Rober

to Pi

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Univer

sità di U

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“Car

loBo”

CORSO DI GENETICA

LA GENETICA DI

BATTERI E VIRUS

La coltivazione dei batteri

Una colonia è formata dacirca 107cellule.Clone = discendenti diun’unica cellula.

Rober

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Univer

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“Car

loBo”

Rober

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Univer

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“Car

loBo”Scambio di materiale genetico

Meccanismi mediante i quali avviene scambiodi materiale genetico tra batteri:

¸ trasformazione

¸coniugazione

¸ sesduzione

¸trasduzione

Rober

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Univer

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“Car

loBo”

La trasformazioneLa trasformazione è il trasferimento di materale genetico da unbatterio all’altro mediato da frammenti di DNA extracellulare.

La trasformazione (in Streptococcus pneumoniae) è stataosservata per la prima volta da Frederick Griffith nel 1928.

Nel 1944 Avery, MacLeod eMcCarty dimostrarono che ilprincipio trasformante era ilDNA.

Nella trasformazione frammentiisolati di DNA vengono assorbitidall’esterno all’interno dellacellula.

Rober

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Univer

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“Car

loBo”

La mappa pertrasformazione

Con latrasformazione èpossibile mappare igeni: quanto piùdue marcatori sonovicini, tanto piùprobabile è la lorocotrasformazione.

p ed o non stanno mai insieme ->sono i più distanti -> q è al centro!

La trasformazione a livellomolecolare

Rober

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Univer

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“Car

loBo”

Rober

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Univer

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“Car

loBo”

La scopertadella

coniugazione - 1Nel 1946 Joshua Lederberg eEdward Tatum dimostraronoche due ceppi di E.coliauxotrofi (E. coli A met- bio-

thr+ leu+ thi+ ed E. coli B met+

bio+ thr- leu- thi-), posti a

contatto, possono scambiarsimateriale genetico e crearedei batteri prototrofi.Colonie prototrofe: 1x10-7

Rober

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Univer

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“Car

loBo”

La scoperta della coniugazione - 2

Alla fine degli anni‘40 Bernard Davisscopre che se idue ceppi sonoseparati da unfiltro attraversocui possonopassare sostanze

(ma non batteri) non si ha laformazione di prototrofi: ilcontatto fisico tra i due ceppi èindispensabile!

Rober

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Univer

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“Car

loBo”

Il fattore di fertilità (F)Nel 1953 William Hayes scoprì che il trasferimentogenico avviene in una sola direzione: da un donatore

(maschio) ad un ricevente (femmina). Hayes trovòun donatore “sterile” (cioè incapace di trasferirel’informazione) che si era trasformato in unricevente, pertanto ipotizzò che la capacità difungere da donatore fosse una condizione ereditaria

determinata da una fattore di fertilità F. I ceppi che portano F sonodonatori (F+), quelli senza F sono riceventi (F-). Inoltre osservò che iltrasferimente genico era un evento raro, ma il fattore F venivatrasferito facilmente. Successivamente fu dimostrato che il fattoreF è un plasmide, cioè un anello di DNA indipendente dal cromosoma

batterico e non facente parte del genoma batterico, che si replicanel citoplasma batterico in maniera autonoma.

La scoperta dellaconiugazione - 3

Rober

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Univer

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“Car

loBo”

Rober

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Univer

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“Car

loBo”

I ceppi HfrLuca Cavalli Sforza scoprì un nuovo ceppoderivato da un F+ chiamato high frequency ofrecombination (Hfr). L’incrocio Hfr x F- dava1000 volte più ricombinanti dell’incrocio F+ xF-, ma nessuna cellula F- diventava F+. Siscoprì poi che il ceppo Hfr si forma in seguitoall’integrazione di F nel cromosoma batterico.

Quando si mescolano cellule F+ con cellule F- il fattore F siintegra nel cromosoma batterico con una bassa frequenza. Ciòdetermina trasferimento di geni batterici ma con bassafrequenza. Nell’incrocio Hfr x F- invece, dal momento che tutti ibatteri donatori hanno F integrato, la frequenza di ricombinantiè alta.

Rober

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Univer

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“Car

loBo”

L’integrazionedi F

La ricombinazione tra due anelli diDNA, in seguito ad un singolo

crossing over, porta allaformazione di un anello unico cheè la somma dei due precedenti. Inquesto modo un ceppo F+ (con Fplasmide libero) può trasformarsiin un ceppo Hfr. Una voltainserito, il plasmide F mantiene lasua capacità di riconoscere unbatterio F- e, in questo caso,tenta di iniziare la coniugazione.

Rober

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Univer

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“Car

loBo”

Il trasferimentodi Hfr - 1

Il trasferimento di F integrato (Hfr)comincia sempre a partire dall’origine direplicazione O. Ma quando è integrato Onon si trova all’estremità di F: il ricevente,per poter diventare F+, dovrebbe riceveretutto il cromosoma batterico del

donatore. Poiché il pilo sessuale è instabile,anche a causa del moto browniano delliquido di coltura, il trasferimento non è(quasi) mai completo: il ricevente resta F-ma ottiene una parte di DNA batterico daldonatore che può eventualmente essereintegrata nel cromosoma.

Rober

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Univer

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“Car

loBo”

Il trasferimento di Hfr - 2A questo punto, il ricevente non ha ricevuto un DNA circolare, malineare! Questo potrà eventualmente essere integrato nel genomadel ricevente per ricombinazione sfruttando l’omologia del DNAbatterico, e solo in seguito ad un numero pari di crossing over.

Rober

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Univer

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“Car

loBo”

La coniugazione interrottaElie Wollman e François Jacob, 1957

Si può sfruttare la labilità delpilo e l’inserzione di F permappare i geni di un cromosomabatterico. Infatti, leintegrazioni di F sono casualisia come punto di inserzione,sia come orientamento delplasmide, quindi ogni ceppobatterico Hfr trasferirà geninel ricevente con un ordine cheriflette la disposizione dei genilungo il cromosoma.

Rober

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Univer

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“Car

loBo”

La proceduraEsempio: donatore HfrH thr+leu+aziRtonR lac+gal+strS

ricevente: F- thr leu aziStonS lac gal strR

I due tipi di cellule vengonomescolate in gran quantità inun terreno liquido a 37°C. Avari tempi vengono prelevatidei campioni della coltura,vengono agitati (perinterrompere artificialmentela coniugazione) e piastrati suterreni selettivi (nell’esempioillustrato a lato, contenentestreptomicina) per uccidere lecellule Hfr. Si ottiene inquesto modo una mappa a

tempo del cromosomabatterico donatore.

Rober

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Univer

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“Car

loBo”Le mappe a tempo

Wollman e Jacob arrivarono a queste conclusioni perché:

¸ ogni allele del donatore appariva nel ricevente F- dopo un intervallodi tempo ben preciso dall’inizio della coniugazione;

¸ gli alleli del donatore si presentavano sempre in una specificasequenza;

¸ i marcatori che entravano più tardi comparivano in un numerominore di cellule.

Da queste osservazioni dedussero che il trasferimento avviene apartire da un punto ben preciso sul cromosoma del donatore chiamatoorigine O e prosegue secondo una modalità lineare.

Rober

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Univer

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“Car

loBo”

Costruzione dellamappa

Come unità di misura si usa il tempo inminuti impiegato dagli alleli del donatoread entrare nel ricevente.

Solo dopo circa 2 ore i riceventi diventanoF+ Ÿ il fattore F entra per ultimo.

Rober

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Univer

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“Car

loBo”

L’integrazione di F

Fu Campbell che scoprì che l’integrazione di F avviene tramite un singolocrossing over tra i due anelli di DNA, portando alla loro fusione ecreando un unico anello che è la somma dei due componenti. Poichéesistono nel cromosoma batterico vari siti con sequenza omologa allaregione di appaiamento di F, si possono ottenere tanti ceppi Hfr, ognunodei quali trasferisce i geni in un ordine diverso.

Rober

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Univer

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“Car

loBo”

Il cromosoma battericoè circolare

Usando vari ceppi Hfr ed ottenendo mappe diverse, Campbell ipotizzòche il cromosoma batterico fosse circolare.

Il saggio a tre punti nei batteri

Rober

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Univer

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“Car

loBo”

Rober

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Univer

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“Car

loBo”

La sesduzione,ovvero F’

Nel 1959 E. Adelber scoprì che inun ceppo Hfr il fattore F puòexcidersi e generare un ceppo F+.Se però excide in maniera errata,può incorporare il gene battericoaccanto al quale era inserito. Inquesto caso prende il nome di F’. Ilplasmide F’ può coniugare edinserire il gene che ha incorporatoin un batterio ricevente(sesduzione) che diventa F+ eproduce un diploide parziale

stabile, o merozigote.

Rober

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Univer

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“Car

loBo”

La trasduzione

È il trasferimento dei geni batterici mediatoda batteriofagi.

I fagi che effettuano la trasduzionegeneralizzata veicolano qualsiasi porzionedel genoma dell’ospite, mentre i fagi cheeffettuano la trasduzione specializzatatrasferiscono solo porzioni specifiche.

La trasduzione generalizzata fu scoperta nel1951 da Joshua Lederberg e Norton Zinderche ottennero prototrofi anche conl’esperimento del “tubo a U”. Il meccanismovenne poi chiarito da Ikeda e Tomizawa conil fago P1 nel 1965.

Il ciclo vitale di un fago litico

Rober

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Univer

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“Car

loBo”

La trasduzione generalizzata

NB: nellatesta del

fago non

restanogeni fagici!

Rober

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“Car

loBo”

Rober

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Univer

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“Car

loBo”

La mappa per trasduzioneCon la trasduzione generalizzata si possono stabilire relazionidi associazione tra i geni.La cotrasduzione è il trasferimento di due geni batterici(molto vicini) ad opera dello stesso fago. Ad esempio:

donatore leu+thr+aziR xricevente leu-thr-aziS

thr leu azi

thr azi leuoppure

Dalla prima parte (leu+):

Ma dalla seconda parte si deduce che è la prima, la mappa giusta!

Rober

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Univer

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“Car

loBo”

La frequenza di cotrasduzionedonatore a+b+ x ricevente a-b-

frequenza dicotrasduzione =

numero dei trasduttantiper entrambi i marcatori

numero di trasduttanti totalix 100

a+b-

a-b+

a+b+

trasduttanti

selezionando per a+freq. di cotrasduzione =

(a+b+)

(a+b-)+(a+b+)x 100

selezionando per b+ (a+b+)

(a-b+)+(a+b+)freq. di cotrasduzione = x 100%

Rober

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Univer

sità di U

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“Car

loBo”La trasduzione specializzata

Alcuni batteriofagi, una volta entrati nell’ospite, possono seguiredue strade alternative. Come descritto, possono procedere con ilclassico ciclo litico. Oppure possono entrare in un ciclo dettolisogenico (o lisogeno); in questo caso si parla di fagi temperati oprofagi. I fagi temperati sono dei fagi quiescenti chesopravvivono nell’ospite attraverso le generazioni cellulari senzalisarlo, e sfruttano la replicazione del DNA batterico per la lorostessa replicazione e sopravvivenza. La quiescenza avviene graziead un sistema di controllo genetico che impedisce al fago diinnescare il ciclo litico finché non si verificano determinatecondizioni. In questo modo il fago può sopravvivere senza nuocereall’ospite, in teoria indefinitamente.

Rober

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Univer

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“Car

loBo”

Il ciclo lisogenicodel profago l

Il profago l si può integrare con unsingolo crossing over a livello del “sito diattacco di lambda” tra i geni gal e bio.

Meccanismo dellatrasduzione specializzata

NB: nella testa del

fago restano

ANCHE i geni fagici!

Rober

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Univer

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“Car

loBo”

Riassumendo…

Rober

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Univer

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“Car

loBo”

Rober

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Univer

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“Car

loBo”

Gli eterozigotiUn organismo eterozigotedoppio rispetto a duemutazioni può essere cis otrans eterozigote rispetto adesse. Se le due mutazioni sonosullo stesso cromosoma, allorasi dice che esse sono in cis.Altrimenti sono in trans. Ingenerale, tutti gli elementi

genetici che si trovano sulla

stessa molecola di DNA sono

in cis tra loro.

Lemuta-zioniin cis

Le duemutazionipossonoessere

intrageniche

ointergeniche!

Rober

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Univer

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“Car

loBo”

Le muta-zioni intrans

Le mutazioni intrans possonoNON darefenotiposelvatico!

Rober

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“Car

loBo”

Rober

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Univer

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“Car

loBo”

I fenotipi dei fagi

Marcatori del fago T2:

h+ lisa il ceppo B di E. coli ma non il ceppoB/2

h lisa sia il ceppo B che il B/2

r+ forma placche piccole con margini indistinti

r forma placche grandi con margini netti

Quando i fagi h+ crescono su uno strato misto di cellule B e B/2formano placche torbide perché lisano solo i batteri B, mentre ibatteri B/2 crescono nelle placche provocandone la torbidità. Ifagi h formano invece placche chiare.

I fenotipi fagici possono essere riconosciuti per la forma e/o ledimensioni delle placche di lisi, e per la specificità d’ospite (ceppobatterico che un fago è in grado di lisare).

I fenotipi dei fagiEsistono alleli mutanti del gener detti rII.

Rober

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Univer

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“Car

loBo”

Rober

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Univer

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“Car

loBo”

L’incrociotra fagi

Per incrociare tra lorodei fagi (organismiaploidi, riproduzionenon sessuata) digenotipo diverso si puòcoinfettare un batterioospite usando oppor-tune concentrazioni deitre organismi. I DNAfagici nel batteriopossono eventualmentericombinare tra loro.

Rober

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Univer

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“Car

loBo”Mappatura dei geni fagici

Frequenza diricombinazione

tra h ed r

placche (h+r+) + (h-r- )placche totali

x 100

Rober

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Univer

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“Car

loBo”

La complementazione nei fagi

I fagi mutanti rII producono placche grandi con margini netti; sono ingrado di lisare il ceppo B di E. coli ma non il ceppo K(l).

I fagi selvatici rII+ producono placche piccole con margini irregolari;sono in grado di lisare sia il ceppo B di E. coli che il ceppo K(l).

Esistono tanti ceppi mutanti di fagi di tipo rII; per vedere se questiappartengono tutti allo stesso locus genetico si esegue un test di

complementazione.

Per fare il test di complementazione tra due fagi mutanti rII (es.rII1 e rII2) si fa una doppia infezione (o infezione mista) su K(l) e siverifica se avviene la lisi oppure no.

I fagi dei due ceppi mutanti vengono piastrati ad alta molteplicità di

infezione, cioè ad un concentrazione elevata in modo che i batterivengano infettati allo stesso tempo da entrambi i tipi fagici mutanti.

Rober

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Univer

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“Car

loBo”

I risultati di una doppiainfezione

Se si ha la lisi delle cellule K(l) vuoldire che le mutazioni sono a carico digeni diversi e pertanto complementano.Se non si osserva lisi le mutazioni sonoa carico dello stesso gene e diconseguenza non complementano.Nella complementazione i genotipi dellaprogenie fagica rimangono mutanti comequelli dei genitori. Avviene solo unmescolamento di prodotti genici.Viceversa, nella ricombinazione igenotipi della progenie sono diversi daquelli dei genitori.

Rober

to Pi

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Univer

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“Car

loBo”

formano placchela metà dei fagi(i selvatici) chelisano B. I doppi

mutanti nonformano placche

Rober

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Univer

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“Car

loBo”

Analisi genetica dellaprogenie fagica

La progenie fagica si piastra su

E.coli B E.coli K(l)

Complementazionetutti i fagi

formano placche(titolo elevato)

non si osservaformazione di

placche

Ricombinazione

tutti i fagiformano placche

(titolo moltobasso)

La frequenza di ricombinazione è di solito moltobassa e non interferisce con la complementazione.

Rober

to Pi

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Univer

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“Car

loBo”

Il cistroneMediante il test dicomplementazioneè possibile definireil gene come unitàdi funzione. Ungene o cistrone è laregione geneticaall’interno dellaquale non c’è

complementazione

tra mutazioni. Il

cistrone è l’unità

di funzione.

m1m2++

complementazione

trans

m1 ++ m2 +

+

assenza dicomplementazione

trans

m1 m2+ +

complementazione

cis

m1 m2++

+ +

complementazione

cis

Il cistrone prende il nome dal test di complementazione che sichiama test cis-trans.

Rober

to Pi

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Univer

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“Car

loBo”La struttura fine del gene - 1

Negli anni ‘40 Edward B. Lewis, lavorandosul locus Star del cromosoma 2 diDrosophila (che controlla le dimensionidell’occhio) trovò che su 57.000 individuinati dall’incrocio S (Star, dominante) perast (asteroid, recessivo, anch’esso conocchio ridotto) solo 16 avevano occhinormali (quindi con genotipo +/+). Laspiegazione più semplice era che fosseavvenuta ricombinazione tra mutazioni insiti diversi dello stesso gene. S ed astfurono chiamati pseudoalleli.

Rober

to Pi

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“Car

loBo”

La struttura fine del gene - 2

Nel 1940 Oliver lavorava sul gene lozenge (lz) sulcromosoma X di Drosophila (gli individui lz/lz hanno occhicon superficie lucida e liscia). Isolò molti alleli lz chemappavano allo stesso locus (lzBS lzK lzl lzg) ed in eterozigosidavano fenotipo mutante. Reincrociando eterozigoti per duediversi alleli lz si ottenevano selvatici, a bassa frequenza.Anche in questo caso si suppose che avvenissericombinazione all’interno del gene lozenge e gli alleli lzfurono chiamati pseudoalleli. Usando la frequenza deiricombinanti selvatici si poteva costruire una mappa dellemutazioni lz all’interno del locus lozenge.

Rober

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Univer

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“Car

loBo”

Seymour BenzerBenzer negli anni ‘50 utilizzò un sistema moltosensibile per mettere in evidenza la

ricombinazione intragenica nel fago T4 e costruìuna mappa genetica dettagliata di siti all’internodel gene rII. La sensibilità del sistema adottatoera data dal fatto che i fagi producono progenie

placche

piccole

margini

irregolari

placche

grandi

margini

netti

B

placche

piccole

margini

irregolari

assenza di

lisi

K(l)

rII+rIImolto numerosa, per cui era possibilemettere in evidenza eventi diricombinazione estremamente rari comequelli che si verificano all’interno di unsingolo gene. Egli isolò circa 3.000

mutanti rII e li saggiò a coppie, tramitedoppie infezioni, per vedere se eranoallelici o no.

I mutanti del cistrone A non complementavano tra loro macomplementavano con tutti i mutanti del cistrone B. I mutanti delcistrone B non complementavano tra loro ma complementavano con tuttii mutanti del cistrone A. Il numero dei mutanti assegnati a ciascuncistrone risultò più o meno lo stesso (circa 1.500).

Rober

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“Car

loBo”

rIIA ed rIIBDai dati di complementazione Benzer capì che le mutazioni rIImappavano in due unità di funzione, che chiamò cistrone A e cistrone B.

Benzer fece doppie infezioni concoppie di mutanti rII (tuttiappartenenti allo stesso cistrone)sul ceppo B ed il lisato fagico

ottenuto lo piastrò sul ceppo K(l) (sul quale potevano crescere solo iricombinanti selvatici) ed ottenne ricombinanti selvatici che si eranooriginati da ricombinazione intragenica.

Rober

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“Car

loBo”

La metodologiaI dati di Benzerconfermarono ciòche avevano intuitoLewis e Oliver, cioèche la ricombina-

zione può avvenire

anche tra siti all’

interno del gene

stesso. Questi sitifurono all’epocachiamati reconi.

frequenza di

ricombinazione

tra due alleli

ricombinanti rII+ x2totale progenie

(numero di placche

presenti sul ceppo B)

=

Rober

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Univer

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“Car

loBo”

I risultati ottenuti

Per ciascun incrocio Benzer faceva un controllo piastrandosingolarmente i fagi di partenza (mutanti) sul ceppo B e poitrasferendo il lisato su K(l). In questo modo era possibile calcolarela frequenza di retromutazione. In tutti i casi si vide che essa eratrascurabile rispetto alla frequenza di ricombinazione.Benzer non osservò mai frequenze di ricombinazione inferiori allo0,01% anche se il suo sistema era in grado di mettere in evidenzafrequenze di ricombinazione dello 0,0001%. Ciò suggeriva l’esistenzadi un limite fisico al di sotto del quale non può avvenirericombinazione.Successivamente si capì che la più piccola unità di ricombinazione

(il recone) coincide con la singola coppia nucleotidica.

Rober

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“Car

loBo”

Risultati straniBenzer notò chealcune coppie dimutanti rII analizzatinon davano mai luogoné a reversione(retromutazione) né aricombinazione. Qualitipi di mutazionipossono dare questirisultati?

complementazione ricombinazione retromutazione + intragenica assenza di placche

Rober

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“Car

loBo”

Le delezioniBenzer ipotizzò chesi potesse trattaredi delezioni. Questeinfatti non possonoricombinare con mu-tazioni puntiformisovrapposte.

Benzer mappò le delezioniincrociandole tra loro: sedall’incrocio tra due diversedelezioni non si ottengonoricombinanti selvatici, alloraesse si sovrappongono.

Due delezioni NON sovrappostepossono invece ricombinare

Rober

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“Car

loBo”

Le delezioni scoperte da Benzer

Rober

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“Car

loBo”

La mappa per delezione

Rober

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Univer

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“Car

loBo”Benzer mappò le

delezioni traloro e poi leutilizzò permappare piùvelocemente

tutte lemutazioni

puntiformi dellaregione rII

tramite test dicomplementa-zione a due a

due.

Rober

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“Car

loBo”

La tecnica genetica

Come si mappa un mutante utilizzando le delezioni? Siano per esempioD1 e D2 due delezioni del gene rIIA. Esse definiscono tre aree delgene, che chiameremo i, ii, iii.

Se una mutazione dà ricombinantiselvatici solo se incrociata conD2, allora risulterà localizzatanella regione i.m m m

Se una mutazione non dà ricombinanti selvatici né con D1 né con D2,allora risulterà localizzata nella regione ii.

Se una mutazione dà ricombinanti selvatici solo se incrociata con D1,allora risulterà localizzata nella regione iii.

Rober

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“Car

loBo”

La mappa fine dei loci rII - 1

Benzer utilizzò deficienze sempre più piccole ed infine incrociò in tuttii modi possibili i mutanti puntiformi interni ad uno stesso segmento percostruire una mappa genetica dettagliata.

Se due mutazioni puntiformi incrociate tra loro non davano ricom-binanti selvatici significava che esse erano a carico dello stesso sito.

Benzer notò che i siti non erano tutti uguali rispetto alla suscettibilitàalla mutazione. In molti casi si aveva una sola mutazione per sito, ma inalcuni casi se ne avevano molte. I siti maggiormente mutabili furonochiamati hot spots (punti caldi).

Gli hot spots si mettono in evidenza anche trattando con mutageni.

La mappa fine dei loci rII - 2

Rober

to Pi

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Univer

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“Car

loBo”

Rober

to Pi

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Univer

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“Car

loBo”Conclusioni

L’analisi della struttura fine del gene ha dimostrato checiascun gene è costituito da una serie lineare di sub-elementi o siti che possono essere alterati dalle mutazionie possono essere separati dalla ricombinazione.Successivamente si vide che ciascun sito consiste in unasingola coppia di basi della doppia elica del DNA.