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Contrôle du trafic intracellulaire des glycoprotéines d'enveloppe au cours de la morphogenèse virale.
Exemple du VIH-1.
Denys BRANDINSERM ERI 19: « Virus, pseudovirus: morphogenèse
et antigénicité » -Université de Tours
Contrôle du trafic intracellulaire des protéines d'enveloppe virale au cours de la morphogenèse du VIH-1
I- Généralités sur la morphogenèse du VIH-11- structure du VIH-1
bicouche lipidique empruntée à la cellule hôte
gp 120 SU
gp 41 TM
enveloppe
gp 41 TM
réverse transcriptase (RT)
matrice (p17 MA)
capside (p24 CA)
intégrase (IN)
ARN
nucléoprotéine
nef
tat
vpuvpr
vif
env
pol3‘ LTRgag5' LTR
rev
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Précurseur gagp55
Matricep17
Capsidep24
Nucléocapsidep15
p9 et p6
Précurseur pol
Protéase
Transcriptase inverseP64/p53
Int égrase
Précurseur envgp160
Glycoprotéine de surface gp120
Glycoprotéine transmembranaire
gp41
Organisation du génome proviral
RRRRôle essentiel dansôle essentiel dansôle essentiel dansôle essentiel dans
l’assemblage et lel’assemblage et lel’assemblage et lel’assemblage et le
bourgeonnemmentbourgeonnemmentbourgeonnemmentbourgeonnemment
viralviralviralviral
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2- Cycle de multiplication dans la cellule
corécepteur
récepteur CD4
Fusion
SSSSite de bourgeonnement ite de bourgeonnement ite de bourgeonnement ite de bourgeonnement
viral ?viral ?viral ?viral ?
Rétrotranscription
ADN proviral
Intégration ARN viralGAG-POL
RE - Golgi
ENV
Bourgeonnement
gp160 (synthèse RE)���� maturation (Golgi) + clivage (protéase cellulaire) et transport vers la surface cellulaire = trimère d’hétérodimères gp120 SU-gp41 TM (oligomères)
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3- Assemblage et bourgeonnement viral
Rôle du précurseur Gag (myristilé). Assemblage Gag (Gag-Pol). Bourgeonnement (similitude avec le bourgeonnement vésiculaire observé dans les endosomes tardifs/MVB = machinerie de sortie des protéines endosomales ou endosomes tardifs/MVB = machinerie de sortie des protéines endosomales ou machinerie ESCRTs ″″″″Endosomal Sorting Complexe Required for Transport″″″″).
Matrice
. Région N-terminale du précursseur Gag = protéine de matrice- myristilation + domaine basique = association aux membranes cellulaires (« radeaux lipidiques »)- incorporation des glycoprotéines d’enveloppe
Précurseur Gag
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Cellules BHK-21 infectées par un réplicon SVF exprimant les protéines de capside du VIH-1
(microscopie à balayage)SSSSite de ite de ite de ite de
bourgeonnement bourgeonnement bourgeonnement bourgeonnement
viral ?viral ?viral ?viral ?QuickTime™ et un
décompresseur TIFF (non compressé)sont requis pour visionner cette image.
Avis divergents selon les études:- uniquement à la membrane plasmique(Jouvenet et al., 2006, Welsch et al., 2007)
- uniquement dans les endosomes tardifs (Dong et al., 2005, Perlman & Resh, 2006)
- dépendant du type cellulaire(Ono & Freed, 2004, Grigorov et al., 2006)
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4- Glycoprotéines d'enveloppe = rôle primordiale dans le cycle de multiplication virale
���� Entrée du virus dans la cellule hôte
���� Morphogenèse virale
gp41TM x 3
gp120SU x 3 Mécanisme permettant l’incorporation des
glycoprotéines d’enveloppe à la surface de virions ?
Dépend de la gp41
La glycoprotéine transmembranaire gp41 TM
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domaine domaine domaine
gp 41gp 120
3 domaines :- domaine extracellulaire (peptide de fusion, oligomérisation de l’enveloppe)- domaine transmembranaire (ancrage)- domaine cytoplasmique: 150 aa (VIH, SIV) = différent des autres rétrovirus (20 à 40 aa)
domaine extracellulaire
domaine transmembranaire
domainecytoplasmique
Rôle du domaine cytoplasmique de la gp41 TM du VIH-1
� conformation de l’ectodomaine� capacité à induire la fusion� incorporation de l’oligomère d’enveloppe dans le virion = infectivité et
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� incorporation de l’oligomère d’enveloppe dans le virion = infectivité et multiplication dans les cellules���� 2 modèles :
. incorporation passive (réalisation de « pseudotypes ») ?ou. interaction spécifique entre domaine cytoplasmique gp41 TM et GAG (délétions à l’extrémité C-terminale de la gp41 TM = ���� incorporation, mutations domaine N-terminal GAG (matrice) = ���� incorporation, polarisation du bourgeonnement, interaction directe entre gp41TM et matrice)
� contrôle du trafic intracellulaire des glycoprotéines d’enveloppe
Rôle du domaine cytoplasmique de la gp41 TM du VIH-1
domaine domaine domaine
gp 41gp 120
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LLP-2 LLP-1
2 groupes de motifs
- LLP1 et LLP2 (« Lentivirus Lytic Peptide »): régions hydrophobes organisées en hélice ∝ qui pourraient s’associer à la membrane plasmiqueRôle notamment dans la capacité à induire la fusion de la gp41 et l’incorporation des glycoprotéines d’enveloppe
- motifs impliqués dans la régulation du trafic intracellulaire des gp d’enveloppe
domaine extracellulaire
domaine transmembranaire
domainecytoplasmique
Motif tyrosineY712SPL
Motif dileucine
LL
Motif Y802W803
Motifs impliqués dans le trafic intracellulaire des glycoprotéines d’enveloppe
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domaine extracellulaire
domaine transmembranaire
domainecytoplasmique
1 motifs tyrosine de type YXXØ (Y: tyrosine, X: aa quelconque, Ø: aa hydrophobes), 1 motif diaromatique (YW), 1 motifs di-leucine de type LZ (L: leucine, Z: aa hydrophobe de type L, I, M) (liste non exhaustive)
Motifs tyrosine, diaromatique et dileucine = contrôle du trafic intracellulaire des protéines transmembranaires
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II- Trafic intracellulaire des protéines transmembranaires1- Les signaux de trafic
� Deux grands familles de signaux de trafic intracellulaire ont été caractérisées: caractérisées:
���� motifs tyrosine de type YXX Ø (Ø: aa hydrophobe)ou NPXY (N: asparagine)
� Rôle dans l’internalisation des protéines transmembranaires,� Rôle dans le transfert des protéines transmembranaires vers les endosomes précoces (transferrine), vers les endosomes tardifs (recépteur au mannose 6-phosphate), vers l’appareil de Golgi (TGN38),� Rôle dans le ciblage vers le pôle basolatéral des cellules épithéliales polarisées
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���� motifs di-leucine de type LZ (Z: aa hydrophobes L, I, M)
� Présents dans le domaine cytoplasmique de protéines telles que CD3γ, CD4, chaîne invariante du CMH, CXCR4, Nef (HIV), etc…� Même rôle que les motifs tyrosine
���� autres signaux
� « cluster » acide (répétition d’aa acides). Rôle dans le transfert des protéines des endosomes vers le Golgi (furine, glycoprotéine E (VZV), etc…)� doublet de résidus aromatiques FW.Rôle dans le transfert des protéines des endosomes vers le Golgi (MPR)� motif de conjugaison à l’ubiquitine.Rôle dans l’internalisation et le transfert des protéines notamment vers les lysosomes (récepteur à l’hormone de croissance, etc…)
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AP2
endosomes
tardifs (MVB)
AP3
2- Les vésicules de transport
Différents types de vésicules selonla localisation intracellulaire:
. Vésicules à clathrine de type AP2=
med transcis
AP2Endosomes
précoces
AP1
AP3. Vésicules à clathrine de type AP2= Localisées à la membrane cytoplasmique (endocytose de protéines de la membrane plasmique vers les endosomes précoces)
. Vésicules à clathrine de type AP1= Localisées au niveau du TGN et des endosomes(transport entre ces deux compartiments)
. Vésicules à clathrine de type AP3= Localisées au niveau du TGN et des endosomes(transport entre TGN/endosomes et lysosomes)
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3- Les complexes d’adaptine
Différentes vésicules à clathrine selon le type de complexe d’adaptine associé aux triskelions
µ1ββββ1
σσσσ1
γγγγ
complexe d’adaptine associé aux triskelions de clathrine
� AP1(chaîne lourde γ, β1, chaîne moyenne µ1, petite sous-unitéσ1)
� AP2(chaîne lourde α, β2, chaîne moyenne µ2, petite sous-unitéσ2)
� AP3(chaîne lourde δ, β3, chaîne moyenne µ2, petite sous-unitéσ3)
� AP4
µ2ββββ2
σσσσ2
αααα
µ3ββββ3
σσσσ3
δδδδ
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Recrutement des protéines dans les vésicules à clathrine viales complexes d’adaptine
complexes d’adaptine
membrane plasmique
Protéine transmembranaire
� Interaction du complexe d’adaptine à la foisavec le triskelion de clathrine (sous-unité β) et avec le domaine cytoplasmique des protéinesmembranaires (chaînes µ des complexes AP1,AP2 (motifs YXX Ø) et AP3; chaînes ββββ)
Puits recouvert de clathrine
clathrine
Vésicules à clathrine
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III- Trafic intracellulaire des glycoprotéines d’enveloppe du VIH-1
1- Interaction de la glycoprotéine d’enveloppe avec les complexes d’adaptine
Motifs très conservés entre les différents isolats viraux
domaine extracellulaire
domaine transmembranaire
Motif tyrosineY712SPL
Motif dileucine
LL
domainecytoplasmique
viraux
µ2-adaptine ββββ2-adaptine
Complexe AP-1 et AP2
Complexe AP-2
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1.1- Exemples de techniques utilisées pour mettre en évidence les interactions gp41 TM/complexes d’adaptine et ses conséquences sur le trafic intracellulaire des gp d’enveloppe
domaine de liaison
domaine d’activation
chaînes des complexes
gp41TM domaine cytoplasmique
� Système double hybride dans la levurechaînes des complexes
d’adaptine
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Interaction avec les complexes AP2
(chaîne µ2)
Berlioz-Torrent et al., J Virol. 1999.
Plus d’interactionpour la gp41TM
avec une mutationdu motif tyrosine
Y/A
Système double hybride dans la levure
� « GST pull down »(protéine de fusion avec la glutathion-S-transférase + protéines étudiées (épitope « flag »), incubation avec complexes AP ou chaînes isolées = purification sur colonne (glutathion) et WB)
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Berlioz-Torrent et al., J Virol. 1999.
� Microscopie confocale
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Distribution intracellulaire des glycoprotéines d’enveloppeBerlioz-Torrent et al., J Virol. 1999.
� Microscopie confocale « co-localisation »
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Distribution intracellulaire des glycoprotéines d’enveloppe
Blot et al., J Virol. 2003.
1.2- Impact des interactions glycoprotéines d’enveloppe/complexes d’adaptine sur le trafic, la distribution intracellulaire des glycoprotéines d’enveloppe et la multiplicationvirale
� Interaction motif tyrosine/AP-2 : endocytose des gp d’enveloppe présentes à la surface
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� Interaction motif tyrosine/AP-2 : endocytose des gp d’enveloppe présentes à la surface cellulaire vers les endosomes- Mutation Y/A = � endocytose et � de l’expression de surface des gp
� Interaction motif LL/AP-1 : implication dans la circulation des gp entre l’appareil deGolgi et les endosomes
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� Interaction gp41TM/complexes AP - impact sur la multiplication virale:
� ciblage des gp d’enveloppe (et du bourgeonnement viral) vers un pôle de la cellule (cellules polarisées MDCK, neurones) - ciblage contrôlé par le motif tyrosine
� mutation motif tyrosine (Y/A) = � infectivité et capacité réplicative du virus (lignées T, PBMC)
Day et al., J Virol. 2004.
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2- Interaction des glycoprotéines d’enveloppe avec TIP47
� TIP 47 (tail-interacting-protein of 47 kDa) : de quoi s’agit’il ?
- assure (en association avec Rab-9-GTP) le retour des récepteurs du mannose-6 phosphate des endosomes tardifs vers le réseau trans-golgiendes endosomes tardifs vers le réseau trans-golgien
- reconnaît le motif F-W porté par le domaine cytoplasmique du récepteur du M6P
- reconnaît un motif diaromatique Y-W dans le domaine cytoplasmique de la gp41 du VIH-1
(Berlioz-Torrent et al., J Virol. 2003)
domaine extracellulaire
domaine transmembranaire
Motif tyrosineY712SPL
Motif dileucine
LL
domainecytoplasmique
Motif Y802W803
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2.1- Exemples de techniques utilisées pour mettre en évidence les interactions gp41 TM/TIP-47 et ses conséquences sur le trafic intracellulaire des gp d’enveloppe
� Système double hybride dans la levure
� « GST pull down »
Blot et al., J Virol. 2003.
� Microscopie cofocale - Distribution après internalisation (transport rétrograde)
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Incubation avec l’anticorps
primaire à 0°C
Incubation 1 h
Marqueur TGN
Incubation 1 hà 37°C
Fixation, perméabilisation
etincubation avec
l’anticorps secondaire
Microscopieconfocale
Marqueur TGN
Blot et al., J Virol. 2003.
2.2- Impact des interactions gp41 TM/TIP47 sur le trafic, la distribution intracellulaire des glycoprotéines d’enveloppe et la multiplication virale
� TIP-47 est impliqué dans le transport rétrograde des gp d’enveloppe des endosomes
vers le Golgi
TIP-47 est indispensable à la multiplication du VIH-1 dans la cellule et à son infectivité
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� TIP-47 est indispensable à la multiplication du VIH-1 dans la cellule et à son infectivité
Cinétique de multiplication en cellule Jurkat Western-Blot anti gp-120
Pas d’incorporation de gp d’enveloppe
dans le virion
Blot et al., J Virol. 2003.
3- Bilan des signaux
connus pour contrôler
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AP2
endosomes
tardifs (MVB)
AP3 TIP-47 connus pour contrôler
le trafic intracellulaire
des gp d’enveloppe
du VIH-1 = circulation
des gp entre TGN et
surface cellulaire med transcis
AP2 (motif YSPL)Endosomes
précoces
AP1 (motif LL)
AP3 TIP-47 (motif YW)
Peu de gp d’enveloppe à la surface cellulaire, bonne l’incorporation des gp dans les virions,éviter la dégradation dans les lysosomes
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4- TIP-47 est un « connecteur entre Gag et les glycoprotéines d’enevloppe
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Distribution intracellulaire des gp d’enveloppe(circulation des gp entre golgi et surface cellulaire)
GolgiEndosomes précoces
Endosomes tradifs (MVB) Surface cellulaire
Quels sont les autres signaux impliqués dans le trafic et la distribution intracellulaire des gp d’enveloppe ???
Problématique des glycoprotéines d’enveloppe de certains virus primaires/souches adaptées
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TGN46 Enveloppe Superposition
Etude de la distribution intracellulaire des glycoprotéines d’enveloppe de virus primaires� Microscopie confocale « co-localisation »
VirusNL4-3
adapté
Virus523
primaire
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IV- Trafic intracellulaire d’autres glycoprotéines d’enveloppe virale
� Nombreux rétrovirus (autres que les lentivirus) = signaux de trafic intracellulaire dans leur gp d’enveloppe
���� motif tyrosine���� motif tyrosine- rétrovirus humain HTLV-1 (régulation de l’expression de surface,polarisation du bourgeonnement)- oncorétrovirus MLV (virus de la leucémie murine) (polarisationdu bourgeonnement)- BLV (virus de la leucémie bovine) (infectivité virale et maintien d’unecharge virale élevée)- RSV (Rous sarcoma virus) - MPMV (Mason-Pfizer monkey virus)
���� motif tyrosine
- Herpesviridae
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. Glycoprotéine E du HSV et glycoprotéines gE et gI du VZVLocalisées dans le TGN = résultat d’un trafic permanent entreTGN, endosomes et surface cellulaire (motifs tyrosine + autres signauxde tri)
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Conclusion
� Virus = exploitation des différentes fonctions cellulaires et notamment de la machinerie permettant le trafic des protéines
Perspectives:Perspectives:
- poursuivre la caractérisation du trafic intracellulaire des gp d’enveloppe
- évaluer l’impact du trafic sur la morphogenèse virale
- analyser l’effet des autres protéines virales sur le trafic des gp (Nef par exemple dansle cas du VIH-1)