Corso di:

“Colture vegetali e applicazioni biotecnologiche”

Dott.ssa G. Massaro

Tel. 0823 274548

e-mail: giuseppina.massaro@unina2.it1a Lezione del 21/01/2011

LAUREA TRIENNALE IN BIOTECNOLOGIE

Totipotenza

Le tecniche di coltura si basano, principalmente, su due caratteristiche delle cellule vegetali:

Plasticità

Terreni per colture vegetali:

Le condizioni nutrizionali sono simili alle condizioni in cui la cellula o la pianta intera si trovano in natura

Sono costituiti da soluzioni acquose (H 2O distillata)

Il substrato su cui si sviluppano le colture deve garantire che l’espianto abbia

disponibilità di tutte le sostanze di cui questo necessita.

È sempre costituito da acqua e da una serie di sali e di sostanze organiche, ad una certa temperatura e pH.

Terreni per colture vegetali:

SolidoLiquido

Composizione dei Terreni di Coltura:

Nutrienti minerali

Nutrienti organici

Sostanze di crescita

Nutrienti minerali

Le piante sono organismi autotrofi che possono sintetizzare tutti i loro componenti organici molecolari a partire da elementi nutritivi inorganici , che hanno origine minerale oppure che si sono mineralizzati a seguito di decomposizione della sostanza organica. Gli elementi di origine minerale sono assorbiti in forma ionica dalla pianta.

Alcuni elementi vengono detti essenziali.

Un elemento essenziale è definito come un elemento con un determinato ruolo fisiologico, la cui assenza impedisce il completamento del ciclo biologico di una pianta.

Micronutrienti

Elemento Disponibile come

Macronutrienti

Elemento Disponibile come

–

–

–

Mengel e Kirkby (1979) proposero di

classificare gli elementi essenziali in 4

gruppi a seconda del loro ruolo

biochimico e della loro funzione

fisiologica.

Gruppo 1

Gruppo 2

Gruppo 3

Gruppo 4

Nutrienti organici

Monosaccaridi (glucosio)

Disaccaridi (saccarosio)

Saccarosio è il carboidrato più utilizzato nelle colture vegetali

alla concentrazione del 2-3% (w/v)Ca

rboidr

ati

Amminoa

cidi In genere l’aggiunta di un singolo amminoacido (tranne la glicina) ha

effetti inibitori, si preferisce utilizzare un idrolizzato di caseina (0.02-0.1%) oppure l’amminoacido glicina con o senza l’aggiunta di altri amminoacidi quali asparagina, glutammina, tirosina, arginina, cisteina.

Vita

mine

Acido Nicotinico

Piridossina

Tiamina

Biotina

Le vitamine sono cofattori enzimatici in reazioni del metabolismo. Tra questi la tiamina è essenziale per la crescita di organismi fotosintetici superiori.

Regolatori di crescita: ormoni

Gli ormoni impiegati nelle colture sono:

Auxine: stimolano la divisione e la moltiplicazione cellulare (favoriscono la duplicazione del DNA), promuovendo la radicazione e l’allungamento cellulare;

Citochinine: stimolano la divisione cellulare, la formazione dei germogli;

Gibberelline: sono impiegate per interrompere della dormienza dei semi e per stimolare l’allungamento dei germogli.

Invece, l’Acido abscissico e l’Etilene non sono utilizzati nelle colture .

È necessario creare e mantenere condizioni asettiche, perché i terreni di coltura essendo ricchi di sostanze organiche ed inorganiche risultano ambiente ideale per la crescita di funghi e batteri contaminanti.

Tali organismi crescono più velocemente delle cellule vegetali, ed alterano la composizione del mezzo di coltura (consumando sostanze e producendo metaboliti e tossine che concorrono alla variazione della composizione del terreno).

Il terreno di coltura, come anche i contenitori (capsule Petri, beute o tubi) e gli strumenti (bisturi, lamette, pinzette) vengono autoclavati in umido a 120°C a 2 atm per 15-20 minuti.

STERILIZZAZIONE

Gli strumenti all’atto dell’utilizzo vengono ulteriormente sterilizzati mediante lavaggio con etanolo al 70% o sodio ipoclorito (candeggina) a 1-2 % per alcuni secondi.

Sterilizzazionedel materiale vegetale

EtanoloIpoclorito

H2O2AgNO3HgCl2

Antibiotici

AGENTE CONCENTRAZIONE TEMPO DI DISINFEZIONE

70 - 95 % 5 - 15 %3 - 12 %

1 % 0.1 - 1 %4 - 5 mg/l

pochi secondi - 2 minuti 5 - 30 minuti5 - 15 minuti5 - 30 minuti2 - 10 minuti30 - 60 minuti

Motore e pre-filtri

Lampada UV

Filtri 0,2 µm

Ripiano sterilizzabile

Condizioni di Crescita

Temperatura: 18-25°C;

Illuminazione: almeno 200 µE m-2 s-1;

Fotoperiodo: in genere 16 h di luce / 8 ore di buio

Lo sviluppo delle radici è favorito a valori di pH leggermente acidi (da 5.5 a 6.5)

I funghi sono predominanti nei suoli con valori di pH acidi

I batteri si sviluppano maggiormente nei suoli con valori di pH alcalini

Una proprietà importante dei terreni nutritivi è il pH. Il pH del suolo può influire sull’accrescimento delle piante e dei microrganismi.

Influenza del pH sulla disponibilità degli elementi nutritivi

Il pH è fondamentale per mantenere lo stato di solubilità degli elementi e ottimizzare i processi di scambio fra le radici e la soluzione nutritiva.

A valori di pH più basso diventano più solubili i sali presenti nel suolo come carbonati, solfati e fosfati facilitandone l’assorbimento da parte delle radici.

pH del terreno

Colture

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Colture : come si fa?

’

Colture

Colture

Problemi delle colture tradizionali:

Problemi delle colture tradizionali:

Grazie per la cortese attenzione