Cooperazione e conflitti nei biofilm -...

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Cooperazione e Cooperazione e conflitti nei biofilm conflitti nei biofilm microbici microbici Cosimo Di Fonzo matr. 719408 Algoritmi per la Bioinformatica Laurea Magistrale in GFB, A.A. 2007/08

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Cooperazione e Cooperazione e conflitti nei biofilm conflitti nei biofilm microbicimicrobici

Cosimo Di Fonzo matr. 719408

Algoritmi per la BioinformaticaLaurea Magistrale in GFB, A.A. 2007/08

Biofilm

I biofilm sono comunità ben strutturate di batteri racchiuse in una matrice polimerica prodotta dalle cellule stesse, i quali crescono su superfici (inerti o “biologiche”) solitamente all’interfaccia con una fase liquida;

Importanza: Biofilm come fattore di virulenza (aumentano la resistenza alle terapie); Industria (bioreattori); Bioredemention; Depurazione delle acque di scarico;

Poca conoscenza sulle dinamiche e sui processi di base coinvolti nella formazione e crescita dei biofilm;

Biofilm: formazione

Adesione Colonizzazione Maturazione

Interazioni chimico-fisiche Proteine di membrana, Flagello…

↑ ↑ ↑Pili, Polisaccaridi (alginato), Fattori di aggregazione cellulare (curli, ecc.)

EPS: produzione/organizzazioneQuorum sensing

Biofilm in risposta allo stess?

Come risposta a stress ambientali: si forma in condizioni non ottimali di crescita (basse temperature, scarse sostanze nutritive);

Paradosso: il batterio decide di non usare i polisaccaridi per il proprio metabolismo, ma per la produzione e secrezione di polimeri → nonostante la crescita ridotta, decide di organizzarsi in biofilm;

Le cellule passano la maggior parte della loro vita in biofilm piuttosto che come cellule planctoniche;

Il ruolo della matrice polimerica

La matrice è costituita da sostanze polimeriche extracellulari (EPS), con il compito di “stipare” i batteri;

Malgrado la produzione di polimeri sia ubiquitaria, non si conosce ancora l’esatto beneficio evolutivo;

Benefici “accertati”: Mantenimento della struttura; Protezione dall’aggressione di deidrogenasi, radiazioni ultraviolette,

escoriazione da parte di predatori; Facilitano l’attività extracellulare enzimatica e il meccanismo di

segnalazione; Condivisione delle risorse: Nei biofilm le cellule condividono la maggior parte delle molecole secrete

(enzimi, molecole segnale, polimeri); Ciò suggerirebbe ci sia una apertura alla evoluzione di ceppi “imbroglioni”,

che sfruttano le risorse degli altri, senza contribuire al pool del gruppo;

Cosa si sa oggi sui biofilm?

Biofilm ad unico ceppo batterico: perfetta cooperazione tra le cellule, nessuna competizione evolutiva;

Semplice raggiungimento della situazione ottima per il gruppo;

Biofilm a più ceppi di un’unica specie batterica o multispecie: bassa conoscenza;

È improbabile che i biofilm abbiano una struttura clonale necessaria per generare la perfetta cooperazione;

Biofilm e Systems Biology (SB)

Perché la SB? Chiarezza sulle dinamiche e sui processi di base coinvolti nella formazione e crescita del biofilm;

Come? Costruzione di modelli matematici che descrivono in modo formale la struttura e le dinamiche del biofilm;

Modelli matematici → rappresentazione quantitativa del sistema;

Consistono in un set di equazioni che permettono di fare astrazioni circa le informazioni richieste per la simulazione del sistema;

Rappresentazioni meccanicistiche e rigorose basate su principi primari (leggi della fisica, chimica e biologia);

Studiare in silico gli effetti dei cambiamenti di particolari parametri che non sarebbero valutabili attraverso esperimenti di laboratorio;

Biofilm modelling

Modellazione 1D: il biofilm è visto come un uniforme film steady state → utilizzata per descrivere trasformazioni macroscopiche;

Limiti: (1) sistemi a singolo organismo, (2) molte caratteristiche

esplicitamente definite, (3) incapace di generare morfologia caratteristica;

Modellazione 2D/3D: adatta ai biofilm multispecie → offrono la possibilità di trarre proprietà implicite da principi di base;

Consentono una modellazione modulare → sottomodelli: (a) crescita e

deperimento della biomassa, (b) divisione e propagazione, (c) trasporto del substrato e reazioni, (d) distaccamento della biomassa, (e) il flusso liquido oltre il biofilm, (f) ancoraggio della biomassa;

Miglior comprensione di fenomeni specifici, migliore validazione dei componenti individuali, risoluzione delle equazioni più flessibile:

Modelli: (1) individual-based models (IbM) e (2) biomass-based model

Individual-based model (IbM)

Gli individual-based model dicono che la simulazione globale è una conseguenze delle interazioni locali dei membri di una popolazione;

Approccio bottom-up;

Individui: membri di una popolazione; Framework: contesto in cui avvengono le interazioni tra individui; Parametri; Comportamenti: sono definiti esplicitamente da un insieme di regole che

mimano il comportamento degli individui reali;

Modellazione di biofilm: La dinamica della “comunità” biofilm emergerà implicitamente dalle

interazioni locali delle singole cellule, come crescita e riproduzione; Spatially explicity: locazione in uno spazio geometrico; Mobilità: gli individui si muovono nel framework in modo indipendente;

Biomass-based model

Biofilm è trattato come un sistema multifase: il volume è usato per sviluppare l’equazione macroscopica della dinamica della biomassa;

Biomassa: massa delle cellule per unità di volume;

Cellular automata (CA): Approccio bottom-up; Modellazione grind-based: la biomassa è allocata su una griglia; Il cambiamento della biomassa avviene passo dopo passo, lungo un

numero finito di direzioni, in accordo ad un set di regole;

Approccio continuo: Diverso da bottom-up: rappresentazione omogenea della biomassa, la

quale propagazione è modellata da equazioni differenziali;

IbM, CA e Approccio continuo: differenze

IbM e CA

IbM è più adatto alla modellazione di biofilm multispecie rispetto a CA, e permette la comprensione delle relazioni tra proprietà microscopiche e macroscopiche nei sistemi a popolazione mista;

CA ha poca libertà di movimento ed assume ambiente uniforme per la crescita;

IbM e approccio continuo

Nell’approccio continuo, il metodo usato per propagazione della biomassa è deterministico, e può essere analizzato numericamente (negli approcci bottom-up è stocastico), mentre il biofilm è visto come un fluido viscoso e incomprimibile, più adatta della rappresentazione gel-like dell’IbM → non adatto per biofilm multispecie;

Altruismo: comportamento che incrementa la fitness, correlata al gruppo, di altri gruppi a scapito di quella del proprio gruppo;

Gruppo: cellule dello stesso ceppo batterico;

Il modello di Kreft (2004)

Modello fatto su biofilm a singola specie: due ceppi con differenti tassi di uptake del glucosio → valutare il loro comportamento nel biofilm in formazione;

Holophaga foetida (batterio anaerobico): (1) YS (yield strategy – alta produzione (polimeri, enzimi, ecc.) con basso tasso di crescita) e (2) RS (rate strategy – alto tasso di crescita e bassa produzione;

Simulazione con BacSim (Kreft, et al. 2001) (IbM) → modellazione multidimensionale (2D);

Cellule batteriche viste come sfere: divisione cellulare al raggiungimento di un valore critico, e se le cellule si sovrappongono sono spinte in avanti;

Il trasporto dei substrati avviene per diffusione dal bulk liquid (fonte), diffondendo attraverso il boundary layer, all’interno del biofilm.

Crescita è verso la fonte di substrato, e la sua diffusione è guidata dal consumo del substrato: cellule RS domanderanno più substrato.

Il flusso del carbonio

Rappresentazione del flusso di carbonio coinvolto dall’uptake del substrato alla formazione dei prodotti finali (biomassa e sostanze extracellulari);

RS YS

Sostanze extracellulari Sostanze

extracellulari Biomassa Biomassa

Risultati

In un ambiente in cui le risorse sono limitate, le due condizioni (YS, RS) cooperano nella formazione del biofilm → origine e mantenimento di una strategia altruistica (senza interazioni dirette);

Cellule del ceppo YS dovrebbero aiutare (o venire sfruttati) quelle del ceppo RS;

Cooperazione ed altruismo sono necessari per la formazione ottimale del biofilm.

È vero che la produzione di polimeri richiede una cooperazione globale all’interno del biofilm?

Ma se la produzione di polimeri riduce la disponibilità di energia per la crescita, che cosa sostiene la produzione di polimeri, e come essa fronteggia la selezione per competizione di altre cellule a crescita rapida?

Scopo del lavoro

“Nei biofilm ci sono alti livelli di cooperazione perché la produzione di EPS da parte di un ceppo produttore può essere usata e sfruttata dagli altri tipi cellulari”

I conflitti potrebbero essere maggiori rispetto ai comportamenti altruistici proposti da Kreft;

Verificare tale ipotesi con simulazione basata su IbM: competizione tra ceppo produttore di EPS (EPS+) e non produttore (EPS-) in biofilm;

Valutare gli effetti della fitness della produzione di EPS per differenti livelli di investimento in polimeri (f) e diverse densità di polimeri (ρX/ρEPS);

Biofilm modelling: IbM proposto

È un framework per l’implementazione di modelli biofilm multispecie multidimensionali (2D o 3D);

Descrizione discreta della biomassa (individui = particelle di biomassa); Descrizione biochimica del flusso di carbonio per la crescita e produzione di

polimeri extracellulari (EPS); Calcolo degli effetti della diffusione e dei conseguenti gradienti di soluto nel

biofilm;

Mantiene la descrizione strutturata della biomassa, che distingue i suoi componenti (specie batteriche, biomassa inerte e EPS);

Integra la possibilità di implementare (1) qualsiasi tipo di interazione cinetica cibo/microrganismo, insieme a qualsiasi numero di particulate species e soluti coinvolti, (2) secrezione di EPS, e detachment della biomassa;

Il framework

Le tre scale considerate nel modellazione multidimensionale del biofilm;

Il framework

Classificazione: (a) Particulate species: qualsiasi sostanza componente la matrice del

biofilm (biomassa attiva, prodotti di riserva, come lipidi e glicogeno, EPS);

(b) Solute species (o soluti): composti disciolti nella fase liquida, ma anche prodotti microbici (ossigeno, fonti di carbonio e azoto, molecole coinvolte nel meccanismo di segnalazione extracellulare);

Individui: agenti di biomassa (sferici o cilindrici) indipendenti (individual biomass

particles), piuttosto che come singole cellule batteriche, che ne minano il comportamento (crescono, si dividono, si muovono, deperiscono, muoiono) → pDocument type

Processi di bioconversione: tutte le reazioni in biofilm, le quali possono coinvolgere qualsiasi numero di

substrati e di prodotti metabolici (sia soluti che particulate);

Il framework

Tasso di reazione: tutte le reazioni definite hanno tasso di reazione del primo ordine, alla concentrazione del particulate che media la reazione;

Il tasso di reazione i (ri), è definito in termini di massa della specie di riferimento (m), coinvolta nel processo (substrato o prodotto). La reazione è mediata dalla particulate species p;

qi è il tasso specifico della reazione i, ed è definito come il prodotto di qimax (tasso specifico massimo) ed una serie di fattori di saturazione (φj );

Cp è la concentrazione della particulate species p;

Il framework

Il tasso netto (rn) per una specie n (soluto o particulate), è dato dalla somma dei tassi di tutte le reazioni in cui n è coinvolta, moltiplicati per uno specifico coefficiente di produzione (Ynm) e un fattore segnale (γin):

Ynm è sempre positivo; γin vale +1 o -1, rispettivamente, se n è prodotto o consumato in i → descrivere bioprocessi che usano tabelle stechiometriche;

Bilanciamento della massa: l’eq. sopra, se scritta in termini di massa per particle, è usata per calcolare i cambiamenti della massa di ogni particulate;

Mn e Mp sono, le masse dei un particulate n e p (che media la reazione i) di un agente → al variare della massa, cambierà anche la sua dimensione;

Il framework

Distaccamento (o detachment): stress meccanici agiscono sulla superficie del biofilm causano il distaccamento, che dipenderà dalla densità locale del biofilm, e dalla concentrazione locale della specie chimica che induce il distaccamento;

Deperimenti: riduzione della dimensione della biomassa degli agenti, dovuto a decay di EPS o inattivazione della biomassa batterica → tirerà vero se stesso gli agenti vicini, con riduzione del volume del biofilm;

Bilanciamento massa dei soluti: Presenti sia nella fase liquida (costituita da bulk liquid compartment e da un concentration boundary layer) che nella fase biofilm. Calcola la dinamica della concentrazione dei soluti, mentre gli effetti del trasporto dei soluti possono essere trascurati;

Bulk concentration dei soluti: impostata dall’utente o calcolata dal

bilanciamento di massa del sistema. Essa può essere costante o a intermittenza: influenzerà il comportamento del biofilm;

Il framework

Implementazione: i processi coinvolti nella formazione del biofilm implementati in modo sequenziale attraverso una simulazione ciclica

Il ciclo di simulazione prevede:

Determinazione del time step, Δt, per la presente interazione al tempo t; Operazioni di crescita della biomassa e propagazione del biofilm: Crescita degli agenti di biomassa (con eventuali divisioni o rilascio EPS); Ciclo di propagazione, in cui c’è l’avanzamento del fronte del biofilm; Distaccamento di biomassa; Aggiornamento del campi di concentrazione dei soluti: Aggiornamento della bulk concentration dei soluti, esecuzione del

bilanciamento della massa globale dei soluti con comportamento dinamico; Aggiornamento dei campi di concentrazione spaziale dei soluti allo steady

state; Avanzamento del tempo di simulazione a t = t + Δt e riavvio del ciclo di

simulazione dal passo 1.

Il framework

La simulazione ciclica usa time step variabili (Δt), permettendo così l’uso del framework per modellare la formazione di sistemi biofilm diversi;

I time step di ciascuna iterazione devono essere adattati per garantire la stabilità di tutti i passaggi della simulazione: scelta della Δt limite (contraint Δt) in base alla scala d’interesse

Δt1 limite - scala individuale; Δt2 limite - scala-biofilm; Δt3 limite - scala-sistema;

La selezione del time step per l’iterazione sarà il minimo tra

Il framework

Scopo: modellazione dei processi biochimici che guidano la crescita di individui EPS+ ed EPS-, per l’analisi del comportamento nella formazione di biofilm;

Scelta della dimensionalità del sistema (2D) e della scala del volume computazionale (dominio quadrato con lati pari a 1000 μm);

Definizione di: Raggio massimo delle particella di biomassa (Rdivision = 8 μm) e della griglia

di risoluzione del campi di concentrazione dei soluti (ossigeno); Particulate e dei soluti coinvolti nel sistema e quali reazioni avvengono

(pDocument type); Espressioni per i tassi di reazione, e associazione delle reazioni con ogni

specie coinvolta, usando i coefficienti di produzione (tabella stechiometrica); Velocità del distaccamento; Boundary layer; Criterio di terminazione della simulazione (20 giorni)

Il flusso del carbonio

Rappresentazione del flusso di carbonio coinvolto dall’uptake del substrato (glucosio) alla formazione dei prodotti finali (biomassa ed EPS);

Parametro centrale: f è l’investimento nella produzione di polimeri

Rappresentazione del flusso di carbonio coinvolto dall’uptake del substrato (glucosio) alla formazione dei prodotti finali, biomassa ed EPS;

Parametro centrale: f è l’investimento nella produzione di polimeri

rs è il tasso netto di uptake del glucosio (rate-limiting step)

rX, rEPS = tassi di produzione di biomassa e EPS

rCO2 = tasso di CO2 rilasciatarO2 = tasso di consumo O2

Y = coefficiente di produzione per uso del carbonio

Parametri

Il set di parametri è valuto sul patogeno umano opportunista Pseudomonas aeruginosa → crescita aerobica e usa come fonte di carbonio il glucosio;

La crescita è diffusione-limitata;

Soluti e gradiente di O2

Soluti: glucosio e O2 (consumati) e CO2 (prodotto); Gradiente di ossigeno: L’O2 disciolto è trasportato per diffusione, e

consumati nelle reazione che avvengono nel biofilm; La diffusione e reazione dell’ossigeno è descritta dall’equazione

differenziale parziale

è il gradiente della funzione nella coordinate cartesiane (2D); DO2 è la capacità diffusiva dell’ossigeno ed è variabile → permette di

correlare la diffusione alla composizione della biomassa; È risolta allo steady state (la diffusione è più veloce della crescita batterica);

Soluti e gradiente di O2

La diffusione-reazione dell’ossigeno è risolta ad ogni iterazione di crescita del biofilm;

Condizioni: substrato solido a flusso zero, bordi ciclici del dominio di calcolo, valori costati per i limiti superiori al concentration boundary layer.

Particulate species

Il biofilm è composto da biomassa attiva (microrganismi) e da EPS (si assume che le particulate species siano presenti solo nella fase-biobilm);

pDocument type: (a) Agenti rappresentati le cellule EPS+: composti da biomassa, capaci

anche di produrre e secernere EPS;

(b) Agenti rappresentanti le cellule EPS-: composti solo da biomassa (caso speciale di EPS+ con f = 0);

Particulate species

Il volume occupato da ciascun agente (Va) è dato dalla sua composizione. Per l’agente EPS+ si otterrà

Va serve a determinare le attività degli agenti (crescita, divisione, rilascio di EPS, deperimento)

Riproduzione: quando Rparticle = Rdivision → divisione dell’agente; Escrezione di EPS: la frazione di massa EPS relativa alla massa totale

raggiunge fEPS,excration

Set di simulazione ed inoculi

Primo set: valutare la competizione tra cellule del ceppo produttore di EPS (EPS+) con quelle del ceppo non produttore (EPS-), nella realizzazione di biofilm;

Inoculo: 50 individui di ciascun ceppo piazzati casualmente;

Secondo set: (a) valutare la capacità invasiva del ceppo EPS+, durante la formazione di biofilm, e (b) analizzare la comparsa di un mutante (cellula focale produttrice o non produttrice di EPS) all’interno di una popolazione con caratteristiche opposte;

Inoculo (a): 100 individui (differenti quantità di EPS+ e EPS-);

Inoculo (b): 61 individui (60 EPS- ed 1 EPS+ e vice versa);

Competizione diretta

Il primo set di simulazioni: semplice competizione diretta tra i ceppi EPS+ ed EPS- in un biofilm in formazione;

Per entrambi i ceppi è calcolata la fitness, come segue

Obiettivo: valutare il range di valori di f e ρX/ρEPS per cui la produzione di EPS può fornire un vantaggio all’interno di un biofilm;

Osservazione: un vantaggio relativo al biofilm, può non essere un vantaggio evolutivo se la crescita veloce porta grandi costi alla produttività totale → analisi della capacità invasiva;

Competizione diretta

Tasso di crescita relativo al ceppo EPS+ in un biofilm: la competizione dipende sia dall’investimento, che dalla densità, di EPS;

Competizione diretta

La competizione diretta tra EPS+ e EPS- mostra l’importanza del gradiente di ossigeno nei risultati della competizione (f = 0,55 e ρX/ρEPS = 6);

Competizione diretta

Riassumendo: Con gradiente di ossigeno nullo (caso irrealistico): competizione

decisa dal tasso di crescita: Il ceppo EPS- ha la meglio su EPS+ (Movie 1);

Con gradienti di ossigeno: dipendenza da f e dalla densità di EPS;

Per alte densità di EPS (ρX/ρEPS = 1), EPS+ perde il confronto con EPS- (Movie 2);

Per basse densità di EPS (ρX/ρEPS > 1), c’è un ampio range di valori di f per i quali EPS+ vince il confronto con EPS- (Movie 3);

Per vedere i movie: http://www.pnas.org/cgi/content/full/0607651104/DC1#M1

Invasione di un raro mutante

Il secondo set di simulazioni valuta se la produzione di polimeri sia evolutivamente stabile;

Analisi della capacità invasiva (a): Raro mutante EPS+ → EPS-; Reinvasione di EPS- → EPS+

Fitness di invasione

wS1 e ‹wS2› sono, rispettivamente, la fitness del mutante e la fitness media della popolazione;

Invasione di un raro mutante

Analisi dell’invasione di un raro mutate: (a) EPS+→ EPS-, (b) EPS+→ EPS- (f = 0,5);

Quando vince EPS+?

Riassumendo: La capacità invasiva è valutata in termini di correlazione genetica media

(con 10 ceppi la correlazione media è pari a 0,1);

L’invasione di ceppi produttori di EPS è favorita da:

Presenza di molti ceppi (bassa correlazione genetica);

Basse densità del polimero;

In precise condizioni, sia EPS+ può invadere una popolazione EPS-, che vice versa → entrambi coesistono stabilmente in una popolazione;

EPS+ è altruista o egoista?

Analisi della capacità invasiva (b): sistema con singola cellula focale EPS+, all’interno di una popolazione di EPS- → valutare gli effetti della fitness sulle discendenze di EPS+ e delle cellule EPS-;

Il comportamento della cellula focale EPS+: all’inizio della simulazione, paga la lenta divisione;

il guadagno è rivolto alle generazioni successive: la secrezione di EPS spingerà i discendenti della cellula focale EPS+, (a) verso condizioni ricche di O2, (b) e con ridotta competizione per lo spazio;

L’ altruismo della cellula focale favorirà la selezione del ceppo EPS+;

L’altruismo non è rivolto alle cellule EPS- → competizione;

EPS+ “soffoca” EPS-!

La produzione di polimeri da parte della cellula focale EPS+ è altruistica per la propria stirpe, ma dannosa per le cellule vicine EPS-;

EPS+ “soffoca” EPS-!

Nella fase di iniziazione del biofilm, c’è forte competizione;

produzione EPS è malevola per le cellule EPS- → riduzione della fitness; soffocamento delle EPS- → permette a EPS+ di invadere molto facilmente

biofilm a maggioranza EPS-;

La natura del vantaggio è dipendente da: Frequenza nella produzione di polimeri → all’aumentare di EPS

diminuiscono i benefici associati (maggior competizione interna per spazio e O2);

Frequenza con cui i produttori di EPS compaiono→ aumenta la competizione locale per lo spazio (ma è ridotta dall’espansione verso l’alto);

Superproduttori di EPS

Il vantaggio è dipendente dall’investimento nella produzione di EPS (f = 1,5 e ρX/ ρEPS = 6);

EPS: esiste un certo equilibrio

Riassumendo:

Medio/bassa produzione di EPS: benefici per le cellule produttrici (si raggiungono concentrazioni di O2 favorevoli);

Grande produzione di EPS: le cellule EPS+ sono disperde nel biofilm, con diluizione del gradiente di O2 → riselezione del ceppo EPS-;

L’investimento nella produzione dei polimeri (f), evolve attraverso mutazione, che deve portare a piccoli effetti nella produzione di polimeri;

Conclusioni

In un biofilm misto, la secrezione di polimeri fornisce un forte vantaggio competitivo alla discendenza delle cellule produttrici: la cooperazione globale non è richiesta;

La secrezione di EPS è altruista solo verso i discendenti, perché li spinge verso zone ricche di ossigeno e fornisce loro un forte vantaggio competitivo, dovuto al soffocamento delle cellule non produttrici vicine;

I produttori di EPS non avranno sempre la meglio sui non produttori;

La matrice polimerica fornisce benefici globali (protezione contro antimicrobici) sia alla stirpe produttrice di EPS, ma anche alle altre → altalenarsi di cooperazione e conflitti tra i vari ceppi;

Il modello si oppone alla idea consolidata che vuole che nei biofilm misti, la produzione di EPS diminuisca, e con essa anche la resistenza agli antimicrobici → la produzione di polimeri, invece aumenta (vedi Pseudomonas aeruginosa);

“Ciao Darwin…”

Cooperazione ed un adattamento altruista rappresentano un problema in biologia evolutiva, perché va contro i principi della teoria evoluzionistica, la quale predice che la selezione per egoismo ed imbroglio dovrebbe scalzare i comportamenti di gruppo.

Riferimenti bibliografici

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Kreft, J.U., Picioreanu C., Wimpenny, J.W.T., and van Loosdrecht, M.C.M (2001) Individual-based modelling of biofilms. Microbiol-SGM 147, 2897-2912

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Xavier, J.B. and Foster, K.R. (2007) Cooperation and conflict in microbial biofilms. PNAS 104, 876-88;