8/9/2019 Conversion of Sam to Ethy

1/5

P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USAV o l . 7 6 , N o . 1 , p p . 1 7 0 - 1 7 4 ' , J a n u a r y 1 9 7 9B i o c h e m i s t r y

E t h y l e n e b i o s y n t h e s i s : I d e n t i f i c a t i o n o f 1 - a m i n o c y c l o p r o p a n e - 1 -c a r b o x y l i c a c i d a s a n i n t e r m e d i a t e i n t h e c o n v e r s i o no f m e t h i o n i n e t o e t h y l e n e( S - a d e n o s y l m e t h i o n i n e / a m i n o e t h o x y v i n y l g l y c i n e / f r u i t r i p e n i n g / a p p l e )

D . 0 . ADAMS AND S . F . YANGD e p a r t m e n t o f V e g e t a b l e C r o p s , U n i v e r s i t y o f C a l i f o r n i a , D a v i s , C a l i f o r n i a 9 5 6 1 6C o m m u n i c a t e d b y P . K . S t u m p f , O c t o b e r 1 3 , 1 9 7 8ABSTRACT L f U - 1 4 C j M e t h i o n i n e f e d t o a p p l e t i s s u e w a se f f i c i e n t l y c o n v e r t e d t o e t h y l e n e w h e n t h e t i s s u e w a s i n c u b a t e di n a i r . I n n i t r o g e n , h o w e v e r , i t w a s n o t m e t a b o l i z e d t o e t h y l e n eb u t w a s i n s t e a d c o n v e r t e d t o 1 - a m i n o c y c l o p r o p a n e - 1 - c a r b o x y -l i c a c i d ( A C C ) . When a p p l e t i s s u e s w e r e f e d w i t h L [ m e t h y l -I 4 C j m e t h i o n i n e o r L { 3 5 S ~ m e t h i o n i n e a n d i n c u b a t e d i n n i t r o g e n ,r a d i o a c t i v i t y w a s f o u n d s u b s e q u e n t l y i n m e t h y l t h i o r i b o s e . T h i ss u g g e s t s t h a t m e t h i o n i n e i s f i r s t c o n v e r t e d t o S - a d e n o s y l m e t h -i o n i n e w h i c h i s i n t u r n f r a g m e n t e d t o ACC a n d m e t h y l t h i o -a d e n o s i n e . M e t h y l t h i o a d e n o s i n e i s t h e n h y d r o l y z e d t om e t h y l t h i o r i b o s e . T h e c o n c l u s i o n t h a t A CC i s a n i n t e r m e d i a t ei n t h e c o n v e r s i o n o f m e t h i o n i n e t o e t h y l e n e i s b a s e d o n t h ef o l l o w i n g o b s e r v a t i o n s : L a b e l e d AC C w a s e f f i c i e n t l y c o n v e r t e dt o e t h y l e n e b y a p p l e t i s s u e i n c u b a t e d i n a i r ; t h e c o n v e r s i o n o fl a b e l e d m e t h i o n i n e t o e t h y l e n e w a s g r e a t l y d e c r e a s e d i n t h ep r e s e n c e o f u n l a b e l e d A C C , b u t t h e c o n v e r s i o n o f l a b e l e d ACCt o e t h y l e n e w a s l i t t l e a f f e c t e d b y t h e p r e s e n c e o f u n l a b e l e dm e t h i o n i n e ; a n d 2 - a m i n o - 4 ( 2 ' - a m i n o e t h o x y ) t r a n s - 3 - b u t e n o i ca c i d , a p o t e n t i n h i b i t o r o f p y r i d o x a l p h o s p h a t e - m e d i a t e d e n -z y m e r e a c t i o n s , g r e a t l y i n h i b i t e d t h e c o n v e r s i o n o f m e t h i o n i n et o e t h y l e n e b u t d i d n o t i n h i b i t c o n v e r s i o n o f AC C t o e t h y l e n e .T h e s e d a t a i n d i c a t e t h e f o l l o w i n g s e q u e n c e f o r t h e p a t h w a y o fe t h y l e n e b i o s y n t h e s i s i n a p p l e t i s s u e : m e t h i o n i n e - _ S - a d e n o -s y l m e t h i o n i n e - A C C - e t h y l e n e . A p o s s i b l e m e c h a n i s m a c -c o u n t i n g f o r t h e s e r e a c t i o n s i s p r e s e n t e d .E t h y l e n e i s a p l a n t h o r m o n e t h a t i n i t i a t e s f r u i t r i p e n i n g a n dr e g u l a t e s m a n y a s p e c t s o f p l a n t g r o w t h a n d d e v e l o p m e n t ( 1 ) .I t i s g e n e r a l l y t h o u g h t t h a t m e t h i o n i n e i s t h e c o m m o n p r e c u r s o ro f e t h y l e n e t h r o u g h o u t d i v e r s e h i g h e r p l a n t t i s s u e s i n w h i c h t h eh o r m o n e o c c u r s a n d e x e r t s i t s m a n y e f f e c t s ( 2 - 4 ) . I n a p p l e t i s s u et h e c o n v e r s i o n o f m e t h i o n i n e t o e t h y l e n e r e p r e s e n t s t h e m a j o rm e t a b o l i s m o f m e t h i o n i n e ( 5 ) . I n t h i s c o n v e r s i o n , C - 1 o f m e -t h i o n i n e i s c o n v e r t e d t o C O 2 , C - 2 t o f o r m i c a c i d , a n d C - 3 , 4 t oe t h y l e n e . T h e s u l f u r a t o m , h o w e v e r , i s r e t a i n e d i n t h e t i s s u e ( 2 ) .B e c a u s e t h e c o n v e r s i o n o f m e t h i o n i n e t o e t h y l e n e i s g r e a t l yi n h i b i t e d b y u n c o u p l e r s o f o x i d a t i v e p h o s p h o r y l a t i o n , B u r g ( 6 )a n d M u r r a n d Y a n g ( 7 ) p r o p o s e d t h a t S - a d e n o s y l m e t h i o n i n e( S A d o M e t ) , f o r m e d f r o m m e t h i o n i n e a n d A T P , i s a n i n t e r m e -d i a t e b e t w e e n m e t h i o n i n e a n d e t h y l e n e . A d a m s a n d Y a n g ( 8 )h a v e p r e s e n t e d e v i d e n c e s h o w i n g t h a t 5 ' - m e t h y l t h i o a d e n o s i n e( M e S A d o ) a n d i t s h y d r o l y s i s p r o d u c t , 5 - m e t h y l t h i o r i b o s e( M e S R i b ) , a r e d e r i v e d f r o m t h e C H 3 S g r o u p o f m e t h i o n i n ed u r i n g i t s c o n v e r s i o n t o e t h y l e n e a n d h a v e s u b s t a n t i a t e d t h e r o l eo f S A d o M e t a s a n i n t e r m e d i a t e i n t h e b i o s y n t h e s i s o f e t h y l e n ef r o m m e t h i o n i n e .I t h a s b e e n k n o w n f o r s o m e t i m e t h a t e n d o g e n o u s e t h y l e n ep r o d u c t i o n , a s w e l l a s t h e c o n v e r s i o n o f m e t h i o n i n e t o e t h y l e n e ,c e a s e s i n p l a n t t i s s u e s p l a c e d i n a n a n a e r o b i c a t m o s p h e r e a n dt h a t a s u r g e o f e t h y l e n e p r o d u c t i o n o c c u r s u p o n e x p o s u r e o f t h et i s s u e t o a i r . T h e s e o b s e r v a t i o n s a r e i n t e r p r e t e d t o i n d i c a t e t h a t

a n i n t e r m e d i a t e a c c u m u l a t e s d u r i n g a n a e r o b i c i n c u b a t i o n a n di s s u b s e q u e n t l y c o n v e r t e d t o e t h y l e n e u p o n e x p o s u r e t o o x y g e n( 2 , 9 ) . W e t h e r e f o r e e x a m i n e d t h e m e t a b o l i s m o f m e t h i o n i n eu n d e r t h e s e c o n d i t i o n s . W e n o w r e p o r t t h a t I - a m i n o c y c l o -p r o p a n e - 1 - c a r b o x y l i c a c i d ( A C C ) i s t h e i n t e r m e d i a t e i n t h ec o n v e r s i o n o f m e t h i o n i n e t o e t h y l e n e . T h e c o n v e r s i o n o f m e -t h i o n i n e t o ACC i s s t r o n g l y i n h i b i t e d b y a m i n o e t h o x y v i n y l -g l y c i n e ( A V G ) , a n i n h i b i t o r o f p y r i d o x a l p h o s p h a t e - m e d i a t e dr e a c t i o n s , a n d t h e c o n v e r s i o n o f AC C t o e t h y l e n e r e q u i r e so x y g e n .MATERIALS A ND METHODSP l a n t M a t e r i a l . A p p l e s ( M a l u s s y l v e s t r i s M i l l , v a r . G o l d e nD e l i c i o u s ) w e r e p i c k e d n e a r C a m i n o , C A , d u r i n g c o m m e r i c a lh a r v e s t . F r u i t w e r e s t o r e d a t 0 0 C a n d w e r e t r a n s f e r r e d t o r o o mt e m p e r a t u r e 2 4 - 4 8 h r p r i o r t o t h e e x p e r i m e n t .C h e m i c a l s . L - [ U - 1 4 C ] M e t h i o n i n e a n d D L - [ 4 - 1 4 C ] h o m o s e r i n ew e r e p u r c h a s e d f r o m S c h w a r z / M a n n , L - [ a 5 S ] m e t h i o n i n e a n dL - [ m e t h y l - 1 4 C ] m e t h i o n i n e f r o m A m e r s h a m / S e a r l e , a n d D L -a - a m i n o [ 3 - 1 4 C ] b u t y r i c a c i d f r o m C a l b i o c h e m . AVG w a s a g i f tf r o m J . P . S c a n n e l l ( H o f f m a n n - L a R o c h e ) . S o m e a u t h e n t i cs a m p l e s o f AC C w e r e k i n d l y p r o v i d e d b y L . F . B u r r o u g h s a n dW . C . J . R o s s , a n d o t h e r s w e r e p u r c h a s e d f r o m C a l b i o c h e m .D L - V i n y l g l y c i n e w a s a p r o d u c t o f C a l b i o c h e m . H o m o s e r i n el a c t o n e w a s s y n t h e s i z e d f r o m h o m o s e r i n e ( 1 0 ) .F e e d i n g E x p e r i m e n t s . P l u g s , 1 cm i n d i a m e t e r a n d 2 cm

l o n g , w e r e c u t f r o m a p p l e f r u i t w i t h a c o r k b o r e r a n d s c a l p e l .T h e y w e r e q u i c k l y r i n s e d i n 2 % ( w t / v o l ) K C 1 a n d b l o t t e d w i t ha p a p e r t o w e l . I n d i c a t e d s u b s t r a t e s w e r e i n f u s e d b y a v a c u u mi n f i l t r a t i o n t e c h n i q u e a s d e s c r i b e d ( 1 1 ) . F o r i n c u b a t i o n i n an i t r o g e n o r a i r a t m o s p h e r e , a t i s s u e p l u g w a s p l a c e d i n a 1 2 - m lp l a s t i c s y r i n g e f i t t e d w i t h a t h r e e - w a y s t o p c o c k . Two h o l e s ( 3mm d i a m e t e r ) w e r e m a d e n e a r t h e e n d o f t h e s y r i n g e t o a l l o wf l u s h i n g w i t h a s t r e a m o f n i t r o g e n o r a i r f r o m t h e s t o p c o c k i n l e t .A f t e r f l u s h i n g , t h e s y r i n g e w a s s e a l e d f o r i n c u b a t i o n . G a ss a m p l e s w e r e w i t h d r a w n p e r i o d i c a l l y f r o m t h e i n c u b a t i o n s y -r i n g e w i t h a s a m p l i n g s y r i n g e a n d a s s a y e d f o r t o t a l a n d r a d i o -a c t i v e e t h y l e n e . T o t a l e t h y l e n e w a s d e t e r m i n e d b y g a s c h r o -m a t o g r a p h y o f a 1 - m l s a m p l e . R a d i o a c t i v e e t h y l e n e w a s d e -t e r m i h e d b y i n j e c t i n g a 5 - m l s a m p l e i n t o a s c i n t i l l a t i o n v i a ls e a l e d w i t h a r u b b e r s e r u m c a p a n d c o n t a i n i n g 0 . 2 m l o f 0 . 2 5M m e r c u r i c p e r c h l o r a t e a s a b s o r b a n t . A f t e r 9 0 m i n , r a d i o a c -t i v i t y w a s a s s a y e d b y s c i n t i l l a t i o n c o u n t i n g .C h a r a c t e r i z a t i o n o f R a d i o a c t i v e M e t a b o l i t e s . A f t e r i n -c u b a t i o n , i c e - c o l d e t h a n o l w a s i n t r o d u c e d i n t o t h e s y r i n g ew h i c h w a s t h e n p l a c e d i n a d r y i c e / a c e t o n e b a t h . T h e p l u g o ft i s s u e w a s l a t e r h o m o g e n i z e d a n d e x t r a c t e d w i t h 8 0 % e t h a n o l .A b b r e v i a t i o n : A C C , 1 - a m i n o c y c l o p r o p a n e - l - c a r b o x y l i c a c i d ; A V G ,a m i n o e t h o x y v i n y l g l y c i n e [ 2 - a m i n o - 4 - ( 2 ' - a m i n o e t h o x y ) t r a n s - 3 - b u -t e n o i c a c i d ] ; M e S A d o , 5 ' - m e t h y l t h i o a d e n o s i n e ; M e S R i b , 5 - m e t h y l -t h i o r i b o s e ; S A d o M e t , S - a d e n o s y l m e t h i o n i n e .

1 7 0

T h e p u b l i c a t i o n c o s t s o f t h i s a r t i c l e w e r e d e f r a y e d i n p a r t b y p a g ec h a r g e p a y m e n t . T h i s a r t i c l e m u s t t h e r e f o r e b e h e r e b y m a r k e d " a d -v e r t i s e m e n t " i n a c c o r d a n c e w i t h 1 8 U . S . C . 1 7 3 4 s o l e l y t o i n d i c a t et h i s f a c t .

8/9/2019 Conversion of Sam to Ethy

2/5

P r o c . N a t i . A c a d . S c i . USA 7 6 ( 1 9 7 9 ) 1 7 1T h e e x t r a c t s were c o n c e n t r a t e d i n vacuo a t 3 8 ' C a n d c h r o -m a t o g r a p h e d o n Whatman 3 MM paper w i t h b u t a n o l / a c e t i ca c i d / w a t e r , 4 : 1 : 5 ( v o l / v o l ) , a s d e v e l o p i n g s o l v e n t . P a p e r e l e c -t r o p h o r e s i s w a s p e r f o r m e d a t pH 2 . 2 ( 1 0 % a c e t i c a c i d ) , pH 6 . 8( 2 5 mM p h o s p h a t e b u f f e r ) , pH 1 0 . 8 ( 2 0 mM N a g C O 3 ) , or pH1 1 ( 5 0 mM s o d i u m b o r a t e ) . R a d i o a c t i v i t y o n t h e paper w asd e t e c t e d b y a r a d i o s c a n n e r . A m i n o a c i d s o n pap er w er e v i s u -a l i z e d b y s p r a y i n g w i t h n i n h y d r i n a n d h e a t i n g b r i e f l y a t 8 0 -9 0 C ; M e S R i b w as d e t e c t e d b y s p r a y i n g w i t h an a n i l i n e /p h o s p h o r i c a c i d s o l u t i o n a n d h e a t i n g b r i e f l y a t 1 0 5 ' C ( 1 2 ) .

P r e p a r a t i o n o f [ 1 4 C J A C C . R a d i o a c t i v e A C C was o b t a i n e db y i n j e c t i n g L - [ U - ' 4 C ] m e t h i o n i n e i n t o a p p l e p l u g s t h a t weret h e n i n c u b a t e d f o r 6 h r i n a n i t r o g e n a t m o s p h e r e . A f t e r e x -t r a c t i o n w i t h e t h a n o l a s d e s c r i b e d a b o v e , r a d i o a c t i v e a m i n oa c i d s w e r e f i r s t s e p a r a t e d f r o m t h e o t h e r c o m p o n e n t s b y a d -s o r p t i o n o n a n i o n e x c h a n g e r e s i n ( D o w e x 5 0 , H + ) c o l u m nf o l l o w e d b y e l u t i o n w i t h 2 M N H 4 0 H . A f t e r c o n c e n t r a t i o n , t h ec a t i o n i c f r a c t i o n was c h r o m a t o g r a p h e d o n Whatman 3 MMpaper as d e s c r i b e d a b o v e . T h e r a d i o a c t i v e r e g i o n c o r r e s p o n d i n gt o AC C w a s c u t f r o m t h e c h r o m a t o g r a m a n d e l u t e d w i t h 7 0 %e t h a n o l . T h e e l u a t e was c o n c e n t r a t e d u n d e r a s t r e a m o f n i t r o -ge n a n d s u b j e c t e d t o e l e c t r o p h o r e s i s o n W h a t m a n 3 MM papera t pH 2 . 2 . T h e r e g i o n c o r r e s p o n d i n g t o A C C w a s a g a i n e l u t e da n d p u r i f i e d o n a n i o n e x c h a n g e r e s i n ( D o w e x 5 0 , H + ) c o l u m n .T h e p u r i f i e d r a d i o a c t i v e A C C was d i s s o l v e d i n 2 % K C I f o rf e e d i n g e x p e r i m e n t s or d i s s o l v e d i n 5 0 % m e t h a n o l f o r h y d r o -g e n a t i o n .H y d r o g e n a t i o n . H y d r o g e n a t i o n o f c o m p o u n d X w a s per-f o r m e d i n 5 0 % aqueous m e t h a n o l a t 2 5 0 C w i t h 2 . 7 a t m o s p h e r e s( 1 a t m o s p h e r e = 1 . 0 1 3 X 1 0 5 P a ) o f h y d r o g e n a n d p a l l a d i u mon c h a r c o a l a s a c a t a l y s t . A f t e r h y d r o g e n a t i o n t h e p r o d u c t s w eres e p a r a t e d a n d c h a r a c t e r i z e d b y paper e l e c t r o p h o r e s i s a t pH2 . 2 .C o c r y s t a l l i z a t i o n . C o m p o u n d X r e c o v e r e d a n d p u r i f i e df r o m f e e d i n g e x p e r i m e n t s a n d i t s h y d r o g e n a t i o n p r o d u c t w e r ef u r t h e r c h a r a c t e r i z e d b y c o c r y s t a l l i z a t i o n w i t h t h e corre-s p o n d i n g a u t h e n t i c c o m p o u n d s . T h e r a d i o a c t i v e s a m p l e sc o n t a i n i n g a k n o w n amount o f r a d i o a c t i v i t y w e r e m i x e d w i t h5 0 mg o f t h e a u t h e n t i c c o m p o u n d . T h e m i x t u r e was d i s s o l v e di n 7 0 % e t h a n o l a n d r e c r y s t a l l i z e d f o u r t i m e s f r o m e t h a n o l /w a t e r . A f t e r e a c h r e c y r s t a l l i z a t i o n t h e s p e c i f i c r a d i o a c t i v i t y o ft h e m a t e r i a l w a s d e t e r m i n e d . F o r a m i n o a c i d d e t e r m i n a t i o nt h e n i n h y d r i n m e t h o d o f Y e m m a n d C o c k i n g ( 1 3 ) was u s e d ,e x c e p t t h a t f o r AC C t h e b o i l i n g t i m e was i n c r e a s e d t o 1 h r t oo b t a i n a s u i t a b l e c o l o r r e a c t i o n . R a d i o a c t i v i t y was d e t e r m i n e db y l i q u i d s c i n t i l l a t i o n c o u n t i n g .

E

c0

L. _0 'UPC

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 1 1 2I n c u b a t i o n t i m e , h rF I G . 1 . I n c o r p o r a t i o n o f L - [ U - 1 4 C ] m e t h i o n i n e i n t o e t h y l e n e b ya p p l e p l u g s . The p l u g s w e r e i n f i l t r a t e d w i t h 0 . 5 , C i o f L - [ U - ' 4 C ] -m e t h i o n i n e ( 1 0 0 g C i / g t m o l ) a n d i n c u b a t e d i n a i r ( & ) , i n n i t r o g e n ( @ ) ,

or i n n i t r o g e n f o r 6 h r a n d t h e n i n a i r ( 0 ) .

0.8

( U-00

0 . 60 40 . 2 .

0 . 80 6 -0 . 4 -0 . 2

0 . 2 5 0 . 5R F 0 . 7 5F I G . 2 . R a d i o c h r o m a t o g r a m scans o f e t h a n o l e x t r a c t s p r e p a r e df r o m a p p l e p l u g s d e s c r i b e d i n F i g . 1 . ( A ) L - [ U - 1 4 C ] M e t h i o n i n e u s e d .( B ) E x t r a c t p r e p a r e d f r o m t h e p lu g i n c u b a t e d i n a i r f o r 1 2 h r . ( C )E x t r a c t p r e p a r e d f r o m t h e p l u g i n c ub a t e d i n n i t r o g e n f o r 6 h r . ( D )E x t r a c t p r e p a r e d f r o m t h e p l u g i n c u b a t e d f o r 6 h r i n n i t r o g e n a n dt h e n t r a n s f e r r e d t o a i r f o r 6 h r .

R ESULT SC h a r a c t e r i s t i c s o f t h e C o n v e r s i o n o f M e t h i o n i n e i n t o a nUnknown M e t a b o l i t e . F i g . 1 s h o w s t h e p r o d u c t i o n o f r a d i o -a c t i v e e t h y l e n e f r o m p l u g s o f a p p l e t i s s u e f e d w i t h [ U - 1 4 C ] -m e t h i o n i n e . O n e p l u g w a s i n c u b a t e d i n a i r c o n t i n u o u s l y , an -o t h e r u n d e r n i t r o g e n f o r 6 h r w i t h o u t exposure t o a i r , a n d t h et h i r d w as i n c u b a t e d u n d e r n i t r o g e n f o r 6 h r a n d s u b s e q u e n t l yt r a n s f e r r e d t o a i r f o r 6 h r . T h e p l u g i n c u b a t e d i n a i r c o n v e r t e da b o u t h a l f o f t h e r a d i o a c t i v i t y t o e t h y l e n e w h e r e a s t h e p l u gi n c u b a t e d i n n i t r o g e n p r o d u c e d very l i t t l e r a d i o a c t i v e e t h y l e n e .T h e p l u g t h a t w a s i n c u b a t e d i n n i t r o g e n a n d s u b s e q u e n t l yt r a n s f e r r e d t o a i r p r o d u c e d very l i t t l e e t h y l e n e w h i l e i n n i t r o -

g e n . U p o n t r a n s f e r t o a i r , h o w e v e r , i t p r o d u c e d e t h y l e n e a t ar a t e h i g h e r t h a n d i d t h e p l u g t h a t was i n c u b a t e d c o n t i n u o u s l yi n a i r .When t h e p l u g s w ere h o m o g en i z e d a n d t h e e x t r a c t s a n a l y z e db y paper r a d i o c h r o m a t o g r a p h y , i t was f o u n d t h a t o n l y a s m a l lamount o f m e t h i o n i n e ( R F 0 . 4 5 ) r e m a i n e d i n p l u g s i n c u b a t e di n a i r ( F i g . 2 B ) . I n p l u g s i n c u b a t e d i n n i t r o g e n , h o w e v e r , anu n k n o w n r a d i o a c t i v e m e t a b o l i t e ( d e s i g n a t e d " c o m p o u n d X " )w i t h an R F o f 0 . 3 7 a c c u m u l a t e d ( F i g . 2 C ) . I n p l u g s r e t u r n e dt o a i r a f t e r i n c u b a t i o n i n n i t r o g e n , c o m p o u n d X d i s a p p e a r e d( F i g . 2 D ) w i t h t h e c o n c o m i t a n t p r o d u c t i o n o f e t h y l e n e ( F i g .1 ) . I n f u r t h e r s t u d y o f t h e f o r m a t i o n o f c o m p o u n d X , we com-p a r e d t h e m e t a b o l i s m o f u n i f o r m l y l a b e l e d a n d m e t h y l - l a b e l e dm e t h i o n i n e i n p l u g s i n c u b a t e d u n d e r n i t r o g e n . P l u g s f e d [ U -

B

D

4 0 A73 0 X , 2 0 p1 0-y0

I - - , "

B i o c h e m i s t r y : A d a m s a n d Y a n g

6

1

8/9/2019 Conversion of Sam to Ethy

3/5

1 7 2 B i o c h e m i s t r y : A d a m s a n d Yang

a 041 1(4e lr .*leS~M0 . 2 .11k _

~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ B0.8-

0.6- MeSRib-'-"-040. 2

0 . 2 5 0 . 5 0 . 7 5RF

F I G . 3 . R a d i o c h r o m a t o g r a m scans o f e t h a n o l e x t r a c t s p r e p a r e df r o m a p p l e p l u g s i n f i l t r a t e d w i t h 0 . 5 A C i o f L - [ U - 1 4 C j m e t h i o n i n e ( 1 0 0, q C i / A m o l ) ( A ) or 0 . 5 , C i o f L - [ m e t h y l - 1 4 C j m e t h i o n i n e ( 4 9 M C i / M m o l )( B ) . A f t e r i n f i l t r a t i o n t h e p l u g s w e r e i n c u b a t e d f o r 6 h r i n a n i t r o g e na t m o s p h e r e .' 4 C ] m e t h i o n i n e c o n t a i n e d c o m p o u n d X b u t p l u g s f e d[ m e t h y l - 1 4 C ] m e t h i o n i n e d i d n o t ( F i g . 3 ) . I n b o t h s i t u a t i o n s ,m e t h i o n i n e w as m e t a b o l i z e d e x t e n s i v e l y . P l u g s f e d [ m e t h y l -1 4 C ] m e t h i o n i n e c o n t a i n e d a m e t a b o l i t e ( R F , 0 . 6 8 ) t h a t w as l a t e ri d e n t i f i e d a s M e S R i b b y p a p e r c o c h r o m a t o g r a p h y a n d coe-l e c t r o p h o r e s i s w i t h a u t h e n t i c m a t e r i a l , a s d e s c r i b e d ( 8 ) . I n plugsf e d [ a 5 S i m e t h i o n i n e a n d i n c u b a t e d u n d e r n i t r o g e n , l a b e l e dM e S R i b w as o b s e r v e d b u t n o t c o m p o u n d X ; t h i s w a s a l s o t h er e s u l t i n t h e e x p e r i m e n t u s i n g [ m e t h y l - ' 4 C ] m e t h i o n i n e . T h e s eo b s e r v a t i o n s i n d i c a t e t h a t c o m p o u n d X p o s s e s s e s n e i t h e r t h es u l f u r a t o m no r t h e m e t h y l group o f m e t h i o n i n e . F u r t h e r m o r e ,b e c a u s e t h e m e t a b o l i s m o f m e t h i o n i n e t o c o m p o u n d X i s a c -c o m p a n i e d b y t r a n s f e r o f t h e C H 3 S group o f m e t h i o n i n e t oM e S R i b , t h e p r e s e n t r e s u l t s are i n a g r e e m e n t w i t h t h e c o n c l u -s i o n t h a t m e t h i o n i n e i s c o n v e r t e d t o c o m p o u n d X v i a S A d o M e ta s a n i n t e r m e d i a t e ( 8 ) . I n t h i s c o n v e r s i o n , M e S A d o i s a s s u m e dt o b e t h e p r i m a r y p r o d u c t b e c a u s e i t h a s b e e n e s t a b l i s h e d t h a tM e S A d o i s r a p i d l y h y d r o l y z e d t o M e S R i b i n a p p l e t i s s u e .

C h e m i c a l I d e n t i f i c a t i o n o f C o m p o u n d X . T h e u n k n o w nr a d i o a c t i v e m a t e r i a l w as c a t i o n i c o n e l e c t r o p h o r e s i s a t pH 2 . 2 ,n e u t r a l a t pH 6 . 8 , a n d a n i o n i c a t pH 1 1 . I t r e a c t e d w i t h 2 , 4 -d i n i t r o f l u o r o b e n z e n e a n d gave a d e r i v a t i v e t h a t m i g r a t e d a sa n a n i o n a t pH 6 . 8 . T h e s e r e s u l t s s u g g e s t t h a t t h e m e t a b o l i t ec o u l d b e a n a m i n o a c i d . U p o n h y d r o g e n a t i o n i t gave a r a d i o -a c t i v e p r o d u c t ( 4 0 % y i e l d ) t h a t c o m i g r a t e d w i t h a - a m i n o -b u t y r i c a c i d i n b o t h paper c h r o m a t o g r a p h y a n d paper e l e c -t r o p h o r e s i s a t pH 2 . 2 a n d 1 0 . 8 . T h e i d e n t i t y o f t h e h y d r o g e -n a t i o n p r o d u c t a s a - a m i n o b u t y r i c a c i d w a s c o n f i r m e d b y co -c r y s t a l l i z a t i o n o f t h e r a d i o a c t i v e m a t e r i a l w i t h a u t h e n t i c DL-a - a m i n o b u t y r i c a c i d t o c o n s t a n t s p e c i f i c a c t i v i t y ( T a b l e 1 ) . T h em o b i l i t y o f c o m p o u n d X w as c o m p a r e d w i t h t h a t o f a u t h e n t i cs a m p l e s o f A C C , a z e t i d i n e - 2 - c a r b o x y l i c a c i d , 2 - a m i n o - 3 - b u -t e n o i c a c i d ( v i n y l g l y c i n e ) , a n d h o m o s e r i n e l a c t o n e i n paperc h r o m a t o g r a p h y a n d i n paper e l e c t r o p h o r e s i s , b e c a u s e t h e s e

I*u ,040

0L.4 )SOd

0 1 2 3 4Tim e i n c u b a t e d , h r 5 6

F I G . 4 . C o n v e r s i o n o f r a d i o a c t i v i t y i n t o e t h y l e n e b y a p p l e p l u g si n f i l t r a t e d w i t h 0 . 6 u C i a n d 6 n m o l o f L - [ U - 1 4 C ] m e t h i o n i n e ( 0 ) , 0 . 6, M C i a n d 6 n m o l o f L - [ U - 1 4 C ] m e t h i o n i n e p l u s 0 .1 , m o l o f u n l a b e l e dAC C ( 0 ) , 0 . 3 M C i o f [ 1 4 C J A C C (A), or 0 . 3 M C i o f [ 1 4 C ] A C C p l u s 0 . 1M m o l o f u n l a b e l e d m e t h i o n i n e ( - ) . A l l p l u g s were i n c u b a t e d i n a i r .c o m p o u n d s ar e t h e d e h y d r o g e n a t e d f o r m s o f a - a m i n o b u t y r i ca c i d . O n l y A C C w as f o u n d t o c o m i g r a t e w i t h c o m p o u n d X i nb o t h paper c h r o m a t o g r a p h y a n d paper e l e c t r o p h o r e s i s a t pH2 . 2 a n d 1 0 . 8 . When a u t h e n t i c A C C w as h y d r o g e n a t e d , i t a l s oy i e l d e d a - a m i n o b u t y r i c a c i d . L i k e A C C , c o m p o u n d X r e a c t e dvery s l o w l y w i t h n i n h y d r i n a s r e v e a l e d b y pap er c h r o m a t o g -r a p h y , s u g g e s t i n g t h a t i t c o n t a i n e d no a - h y d r o g e n . I d e n t i f i -c a t i o n o f r a d i o a c t i v e c o m p o u n d X a s A C C w as f u r t h e r c on -f i r m e d b y c o c r y s t a l l i z a t i o n o f t h e r a d i o a c t i v e m a t e r i a l w i t ha u t h e n t i c A C C t o c o n s t a n t s p e c i f i c r a d i o a c t i v i t y ( T a b l e 1 ) . T oensure r e l i a b i l i t y o f t h e m e t h o d , D L - a - a m i n o ( 3 - 1 4 C l b u t y r i c a c i dw as c o c r y s t a l l i z e d w i t h a u t h e n t i c AC C or D L - a - a m i n o b u t y r i ca c i d . A s e x p e c t e d , a c t i v i t y w as n o t r e t a i n e d w i t h A C C b u t w asr e t a i n e d w i t h D L - a - a m i n o b u t y r i c a c i d . T h e i n i t i a l d e c r e a s e i ns p e c i f i c r a d i o a c t i v i t y w h e n c o m p o u n d X w as c o c r y s t a l l i z e dw i t h a u t h e n t i c AC C may b e d u e t o c o n t a m i n a t i o n b y so m er a d i o a c t i v i t y o t h e r t h a n A C C i n t h e p u r i f i e d s a m p l e o f c o m -p o u n d X .C o n v e r s i o n o f A C C t o E t h y l e n e i n A p p l e T i s s u e . T o pro-v i d e d i r e c t e v i d e n c e t h a t t h e t i s s u e i s c a p a b l e o f c o n v e r t i n gA C C i n t o e t h y l e n e , AC C w as p r e p a r e d a n d i s o l a t e d f r o m p l u g st h a t h a d b e e n f e d [ U - 1 4 C ] m e t h i o n i n e a n d i n c u b a t e d u n d e rn i t r o g e n . I t c an b e seen f r o m F i g . 4 t h a t A C C w as e f f i c i e n t l yc o n v e r t e d t o e t h y l e n e . I f A C C i s an i n t e r m e d i a t e in t h e con-v e r s i o n o f m e t h i o n i n e t o e t h y l e n e , t h e a d d i t i o n o f u n l a b e l e dA C C s h o u l d s i g n i f i c a n t l y d i l u t e t h e i n c o r p o r a t i o n o f r a d i o a c -t i v i t y f r o m m e t h i o n i n e i n t o e t h y l e n e , b u t t h e i n c o r p o r a t i o n o fr a d i o a c t i v i t y f r o m A C C i n t o e t h y l e n e s h o u l d b e l e s s a f f e c t e db y t h e a d m i n i s t r a t i o n o f u n l a b e l e d m e t h i o n i n e . T h e r e s u l t s o ft h e d i l u t i o n e x p e r i m e n t s s h o w n i n F i g . 4 are i n c l o s e a g r e e m e n tw i t h t h i s p r e d i c t i o n . I t h a s b e e n s h o w n t h a t t h e c o n v e r s i o n o fm e t h i o n i n e t o e t h y l e n e a n d M e S A d o i s g r e a t l y i n h i b i t e d b yA VG ( 8 ) . I n t h e p r e s e n t s t u d y we h a v e p r e s e n t e d f u r t h e r e v i -d e n c e t h a t m e t h i o n i n e i s c o n v e r t e d i n t o M e S R i b a n d A C Cp r e s u m a b l y v i a S A d o M e t , a n d t h a t t h i s c o n v e r s i o n i s s e n s i t i v e

T a b l e 1 . C o c r y s t a l l i z a t i o n o f t h e r a d i o a c t i v e m e t a b o l i t e a n d i t s h y d r o g e n a t e d p r o d u c t w i t h a u t h e n t i c s a m p l e sU n l a b e l e d S p e c i f i c r a d i o a c t i v i t y a t e a c h c r y s t a l l i z a t i o n , c p m / g m o l1 4 C s a m p l e a u t h e n t i c c o m p o u n d I n i t i a l 1 2 3 4

C o m p o u n d X ACC 8 0 4 6 9 1 7 2 5 7 1 8 . 6 8 0D L - a - A m i n o [ 3 - 1 4 C j b u t y r i c a c i d A C C 6 8 1 4 4 7 2 3 1 9 2 2 5H y d r o g e n a t e d X D L - a - A m i n o b u t y r i c a c i d 1 3 5 1 0 9 1 0 3 9 9 1 1 2 .D L - [ 4 - 1 4 C ] H o m o s e r i n e D L - a - A m i n o b u t y r i c a c i d 6 3 4 2 7 1 1 1 0 4 0 9D L - a - A m i n o [ 3 - ' 4 C ] b u t y r i c a c i d D L - a - A m i n o b u t y r i c a c i d 5 0 5 4 6 0 4 9 8 4 8 8 4 6 4

605 0 - 1 A4 0 -3 0 - -

2 0 A " - I-1 0 X . z ..z1

P r o c . N a t i . A c a d . S c i . USA 7 6 ( 1 9 7 9 )

8/9/2019 Conversion of Sam to Ethy

4/5

P r o c . N a t i . A c a d . S c i . USA 7 6 ( 1 9 7 9 ) 1 7 3C 0 2 A T P P P i +Pi+ C o 01 +-HA. + 1 +C H 3 - S - C H 2 7 C H 2 7 C - N H 3 - o--- C H O - S - C H 2 C H 2 7 C - N H 3I ~ ~~~IH A d e n o s i n e H

OHC tH

H 2 0 + H

C H 3 - S C H ,I n eA d e n o s i n e| C H 3 - S - A d e n o s i n e

H O H + OHC-kNH H2 C -CH2

C o 0 NH1 1 H O O H [ ] + H 2 0s< H +

HI +HO-O-C-NH3t ) t i k,C =0

I +H20

CH2=Ch-HC H 2 = C H 4

CH2

C H2 NH3\H /

H O - 0 O C o -

HCONH2 0 - E + EH3H 2 0

F I G . 5 . P o s t u l a t e d m e c h a n i s m f o r t h e b i o s y n t h e s i s o f e t h y l e n e f r o m m e t h i o n i n e . T h e s u b s t i t u t e d p y r i d i n e c a r b o x a l d e h y d e s t a n d s f o r p y r i d o x a lp h o s p h a t e .t o AVG i n h i b i t i o n ; t h e c o n v e r s i o n o f AC C t o e t h y l e n e , h o w e v e r ,i s u n i n h i b i t e d b y A V G . T a b l e 2 i l l u s t r a t e s t h e e f f e c t o f A VG ont h e c o n v e r s i o n o f m e t h i o n i n e or A C C t o e t h y l e n e . T h e c o n -v e r s i o n o f m e t h i o n i n e t o e t h y l e n e w as g r e a t l y i n h i b i t e d b y A VG

T a b l e 2 . E f f e c t o f A VG o n t h e c o n v e r s i o n o f m e t h i o n i n e a n dA C C t o e t h y l e n e b y a p p l e t i s s u e. I 1 4 C 2 H 4C o m p o u n d i n f i l t r a t e d n C i %

E x p . 1 :L - [ U - 1 4 C ] M e t h i o n i n e 9 1 1 0 0L - [ U - 1 4 C ] M e t h i o n i n e + A V G 3 . 9 4

E x p . 2 :[ U - 1 4 C J A C C 5 0 1 0 0[ U - ' 4 C ] A C C + A VG 7 6 1 5 3E a c h p l u g o f a p p l e t i s s u e w a s i n f i l t r a t e d w i t h 0 . 1 m l o f 2% K C I s o -l u t i o n c o n t a i n i n g 0 . 7 i C i o f L - [ U - 1 4 C ] m e t h i o n i n e ( 1 0 0 s C i / M m o l ) o r0 . 2 4 j C i o f [ U - 1 4 C ] A C C a n d 2 . 5 n m o l o f A VG a s i n d i c a t e d . T h e p l u g sw e r e i n c u b a t e d f o r 6 h r i n e x p e r i m e n t 1 a n d 7 h r i n e x p e r i m e n t 2 .P e r c e n t a g e i n c o r p o r a t i o n w a s c a l c u l a t e d r e l a t i v e t o c o r r e s p o n d i n gp l u g s t h a t r e c e i v e d n o AVG.

a s r e p o r t e d ( 8 ) , b u t t h e c o n v e r s i o n o f A C C t o e t h y l e n e w a ss t i m u l a t e d b y A V G . A p o s s i b l e e x p l a n a t i o n o f t h i s s t i m u l a t o r ye f f e c t o f AVG i s t h a t i t i n h i b i t s t h e c o n v e r s i o n o f e n d o g e n o u sm e t h i o n i n e t o A C C , r e s u l t i n g i n a s m a l l e r e n d o g e n o u s A C Cp o o l a n d c o n s e q u e n t l y l e s s d i l u t i o n o f t h e l a b e l e d A C C . O u rr e s u l t s p r e d i c a t e t h e f o l l o w i n g s e q u e n c e f o r t h e c o n v e r s i o n o fmethionine to ethylene in apple tissue: Methionine ACCe t h y l e n e . T h e f i r s t s t e p i s s e n s i t i v e t o AVG i n h i b i t i o n ; t h e l a s ts t e p r e q u i r e s o x y g e n .

D I S C U S S I O NE n d o g e n o u s e t h y l e n e p r o d u c t i o n a n d t h e c o n v e r s i o n o f m e -t h i o n i n e t o e t h y l e n e a r e g r e a t l y i n h i b i t e d b y r h i z o b i t o x i n e a n di t s e t h o x y a n a l o g ( A V G ) i n a n u m b e r o f p l a n t t i s s u e s ( 3 , 4 , 1 4 ) .T h e s e c o m p o u n d s are k n o w n t o i n h i b i t p y r i d o x a l p h o s p h a t e -m e d i a t e d r e a c t i o n s a n d a m e c h a n i s m f o r t h e i r a c t i o n h a s b e e nd i s c u s s e d b y R a n d o ( 1 5 ) . I n a p r e v i o u s s t u d y we f o u n d e v i d e n c et h a t i m p l i c a t e d S A d o M e t a s an i n t e r m e d i a t e i n t h e c o n v e r s i o no f m e t h i o n i n e t o e t h y l e n e ( 8 ) . T h i s w as b a s e d o n t h e o b s e r v a t i o nt h a t M e S A d o a n d M e S R i b are t h e p r e d o m i n a n t p r o d u c t s d e -r i v e d f r o m t h e m e t h y l t h i o g r o u p o f m e t h i o n i n e i n a p p l e t i s s u ew h i l e i t i s p r o d u c i n g e t h y l e n e . I n t h e p r e s e n t s t u d y we h a v e

H2C- C H 2>7N=CH NH

B i o c h e m i s t r y : A d a m s a n d Y a n g

8/9/2019 Conversion of Sam to Ethy

5/5

1 7 4 B i o c h e m i s t r y : A d a m s a n d Y a n gd e m o n s t r a t e d an a c c u m u l a t i o n o f l a b e l e d AC C f o r m e d f r o mt h e m e t h i o n i n e a d m i n i s t e r e d t o t i s s u e i n c u b a t e d i n n i t r o g e n ,a n a t m o s p h e r e t h a t i n h i b i t e d t h e conversion o f m e t h i o n i n e t oe t h y l e n e ( F i g s . 1 a n d 2 ) . T h e f o r m a t i o n o f A C C f r o m m e t h i o -n i n e was a c c o m p a n i e d b y t h e p r o d u c t i o n o f M e S R i b ( F i g . 3 ) ,a n d t h e f o r m a t i o n o f AC C a n d M e S R i b f r o m m e t h i o n i n e wasc o n c o m i t a n t l y i n h i b i t e d b y A V G . I t i s r e a s o n a b l e t o assume t h a tA C C a n d M e S R i b ar e f o r m e d v i a f r a g m e n t a t i o n o f S A d o M e t .H o w e v e r , t h e p r e s e n t d a t a d o n o t e s t a b l i s h w h e t h e r A VG i n -h i b i t s t h e c o n v e r s i o n o f m e t h i o n i n e t o S A d o M e t or o f S A d o M e tt o A C C . W e h a v e e x a m i n e d t h e e f f e c t o f A VG o n S A d o M e tf o r m a t i o n f r o m l a b e l e d m e t h i o n i n e i n a p p l e t i s s u e a n d h a v ef o u n d t h a t t h e a m o u n t o f l a b e l e d S A d o M e t i n c r e a s e s s e v e r a l f o l di n t h e presence o f AVG a s c o m p a r e d t o c o n t r o l t i s s u e w i t h o u tt h e i n h i b i t o r ( u n p u b l i s h e d o b s e r v a t i o n s ) . I t i s s u g g e s t e dt h e r e f o r e t h a t A V G d o e s n o t i n h i b i t t h e conversion o f m e t h i o -n i n e t o S A d o M e t b u t i n h i b i t s t h e c o n v e r s i o n o f S A d o M e t t oA C C . I f t h e A VG i n h i b i t i o n i s a r e s u l t o f i t s i n t e r f e r e n c e w i t hp y r i d o x a l p h o s p h a t e - m e d i a t e d enzyme r e a c t i o n s , a n d i f t h ec o n v e r s i o n o f S A d o M e t t o ACC i s i n d e e d t h e s t e p a t w h i c h AVGi n h i b i t s e t h y l e n e p r o d u c t i o n , t h e n i t i s p r o b a b l e t h a t t h i s s t e pi s m e d i a t e d b y p y r i d o x a l p h o s p h a t e .A p o s t u l a t e d m e c h a n i s m t o a c c o u n t f o r t h e s e r e a c t i o n s i ss h o w n i n F i g . 5 . T h e f i r s t s t e p i s t h e a c t i v a t i o n o f m e t h i o n i n eb y ATP t o p r o d u c e S A d o M e t , w h i c h t h e n r e a c t s w i t h p y r i d o x a lp h o s p h a t e t o f o r m a S c h i f f b a s e . I t i s k n o w n t h a t p y r i d o x a lp h o s p h a t e i s c a p a b l e o f c a t a l y z i n g y - e l i m i n a t i o n r e a c t i o n s ( 1 6 ) .T h i s i s a n o v e l e x a m p l e , h o w e v e r , i n t h a t t h e a - h y d r o g e n i se l i m i n a t e d a l o n g w i t h t h e y - s u b s t i t u e n t , r e s u l t i n g i n t h e f o r -m a t i o n o f a c y c l o p r o p a n e r i n g . T h e c a r b o x y l , C - 1 , C - 2 , a n d ( > 3o f AC C w o u l d b e d e r i v e d f r o m C - 1 , C - 2 , C - 3 , a n d C - 4 , r e -s p e c t i v e l y , o f m e t h i o n i n e . I t w o u l d t h e r e f o r e b e e x p e c t e d t h a tt h e e n d p r o d u c t s o f AC C m e t a b o l i s m t o e t h y l e n e i n a p p l e t i s s u ew o u l d b e C O 2 , HCOOH, a n d e t h y l e n e . T h e f a t e o f e a c h c a r b o nh a s b e e n f a i r l y w e l l e s t a b l i s h e d , b u t t h e r e i s l i t t l e i n f o r m a t i o na b o u t t h e m e c h a n i s m o f A C C c o n v e r s i o n t o e t h y l e n e e x c e p tt h a t t h e p r o c e s s r e q u i r e s o x y g e n . T h e i n v o l v e m e n t o f h y d r o g e np e r o x i d e i n t h e c l e a v a g e o f c y c l o p r o p a n e r i n g , a s s h o w n i n F i g .5 , a w a i t s e x p e r i m e n t a l e v i d e n c e . H y d r o g e n p e r o x i d e i s a l i k e l yc a n d i d a t e b e c a u s e i t i s t h e p r o d u c t o f c e r t a i n o x i d a s e s , h a s b e e ni m p l i c a t e d i n t h e o n s e t o f f r u i t r i p e n i n g a n d e t h y l e n e p r o d u c -t i o n ( 1 7 ) , a n d r e a c t s w i t h AC C a t e l e v a t e d t e m p e r a t u r e t op r o d u c e e t h y l e n e c h e m i c a l l y ( u n p u b l i s h e d o b s e r v a t i o n ) . T h ef o r m a t i o n o f e t h y l e n e , C O 2 , f o r m i c a c i d , a n d a m m o n i a i s i nk e e p i n g w i t h t h e r e s u l t s o b t a i n e d w i t h t r a c e r s t u d i e s i n a p p l et i s s u e ( 2 ) . T h a t AC C i s i n d e e d a p r e c u r s o r o f e t h y l e n e i s f u r t h e rs u p p o r t e d b y u n p u b l i s h e d o b s e r v a t i o n s i n t h i s l a b o r a t o r y ( A .C a m e r o n , Y . Y u , a n d L . F e n t o n ) : upon t r e a t m e n t w i t h A C C ,a r e m a r k a b l e i n c r e a s e i n e t h y l e n e p r o d u c t i o n occurs i n v a r i o u s

p l a n t t i s s u e s t h a t n o r m a l l y p r o d u c e l i t t l e e t h y l e n e . T h e s e r e s u l t sa n d o t h e r s s u g g e s t t h a t t h e c o n v e r s i o n o f S A d o M e t t o ACC i st h e r a t e - l i m i t i n g s t e p i n t h e s e p l a n t t i s s u e s .ACC w a s f i r s t i s o l a t e d a n d c h a r a c t e r i z e d f r o m c i d e r a p p l e sa n d p e r r y p e a r s b y B u r r o u g h s ( 1 8 ) i n 1 9 5 7 . S u b s e q u e n t l y , i t w a si d e n t i f i e d i n r i p e c o w b e r r i e s ( V a c c i n i u m m t i s - i d a e a ) ( 1 9 ) b u tc o u l d n o t b e d e t e c t e d i n u n r i p e c o w b e r r i e s . T h i s o b s e r v a t i o nw a s l a t e r c o n f i r m e d b y B u r r o u g h s ( 2 0 ) , w h o a l s o o b s e r v e d t h a tt h i s a m i n o a c i d i n c r e a s e d c o n s i d e r a b l y d u r i n g s t o r a g e o f p e a r sa f t e r h a r v e s t . B u r r o u g h s ( 2 0 ) s u g g e s t e d t h a t i t m i g h t b e r e l a t e di n s o m e w a y t o t h e p r o c e s s o f f r u i t r i p e n i n g , a l t h o u g h h e w a su n a b l e t o a s s i g n a m e t a b o l i c r o l e f o r t h i s u n u s u a l a m i n o a c i d .W e h a v e n o w d e m o n s t r a t e d t h e r o l e o f AC C i n e t h y l e n e b i o -s y n t h e s i s a n d t h u s e s t a b l i s h e d t h a t i t h a s , i n d e e d , a m o s t s i g -n i f i c a n t r o l e i n f r u i t r i p e n i n g .

T h i s w o r k w a s s u p p o r t e d b y N a t i o n a l S c i e n c e F o u n d a t i o n G r a n t sPC M 7 5 - 1 4 4 4 4 a n d P C M - 7 8 - 0 9 2 7 8 .1 . A b e l e s , F . B . ( 1 9 7 3 ) E t h y l e n e i n P l a n t B i o l o g y ( A c a d e m i c , Ne wY o r k ) .2 . Y a n g , S . F . ( 1 9 7 4 ) T h e C h e m i s t r y a n d B i o c h e m i s t r y o f P l a n tH o r m o n e s , e d s . R u n e c k l e s , V . C . , S o n d h e i m e r , E . & W a l t o n , D .C . ( A c a d e m i c , Ne w Y o r k ) , p p . 1 3 1 - 1 6 4 .3 . H a n s o n , A . D . & K e n d e , H . ( 1 9 7 6 ) P l a n t P h y s i o l . 5 7 , 5 2 8 -5 3 7 .4 . O w e n s , L . D . , L i e b e r m a n , M . & K u n i s h i , A . ( 1 9 7 1 ) P l a n t P h y s i o l .

4 8 , 1 - 4 .5 . B u r g , S . P . & C l a g e t t , C . 0 . ( 1 9 6 7 ) B i o c h e m . B i o p h y s . R e s .Commun. 2 7 , 1 2 5 - 1 3 0 .6 . B u r g , S . P . ( 1 9 7 3 ) P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USA 7 0 , 5 9 1 - 5 9 7 .7 . M u r r , D . P . & Y a n g , S . F . ( 1 9 7 5 ) P h y t o c h e m i s t r y 1 4 , 1 2 9 1 -1 2 9 2 .8 . A d a m s , D . 0 . & Y a n g , S . F . ( 1 9 7 7 ) P l a n t P h y s i o l . 6 0 , 8 9 2 - 8 9 6 .9 . B u r g , S . P . & T h i m a n n , K . V . ( 1 9 5 9 ) P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USA4 5 , 3 3 5 - 3 4 4 .1 0 . M u d d , S . H . ( 1 9 5 9 ) J . B i o l . C h e m . 2 3 4 , 8 7 - 9 2 .1 1 . B a u r , A . H . & Y a n g , S . F . ( 1 9 6 9 ) P l a n t P h y s i o l . 4 4 , 1 3 4 7 -1 3 4 9 .1 2 . D a w s o n , R . M . C . , E l l i o t t , D . , E l l i o t t , W . H . & J o n e s , K . M . ( 1 9 6 9 )i n D a t a f o r B i o c h e m i c a l R e s e a r c h ( O x f o r d U n i v . P r e s s , Ne wY o r k ) , p . 5 4 4 .1 3 . Yemm, E . W . & C o c k i n g , E . C . ( 1 9 5 5 ) A n a l y s t 8 0 , 2 0 9 - 2 1 3 .1 4 . L i e b e r m a n , M . , K u n i s h i , A . T . & O w e n s , L . D . ( 1 9 7 5 ) i n F a c t e u r se t R e g u l a t i o n d e l a M a t u r a t i o n d e s F r u i t s ( C e n t r e N a t i o n a l d el a R e c h e r c h e S c i e n t i f i q u e , P a r i s ) , p p . 1 6 1 - 1 7 0 .1 5 . R a n d o , R . R . ( 1 9 7 4 ) S c i e n c e 1 8 5 , 3 2 0 - 3 2 4 .1 6 . D a v i s , L . & M e t z l e r , D . E . ( 1 9 7 2 ) i n T h e E n z y m e s , e d . B o y e r ,P . D . ( A c a d e m i c , Ne w Y o r k ) , V o l . 7 , p p . 3 3 - 7 4 .1 7 . B r e n n a n , T . & F r e n k e l , C . ( 1 9 7 7 ) P l a n t P h y s i o l . 5 9 , 4 1 1 - 4 1 6 .1 8 . B u r r o u g h s , L . F . ( 1 9 5 7 ) N a t u r e ( L o n d o n ) 1 7 9 , 3 6 0 - 3 6 1 .1 9 . V a h a t a l o , M . L . & V i r t a n e n , A . I . ( 1 9 5 7 ) A c t a C h e m . S c a n d . 1 1 ,7 4 1 - 7 4 3 .2 0 . B u r r o u g h s , L . F . ( 1 9 6 0 ) J . S c i . F o o d A g r i c . 1 1 , 1 4 - 1 8 .

F r o c . N a t l . A c a d . s c i . USA 7 6 ( 1 9 7 9 )