COURS CHM 2971 Hiver 2005 Chimie bio-analytiqueesilbac1.esi.umontreal.ca/~thibaupi/CHM2971/DOC/CHM...
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COURS2
17 janvier 2006
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2.4 Définitions quantitatives
• Donc DM estplus importanteen GC (analytegazeux) qu’enLC (analyteliquide)
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• Cu : Résistance au transfert de masse (TM)– Facteur le plus important, autant en chromatographie liquide
qu’en chromatographie gazeuse. Englobe 3 processus:– TM dans la phase mobile– TM dans la phase mobile stagnante dans les pores– TM dans la phase stationnaire
– Caractérise le processus d’adsorption désorption– Il faut maintenir K = [A]S/[A]M constante
2.4 Définitions quantitatives
CM
CS
phase stationnaire
support
pore
Phase mobile
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2.4 Définitions quantitatives
xM
pxM D
dkfwC µµ
2)( ′⋅=
« CM »
xS
fxS Dk
dkqC µµ
)1(
2
′+
⋅′⋅=
« CS »w : constante deproportionnalitéf(k’): fonction décrivantl’affinité du soluté pour laphase mobiledp : la taille des particulesDM : coefficient de diffusion(dans la phase mobile)
q : un facteur géométrique qui dépend dela nature des micro- particules; q ~ 1/30 k’ : le facteur de capacité df : l’épaisseur de la phase stationnaire DS : est le coefficient de diffusion du solutédans la phase stationnaire
* H diminue si les particules du support solide sont petites (dp), si lefilm greffé (la phase stationnaire) est mince (df), si DM et DS grand.
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xSMx
u)CC(uBAH +++=
pd2H ⋅⋅= λx
MDµ
γ 12 ⋅⋅+ xM
2p
Dd)k(fw
µ′⋅
+ xS
f
Dkdkq
µ)1(
2
′+
⋅′⋅+
2.4 Définitions quantitatives
Équation de van Deemter
Chemins multiples
Diffusion longitudinal
Transfert de masse
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• Équation générale de la chromatographie :
Équation qui lie la R, N, k’ et α :
– On voit que :• N = f (R2)• R ↑ si α ↑• R ↑ si k’ ↑
⎟⎟⎠
⎞⎜⎜⎝
⎛+
⎟⎠⎞
⎜⎝⎛ −
= '
'
11
4 B
B
kkNR
αα
Efficacité Sélectivité Facteur de capacité
2.4 Définitions quantitatives
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• Conditions limites :
– Manque d’efficacité : N → 0, on a que R → 0• Situation caractérisée par des pics larges• Solutions : limiter les volumes morts, optimiser la vitesse
linéaire moyenne,– Manque de sélectivité : α → 1, on a que R → 0
• Situation caractérisée par des pics minces, des temps derétention raisonnables mais, une mauvaise séparation.
• Solutions : changer la température ou la phase stationnaire– Manque d’affinité : k’B → 0, on a que R → 0
• Situation caractérisée par des temps de rétention trop courts• Solutions : diminuer la température ou changer la phase
stationnaire
⎟⎟⎠
⎞⎜⎜⎝
⎛+
⎟⎠⎞
⎜⎝⎛ −
= '
'
11
4 B
B
kkNR
αα
2.4 Définitions quantitatives
xu
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3.0 Techniques dechromatographie
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Classification des techniques
3.1 Aperçu des différentestechniques utilises
ChromatographieDéfinition : séparation des constituants d’un mélange en fonctiondes vitesses auxquelles ils sont entraînés, par une phase mobileliquide ou gazeuse, à travers une phase stationnaire
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Analyse de peptides
3.1 Aperçu des différentestechniques utilises
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3.2 La chromatographie surcouche mince (CCM ou TLC)
PrincipeTechnique utilisant une plaque surlesquelle se trouve une couche dephase stationnaire:• Une goutte du mélange à séparerest déposée au bas de la plaque• Le bas de la plaque est trempédans un solvant (ou mélange) qui sedéplace vers le haut par capillarité• Les analytes migrent à différentesvitesses et se séparent
A B A+B
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s
cf d
dR ==solvant de front le par parcourue distance
composé un par parcourue distance
• La distance parcourue par uncomposé dépend de la force desinteractions avec la phasestationnaire par rapport à sadissolution dans la phase mobile
• On peut relier k’ et Rf parl’équation :
f
f
RR
k−
=1'
A B A+B
dA dB ds
S
Xf d
dR =
3.2 La chromatographie surcouche mince (CCM ou TLC)
Rf
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• Support solide :– Verre– Aluminium– Plastique
• Phase stationnaire (df ≈ 150 µm) :– Alumine, Al2O3 ? polaire– Silice, SiO2 ? polaire– Phase inverse (C18, …) ? non-polaire
* Quand la phase stationnaire est polaire, la distance de migration estreliée à la polarité des composés. Les molécule peu polaires migrent plusloin avec le solvant, tandis que les molécules polaires sont plus retenuspar la phase stationnaire et migrent moins.
• Phase mobile :– Tout solvant ou mélange de solvants dans lequel les analytes sont
solubles et où il n’y a pas de réaction chimique (Ex. : chloroforme,méthanol, hexane, acétate d’éthyle)
3.2 La chromatographie surcouche mince (CCM ou TLC)
Matériel
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• Visuelle- produit coloré
• Optique- lampe UV
• Formation de dérivés- Révélation avec réactifs :
- iode- acide sulfurique - ninhydrine- permanganate
3.2 La chromatographie surcouche mince (CCM ou TLC)
Détection
incolore excitation UV
émission visible
coloré
Limite de détection ≈ 0,1 mM
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3.3 Chromatographie gazeuseSchéma de l’appareil
Tamis moléculaire
Restricteurde flux
Contrôleurde flux
ÉlectromètreDétecteur
Enregistreur:-Imprimante-Intégrateur-Ordinateur
Régulateur Injecteur
Colonne
Gaz
por
teu
r
Hyd
rogè
ne
Air
Injecteur
Four
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2.4 Chromatographie gazeusePhotographie de l’appareil
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• Injecteur : injection directe
3.3 Chromatographie gazeusePrincipaux constituants
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3.3 Chromatographie gazeusePrincipaux constituants
• Injecteur : Diviseur d’effluent (Split/splitless)
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• Échantillons :– État physique : liquide (0,1-10 µL) ou gaz (0,5-5 mL)– Stable thermiquement (350 °C)– Volatil– Polarité moyenne– Masse moléculaire < 600 g/mol
• Four– Température constante(mode isotherme)– Température variable avec le temps(mode programmation de température)
3.3 Chromatographie gazeusePrincipaux constituants
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• Gaz vecteur (phase mobile) :– Son rôle consiste à entraîner les solutés– Gaz chimiquement inerte (He, N2 ou H2)
• He le plus utilisé car compatible avec la plupart desdétecteurs en GC
– Choix dépend du détecteur– Caractéristiques : peu coûteux, peu dangereux et pur
• Impuretés qui doivent être enlevées• H2O : Tamis moléculaire• O2 : Systèmes commerciaux d’élimination catalytique• Hydrocarbures : Charbon activé
3.3 Chromatographie gazeusePrincipaux constituants
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• Effet de la nature des gaz sur la vitesse optimale de séparation
3.3 Chromatographie gazeusePhase mobile
Rouessac & Rouessac
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– He, N2 et H2 donnent environ le même HEPT optimal, mais à des débits(µ) différents
– Vitesse optimale augmente de N2 < He < H2
– Séparations les plus rapides avec H2 sans perte de résolution (HEPT↓)Or, Il est inconvénient car :
• réagit de manière catalytique avec les composés insaturés• incompatible avec la MS car détruit l’huile des pompes• gaz explosif lorsque présent à >4% vol.
– À plus haut débit, H2 et He donnent une meilleures R (HEPT ↓) que N2
• soluté se diffuse plus rapidement donc Cµ↓ ⇒ HEPT ↓ ⇒ R ↑– Si gaz plus lourd, il y a moins de diffusion, donc B/µ↓ ⇒ HEPT ↓ ⇒ R ↑– Viscosité : H2 < N2 < He
• résistance lors de la circulation dans un capillaire
3.3 Chromatographie gazeusePhase mobile
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10-600,5-15Flux (ml/min)
2-40,1-0,7Diamètre interne (mm)
10 µg/pic100 ng/picCapacité
1-100,1-8Épaisseur du film (µm)
4000250 000N (total moyen)
10-403-40Pression de tête (psig)
0,5-55-100Longueur (m)
support granulé inerteimprégné de phase stat.liquide (CGL) ouadsorbant actif (CGS)
tapisse la paroi interneWCOT (wall-coated),SCOT (support-coated)PLOT (porous-layer)
Phase stationnaire
verre, cuivre ou acierinoxydableSiO2 + polyimideColonne
Colonne garnieColonne capillaire
3.3 Chromatographie gazeuseType de colonne
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30 m x 0.53 mm x 0.88 µm DB-1 Type de phase stationnaire(L x d.i. x dp)
3.3 Chromatographie gazeuseType de colonne
Porus Layer Open Tube
Wall Coated Open Tube
Support Coated Open Tube
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• Avantages des colonnes capillaires p/r colonnes remplies :– N augmente car A (chemins multiples) ? 0, HEPT ↓ ⇒ R ↑– Débit (µ) plus élevé = temps d’analyse plus courts
• Pas de particules paquetées dans la colonne (∆P ↓)– Plus grande sensibilité pour des petites quantités d’analyte– Pas pratique pour l’analyse de gaz inerte, inorganique, faible MM
3.3 Chromatographie gazeuseType de colonne
Garnie CapillaireN ~ 642
N ~ 6400
Harris Fig. 24-3 et 24-4
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• Support (pour phase stationnaire) :– Grains de solide inactifs, fins et uniformes– Grande surface spécifique (> 1m2/g) et stabilité thermique– Retient le liquide non volatil (phase stat.)– 3 types :
• Supports poreux naturels : diatomée (CHROMOSORB)• Supports poreux artificiels : billes de silice poreuse (SPHÉROSIL)• Supports peu ou non poreux : billes de verre ou poudre de
Téflon
3.3 Chromatographie gazeuseType de colonne
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• Caractéristiques élémentaires :– Solide (CGS) ou liquide (CGL) chimiquement inerte– Non volatil et non soluble dans la phase mobile– Uniformément distribué et stabilité thermique– Son rôle est de permettre un équilibre de distribution (KD, k’, α)
• Phases stat. solides : ADSORPTION (PLOT)– Alumine (Al2O3) : Séparation des hydrocarbures– Zéolite (Na12(Al12Si12O48) • 27 H2O (« molecular sieves ») :
Séparation des gaz comme H2, O2, N2, CO2 et CH4
• Phases stat. liquides : PARTAGE (WCOT et SCOT)– Non volatil à la T de l’analyse– Choix relié aux composés à séparer (« Qui se ressemble
s’assemble ») et à sa température limite d’utilisation (volatilité)
3.3 Chromatographie gazeusePhase stationnaire
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Structure (colonnes garnies etcapillaires):
- Squalane : référence nonpolaire (hydrocarbure MM↑)
- Huiles de silicone :- Faciles à synthétiser- Polarités variables- Stabilité thermique- Peu volatiles et greffables- Structure connue
- Carbowax (polyéthylèneglycol)- Carboran (T ~400oC)- Polymère silarylène
(T ~ 400oC)
3.3 GCPhase stationnaire
Harris Table 24-1
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3.3 Chromatographie gazeusePhase stationnaire
• Phase stat. greffée– Lié chimiquement à la surface du support
• Phase stat. réticulée– Réaction in situ sur la phase stat.
(polymérisation) créant de nouveaux liensplus robustes
Bénéfices– Minimise le bleeding (détachement
progressif de la phase stationnaire)– Augmente la résistance au solvant– Augmente la stabilité thermique– Augmente la durée de vie
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3.3 Chromatographie gazeuseEffet de la température
• En GC, la température (T) est un paramètredéterminant pour la rétention
• La chromatographie est un processus enpseudo équilibre :
mA
sA
ccK
=1- On sait que :
m
s
VVkK ×= ,
( )( ) s
m
m
s
VV
AmolnAmolnK ×=
2- Donc :
3- Thermodynamique :
4- En substituant K on isole ln k’ pour obtenir :
KRTG ln−=∆
s
m
VV
RTGk lnln , −
∆−=
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3.3 Chromatographie gazeuseEffet de la température
Si on considère un mélange de composés avec des Téb très différentes, lessolutés à faible Téb seront bien séparés au début de la programmation, et larétention des solutés à Téb plus élevés est amenée à un temps raisonnableà plus haute température. T↑ ? pression de vapeur↑ ? k’ ↓ ? tanalyse↓
Isotherme:150oC
Programmation de température:50oC à 250oC 8oC/min
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• Ordre d’élution en GC :– Le moteur général de l’élution est la température.– Pour des solutés très semblables (Téb similaires), les différentes
interactions avec la phase stationnaire permettront la séparation
• Indice de rétention :– Droite de Kovats : l’injection d’un mélange de n-alcanes dans
une colonne chromatographique dont le débit du gaz vecteur etla température sont stabilisés permet d’obtenir unchromatogramme dont les temps de rétention répondent àl’équation suivante :
3.3 Chromatographie gazeuseIndices de rétention
bantR +=,log (n)
n : nbre d’atomes de C(≥ 5 ou 6)a et b : coefficients numériques