntique


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- Pst Iest une enzyme de restriction produite par Providencia stuartii.


5 CTGCAG 33 GACGTC 5

Pst I

NNNNCTGCAGNNNN

NNNNGACGTCNNNN

NNNNCTGCA

NNNNG

GNNNN

ACGTCNNNN+

2H2O Mg++

Mthylation (-)

Gnie gntique


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- Les sites de restriction sont souvent de type palindrome, cest dire quilssontidentiques sur les deux brins de lADN (mais antiparallles sur lautre brin).Lorsque lhydrolysedes liaisons phosphodiester se fait loin du centre de symtrie


- La mthylation de la premire cytosine ou de ladninedu site dhydrolyseinhibentla reconnaissance du site par Pst I. LADNde la bactrie ainsi mthyl nestpashydrolys alors que lADNparasite qui nestpas mthyl sera hydrolys..



Pst I

5 CTGCAG 33 GACGTC 5

Gnie gntique


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Gnie gntiqueAlphabet dgnr

Alphabet dgnr du code gntique

A = AdnosineR = A ou puRine

H = non G (A, C ou T)

C = Cytosine V = non T (A, C ou G)

G = Guanine Y = C ou TpYrimidine

D = non C (A, G ou T)

T = Thymidine B = non A (C, G ou T)

K = G ou T ctone(keto en anglais)

S = C ou G 3 liaisons H(strong en anglais)

M = A ou C aMineW = A ou T 2 liaisons H

(weak en anglais)

N = A, C, G ou T

Le complment de A C G T R Y K M S W B D H V N

est T G C A Y R M K S W V H D B N

Gnie gntique


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- La spcificit large de certaines enzymes ou encore la dgnrescence du code

gntique implique quon doit indiquer quelquefois dans les squences des lettrescorrespondant plusieurs bases azotes diffrentes pour le mme nuclotide prsent une position.

- Le choix peut porter sur deux des 4 nuclotides : A ou G, C ou T, G ou T, A ou C, Cou G, A ou T ; ou bien sur 3 nuclotides : C, G ou T, A, G ou T, A, C ou T, A, C ou G ;

ou enfin sur les 4 nuclotides : A, C, G ou T.

Gnie gntiqueAlphabet dgnr

- Les rgles de complmentarit impliquent videmment une dgnrescence de lasquence de lautrebrin en regard duneposition dgnre.

Gnie gntique


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Ava II

NNNNGGWCCNNNN

NNNNCCWGGNNNN

NNNNG

NNNNCCWG

GWCCNNNN

GNNNN+

2H2O Mg++

Mthylation (-)

-Ava IIest une enzyme de restriction produite parAnabaena variabilis.

- Le site de liaison lADNest form de cinq paires de nuclotides :

5 GGWCC 33 CCWGG 5

Gnie gntique


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Ava II

- Les sites de restriction sont souvent de type palindrome, cest dire quilssontidentiques sur les deux brins de lADN (mais antiparallles sur lautre brin).Lorsque lhydrolysedes liaisons phosphodiester se fait loin du centre de symtrie


- La mthylation des cytosines du site dhydrolyseinhibe la reconnaissance du siteparAva II. LADNde la bactrie ainsi mthyl nestpas hydrolys alors que lADNparasite qui nestpas mthyl sera hydrolys..

5 GGWCC 33 CCWGG 5

Gnie gntique


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Hind II

- Hind II est une enzyme de restriction produite par Haemophilus influenzae,souche Rd.


5 GTYRAC 33 CARYTG 5

NNNNGTYRACNNNN

NNNNCARYTGNNNN

NNNNGTY

NNNNCAR

RACNNNN

YTGNNNN+

2H2O Mg++

Mthylation (-)

Gnie gntique


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- Les sites de restriction sont souvent de type palindrome, cest dire quils sontidentiques sur les deux brins de lADN(mais antiparallles sur lautrebrin). Lorsquelhydrolysedes liaisons phosphodiester se fait au centre de symtrie du palindrome

toutes les paires de nuclotides restent apparies : les fragments qui en rsultentsont dits bouts francs .

- La mthylation de ladninedu site dhydrolyse inhibe la reconnaissance du sitepar Hind II. LADNde la bactrie ainsi mthyl nestpas hydrolys alors que lADNparasite qui nestpas mthyl sera hydrolys.


Hind II

5 GTYRAC 33 CARYTG 5

Gnie gntique


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Gnie gntiqueLes enzymes de restrictionDigestion dune squence (Hae III)

Gnie gntique


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- Chacune des squences GGCC engendre une coupure de lADN,ce qui produit des

fragments de restriction dont le longueur dpend de la frquence de cette squencesur lADN.

- Voici le rsultat de la digestion du gne de lapoA-II (brin codant) par Hae III.

g qLes enzymes de restriction

Digestion dune squence (Hae III)

- Les apolipoprotines A et B (Apo A et B) sont des lipoprotines fabriques par lefoie, intervenant dans le mtabolisme des lipides (graisses). L'ApoA1 sert au retourdu cholestrol vers le foie o il va tre dtruit : de ce fait, elle est surtout un

marqueur de protection vis--vis des maladies cardio-vasculaires. L'ApoB participeplutt au transport et aux dpts de cholestrol sur les parois des artres. Elle estdonc un marqueur d'athrosclrose, responsable de maladies cardio-vasculaires(notamment d'infarctus du myocarde).

Gnie gntique


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- On peut tablir des cartes des emplacements de ces sites sur lADN (cartes derestriction).

- La recherche de ces sites sur lADN extrait dun sujet permet de dtecter des

squences diffrentes qui ajoutent ou suppriment des sites de restriction. Il enrsulte que les fragments de restriction chez ces individus nont pas la mmelongueur que les mmes fragments chez les autres individus : il y a unpolymorphisme de longueur des fragments de restriction (RFLP = RestrictionFragment Length Polymorphism).

g qLes enzymes de restriction

Digestion dune squence (Hae III)

Cours Genie Genetique L3 Partie1

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